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Biology

Application de la vermimétrie de flux pour la quantification et l’analyse du microbiome intestinal de Caenorhabditis elegans

Published: March 31, 2023 doi: 10.3791/64605
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1,2
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research and Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Development, Disease Models and Therapeutics Program, Graduate School of Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Caenorhabditis elegans est un modèle puissant pour examiner les déterminants moléculaires à l’origine des interactions hôte-microbiome. Nous présentons un pipeline à haut débit profilant les niveaux de colonisation du microbiome intestinal chez un seul animal ainsi que des aspects clés de la physiologie de C. elegans.

Abstract

La composition du microbiome intestinal peut avoir un impact considérable sur la physiologie de l’hôte tout au long du développement et de la vie de l’animal. La mesure des changements de composition dans le microbiome est cruciale pour identifier les relations fonctionnelles entre ces changements physiologiques. Caenorhabditis elegans est apparu comme un puissant système hôte pour examiner les moteurs moléculaires des interactions hôte-microbiome. Grâce à son plan corporel transparent et à ses microbes naturels marqués par fluorescence, les niveaux relatifs de microbes dans le microbiome intestinal d’un animal C. elegans individuel peuvent être facilement quantifiés à l’aide d’un grand trieur de particules. Nous décrivons ici les procédures de mise en place expérimentale d’un microbiome, la collecte et l’analyse des populations de C. elegans au stade de vie souhaité, le fonctionnement et la maintenance du trieur, ainsi que les analyses statistiques des ensembles de données résultants. Nous discutons également des considérations relatives à l’optimisation des paramètres du trieur en fonction des microbes d’intérêt, du développement de stratégies de contrôle efficaces pour les stades de vie de C. elegans et de la façon d’utiliser les capacités du trieur pour enrichir les populations animales en fonction de la composition du microbiome intestinal. Des exemples d’applications potentielles seront présentés dans le cadre du protocole, y compris le potentiel d’évolutivité vers des applications à haut débit.

Introduction

L’évolution animale est sous l’influence microbienne constante1. À partir de divers microbes présents dans l’environnement, les hôtes animaux acquièrent des partenaires spécifiques2 qui étendent les capacités de l’hôte et déterminent sa physiologie et sa susceptibilité aux maladies3. Par exemple, les analyses métagénomiques du microbiome intestinal ont révélé des classes métaboliques enrichies de gènes microbiens qui peuvent conférer une plus grande récolte et stockage d’énergie chez les souris obèses4, dont beaucoup se trouvent également dans le microbiome intestinal humain5. Il y a encore un grand besoin d’établir des relations causales et d’identifier les déterminants moléculaires de l’impact du microbiome, bien que les progrès aient été entravés par la complexité du microbiome et la traçabilité des systèmes hôtes au criblage à grande échelle.

L’organisme modèle C. elegans fournit une plate-forme pour faire progresser la compréhension moléculaire des liens entre le microbiome et la physiologie de l’hôte. C. elegans possède 20 cellules intestinales avec une couche muqueuse et des structures de villosités. Ces cellules sont dotées d’abondants gènes chimiorécepteurs qui détectent les produits microbiens et produisent des molécules antimicrobiennes qui régulent potentiellement leurs colonisateurs intestinaux 6,7. Cette biologie conservée de C. elegans a conduit à un grand nombre de découvertes dans la signalisation de l’hôte qui régule les microbes intestinaux, y compris la signalisation de l’insuline, le TGF-bêta et la MAP Kinase 8,9,10.

C. elegans utilise les microbes à la fois comme régime alimentaire pour la croissance pendant le développement et comme microbiome à l’âge adulte. Avec l’âge, certains microbes peuvent s’accumuler trop dans la lumière intestinale et la relation hôte-microbe passe de la symbiose à la pathogenèse11. Dans son habitat naturel, C. elegans rencontre un large éventail d’espèces bactériennes12,13. Le séquençage de l’ADNr 16S à partir d’échantillons représentatifs prélevés dans des habitats naturels (fruits pourris, tiges végétales et vecteurs animaux) a révélé que le microbiome naturel de C. elegans est dominé par quatre phylums bactériens : les protéobactéries, les Bacteroidetes, les Firmicutes et les Actinobactéries. À l’intérieur de ces divisions, il y a une grande variation dans la diversité et la richesse des bactéries en fonction de l’habitat12,13,14,15. Plusieurs communautés définies ont été établies, y compris les collections de 63 membres (BIGbiome)16 et de 12 membres (CeMbio) représentant les principaux genres de microbiome créés pour la communauté de recherche de C. elegans 17. Les microbiomes et les souches constitutives peuvent avoir un impact diversifié sur la physiologie de C. elegans, comme la taille corporelle, les taux de croissance et les réponses au stress 9,16,17. Ces études fournissent des ressources et des exemples pour établir C. elegans comme modèle pour la recherche sur le microbiome.

Ici, un flux de travail basé sur un grand trieur de particules (LPS) (Figure 1) est présenté qui utilise le système C. elegans pour mesurer simultanément la composition du microbiome et les mesures de base de la physiologie de l’hôte à l’échelle de la population. Du côté microbien, le flux de travail est adaptable pour assembler un microbiome défini ou des microbes uniques afin de tester la robustesse et la plasticité de la communauté avec des interactions microbiennes croissantes. Du côté de l’hôte, le flux de travail permet des tests à haut débit pour mesurer les niveaux de colonisation des microbes fluorescents dans le microbiome et la lecture physiologique de l’hôte en termes de développement, de taille corporelle et de reproduction. Dans l’ensemble, le modèle de microbiome de C. elegans permet à des criblages à haut débit d’identifier les déterminants métaboliques et génétiques modulant la physiologie de l’hôte.

