Summary
Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für das modulare Tol2-Transgenese-System, eine Gateway-basierte Klonierungsmethode zur Herstellung und Injektion transgener Konstrukte in Zebrafischembryonen.
Abstract
Fetale Alkoholspektrumstörungen (FASD) sind durch eine sehr variable Reihe von strukturellen Defekten und kognitiven Beeinträchtigungen gekennzeichnet, die aufgrund einer pränatalen Ethanolexposition auftreten. Aufgrund der komplexen Pathologie von FASD haben sich Tiermodelle als entscheidend für unser aktuelles Verständnis von Ethanol-induzierten Entwicklungsdefekten erwiesen. Zebrafische haben sich aufgrund des hohen Erhaltungsgrades sowohl der Genetik als auch der Entwicklung zwischen Zebrafisch und Mensch als leistungsfähiges Modell zur Untersuchung ethanolinduzierter Entwicklungsdefekte erwiesen. Als Modellsystem besitzen Zebrafische viele Eigenschaften, die sie ideal für Entwicklungsstudien machen, darunter eine große Anzahl von extern befruchteten Embryonen, die genetisch beherrschbar und durchscheinend sind. Dies ermöglicht es den Forschern, den Zeitpunkt und die Dosierung der Ethanolexposition in mehreren genetischen Kontexten genau zu steuern. Ein wichtiges genetisches Werkzeug, das im Zebrafisch zur Verfügung steht, ist die Transgenese. Die Generierung transgener Konstrukte und die Etablierung transgener Linien kann jedoch komplex und schwierig sein. Um dieses Problem zu lösen, haben Zebrafischforscher das Transposon-basierte Tol2-Transgenesesystem etabliert. Dieses modulare System verwendet einen Multisite-Gateway-Klonierungsansatz für den schnellen Zusammenbau kompletter Tol2-Transposon-basierter transgener Konstrukte. Hier beschreiben wir die flexible Tol2-System-Toolbox und ein Protokoll zur Generierung transgener Konstrukte, die für die Zebrafisch-Transgenese und deren Verwendung in Ethanolstudien bereit sind.
Introduction
Die pränatale Ethanolexposition führt zu einem Kontinuum struktureller Defizite und kognitiver Beeinträchtigungen, die als fetale Alkoholspektrumstörungen (FASD) bezeichnet werden1,2,3,4. Die komplexen Beziehungen zwischen mehreren Faktoren machen es schwierig, die Ätiologie von FASD beim Menschen zu untersuchen und zu verstehen. Um diese Herausforderung zu lösen, wurde eine Vielzahl von Tiermodellen verwendet. Die biologischen und experimentellen Werkzeuge, die in diesen Modellen zur Verfügung stehen, haben sich als entscheidend für die Entwicklung unseres Verständnisses der mechanistischen Grundlagen der Ethanol-Teratogenität erwiesen, und die Ergebnisse dieser Modellsysteme stimmen bemerkenswert mit dem überein, was in humanen Ethanolstudien gefunden wurde 5,6. Unter diesen haben sich Zebrafische zu einem leistungsfähigen Modell für die Untersuchung der Ethanol-Teratogeneseentwickelt 7,8, was zum Teil auf ihre externe Befruchtung, ihre hohe Fruchtbarkeit, ihre genetische Lenkbarkeit und ihre durchscheinenden Embryonen zurückzuführen ist. Diese Stärken zusammen machen Zebrafische ideal für Echtzeit-Live-Bildgebungsstudien von FASD mit transgenen Zebrafischlinien.
