Summary
Caenorhabditis elegans är en kraftfull modell för att undersöka de molekylära determinanter som driver värd-mikrobiominteraktioner. Vi presenterar en pipeline med hög genomströmning som profilerar de enskilda djurnivåerna av tarmmikrobiomkolonisering tillsammans med viktiga aspekter av C. elegans-fysiologin.
Abstract
Sammansättningen av tarmmikrobiomet kan ha en dramatisk inverkan på värdens fysiologi under djurets utveckling och liv. Att mäta sammansättningsförändringar i mikrobiomet är avgörande för att identifiera de funktionella sambanden mellan dessa fysiologiska förändringar. Caenorhabditis elegans har dykt upp som ett kraftfullt värdsystem för att undersöka de molekylära drivkrafterna för värd-mikrobiominteraktioner. Med sin transparenta kroppsplan och fluorescerande märkta naturliga mikrober kan de relativa nivåerna av mikrober i tarmmikrobiomet hos ett enskilt C. elegans-djur enkelt kvantifieras med hjälp av en stor partikelsorterare. Här beskriver vi procedurerna för experimentell uppställning av ett mikrobiom, insamling och analys av C . elegans-populationer i önskat livsstadium, drift och underhåll av sorteraren och statistiska analyser av de resulterande datauppsättningarna. Vi diskuterar också överväganden för att optimera sorteringsinställningar baserat på de mikrober som är av intresse, utvecklingen av effektiva grindstrategier för C. elegans livsstadier och hur man kan utnyttja sorteringsfunktioner för att berika djurpopulationer baserat på tarmmikrobiomsammansättning. Exempel på potentiella tillämpningar kommer att presenteras som en del av protokollet, inklusive potentialen för skalbarhet till applikationer med hög genomströmning.
Introduction
Djurens evolution är under konstant mikrobiell påverkan1. Från olika mikrober i miljön får djurvärdar specifika partners2 som utökar värdens kapacitet och driver dess fysiologi och mottaglighet för sjukdomar3. Till exempel avslöjade metagenomiska analyser av tarmmikrobiomet berikade metaboliska klasser av mikrobiella gener som kan ge större energiskörd och lagring hos överviktiga möss4, av vilka många också finns i människans tarmmikrobiom5. Det finns fortfarande ett stort behov av att fastställa orsakssamband och fastställa de molekylära bestämningsfaktorerna för mikrobiomets påverkan, även om framstegen har hämmats av mikrobiomkomplexiteten och hanterbarheten hos värdsystem för storskalig screening.
Modellorganismen C. elegans utgör en plattform för att främja molekylär förståelse av kopplingar mellan mikrobiom och värdfysiologi. C. elegans har 20 tarmceller med ett slemhinneskikt och villistrukturer. Dessa celler är utrustade med rikligt med kemoreceptorgener som känner av mikrobiella produkter och producerar antimikrobiella molekyler som potentiellt reglerar deras tarmkolonisatörer 6,7. Denna bevarade biologi av C. elegans har lett till ett enormt antal upptäckter inom värdsignalering som reglerar tarmmikrober, inklusive insulinsignalering, TGF-beta och MAP-kinas 8,9,10.
C. elegans använder mikrober som både sin diet för tillväxt under utvecklingen och mikrobiom som vuxna. Med hög ålder kan vissa mikrober överackumuleras i tarmlumen och förhållandet mellan värd och mikrob skiftar från symbios till patogenes11. I sina naturliga livsmiljöer stöter C. elegans på ett brett spektrum av bakteriearter12,13. Sekvensering av 16S rDNA från representativa prover som samlats in i naturliga livsmiljöer (ruttna frukter, växtstam och djurvektorer) avslöjade att det naturliga mikrobiomet hos C. elegans domineras av fyra bakteriella fyla: Proteobakterier, Bacteroidetes, Firmicutes och Actinobacteria. Inom dessa indelningar ligger stor variation i mångfalden och rikedomen av bakterier baserat på livsmiljön12,13,14,15. Flera definierade samhällen har etablerats, inklusive samlingarna med 63 medlemmar (BIGbiome)16 och 12 medlemmar (CeMbio) som representerar de bästa mikrobiomsläktena som skapats för C. elegans-forskarsamhället 17. Både mikrobiom och komponentstammar kan ha en varierad inverkan på fysiologin hos C. elegans såsom kroppsstorlek, tillväxthastighet och stressreaktioner 9,16,17. Dessa studier ger resurser och exempel för att etablera C. elegans som en modell för mikrobiomforskning.