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Protocol

1. Préparation du mélange de microbiome

  1. Tamponnez ou éliminez les bactéries d’un stock de glycérol de congélation sur une plaque de bouillon de lysogénie (LB) ou un milieu de croissance approprié, et cultivez pendant la nuit à une température optimale en fonction des souches bactériennes d’intérêt (généralement 25 °C pour les microbes naturels de C. elegans ).
  2. À partir de la plaque LB, utiliser une seule colonie de chaque isolat bactérien (p. ex., 12 bactéries de la collection CeMbio) pour inoculer 800 μL de milieu LB dans des puits séparés d’une plaque à puits profond de 1 mL. Incuber toute la nuit à la température optimale en agitant à 250 tr/min.
    REMARQUE : Ce protocole est optimisé pour une utilisation avec des microbiomes naturels définis (par exemple, CeMbio), mais peut être facilement ajusté pour les microbes individuels par croissance dans des conditions appropriées ou d’autres récipients de culture (tubes).
  3. Évaluez la croissance de chaque microbe par spectrophotométrie. Transférez une aliquote de 20 μL dans 80 μL de LB et ajoutez la solution dans une plaque transparente à fond plat à 96 puits. Mesurez le diamètre extérieur600 sur un lecteur de plaques.
  4. Après une nuit de croissance, centrifugez la plaque de culture à puits profond à 4 000 x g pendant 10 min pour granuler les bactéries et éliminer le surnageant par aspiration à l’aide d’un collecteur d’aspiration à 96 puits ou d’une pipette multicanaux.
  5. À l’aide des valeurs de OD 600, normaliser la concentration de chaque microbe à un OD600 final de 1,0 en utilisant un milieu stérile M9.
  6. S’il s’agit d’une combinaison de microbes, déterminez la quantité de culture bactérienne nécessaire à l’expérience et créez un mélange maître de microbiome en combinant des volumes égaux de chaque souche bactérienne dans un tube de taille suffisante (p. ex., des tubes de 5 ml ou de 15 ml).
  7. Placer 30 à 50 μL de microbes avec un diamètre extérieur final de600 de 1,0 au centre de chaque milieu de croissance des nématodes (NGM), une plaque de gélose contenant ou un puits18. Laissez le microbiome ensemencé se développer pendant la nuit à une température optimale (25 °C ici).
    REMARQUE : Préparez les plaques de gélose NGM à l’avance conformément aux instructions du Wormbook ou en utilisant de la poudre NGM prémélangée18. Par exemple, 3 mL de NGM sont ajoutés pour les plaques à 12 puits, et 1,5 mL est ajouté pour les plaques à 24 puits.

2. Préparation de C. elegans synchronisés pour la croissance sur le microbiome

  1. Cultivez environ 100 vers sur des plaques NGM (6 cm de diamètre) ensemencées d’Escherichia coli OP50, jusqu’à ce que les vers atteignent l’âge adulte gravide. Aux fins de ce protocole, la souche N2 de C. elegans a été utilisée, bien que le protocole puisse facilement être adapté à d’autres souches de nématodes.
  2. Ajouter 6 mL de tampon M9 (plus 0,01 % de triton X-100 ; M9-TX) à la plaque, en pipetant de haut en bas pour éliminer environ 100 vers adultes gravides dans un tube conique de 15 ml.
  3. Préparez une solution d’eau de Javel fraîchement préparée en mélangeant deux parties d’eau de Javel avec une partie de 5 M de NaOH.
  4. Centrifuger les vers à 3 000 x g pendant 30 s pour granuler les vers. Aspirer pour ramener le volume à 4 mL, puis ajouter 2 mL de solution d’eau de Javel.
  5. Fermez bien le couvercle et secouez le tube. Surveillez les vers adultes dans la solution sous un microscope stéréoscopique à un grossissement de 10x. Lorsque les corps adultes commencent à se désagréger, généralement après 3,5 minutes, arrêtez de secouer et centrifugez à 3 000 x g pendant 30 s.
  6. Aspirer jusqu’à un volume minimal à l’aide d’une pipette. Resuspendez, centrifugez et aspirez quatre fois dans le M9-TX pour éliminer l’eau de Javel.
  7. Remettre en suspension 4 à 6 mL de M9-TX et placer le tube sur un rotateur pendant la nuit, en permettant aux œufs d’éclore et de se synchroniser au stade L1.
  8. Le lendemain, prélevez 10 μL de vers L1 dans M9-TX dans le tube et déposez-les sur une boîte de Pétri propre. Comptez le nombre de vers L1 vivants sous un stéréomicroscope à un grossissement total de 20x.
  9. Sur la base de la densité L1, pipeter le volume approprié pour déposer ~50 larves L1 synchronisées sur le bord des plaques NGM ensemencées dans le microbiome et incuber à 20 °C. Laissez les vers grandir jusqu’à l’âge souhaité (jour 2 ou jour 3 de l’âge adulte).