Transgene Zebrafische wurden ausgiebig verwendet, um verschiedene Aspekte der Embryonalentwicklung zu untersuchen9. Die Herstellung transgener Konstrukte und nachfolgender transgener Linien kann jedoch äußerst schwierig sein. Ein Standard-Transgen benötigt ein aktives Promotorelement, um das Transgen anzutreiben, und ein Poly-A-Signal oder einen "Schwanz", alles in einem stabilen bakteriellen Vektor für die allgemeine Vektorerhaltung. Die traditionelle Erzeugung eines transgenen Mehrkomponentenkonstrukts erfordert mehrere zeitaufwändige Unterklonierungsschritte10. PCR-basierte Ansätze, wie z. B. die Gibson-Assemblierung, können einige der Probleme umgehen, die mit dem Subklonen verbunden sind. Für die Erzeugung jedes einzigartigen transgenen Konstrukts müssen jedoch einzigartige Primer entworfen und getestet werden10. Neben der Konstruktion von Transgenen waren auch die genomische Integration, die Übertragung der Keimbahn und das Screening auf eine ordnungsgemäße Transgenintegration schwierig. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Verwendung des Transposon-basierten Tol2-Transgenesesystems (Tol2Kit)10,11. Dieses modulare System nutzt das Klonen von Gateways an mehreren Standorten, um schnell mehrere transgene Konstrukte aus einer ständig wachsenden Bibliothek von "Eingangs"- und "Ziel"-Vektoren zu generieren. Integrierte Tol2-transponierbare Elemente erhöhen die Transgeneserate erheblich und ermöglichen die schnelle Konstruktion und genomische Integration mehrerer Transgene. Mit Hilfe dieses Systems zeigen wir, wie die Generierung einer endodermen transgenen Zebrafischlinie genutzt werden kann, um die gewebespezifischen strukturellen Defekte zu untersuchen, die FASD zugrunde liegen. Letztendlich zeigen wir in diesem Protokoll, dass der modulare Aufbau und die Konstruktion transgener Konstrukte die FASD-Forschung auf Zebrafischbasis sehr unterstützen werden.
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Protocol
Alle Zebrafischembryonen, die in diesem Verfahren verwendet wurden, wurden gemäß den etablierten IACUC-Protokollen aufgezogen und gezüchtet12. Diese Protokolle wurden von der University of Louisville genehmigt.
HINWEIS: In dieser Studie wurden der Wildtyp-Zebrafischstamm AB und die Doppelmutantenlinie bmp4 st72;smad5b1100 verwendet. Das gesamte Wasser, das bei diesem Verfahren verwendet wurde, war steriles Umkehrosmosewasser. Konfokale Bilder wurden unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen. Die Endodermmessungen wurden mit dem Messwerkzeug in ImageJ durchgeführt. Alle statistischen Auswertungen wurden mit Hilfe einer Statistiksoftware durchgeführt.
1. Erstellen der Lösungen und Medien
- Bakterielle Medien: LB-Brühe oder Agar gemäß den Anweisungen des Herstellers auflösen und autoklavieren. Bevor Sie das Medium in 100-mm-Petrischalen füllen, fügen Sie entweder Ampicillin (50 μg/ml), Kanamycin (50 μg/ml) oder eine Ampicillin/Chloramphenicol-Kombination (50 μg/ml bzw. 30 μg/ml) hinzu.
- Um 20x Embryonenmedium herzustellen, lösen Sie Folgendes in 1 l Wasser auf: 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl 2, 0,41 g K 2 HPO 4, 0,142 g Na2 HPO 4 und 4,9 g MgSO4·7H2 O. Filter-sterilisieren Sie die Stammlösung mit einem 0,22-μm-Vakuumfiltrationssystem, und bei 4 °C lagern.
Anmerkungen: Ignorieren Sie den weißen Niederschlag, der sich bildet; Dies hat keine Auswirkungen auf die Medien. - In 19 l Wasser 1,2 g NaHCO3 auflösen und 1 l des 20-fachen Embryo-Media-Vorrats hinzufügen, um die funktionierende Embryo-Media-Lösung zu erzeugen, und diese Lösung bei 28 °C halten.
- Für eine 2%ige phenolrote Lösung werden 20 mg phenolrotes Natriumsalz in 1 ml RNase-freiem Wasser aufgelöst und bei Raumtemperatur gelagert.