Här presenteras ett stort partikelsorterarbaserat arbetsflöde (Figur 1) (Figur 1) som använder C. elegans-systemet för att samtidigt mäta mikrobiomsammansättning och grundläggande mått på värdfysiologi på populationsskala. Från den mikrobiella sidan är arbetsflödet anpassningsbart för att sätta ihop ett definierat mikrobiom eller enskilda mikrober för att testa robustheten och plasticiteten i samhället med ökande mikrobiella interaktioner. Från värdsidan möjliggör arbetsflödet analyser med hög genomströmning för att mäta koloniseringsnivåer av fluorescerande mikrober i mikrobiomet och värdens fysiologiska avläsning när det gäller utveckling, kroppsstorlek och reproduktion. Sammantaget möjliggör mikrobiommodellen för C. elegans skärmar med hög genomströmning för att lokalisera de metaboliska och genetiska determinanter som modulerar värdfysiologin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av mikrobiomblandning
- Stämpla eller strö ut bakterier från en glycerolfrysbuljong på en lysogenibuljong (LB) eller lämpligt odlingsmedium och odla över natten vid en optimal temperatur baserat på bakteriestammar av intresse (vanligtvis 25 °C för naturliga mikrober av C. elegans ).
- Från LB-plattan, använd en enda koloni från varje bakterieisolat (t.ex. 12 bakterier från CeMbio-samlingen) för att inokulera 800 μL LB-medium i separata brunnar på en 1 ml djupbrunnsplatta. Inkubera över natten vid optimal temperatur med skakning vid 250 rpm.
OBS: Detta protokoll är optimerat för användning med definierade naturliga mikrobiom (t.ex. CeMbio), men kan enkelt justeras för enskilda mikrober genom tillväxt under lämpliga förhållanden eller andra odlingskärl (rör). - Bedöm tillväxten av varje mikrob med spektrofotometri. Överför en 20 μl alikvot till 80 μl LB och tillsätt lösningen till en klar platta med 96 brunnar. Mät OD600 på en plattläsare.
- Efter tillväxt över natten, centrifugera djupbrunnsodlingsplattan vid 4 000 x g i 10 minuter för att pelleta bakterier och avlägsna supernatanten genom aspiration med hjälp av ett 96-håls aspirationsgrenrör eller flerkanalspipett.
- Använd OD 600-värden för att normalisera koncentrationen av varje mikrob till en slutlig OD600 på 1,0 med hjälp av sterilt M9-medium.
- Om du kombinerar mikrober, bestäm mängden bakteriekultur som behövs för experimentet och skapa en mikrobiommasterblandning genom att kombinera lika stora volymer av varje bakteriestam till ett rör av tillräcklig storlek (t.ex. 5 ml eller 15 ml rör).
- Placera 30-50 μl av mikroberna med en slutlig OD600 på 1,0 på mitten av varje nematodtillväxtmedium (NGM), agarinnehållande platta eller brunn18. Låt det sådda mikrobiomet växa över natten vid en optimal temperatur (25 °C här).
OBS: Förbered NGM-agarplattor i förväg enligt instruktionerna i Wormbook eller använd färdigblandat NGM-pulver18. Till exempel tillsätts 3 ml NGM för 12-brunnars plattor och 1,5 ml tillsätts för 24-hålsplattor.
2. Beredning av synkroniserad C. elegans för tillväxt på mikrobiomet
- Odla cirka 100 maskar på NGM-plattor (6 cm i diameter) sådda med Escherichia coli OP50, tills maskarna når gravid vuxen ålder. I detta protokoll användes C. elegans N2-stammen, även om protokollet lätt kan anpassas till andra nematodstammar.
- Tillsätt 6 ml M9-buffert (plus 0,01 % triton X-100; M9-TX) till plattan, pipettera upp och ner för att tvätta bort cirka 100 gravida vuxna maskar i ett 15 ml koniskt rör.
- Förbered nygjord blekmedelslösning genom att blanda två delar blekmedel med en del 5 M NaOH.
- Centrifugera maskarna vid 3 000 x g i 30 s för att pelletera maskarna. Aspirera för att få ner volymen till 4 ml och tillsätt sedan 2 ml blekmedelslösning.
- Stäng locket ordentligt och skaka röret. Övervaka de vuxna maskarna i lösningen under ett stereomikroskop vid 10x förstoring. När vuxna kroppar börjar brytas isär, vanligtvis efter 3,5 minuter, sluta skaka och centrifugera vid 3 000 x g i 30 sekunder.
- Aspirera till en minimal volym med en pipett. Suspendera om, centrifugera och aspirera fyra gånger i M9-TX för att tvätta ur blekmedlet.
- Blanda om i 4-6 ml M9-TX och placera röret på en rotator över natten, så att äggen kan kläckas och synkroniseras i L1-stadiet.
- Nästa dag tar du 10 μL L1-maskar i M9-TX från röret och släpper dem på en ren petriskål. Räkna antalet levande L1-maskar under ett stereomikroskop med 20x total förstoring.
- Baserat på L1-densiteten, pipettera lämplig volym för att släppa ~50 synkroniserade L1-larver på kanten av de mikrobiomfröade NGM-plattorna och inkubera vid 20 °C. Låt maskarna växa till önskad ålder (dag 2 eller dag 3 i vuxen ålder).