3. Collecte de la population de vers pour les analyses du microbiome intestinal

  1. Lavez les vers de la pelouse bactérienne avec 1 à 2 mL de M9-TX dans une assiette creuse stérilisée de 2 mL à 96 puits.
    REMARQUE : Pour les souches microbiennes qui créent des biofilms importants, secouez la plaque avec du liquide pendant 5 minutes pour briser les débris microbiens.
  2. Centrifuger la plaque à puits profond à 300 x g pendant 1 min pour granuler les vers, puis retirer le liquide à l’aide d’un collecteur d’aspiration.
    REMARQUE : Les utilisateurs peuvent utiliser une pipette multicanaux pour retirer manuellement le liquide si un collecteur d’aspiration n’est pas disponible. Assurez-vous que les pointes des pipettes ne touchent pas le fond des puits pour éviter la perte d’échantillons de vers.
  3. Ajouter 1,8 mL de M9-TX dans chaque puits de la plaque à puits profond à l’aide d’une pipette multicanal de 1,2 mL. Mélangez en pipetant de haut en bas plusieurs fois et centrifugez à 300 x g pendant 1 min. Répétez cette étape quatre fois pour éliminer les bactéries présentes dans le liquide.
  4. Après le lavage final, porter le volume dans chaque puits à 100 μL à l’aide du collecteur d’aspiration.
    REMARQUE : Pour séparer les adultes des larves par gravité, laissez la plaque sur le banc pendant 30 à 60 s, permettant aux vers adultes de couler au fond du puits. Ensuite, aspirez la plaque pour éliminer les larves de la suspension.
  5. Ajouter 100 μL de lévamisole 10 mM dans M9-TX dans chaque puits et laisser les vers se paralyser pendant 5 min. Après le traitement au lévamisole, ajouter 4 % de la solution d’eau de Javel décrite à l’étape 2.3 dans chaque puits pendant 2 minutes pour réduire les amas bactériens, si nécessaire. Laver avec M9-TX deux fois après le traitement à l’eau de Javel et aspirer jusqu’à un volume final de 100 μL après le deuxième lavage.
  6. Transférez les vers dans une plaque à fond plat à 96 puits contenant 150 μL de lévamisole de 10 mM dans le M9-TX. Maintenez la densité de vers à 50-100 par puits et divisez les vers en plusieurs puits si la population est trop surpeuplée.

4. Mise en place du trieur de particules de grande taille et de l’échantillonneur automatique

  1. Mettez le compresseur d’air, l’ordinateur et l’instrument LPS sous tension. Vérifiez et videz le réservoir à déchets. Ensuite, ajoutez 500 ml d’eau de Javel dans le réservoir à déchets vide. Vérifiez et remplissez la gaine et les réservoirs d’eau si le volume est faible. Assurez-vous que l’ensemble de noyau fluidique et optique (FOCA) de 250 μm est en place.
  2. Exécutez les particules de contrôle pour le contrôle de la qualité. Ouvrez le logiciel de l’instrument LPS. Dans la fenêtre du logiciel, cochez la case Activer les lasers pour activer les lasers 488 nm et 561 nm.
    REMARQUE : Il est possible de sauter les étapes 4.2 à 4.5 si les particules témoins ont été exécutées au cours des 2 semaines précédentes et que l’OFAC n’a pas été modifiée pendant cette période.
  3. Sélectionnez Configurer > particules de contrôle. Sélectionnez Non dans l’invite pour accéder aux paramètres par défaut. Vortex les particules témoins (10 mL dH, 2O et 10 mL de particules témoins dans un tube conique de 50 mL) avant chaque utilisation et chargez-les sur l’orifice d’échantillonnage.
  4. Lorsque vous êtes prêt, cliquez sur Acquérir pour enregistrer 500 événements. Assurez-vous que le taux d’événements est compris entre 15 et 30 événements/s.
    REMARQUE : Si le taux d’événements n’est pas de 15 à 30 événements/s, un ingénieur doit être contacté pour ajuster les paramètres de la machine.
  5. Examinez le coefficient de variation (CV) pour tous les paramètres. Si le CV < 15%, le contrôle qualité est réussi et le logiciel LPS peut être fermé. Si le CV > de 15 %, exécutez à nouveau et ajustez les micromètres avec des particules de contrôle fraîchement fabriquées pour aligner le laser avec la cellule d’écoulement.
  6. Connectez et allumez l’échantillonneur automatique. Ouvrez le logiciel de l’instrument de l’échantillonneur automatique. L’échantillonneur automatique et le logiciel LPS s’ouvrent. Dans la fenêtre du logiciel LPS, accédez à Fichier > Nouvelle expérience, puis Fichier > nouvel échantillon. Cochez la case Activer les lasers pour activer les lasers 488 nm et 561 nm si cela n’a pas déjà été fait.
  7. Créez des modèles pour les diagrammes de points d’acquisition à l’aide du temps de vol (TOF), de l’extinction (EXT) et des canaux fluorescents dans la fenêtre du logiciel LPS. Un bon nombre maximum de départ pour capturer tous les vers est de 8 000 pour TOF et EXT. Les échelles de fluorescence varient en fonction de chaque microbe. Inclure des échantillons de vers témoins cultivés sur des microbes non fluorescents (p. ex., OP50) et chaque microbe fluorescent seul (si des microbes sont mélangés) comme témoins dans chaque expérience.
    1. Cliquez avec le bouton droit de la souris dans le corps d’un graphique pour modifier la mise à l’échelle. Utiliser des animaux témoins, tels que des adultes du jour 1 ou des L1 synchronisés (ou population d’intérêt) pour aider à la sélection des contrôles TOF et EXT.
  8. Dans la fenêtre de l’échantillonneur automatique, sélectionnez Prime. Accédez à Fichier > Ouvrir le script pour sélectionner le script intégré approprié, puis cliquez sur OK.
    1. À des fins d’analyse uniquement, sélectionnez le script à l’aide de l’option Acquérir. Pour le tri, sélectionnez le script avec Dispense. Pour l’acquisition à partir de plaques à 96 puits, sélectionnez le script à 96 puits ; Pour l’acquisition à partir de plaques à 384 puits, sélectionnez le script à 384 puits. Pour le volume d’échantillon (40 ou 100 μL), sélectionnez le script avec le volume correspondant.
  9. Accédez à Modèle de plaque dans le menu du logiciel de l’échantillonneur automatique pour sélectionner les puits souhaités pour l’analyse. Chargez les échantillons témoins. Une fois la plaque chargée sur la platine de l’échantillonneur automatique et sécurisée, appuyez sur Run Plate dans la fenêtre de l’échantillonneur automatique. Enregistrez le fichier lorsque vous y êtes invité.
    REMARQUE : Les échantillons de contrôle et les réglages peuvent être effectués avec un tube conique de 50 ml sur l’orifice d’échantillonnage LPS avant de fixer l’échantillonneur LP.
  10. Lorsque l’acquisition est terminée, cliquez sur le bouton Stocker les données sur le ruban supérieur de la fenêtre du logiciel LPS et enregistrez à nouveau les données .