2. Embryonen-Injektionsformen
- Um die Agarose-Injektionsplatte herzustellen, lösen Sie die Agarose in den Embryomedien bis zu einer Endkonzentration von 3 % auf, indem Sie sie zum Kochen bringen.
- Gießen Sie 50 ml Agarose in 100-mm-Petrischalen und setzen Sie, solange die Agarose noch flüssig ist, die Spritzgussform vorsichtig in die Agarose ein, um eine Blasenbildung unter der Form zu verhindern.
- Die Agaroseplatten abkühlen lassen. Sobald die Agarose fest ist, entfernen Sie die Spritzgussform und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C.
3. Injektionspipetten
- Ziehen Sie 1,0 mm (OD) Kapillaren, die ein Filament enthalten, mit einem vertikalen Pipettenzieher in Nadeln, wobei der Magnet auf 2,5 und das Heizelement auf 14,6 eingestellt ist.
Anmerkungen: Jeder beheizte Abzieher funktioniert, wenn er die Kapillaren sauber und gleichmäßig in zwei Nadeln zieht, aber die Injektionsnadeln müssen innerhalb von 1 Woche nach der Injektion der Zebrafischembryonen gezogen werden, um konsistente Injektionsergebnisse zu erzielen.- Setzen Sie die Kapillare in den Abzieher ein, ziehen Sie die Klemme an jedem Ende fest und aktivieren Sie dann das Heizelement.
- Ziehen Sie an den Kapillaren, um zwei Injektionsnadeln zu erzeugen.
- Entfernen Sie die Kapillaren aus dem Abzieher und bewahren Sie sie in einer leeren Petrischale mit einem Streifen Modelliermasse auf, der als Nadelhalter dient.
4. Herstellung der Transposase-mRNA
- Die Tol2Kit-Plasmid-haltige Transposase wird mit einer NotI-Restriktionsendonuklease linearisiert, indem Folgendes in einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert wird: 10 μl Transposase-Plasmid (150 ng/μl), 1,5 μl Restriktionsendonuklease-Reaktionspuffer, 0,3 μl NotI-Endonuklease.
- Füllen Sie die Reaktion bis zu 20 μl mit RNase-freiem Wasser, mischen Sie sie und verdauen Sie sie dann über Nacht bei 37 °C.
- Stoppen Sie den Transposase-Aufschluss, indem Sie der Aufschlussreaktion 1 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μl 5 MNH4OAc und 80 μl 100 % EtOH hinzufügen und dann mischen und über Nacht bei −20 °C kühlen.
- Zentrifugieren Sie die Lösung bei 14.000x g für 20 min bei 4 °C, saugen Sie dann den Überstand ab und resuspendieren Sie das DNA-Pellet in RNase-freiem Wasser.
- Bestimmen Sie die lineare Plasmidkonzentration in Nanogramm pro Mikroliter (ng/μl) mit einem Fluorometer, indem Sie zuerst 2 μl eines RNase-freien Wasserblindlings und dann 2 μl des linearisierten Plasmids laufen lassen.
HINWEIS: Die Plasmidkonzentrationen liegen typischerweise zwischen 100-200 ng/μl - Richten Sie die SP6-mRNA-Produktion ein, indem Sie die folgenden Komponenten in einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen der Reihe nach kombinieren: 10 μl 2x NTP/CAP, 2 μl 10x Reaktionspuffer, 0,1-1 μg lineare DNA-Vorlage und 2 μl SP6-Enzymmischung.
- Füllen Sie die Reaktion bis zu 20 μl mit RNase-freiem Wasser, mischen Sie sie und inkubieren Sie sie 2 h lang bei 37 °C.
- Nach 2 h Inkubation 1 μl DNase zugeben, gut mischen und weitere 15 min bei 37 °C inkubieren.
- Um die SP6-Reaktion zu stoppen, geben Sie 30 μl LiCl-Fällungslösung in das Reaktionsrohr und mischen Sie es dann und kühlen Sie es über Nacht bei −20 °C.