3. Insamling av maskpopulationer för tarmmikrobiomanalyser
- Tvätta bort maskarna från bakteriegräsmattan med 1-2 ml M9-TX till en steriliserad 2 ml 96-brunns djup tallrik.
OBS: För mikrobiella stammar som skapar betydande biofilmer, skaka plattan med vätska i 5 minuter för att bryta upp mikrobiellt skräp. - Centrifugera djupbrunnsplattan vid 300 x g i 1 minut för att pelletera maskarna och ta sedan bort vätskan med ett aspirerande grenrör.
OBS: Användare kan använda en flerkanalspipett för att manuellt ta bort vätskan om ett aspirerande grenrör inte är tillgängligt. Se till att pipettspetsarna inte vidrör botten av brunnarna för att undvika förlust av maskprover. - Tillsätt 1,8 ml M9-TX till varje brunn på djupbrunnsplattan med hjälp av en 1,2 ml flerkanalspipett. Blanda genom att pipettera upp och ner ett par gånger och centrifugera i 300 x g i 1 min. Upprepa detta steg fyra gånger för att ta bort bakterier i vätskan.
- Efter den sista tvätten, värm volymen i varje brunn till 100 μL med hjälp av suggrenröret.
OBS: För att separera vuxna från larverna med hjälp av gravitationen, lämna plattan på bänken i 30-60 s, så att vuxna maskar kan sjunka till botten av brunnen. Aspirera sedan plattan för att ta bort larver från suspensionen. - Tillsätt 100 μL 10 mM levamisol i M9-TX till varje brunn och låt maskarna förlamas i 5 minuter. Efter behandlingen med levamisol tillsätts 4 % av blekmedelslösningen som beskrivs i steg 2.3 i varje brunn i 2 minuter för att minska bakterieklumpar, om det behövs. Tvätta med M9-TX två gånger efter blekningsbehandlingen och aspirera till en slutlig volym på 100 μL efter den andra tvätten.
- Överför maskarna till en plattbottnad 96-hålsplatta som innehåller 150 μL 10 mM levamisol i M9-TX. Håll masktätheten på 50-100 per brunn och dela upp maskarna i flera brunnar om populationen är för trång.
4. Ställa in storpartikelsorteraren och autosamplern
- Slå på luftkompressorn, datorn och LPS-instrumentet. Kontrollera och töm avfallstanken. Tillsätt sedan 500 ml blekmedel i den tomma avfallstanken. Kontrollera och fyll på mantel och vattentankar om volymen är låg. Se till att 250 μm fluidisk och optisk kärnenhet (FOCA) är på plats.
- Kör kontrollpartiklarna för kvalitetskontroll. Öppna LPS-instrumentets programvara. I programvarufönstret markerar du Aktivera lasrar för att slå på 488 nm och 561 nm lasrar .
OBS: Det är möjligt att hoppa över steg 4.2-4.5 om kontrollpartiklarna har körts under de senaste 2 veckorna och FOCA inte har ändrats under den tiden. - Välj Konfigurera > kontrollera partiklar. Välj Nej i prompten för att gå till standardinställningarna. Vred kontrollpartiklarna (10 ml dH, 2O och 10 ml kontrollpartiklar i ett 50 ml koniskt rör) före varje användning och ladda dem på provporten.
- När du är klar klickar du på Skaffa för att spela in 500 händelser. Se till att händelsefrekvensen är mellan 15 och 30 händelser/s.
OBS: Om händelsefrekvensen inte är 15–30 händelser/s, bör en tekniker kontaktas för att justera maskininställningarna. - Undersök variationskoefficienten (CV) för alla parametrar. Om CV < 15 % godkänns kvalitetskontrollen och LPS-programvaran kan stängas. Om CV > 15 %, kör igen och justera mikrometrar med nygjorda kontrollpartiklar för att rikta in lasern med flödescellen.
- Anslut och slå på autosamplern. Öppna programvaran för autosamplerinstrumentet. Detta öppnar autosamplern och LPS-programvaran. I LPS-programvarufönstret går du till Arkiv > Nytt experiment och sedan Arkivera > nytt exempel. Markera Aktivera lasrar för att slå på 488 nm och 561 nm lasrar om det inte redan har gjorts.
- Skapa mallar för punktdiagram med hjälp av flygtid (TOF), extinktion (EXT) och fluorescerande kanaler i LPS-programvarufönstret. Ett bra startmaximum för att fånga alla maskar är 8 000 för TOF och EXT. Fluorescensskalorna varierar beroende på varje mikrob. Inkludera kontrollmaskprover som odlats på icke-fluorescerande mikrober (t.ex. OP50) och varje fluorescerande mikrob ensam (om mikrober blandas) som kontroller vid varje försök.