5. Analyse des caractéristiques de C. elegans et des niveaux de microbiome intestinal par animal

  1. Les données brutes sont stockées dans trois types de fichiers : .lmd, .bxr3, .txt. Chargez le fichier texte intitulé .txt file dans le programme R pour analyse. Suivez les étapes ci-dessous dans la section R19.
  2. Utilisez le package tidyverse20 comme cadre pour l’analyse.
  3. À l’aide de la fonction ggplot (incluse dans tidyverse), tracez les données LPS en utilisant les valeurs TOF comme axe des x et les valeurs EXT comme axe des y. Un tracé normal montrera deux nuages de points. Assurez-vous que l’un d’entre eux est proche de l’origine et de l’axe des abscisses, ce qui indique les particules plus petites telles que les larves et les petits débris, et que le deuxième groupe de particules se trouve dans le coin supérieur droit du graphique et représente les nématodes adultes.
  4. À l’aide de ce regroupement, choisissez les valeurs limites TOF et EXT adéquates. Le déclenchement peut varier selon les souches de C. elegans sur différents microbes en fonction des changements physiologiques (p. ex., les animaux foncés par rapport aux animaux clairs ou les changements dans le transport des œufs peuvent modifier les coefficients EXT).
  5. Utilisez le sous-ensemble de fonctions pour séparer les adultes et les larves par TOF et EXT. Dans l’exemple ci-dessous, utilisez TOF > 1 200 paramètres et EXT > 1 000 pour contrôler les animaux adultes.
  6. Analyser les ensembles de données qui en résultent pour déterminer les différences statistiques ; utilisez la fonction t-test dans R pour cette expérience.
    1. Pour déterminer l’impact du microbiome sur la taille et la densité optique de C. elegans, comparez les valeurs TOF et EXT, respectivement, entre les conditions. Le TOF est un indicateur de la taille des vers et peut indiquer des changements dans les taux de croissance des animaux à des moments précis. Les changements EXT sont les plus importants entre la fin du développement et l’âge adulte en raison de la lumière diffusée par les œufs et peuvent être utilisés pour évaluer les changements dans le moment de cette transition et de la fécondité. Évaluer la proportion et la répartition de la descendance si elle a été retenue au cours des analyses.
    2. Pour déterminer les changements dans les niveaux de colonisation du microbiome intestinal, normalisez d’abord les valeurs de fluorescence (par exemple, les colonnes rouges ou vertes) en divisant par les valeurs de TOF individuelles pour chaque animal. Au fur et à mesure que les vers grossissent et deviennent adultes, le volume de leur intestin augmente également. La normalisation permet de réduire les artefacts dus aux différences dans la distribution de la taille des échantillons. Utilisez des animaux normalisés pour évaluer les changements dans la colonisation du microbiome intestinal dans toutes les conditions.
      REMARQUE : Un exemple de données brutes et les scripts R correspondants se trouvent dans le fichier supplémentaire 1 JOVE_worm_microbiome.txt et le fichier supplémentaire 2 JOVE_worm_microbiome.r. Voir la figure 2 et la figure 3 pour un exemple représentatif de ces analyses de l’hôte et du microbiome à l’aide de deux bactéries fluorescentes.