- Zentrifugieren Sie die Lösung bei 14.000 x g für 20 min bei 4 °C, um die mRNA zu pelletieren, und saugen Sie dann den Überstand an und waschen Sie das mRNA-Pellet mit 1 ml 80%igem EtOH (verdünnt mit RNase-freiem Wasser).
- Zentrifugieren Sie die Lösung bei 14.000 x g für 20 Minuten bei 4 °C, um die mRNA zu pelletieren, und saugen Sie dann den Überstand an. Lassen Sie das Pellet an der Luft trocknen.
- Das mRNA-Pellet wird in 20 μl RNase-freiem Wasser resuspendiert, die mRNA-Konzentration in Nanogramm pro Mikroliter (ng/μl) mit einem Fluorometer wie in Schritt 4.5 beschrieben bestimmt (sollte mindestens 100 ng/μl betragen), 100 ng mRNA pro Röhrchen für den einmaligen Gebrauch aliquotieren und bei −80 °C lagern.
HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die mRNA nicht abgebaut wird, können 2 μl mRNA schnell auf ein DNA-Elektrophorese-Gel aufgetragen werden, um eine einzelne Bande mit 1.950 bps zu bestätigen.
5. Multisite-Gateway-Klonierung zur Erstellung von Eingangsvektoren für die Transgenese
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Kwan et al.10 modifiziert, wobei die LR-Reaktion als Halb-LR-Reaktion und mit einem Gesamtvolumen von 5 μL geschrieben wurde. Um neue Eintrittselemente zu generieren, müssen BP-Reaktionen mit 5'-, Mittel- und 3'-Donorvektoren verwendet werden10,13.
- Um die Reaktion durchzuführen, sammeln Sie jeweils 10 fmol von p5E, pME und p3E und 20 fmol des Zielvektors (pDest).
HINWEIS: Bei der Multisite-LR-Rekombination werden vier verschiedene Plasmidvektoren verwendet: ein 5'-Eintrittsvektor (p5E), ein mittlerer Eintrittsvektor (pME), ein 3'-Eintrittsvektor (p3E) und ein Zielvektor (pDest), um ein einzigartiges transgenes Konstrukt zu erzeugen, das von Tol2-Wiederholungen flankiert wird, die in Zebrafischembryonen injiziert werden können.- Bestimmen Sie die Größe aller vier Vektoren in Basenpaaren aus der Plasmidquelle (Tabelle 1, Tol2Kit Wiki Seite14 oder Addgene11; siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Bei neuartigen Vektoren kann die vollständige Plasmidsequenzierung über kommerzielle Sequenzierungsunternehmen die genaue Plasmidgröße in bps liefern. - Bestimmen Sie die Konzentration aller vier Vektoren in Nanogramm pro Mikroliter (ng/μl) mit einem Fluorometer, wie in Schritt 4.5 beschrieben.
- Berechnen Sie unter Verwendung des DNA-Gewichts von 660 g/mol und der Plasmidgröße (in bps) die gesamten Nanogramm (ng) des Plasmids, die benötigt werden, um entweder 10 fmol (Eintrittsvektoren) oder 20 fmol (Zielvektor) zu erreichen.
HINWEIS: Das Mosimann-Labor an der University of Colorado, Anschutz Medical Campus, hat eine frei verfügbare Tabelle erstellt, um die Menge des benötigten Plasmids (in ng) und das Volumen (in μL) der für die LR-Reaktion benötigten Vektoren zu berechnen15.
- Bestimmen Sie die Größe aller vier Vektoren in Basenpaaren aus der Plasmidquelle (Tabelle 1, Tol2Kit Wiki Seite14 oder Addgene11; siehe Materialtabelle).
- Um das unten beschriebene Konstrukt sox17:EGFPCAAX zu erzeugen, verwenden Sie die folgenden Vektoren: einen p5E-Vektor, der den Zebrafisch-Sox17-Promotor enthält, der 6.918 bp in Größe16 hat; ein pME-Vektor, der das pränylierte EGFP enthält, das 3.345 bp in Größe10 hat; ein p3E-Vektor, der die späte Poly-A-Signalsequenz SV40 enthält, die 2.838 bp in Größe10 beträgt; und der pDest, der 5.883 bp in Größe10 beträgt.