- Högerklicka i diagrammets brödtext för att ändra skalningen. Använd kontrolldjur som vuxna dag 1 eller synkroniserade L1:or (eller population av intresse) för att hjälpa till med val av TOF- och EXT-grind.
- I autosampler-fönstret väljer du Prime. Gå till Arkiv > Öppna skript för att välja rätt inbyggt skript och klicka sedan på OK.
- Endast för analys väljer du skriptet med Hämta. För sortering, välj skriptet med Dispensera. För förvärv från 96-brunnars plattor, välj skriptet med 96 brunnar; För förvärv från 384-brunnars plattor, välj skriptet med 384 brunnar. För samplingsvolym (40 eller 100 μL) väljer du skriptet med motsvarande volym.
- Gå till Plate Template på autosampler-programvarumenyn för att välja önskade brunnar för analys. Läs in kontrollproverna. När plattan har laddats på autosampler-steget och säkrats, tryck på Run Plate i autosampler-fönstret. Spara filen när du uppmanas att göra det.
OBS: Kontroll samples och inställningar kan göras med ett 50 ml koniskt rör på LPS sample port innan du ansluter LP sampler. - När förvärvet är klart klickar du på knappen Lagra data i det övre menyfliksområdet i LPS-programvarufönstret och sparar data igen.
5. Analys av C. elegans-egenskaper och tarmmikrobiomnivåer per djur
- Rådata lagras i tre filtyper: .lmd, .bxr3, .txt. Läs in textfilen .txt i R-programmet för analys. Slutför stegen nedan i R19.
- Använd paketet tidyverse20 som ett ramverk för analysen.
- Använd ggplot-funktionen (ingår i tidyverse) för att plotta LPS-data med TOF-värdena som x-axeln och EXT-värdena som y-axeln. En normal plottning visar två moln av prickar. Se till att en är nära ursprunget och x-axeln, vilket indikerar mindre partiklar som larver och små skräp och den andra gruppen av partiklar är längst upp till höger i diagrammet och representerar vuxna nematoder.
- Använd denna gruppering som vägledning och välj lämpliga TOF- och EXT-gränsvärden. Gating kan variera beroende på C. elegans-stammar på olika mikrober baserat på förändringar i fysiologi (t.ex. mörka kontra klara djur eller förändringar i äggbärare kan ändra EXT-koefficienter).
- Använd funktionen delmängd för att separera vuxna och larver genom TOF och EXT gating. I exemplet här använder du inställningarna TOF > 1 200 och EXT > 1 000 för att grinda för vuxna djur.
- Analysera de resulterande datauppsättningarna för statistiska skillnader; använd funktionen t-test i R för det här experimentet.
- För att bestämma mikrobiomets inverkan på storleken och den optiska densiteten hos C. elegans, jämför TOF- respektive EXT-värdena mellan förhållandena. TOF är en proxy för maskstorlek och kan indikera förändringar i djurens tillväxthastighet vid specifika tidpunkter. EXT-förändringarna är störst mellan slutet av utvecklingen och vuxen ålder på grund av ljuset som sprids av äggen och kan användas för att bedöma förändringar i tidpunkten för den övergången och fruktsamheten. Bedöm avkommans andel och fördelning om de behölls under analyserna.
- För att bestämma förändringar i tarmmikrobiomkoloniseringsnivåer, normalisera först fluorescensvärden (t.ex. röda eller gröna kolumner) genom att dividera med individuella TOF-värden för varje djur. När maskar växer i storlek och blir vuxna blir också volymen på deras tarm större. Normalisering hjälper till att minska artefakter från skillnader i provdjurens storleksfördelningar. Använd normaliserade djur för att bedöma förändringar i tarmmikrobiomkolonisering över förhållanden.
OBS: Ett rådataexempel och motsvarande R-skript finns i Supplementary File 1 JOVE_worm_microbiome.txt och Supplementary File 2 JOVE_worm_microbiome.r. Se figur 2 och figur 3 för ett representativt exempel på dessa analyser av värden och mikrobiomet med hjälp av två fluorescerande bakterier.
6. Sortering av C. elegans-djur efter tarmmikrobiomegenskaper
- Samla in en population av C. elegans som odlats på fluorescerande märkta mikrober (t.ex. RFP) enligt beskrivningen i steg 3. Maskar bör placeras i 50 ml koniska rör med minst 5 ml prov. Sikta på cirka 2 000 maskar/ml inklusive alla vuxna och avkommor.
OBS: Detta kan också göras i en platt botten 96-hålsplatta med hjälp av LP-samplern. Håll maskdensiteten på 50–100 per brunn.- Om LP sampler har använts, stäng av och koppla bort LP sampler. Återanslut prov- och rensningslinjerna till LPS innan du sorterar.