6. Tri des animaux C . elegans selon les caractéristiques du microbiome intestinal

  1. Prélever une population de C. elegans cultivée sur des microbes marqués par fluorescence (p. ex., RFP) comme décrit à l’étape 3. Les vers doivent être placés dans des tubes coniques de 50 mL avec au moins 5 mL d’échantillon. Visez environ 2 000 vers/mL, y compris tous les adultes et la progéniture.
    REMARQUE : Cela peut également être fait dans une plaque à fond plat de 96 puits à l’aide de l’échantillonneur LP. Maintenez la densité de vers entre 50 et 100 par puits.
    1. Si un échantillonneur LP a été utilisé, éteignez et débranchez l’échantillonneur LP. Reconnectez les lignes d’échantillonnage et de purge au LPS avant le tri.
  2. Ouvrez le logiciel LPS, allez dans Fichier > Nouvelle expérience, puis Fichier > nouvel échantillon. Créez un diagramme à points avec TOF sur l’axe des abscisses et Extinction sur l’axe des ordonnées. Créez un autre diagramme de points avec TOF sur l’axe des abscisses et rouge sur l’axe des y. Utilisez les mêmes paramètres d’échelle d’axe et de laser que précédemment. Cochez la case Activer les lasers pour activer les lasers 488 nm et 561 nm
    REMARQUE : Si ces tracés ont déjà été créés, accédez à Fichier > Ouvrir l’expérience et Fichier > Ouvrir l’échantillon pour charger les graphiques.
    1. Placez le tube d’échantillon de contrôle sur l’orifice d’échantillonnage. Dans la boîte de dialogue Acquérir/Distribuer, cliquez sur Acquérir. Enregistrez le fichier lorsque vous y êtes invité. Une fois qu’un nombre suffisant de vers a été mesuré pour distinguer les populations, cliquez sur Abandonner.
      REMARQUE : Les débits doivent être d’environ 15 à 30 événements/s. Si ce n’est pas le cas, ajustez les concentrations de vers pour vous assurer que les animaux individuels sont analysés ou triés par gouttelette. Dans le LPS, les vers traversent la trajectoire du laser dans différentes positions (droites ou enroulées ou courbées). Ils peuvent prendre un temps différent pour passer le laser et le détecteur en fonction de leurs positions.
    2. Dans le diagramme à points TOF vs Extinction, tracez une barrière autour de la population adulte. Dans le diagramme TOF vs Red dot, dessinez des portes autour des zones avec des valeurs rouges élevées et faibles comme régions d’intérêt pour les vers adultes avec différents niveaux de colonisation du microbiome. Accédez à Afficher > hiérarchie des portes et assurez-vous que les portes fluorescentes sont répertoriées sous la porte de la population adulte. Une fois les paramètres optimisés, accédez à Fichier > Enregistrer l’expérience et Fichier > Enregistrer l’échantillon.
      REMARQUE : Dans l’exemple ci-dessous, sélectionnez les animaux en fonction des portes TOF/EXT pour les adultes et triez-les dans les bassins qui présentent une colonisation élevée ou faible par des bactéries fluorescentes exprimant des protéines rouges. Cependant, toute combinaison de paramètres mesurés par l’EPL peut être utilisée pour identifier la ou les populations d’intérêt.
  3. Avant le tri, assurez-vous que l’appareil de collecte approprié a été chargé. Pour charger la plaque à 96 puits sur l’appareil de collecte, sélectionnez Plaque de charge A > Déplacer sous la section Déplacer l’étape de déplacement de la boîte de dialogue Acquisition/Distribution pour permettre à l’étape de collecte de se déplacer dans une position préparée pour le chargement d’une plaque à 96 puits.
  4. Pour le tri en vrac, sélectionnez la taille de tube appropriée et cliquez sur Déplacer pour charger un tube conique de 15 ml ou de 50 ml. Dans la section Tri de la boîte de dialogue Acquisition/Distribution, choisissez la porte de tri dans la liste déroulante des régions créées. Entrez le nombre d’objets de la région définie à distribuer dans un tube de collecte directement sous la buse de la cellule d’écoulement. Cliquez sur le bouton Trier en bloc dans la boîte de dialogue Acquérir/Distribuer.
  5. Pour la distribution sur une plaque à 96 puits, reportez-vous à Configuration > plaques > plaques calibrées > plaque à 96 puits. Accédez ensuite à Afficher > modèle de plaque, sélectionnez les puits dans lesquels les vers seront triés, saisissez le nombre d’objets à trier dans chaque puits et sélectionnez les régions fermées d’intérêt. Si plus d’une région fermée doit être triée dans la même plaque, cochez la case Gate Each Well. Cliquez sur OK pour enregistrer les modifications.
  6. Une fois que les numéros de tri et les emplacements ont été attribués, cliquez sur les boutons Plaque de remplissage dans la boîte de dialogue Acquérir/Distribuer pour lancer la distribution sur une plaque à 96 puits.
    1. Avant de remplir l’ensemble de la plaque à 96 puits, effectuez un test de tri d’un sous-ensemble d’animaux ou de témoins dans une plaque à 96 puits et analysez-la à l’aide d’un stéréomicroscope pour vous assurer que le nombre approprié et les populations animales souhaitées ont été triés. Une fois que l’exactitude du tri a été confirmée, répétez les étapes 6.3 à 6.6 pour les échantillons expérimentaux. Cliquez sur le bouton Stocker les données sur le ruban supérieur de la fenêtre du logiciel LPS pour enregistrer à nouveau les données .
      REMARQUE : Toutes les mesures (EXT, TOF, RFP, GFP, etc.) peuvent également être collectées pour les animaux triés et comparées à celles qui n’ont pas été triées. Cela peut permettre d’exécuter les modes d’analyse et de tri en même temps si vous le souhaitez.

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Representative Results

Définition des portes des populations d’adultes et de larves
Ici, des C. elegans L1 synchronisés ont été cultivés sur une plaque NGM ensemencée avec E. coli OP50 (Eco), un régime alimentaire standard de laboratoire. Les populations de C. elegans ont été prélevées pour l’analyse LPS après 96 h ou 120 h de croissance à 20 °C (figure 2A). Un diagramme à points de l’extinction (EXT, un indicateur de la densité corporelle) en fonction du temps de vol (TOF, un indicateur de la longueur du corps) crée deux nuages d’animaux visuellement séparés. Chaque point représente un seul animal pour lequel les valeurs EXT et TOF sont plus élevées chez les adultes que chez les larves (figure 2B). Ces deux paramètres sont des inférences précieuses pour la croissance et la physiologie de la population. Par exemple, un diagramme de densité de larves TOF permet de visualiser la distribution des stades larvaires. Les descendants d’adultes âgés de 2 jours étaient dominés par les stades L1 et L2 avec un TOF inférieur à 200, tandis que la plupart des descendants d’adultes âgés de 3 jours atteignaient les stades L3 et L4 (figure 2C). De plus, les diagrammes de densité 2D et de moustaches en forme de boîte sont utiles pour visualiser les changements dans la taille et la densité du corps adulte, car les valeurs de TOF et d’EXT augmentent au jour 3 par rapport au jour 2 lorsqu’elles sont cultivées sur E. coli (figure 2D-F). Cette relation est généralement linéaire à l’âge adulte, mais certains changements physiologiques peuvent avoir un impact sur une caractéristique plus qu’une autre (par exemple, les adultes sans œufs peuvent avoir des valeurs EXT plus faibles sans affecter le TOF).

Profilage de la composition du microbiome intestinal à l’aide de microbes marqués par fluorescence
Afin d’illustrer différents niveaux de colonisation, nous comparons un colonisateur dominant du microbiome naturel de C. elegans : Ochrobactrum BH3 (Och) marqué à la tomate et E. coli OP50 marqué à la protéine fluorescente verte (GFP). Ces deux éléments ont été ensemencés individuellement et dans un mélange égal basé sur le diamètre extérieur (mélange 1 :1) sur la plaque NGM. Des C. elegans L1 synchronisés ont été cultivés dans les trois conditions et prélevés à 120 h pour examiner la dynamique de colonisation chez les adultes âgés de 3 jours (figure 3A). Des diagrammes 2D de densité et de moustaches en forme de boîte ont montré qu’il existe des différences dans les valeurs de TOF et d’EXT chez les adultes lorsque C. elegans est cultivé sur Ochrobactrum BH3 et dans des cultures mixtes (figure 3B-E). La colonisation intestinale des bactéries peut être déduite du niveau de fluorescence détecté chez les nématodes individuels. Des diagrammes en forme de moustache de lecture fluorescente rouge montrent une colonisation accrue d’Ochrobactrum BH3 dans les conditions de mélange que dans Ochrobactrum BH3 seul. En revanche, les valeurs de fluorescent vert indiquent une colonisation OP50 plus faible dans les conditions de mélange que dans OP50 seul. Des tendances similaires sont observées dans les signaux fluorescents normalisés par TOF, ce qui élimine l’effet de la taille corporelle et réduit la variation au sein de la population (figure 3F-I). Pour un microbiome défini avec plusieurs microbes marqués par fluorescence, un diagramme à points peut illustrer les modèles de colonisation de ces microbes. Par exemple, dans le microbiome mixte à deux membres, un diagramme à points de la protéine fluorescente rouge (RFP) par rapport aux canaux GFP montre que les vers sont fortement biaisés vers l’axe des ordonnées (RFP), ce qui suggère que la colonisation OP50 est faible chez la plupart des vers, tandis que les niveaux de colonisation par Ochrobactrum BH3 sont uniformément répartis dans la population (Figure 3J). De même, un diagramme à points de RFP par rapport à EXT peut révéler la relation entre les niveaux de colonisation d’Ochrobactrum BH3 et le développement de l’hôte, comme la densité corporelle (Figure 3K). De plus, les différences dans les profils de reproduction peuvent être observées en traçant le graphique de densité de la population de larves respective sur les trois conditions (figure 3L).

Enrichissement pour les populations ciblées en fonction de la colonisation du microbiome
Les adultes âgés de 3 jours cultivés sur le microbiome mixte à deux membres présentent une large gamme d’intensité RFP, ce qui indique des variations individuelles dans la colonisation d’Ochrobactrum BH3 au sein du groupe (Figure 4A). Pour séparer davantage ces sous-groupes, des vannes de tri pour les RFP haut et bas ont été dessinées manuellement pour trier 15 personnes de chaque porte dans une plaque de 96 puits, comme le montre l’image RFP de l’ensemble du puits (figure 4B). Sous un grossissement plus élevé, des images superposées de champs clairs et de canaux RFP confirment que la méthode de tri sélectionne les vers colonisés par Ochrobactrum BH3 à haut et à faible niveau, ce qui permet une caractérisation plus poussée des conséquences phénotypiques et des facteurs moléculaires (Figure 4C).