- Öppna LPS-programvaran, gå till Arkiv > Nytt experiment och sedan Arkivera > nytt exempel. Skapa ett punktdiagram med TOF på x-axeln och Extinction på y-axeln. Skapa ytterligare ett punktdiagram med TOF på x-axeln och Röd på y-axeln. Använd samma axelskala och laserinställningar som användes tidigare. Markera Aktivera lasrar för att slå på 488 nm och 561 nm lasrar
OBS: Om dessa diagram har skapats tidigare går du till Arkiv > Öppna experiment och Arkiv > Öppna prov för att ladda grafer.- Placera kontrollprovröret på provporten. I dialogrutan Hämta/dispensera klickar du på Hämta. Spara filen när du uppmanas att göra det. När tillräckligt många maskar har mätts för att särskilja populationer klickar du på Avbryt.
OBS: Flödeshastigheterna bör vara cirka 15–30 händelser/s. Om inte, justera maskkoncentrationerna för att säkerställa att enskilda djur analyseras eller sorteras per droppe. I LPS passerar maskar genom laserns väg i olika positioner (rak kontra böjd eller böjd). Det kan ta olika lång tid för dem att passera lasern och detektorn beroende på deras positioner. - I TOF vs Extinction ritar du en grind runt den vuxna befolkningen. I TOF vs Red dot-diagrammet ritar du grindar runt områdena med höga och låga rödvärden som intressanta regioner för vuxna maskar med olika nivåer av mikrobiomkolonisering. Gå till Visa > grindhierarki och se till att de fluorescerande grindarna listas under grinden för vuxna invånare. När inställningarna har optimerats går du till Arkiv > Spara experiment och Spara exempel på fil > exempel.
OBS: I exemplet här, välj djur baserat på TOF/EXT-grindar för vuxna och sortera i pooler som uppvisar antingen hög eller låg kolonisering med röda fluorescerande proteinuttryckande bakterier. Alla kombinationer av parametrar som mäts av LPS kan dock användas för att identifiera den eller de populationer som är av intresse.
- Placera kontrollprovröret på provporten. I dialogrutan Hämta/dispensera klickar du på Hämta. Spara filen när du uppmanas att göra det. När tillräckligt många maskar har mätts för att särskilja populationer klickar du på Avbryt.
- Före sortering, se till att rätt uppsamlingsapparat har laddats. För att ladda 96-hålsplattan på uppsamlingsapparaten, välj Lastplatta A > Flytta under Flytta stage i dialogrutan Anskaffa/dispensera för att tillåta uppsamlingssteget att flytta till ett läge som är förberett för att ladda en 96-hålsplatta.
- För bulksortering, välj lämplig rörstorlek och klicka på Flytta för att ladda antingen ett 15 ml eller 50 ml koniskt rör. I avsnittet Sortering i dialogrutan Hämta/dispensera väljer du sorteringsporten i listrutan med skapade regioner. Mata in antalet objekt från det definierade området som ska dispenseras till ett uppsamlingsrör direkt under flödescellens munstycke. Klicka på knappen Masssortering under dialogrutan Hämta/dispensera.
- För dispensering till en 96-hålsplatta, gå till Inställning > plattor > kalibrerade plattor > 96-hålsplatta. Gå sedan till Visa > plattmall, välj de brunnar som maskarna ska sorteras till, ange antalet objekt som ska sorteras i varje brunn och välj de inhägnade områden som är av intresse. Om mer än ett inhägnat område ska sorteras in i samma platta, kryssa i rutan Grind Each Well. Klicka på OK för att spara ändringarna.
- När sorteringsnummer och platser har tilldelats klickar du på knapparna Fyll tallrik i dialogrutan Förvärva/dispensera för att initiera dispensering till en 96-hålsplatta.
- Innan du fyller hela 96-hålsplattan, utför testsortering av en delmängd av djur eller kontroller i en 96-hålsplatta och analysera med hjälp av ett stereomikroskop för att säkerställa att lämpliga antal och önskade djurpopulationer har sorterats. När korrekt sortering har bekräftats, upprepa steg 6.3-6.6 för experimentella prover. Klicka på knappen Lagra data på det övre menyfliksområdet i LPS-programvarufönstret för att spara data igen.
OBS: Alla mått (EXT, TOF, RFP, GFP, etc.) kan också samlas in för sorterade djur och jämföras med de som inte sorterades. Detta kan göra det möjligt att köra analys- och sorteringslägen samtidigt om så önskas.