Figure 1
Figure 1 : Organigramme des méthodes basées sur la vermimétrie de flux pour évaluer le microbiome intestinal et la physiologie de l’hôte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Définition des populations d’adultes et de larves. (A) Un flux de travail pour collecter les populations de C. elegans aux jours 2 et 3 de l’âge adulte. (B) Diagramme à points du temps de vol (TOF) en fonction de l’extinction (EXT) pour les populations de C. elegans au jour 2 (gris) et au jour 3 (rouge) de l’âge adulte. (C) Graphique de densité des larves TOF aux jours 2 et 3 de l’âge adulte. (D-E) Diagrammes en points et en boîte et moustaches de TOF par rapport à EXT pour les adultes aux jours 2 et 3 de l’âge adulte. (F) Graphique en forme de boîte et de moustaches de l’extinction des adultes aux jours 2 et 3 de l’âge adulte. Les valeurs de p ont été calculées à l’aide du test t de l’étudiant (*** p < 0,001 ; Jour 2 n = 38 ; Jour 3 n = 88). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Profilage de la colonisation du microbiome intestinal à l’aide de microbes marqués par fluorescence. (A) Collecte de populations d’adultes âgés de 3 jours cultivées sur Ochrobactrum BH3 (dExpression de la tomate ; Och), E. coli OP50 (exprimant la GFP ; Eco) ou un mélange 1 :1 des deux bactéries (mélange). (B) Diagramme à points du TOF par rapport à l’EXT pour les adultes du jour 3 cultivés sur le mélange. (C-E) Diagrammes en points et en boîte et moustaches de TOF par rapport à EXT pour des adultes de 3 jours cultivés sur Ochrobactrum BH3. Les lignes pointillées grises indiquent la valeur moyenne de la population cultivée sur l’OP50. (F-G) Graphique en boîte et en moustaches des valeurs de dTomato (RFP) brutes et normalisées par TOF pour des adultes de 3 jours cultivés uniquement avec Mix et Ochrobactrum BH3. (H-I) Parcelles de GFP brute et normalisée par TOF pour des adultes de 3 jours cultivés sur mélange et OP50. (J) Diagramme à points d’Ochrobactrum BH3 (RFP) par rapport à E. coli OP50 (GFP) pour des adultes âgés de 3 jours cultivés sur mélange. (K) Diagramme à points de RFP par rapport à EXT pour les adultes de 3 jours cultivés sur mélange. (L) Parcelle de densité des larves d’adultes âgés de 3 jours cultivées sur un mélange d’Ochrobactrum BH3 et d’OP50. Toutes les valeurs de P ont été générées à partir du test t de Student (*** p < 0,001 ; ** p < 0,01 ; n.s., non significatif ; mélange n = 230 ; Och n = 45). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Enrichir les populations ciblées en fonction de la colonisation du microbiome. (A) Diagramme à points du TOF par rapport au RFP (Ochrobactrum BH3) pour les adultes âgés de 3 jours. Des portes RFP hautes (boîte rouge) et basses (boîte noire) sont dessinées pour enrichir C. elegans avec une colonisation élevée et basse d’Ochrobactrum BH3. (B) Images RFP représentatives (4x) des puits contenant 15 vers triés des vannes RFP hautes et basses (Bar = 1 mm). (C) Images représentatives (10x) de vers individuels provenant de portes RFP hautes et basses (Bar = 100 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Ensemble de données représentatif généré par un trieur de particules de grande taille pour les populations de N2 à l’âge adulte aux jours 2 et 3 cultivées sur E. coli OP50 et Ochrobactrum BH3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Scripts utilisés dans l’analyse et la génération de figures d’un jeu de données représentatif dans l’environnement R. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

La vermimétrie en flux a été utilisée pour caractériser les gènes et les voies de C. elegans contre la colonisation et la toxicité des agents pathogènes dans plusieurs études21,22. Ici, une approche à haut débit est présentée qui utilise C. elegans pour étudier comment les microbiomes intestinaux modulent la physiologie de leur hôte. Par rapport aux méthodes existantes utilisant des unités formant colonie (UFC) ou le séquençage d’amplicon d’ARNr 16S 9,16,17,23,24, cette approche ne nécessite pas de comptage à forte intensité de main-d’œuvre et n’introduit pas de biais potentiel de PCR. En plus de mesurer les microbiomes d’une population entière, cette approche permet aux utilisateurs de visualiser les variations individuelles au sein de la population. Cette approche n’est limitée que par la disponibilité de l’expression de protéines fluorescentes ou de la coloration des microbes et par le nombre de canaux de détection dans le LPS. D’autres considérations relatives à la conception expérimentale sont abordées ci-dessous afin que les utilisateurs puissent créer un flux de travail personnalisé en fonction de leurs besoins.

Considérations relatives à la création et à l’ensemencement d’un microbiome défini
Tout d’abord, chaque culture bactérienne est normalisée à une valeur OD600 de 1 avant de mélanger différentes souches. Il convient de noter que, selon la complexité de la communauté et les relations interspécifiques, la densité de départ peut avoir divers impacts sur la composition établie du microbiome23. Bien que la DO puisse être facilement mesurée par des spectrophotomètres, une mise en garde est que différentes bactéries auront des concentrations différentes (par exemple, le nombre de cellules par mL) pour la même valeur de DO et doivent être ajustées en conséquence. Deuxièmement, la variation de la composition du microbiome dans les pelouses doit être prise en compte. Une fois que le microbiome est ensemencé sur la plaque NGM (ou d’autres milieux), on laisse le microbiome se développer pendant la nuit à température ambiante avant de déposer des populations synchronisées de L1 C. elegans sur les plaques. En raison des variations des taux de croissance et des interactions interspécifiques entre les souches bactériennes, les microbiomes cultivés sur des plaques NGM ou sur toute plaque avec des substrats pour la croissance différeront en composition du mélange de graines d’origine. L’utilisation d’une plaque NGM sans peptone permet de préserver la communauté microbienne d’origine13. Cependant, en raison de la croissance limitée du microbiome sur la plaque sans peptone, une OD d’ensemencement plus élevée ou un nombre réduit de L1 synchronisés par plaque peuvent être nécessaires. Cela permet d’éviter que la population ne meure de faim avant d’avoir atteint l’âge souhaité pour le test. Une autre approche consiste à séquencer ou à déterminer la proportion de microbes dans la pelouse.