- Innan du fyller hela 96-hålsplattan, utför testsortering av en delmängd av djur eller kontroller i en 96-hålsplatta och analysera med hjälp av ett stereomikroskop för att säkerställa att lämpliga antal och önskade djurpopulationer har sorterats. När korrekt sortering har bekräftats, upprepa steg 6.3-6.6 för experimentella prover. Klicka på knappen Lagra data på det övre menyfliksområdet i LPS-programvarufönstret för att spara data igen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Definition av populationsportar för vuxna och larver
Här odlades synkroniserade C. elegans L1 på en NGM-platta sådd med E. coli OP50 (Eco), en standarddiet för laboratorier. C. elegans-populationer samlades in för LPS-analys efter 96 eller 120 timmars tillväxt vid 20 °C (figur 2A). Ett punktdiagram över utdöende (EXT, en proxy för kroppstäthet) kontra time-of-flight (TOF, en proxy för kroppslängd) skapar två visuellt separerade moln av djur. Varje prick representerar ett enda djur där högre EXT- och TOF-värden observeras från vuxna jämfört med larver (Figur 2B). Dessa två parametrar är värdefulla slutsatser för populationstillväxt och fysiologi. Till exempel kan ett täthetsdiagram av larver TOF visualisera fördelningen av larvstadier. Avkommor från 2 dagar gamla vuxna individer dominerades av L1- och L2-stadier med en TOF under 200, medan de flesta avkommor från 3 dagar gamla vuxna nådde L3- och L4-stadier (Figur 2C). Dessutom är 2D-densitet och box-whisker plots användbara för att visualisera förändringar i vuxen kroppsstorlek och densitet eftersom värdena för TOF och EXT ökar på dag 3 jämfört med dag 2 när de odlas på E. coli (Figur 2D-F). Detta förhållande är vanligtvis linjärt under vuxen ålder, men vissa förändringar i fysiologin kan påverka en egenskap mer än en annan (t.ex. kan vuxna utan ägg ha lägre EXT-värden utan att påverka TOF).
Profilering av tarmmikrobiomsammansättning med hjälp av fluorescerande märkta mikrober
För att illustrera olika nivåer av kolonisering jämför vi en dominant kolonisatör av det naturliga mikrobiomet av C. elegans dTomato-märkt Ochrobactrum BH3 (Och) och grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt E. coli OP50. Dessa två såddes individuellt och i en lika stor blandning baserad på OD (1:1 mix) på NGM-plattan. Synkroniserade C. elegans L1 odlades vid de tre betingelserna och samlades in vid 120 timmar för att undersöka koloniseringsdynamiken hos 3 dagar gamla vuxna (Figur 3A). 2D-täthet och box-whisker plots visade att det finns skillnader i vuxna TOF- och EXT-värden när C. elegans odlas på Ochrobactrum BH3 och blandkulturer (Figur 3B-E). Tarmkolonisering av bakterier kan härledas från fluorescensnivån som detekteras i de enskilda nematoderna. Box-whisker-diagram med röda fluorescerande avläsningar visar ökad Ochrobactrum BH3-kolonisering i blandningsbetingelsen än i Ochrobactrum BH3 ensamt. Däremot indikerar grönfluorescerande värden lägre OP50-kolonisering i blandningsbetingelsen än i enbart OP50. Liknande trender observeras i TOF-normaliserade fluorescerande signaler, vilket tar bort effekten av kroppsstorlek och minskar variationen inom populationen (Figur 3F-I). För ett definierat mikrobiom med flera fluorescerande märkta mikrober kan ett punktdiagram illustrera koloniseringsmönster för dessa mikrober. Till exempel, i mikrobiomet med två medlemmar visar ett punktdiagram av rött fluorescerande protein (RFP) kontra GFP-kanaler att maskarna är kraftigt skeva mot y-axeln (RFP), vilket tyder på att OP50-koloniseringen är låg hos de flesta maskar medan nivåerna av Ochrobactrum BH3-kolonisering är jämnt fördelade i populationen (Figur 3J). På samma sätt kan ett punktdiagram över RFP kontra EXT avslöja förhållandet mellan Ochrobactrum BH3-koloniseringsnivåer och värdutveckling såsom kroppstäthet (Figur 3K). Dessutom kan skillnaderna i reproduktionsmönster observeras genom att plotta täthetsdiagrammet för respektive larvpopulation på de tre förhållandena (Figur 3L).
Berikning för målpopulationer baserat på mikrobiomkolonisering
De 3 dagar gamla vuxna som odlas på två-medlemmens blandningsmikrobiom uppvisar ett brett spektrum av RFP-intensitet, vilket indikerar individuella variationer i Ochrobactrum BH3-kolonisering inom gruppen (Figur 4A). För att ytterligare separera dessa undergrupper ritades sorteringsgrindar för hög och låg RFP manuellt för att sortera 15 individer från varje grind till en 96-brunnsplatta, vilket visas av RFP-bilden av hela brunnen (figur 4B). Under högre förstoring bekräftar överlagringsbilder av ljusa fält och RFP-kanaler att sorteringsmetoden väljer höga och låga Ochrobactrum BH3-koloniserade maskar, vilket möjliggör ytterligare karakterisering av fenotypiska konsekvenser och molekylära drivkrafter (Figur 4C).