Mesure de la colonisation du microbiome et de la physiologie de C. elegans
Tout d’abord, les seuils d’extinction (EXT) et de temps de vol (TOF) pour les adultes peuvent varier en fonction de l’âge, du contexte de la souche de C. elegans et des microbes sur lesquels ils sont cultivés. Le fait d’avoir une population adulte âgée d’un jour dans l’expérience pour chaque condition vermifuge/bactérienne peut être utile pour déterminer les seuils de TOF et d’extinction ainsi que pour contrôler la variation due au milieu de croissance et à l’environnement. En plus de l’approche pour les adultes, le TOF et l’EXT peuvent être appliqués à la porte des larves, et un diagramme de densité de la progéniture permet d’estimer le moment et le rendement de la reproduction à l’échelle de la population (figure 3L). Deuxièmement, les gains PMT et la tension sur le LPS doivent être ajustés pour maximiser le rapport signal/bruit et régler la plage du signal pour éviter la saturation. Cela dépend de l’intensité fluorescente des souches bactériennes et de leur niveau de colonisation. Le PMT par défaut à 350 fonctionne bien pour les colonisateurs élevés tels que Ochrobactrum BH3, mais les utilisateurs peuvent avoir besoin d’augmenter les valeurs de PMT ou de tension pour les colonisateurs faibles tels que E. coli OP50. Troisièmement, en raison des différences dans les propriétés des fluorophores et leurs niveaux d’expression dans les souches bactériennes transgéniques, les valeurs fluorescentes ne reflètent pas le nombre absolu de bactéries présentes dans le microbiome. Par conséquent, les valeurs GFP et RFP ne peuvent pas être utilisées pour comparer directement la colonisation entre deux microbes fluorescents différents. La perturbation et le placage des animaux pour identifier les comptes de bactéries vivantes peuvent aider à mieux résoudre ces relations24.

Applications potentielles des stratégies basées sur l’enrichissement
Cette méthode fournit une plate-forme à haut débit pour étudier l’impact des changements du microbiome sur la physiologie de l’hôte à l’échelle de la population. Sur le plan microbien, la disponibilité croissante d’outils et de ressources pour modifier les génomes bactériens25,26,27 augmentera le nombre de mutants microbiens fluorescents et fonctionnels liés au microbiome naturel de C. elegans. Du côté de l’hôte, de nombreux rapporteurs fluorescents sont disponibles pour explorer le lien entre la signalisation cellulaire et la composition du microbiome. La capacité d’enrichir une population hôte ou mutante à partir d’une population mutagène (p. ex., mutagénèse directe EMS)28 ou de souches sauvages regroupées29, avec des caractéristiques spécifiques de colonisation du microbiome, peut considérablement améliorer la capacité de connecter les gènes de l’hôte qui régulent l’impact du microbiome. De plus, la sélection des populations en fonction des caractéristiques de l’hôte et/ou du microbiome peut également faciliter la mise en place d’un cadre de modalités de profilage basées sur les omiques. Cette approche est d’une grande flexibilité et promet de faire progresser la compréhension des médiateurs moléculaires des interactions hôte-microbiome.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH DP2DK116645 (à B.S.S.), une bourse pilote de la Fondation Dunn et une subvention de la NASA 80NSSC22K0250 (à B.S.S.). Ce projet a également été soutenu par le centre de cytométrie et de tri cellulaire du Baylor College of Medicine avec un financement de la bourse de soutien aux installations de base du CPRIT (CPRIT-RP180672), du NIH (S10 OD025251, CA125123 et RR024574) et de l’aide de Joel M. Sederstrom, ainsi que d’une subvention d’instrumentation pour la subvention LPS NIH (S10 OD025251). Certaines souches ont été fournies par le CCG, qui est financé par le Bureau des programmes d’infrastructure de recherche des NIH (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical bottom centrifuge tubes VWR 10026-076
96 deep-well plates (1 mL) Axygen P-DW-11-C
96 deep-well plates (2 mL) Axygen P-DW-20-C
96-well Costar plate Corning 3694
Agar Millipore Sigma Standard bacteriology agar is also sufficient.
Aspirating manifold V&P scientific VP1171A
Bleach Clorox
Bleach solution  Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)
Cell Imaging Multimode Reader Biotek Cytation 5 Bacterial OD measurement
Centrifuge Thermo scientific  Sorvall Legend XTR For 96 well plate and conical tubes
Fluorescent Microscope Nikon TiE
ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. R package Version 3.3.2
Large Particle Autosampler Union Biometrica LP Sampler
Large Particle Sorter Union Biometrica COPAS Biosorter
Levamisole Fisher AC187870100
Lysogeny Broth (LB) RPI L24066 Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.
M9 solution  22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematode Growth Medium RPI N81800-1000.0 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.
RStudio GNU Version 1.3.1093
Sodium hypochlorite Sigma-Aldrich 5M NaOH
Stereo Microscope Nikon SMZ745
Sterile 10 cm diameter petri dishes Corning 351029
Sterile 12-well plates VWR 10062-894
Sterile 24-well plates VWR 10062-896
Sterile 6 cm diameter petri dishes Corning 351007
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

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References

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Biologie Numéro 193 Analyse Microbiome intestinal de Caenorhabditis Elegans Composition Physiologie de l’hôte Changements de composition Relations fonctionnelles Facteurs moléculaires Interactions hôte-microbiome Plan corporel transparent Microbes naturels marqués par fluorescence Niveaux relatifs de microbes Trieur de grandes particules Configuration expérimentale Collecte Analyse Populations de C. elegans Fonctionnement et maintenance du trieur Analyses statistiques Optimisation des paramètres du trieur Stratégies de contrôle efficaces Enrichissement Des populations animales évolutivité vers des applications à haut débit
Application de la vermimétrie de flux pour la quantification et l’analyse du microbiome intestinal de <em>Caenorhabditis elegans</em>
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Zhang, F., Blackburn, D., Hosea, C.… More

Zhang, F., Blackburn, D., Hosea, C. N., Assié, A., Samuel, B. S. Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome. J. Vis. Exp. (193), e64605, doi:10.3791/64605 (2023).

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