Figur 1: Ett flödesschema för flödesmaskeringsbaserade metoder för att bedöma tarmmikrobiom och värdfysiologi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Definition av populationer av vuxna och larver. (A) Ett arbetsflöde för att samla in populationer av C. elegans på dag 2 och dag 3 i vuxen ålder. (B) Prickdiagram över time-of-flight (TOF) kontra utdöende (EXT) för populationer av C. elegans på dag 2 (grå) och dag 3 (röd) i vuxen ålder. C) Täthetsdiagram för larver TOF på dag 2 och dag 3 i vuxen ålder. (D-E) Prick- och låd-och-morrhårsdiagram av TOF kontra EXT för vuxna på dag 2 och dag 3 i vuxen ålder. (F) Box-and-whisker plot för utrotning av vuxna djur på dag 2 och dag 3 i vuxen ålder. P-värden beräknades med studentens t-test (*** p < 0,001; Dag 2 n = 38; Dag 3 n = 88). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Profilering av tarmmikrobiomkolonisering med hjälp av fluorescerande märkta mikrober. (A) Samling av 3 dagar gamla vuxna populationer odlade på Ochrobactrum BH3 (dTomat-uttryckande; och), E. coli OP50 (GFP-uttryckande; Eco) eller en 1:1 blandning av de två bakterierna (blandning). (B) Prickdiagram över TOF kontra EXT för vuxna dag 3 som odlats på Mix. (C-E) Prick- och låd- och morrhårsrutor av TOF kontra EXT för 3 dagar gamla vuxna som odlas på Ochrobactrum BH3. Grå streckade linjer anger medelvärdet för populationen som odlats på OP50. (F-G) Box-and-whisker plot av råa och TOF-normaliserade dTomato (RFP) värden för 3-dagars gamla vuxna odlade på Mix och Ochrobactrum BH3 ensamma. (H–I) Box-and-whisker plottar med rå och TOF-normaliserad GFP för 3-dagars gamla vuxna odlade på mix och OP50. (J) Prickdiagram över Ochrobactrum BH3 (RFP) kontra E. coli OP50 (GFP) för 3 dagar gamla vuxna som odlats på blandning. (K) Prickdiagram över RFP kontra EXT för 3-dagars gamla vuxna som odlats på blandning. (L) Täthetsdiagram över larver från 3 dagar gamla vuxna som odlats på en blandning, Ochrobactrum BH3 och OP50. Alla P-värden genererades från studentens t-test (*** p < 0,001; ** p < 0,01; n.s., inte signifikant; blandning n = 230; Och n = 45). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Berika målpopulationer baserat på mikrobiomkolonisering . (A) Punktdiagram för TOF kontra RFP (Ochrobactrum BH3) för 3-dagars gamla vuxna. Höga (röda lådan) och låga (svarta lådan) RFP-grindar dras för att berika C. elegans med hög och låg Ochrobactrum BH3-kolonisering. (B) Representativa RFP-bilder (4x) av brunnarna som innehåller 15 sorterade maskar från höga och låga RFP-grindar (Bar = 1 mm). (C) Representativa bilder (10x) av enskilda maskar från höga och låga RFP-grindar (Bar = 100 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfil 1: Representativ datauppsättning genererad av stor partikelsorterare för N2-populationer i vuxen ålder dag 2 och dag 3 odlade på E. coli OP50 och Ochrobactrum BH3. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 2: Skript som används vid analys och figurgenerering av representativ datamängd i R-miljön. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flödesvermimetri har använts för att karakterisera C. elegans-gener och vägar mot patogenkolonisering och toxicitet i flera studier21,22. Här presenteras ett tillvägagångssätt som använder C. elegans för att undersöka hur tarmmikrobiom modulerar sin värdfysiologi. Jämfört med befintliga metoder som använder kolonibildande enheter (CFU) eller 16S rRNA-amplikonsekvensering 9,16,17,23,24, kräver detta tillvägagångssätt inte arbetsintensiv räkning eller introducerar potentiell PCR-bias. Förutom att mäta mikrobiom i en hel population gör detta tillvägagångssätt det möjligt för användare att visualisera individuella variationer inom populationen. Detta tillvägagångssätt begränsas endast av tillgången på fluorescerande proteinuttryck eller färgning av mikrober och antalet detektionskanaler i LPS. Ytterligare överväganden för experimentell design diskuteras nedan så att användarna kan skapa ett anpassat arbetsflöde baserat på deras behov.
Överväganden för att skapa och seeda ett definierat mikrobiom
Först normaliseras varje bakteriekultur till ett OD600-värde på 1 innan olika stammar blandas. Det är värt att notera att, beroende på samhällets komplexitet och relationerna mellan arterna, kan starttätheten ha olika effekter på den etablerade mikrobiomsammansättningen23. Även om OD enkelt kan mätas med spektrofotometrar, är en varning att olika bakterier kommer att ha olika koncentrationer (t.ex. antalet celler per ml) för samma OD-värde och bör justeras därefter. För det andra bör variation i mikrobiomsammansättningen i gräsmattor tas med i beräkningen. När mikrobiomet har såtts på NGM-plattan (eller andra medier) får mikrobiomet växa över natten vid rumstemperatur innan synkroniserade L1 C. elegans-populationer släpps på plattorna . På grund av variationer i tillväxthastigheter och interaktioner mellan arter mellan bakteriestammar kommer mikrobiom som odlas på NGM-plattor eller vilken platta som helst med substrat för tillväxt att skilja sig i sammansättning från den ursprungliga fröblandningen. Genom att använda en peptonfri NGM-platta kan man bevara det ursprungliga mikrobiella samhället13. På grund av begränsad mikrobiomtillväxt på den peptonfria plattan kan dock en högre sådd-OD eller ett minskat antal synkroniserade L1 per platta behövas. Detta förhindrar att befolkningen svälter innan den når den önskade åldern för analys. Ett annat tillvägagångssätt är att sekvensera eller på annat sätt bestämma andelen mikrober i gräsmattan.
Mätning av mikrobiomkolonisering och C. elegans fysiologi
För det första kan tröskelvärdena för utdöende (EXT) och flygtid (TOF) för vuxna variera beroende på ålder, C. elegans-stammens bakgrund och de mikrober som de odlas på. Att ha en 1 dag gammal vuxen population i experimentet för varje mask/bakterietillstånd kan vara användbart för att bestämma TOF- och utdöendegränserna samt för att kontrollera variationen på grund av tillväxtsubstrat och miljö. Förutom grind för vuxna individer kan TOF och EXT användas för att grinda larver, och ett täthetsdiagram över avkomman kan uppskatta tidpunkten och produktionen av reproduktion på populationsnivå (Figur 3L). För det andra måste PMT-förstärkningar och spänning på LPS justeras för att maximera signal-brusförhållandet och ställa in signalområdet för att undvika mättnad. Detta beror på bakteriestammarnas fluorescerande intensitet och deras koloniseringsnivåer. Standard PMT vid 350 fungerar bra för höga kolonisatörer som Ochrobactrum BH3, men användare kan behöva öka PMT eller spänningsvärden för låga kolonisatörer som E. coli OP50. För det tredje, på grund av skillnader i fluoroforernas egenskaper och deras uttrycksnivåer i transgena bakteriestammar, återspeglar fluorescerande värden inte det absoluta antalet bakterier som finns i mikrobiomet. Därför kan GFP- och RFP-värden inte användas för att jämföra kolonisering mellan två olika fluorescerande mikrober direkt. Störning och plätering av djur för att identifiera antalet levande bakterier kan bidra till att bättre lösa dessa samband.
Potentiella tillämpningar för berikningsbaserade strategier
Denna metod ger en lämplig plattform med hög genomströmning för att undersöka effekten av mikrobiomförändringar på värdfysiologi på populationsnivå. På den mikrobiella sidan kommer den ökande tillgången på verktyg och resurser för att redigera bakteriella genom 25,26,27 att öka antalet fluorescerande och funktionella mikrobiella mutanter relaterade till C. elegans naturliga mikrobiom. Från värdsidan finns många fluorescerande rapportörer tillgängliga för att utforska kopplingen mellan cellsignalering och mikrobiomsammansättning. Förmågan att berika en värdpopulation eller mutant från en mutagenserad population (t.ex. EMS forward mutagenes)28 eller poolade vilda stammar29, med specifika mikrobiomkoloniseringsegenskaper, kan avsevärt förbättra förmågan att ansluta värdgener som reglerar mikrobiompåverkan. Dessutom kan urvalet av populationer baserat på värd- och/eller mikrobiomegenskaper också underlätta en kader av omics-baserade profileringsmetoder. Detta tillvägagångssätt har stor flexibilitet och lovar att främja förståelsen av de molekylära mediatorerna för värd-mikrobiominteraktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH-anslag DP2DK116645 (till B.S.S.), Dunn Foundation pilot award och NASA-anslag 80NSSC22K0250 (till B.S.S.). Detta projekt stöddes också av Cytometry and Cell Sorting Core vid Baylor College of Medicine med finansiering från CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 och RR024574) och assistans av Joel M. Sederstrom, plus ett instrumenteringsbidrag för LPS NIH-anslaget (S10 OD025251). Vissa stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
- Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
- Bäckhed, F., et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gill, S. R., et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312 (5778), New York, N.Y. 1355-1359 (2006).
- Bargmann, C. I.
- Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921 (2003).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. 10 (9), Bethesda, Md. 3025-3039 (2020).
- Stiernagle, T.
- R Core. Team R: A language and environment for statistical computing. R Core. , (2018).
- Wickham, H., et al. tidyverse. , (2019).
- Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
- Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).
- Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).
- Zhang, F., et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
- Wiles, T. J., et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), 01877 (2018).
- Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).
- Mok, C. A., et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).