- Berechnen Sie unter Verwendung der in Schritt 5.1.2 ermittelten Plasmidkonzentration und der Menge in Nanogramm (ng) für jeden Vektor (Schritt 5.1.3) die gesamten Mikroliter (μL) jedes Plasmids, die benötigt werden, um entweder 10 fmol (Eintrittsvektoren) oder 20 fmol (Zielvektor) zu erreichen, und teilen Sie diese dann durch zwei, um sie in den 5-μL-Halb-LR-Reaktionen zu verwenden (alle unten aufgeführten Werte sind in Tabelle 2 aufgeführt).
- Um 10 fmol p5E-sox17 zu erzeugen, verwenden Sie 45,66 ng (in einer Konzentration von 140,3 ng/μl) und verdünnen Sie es mit sterilem Wasser um den Faktor 4, um 0,65 μl zu erhalten.
- Um 10 fmol pME-EGFPCAAX zu erzeugen, verwenden Sie 22,08 ng (in einer Konzentration von 213,5 ng/μl) und verdünnen Sie es mit sterilem Wasser um den Faktor 10, um 0,52 μl zu erhalten.
- Um 10 fmol p3E-Poly A zu erzeugen, verwenden Sie 15,73 ng (bei einer Konzentration von 276,1 ng/μl) und verdünnen Sie es mit sterilem Wasser um den Faktor 20, um 0,57 μl zu erhalten.
- Für 20 fmol des Zielvektors werden 77,66 ng pDest (in einer Konzentration von 307,3 ng/μl) verwendet und mit sterilem Wasser um den Faktor 5 verdünnt, um 1,63 μl zu erhalten.
- Um eine 5-μl-Halb-LR-Reaktion einzurichten, kombinieren Sie die in Schritt 5.3 bestimmten Volumina von p5E, pME, p3E und pDest in einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie dann steriles Wasser hinzu, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 4 μl zu erreichen.
- Die LR-Enzymmischung 2x für jeweils 1 Minute kräftig vortexieren, um eine ordnungsgemäße Durchmischung zu gewährleisten, und dann 1 μl zur Reaktion hinzufügen und gründlich mischen.
- Inkubieren bei 25 °C über Nacht (16+ h).
- Stoppen Sie die LR-Reaktion durch Zugabe von 0,5 μl Proteinase K (2 μg/μl), inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei 37 °C und kühlen Sie sie dann auf Raumtemperatur ab.
- Wandeln Sie 3-4 μl Plasmid in aufgetaute, chemisch kompetente Zellen um, indem Sie das Plasmid hinzufügen und die Zellen 25-30 Minuten auf Eis ruhen lassen.
- Während die Zellen auf Eis liegen, erwärmen Sie zwei LB-Ampicillin-Agarplatten auf Raumtemperatur.
- Hitzeschock der Zellen in einem 42°C warmen Wasserbad für genau 30 s.
- Nach dem Hitzeschock 250 μl antibiotikafreies, reichhaltiges flüssiges Medium in die Zellen geben und unter Schütteln bei 37 °C 1,5 h inkubieren.
- Verteilen Sie 300 μl Bakterien auf einer Ampicillinplatte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
- Am nächsten Morgen untersuchen Sie die Kolonien auf das Vorhandensein von zwei Phänotypen, klar und undurchsichtig, wählen Sie die klaren Kolonien (wie in Kwan et al.10 beschrieben) nacheinander aus, impfen Sie die Flüssigkultur und schütteln Sie sie dann über Nacht bei 37 °C.
HINWEIS: Klare Kolonien enthalten fast immer die richtige LR-Kolonie (>85% der Fälle). - Führen Sie mit einem handelsüblichen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers eine Plasmidvorbereitung für jede Flüssigkultur durch und diagnostisch verdauen Sie jedes Plasmid, um die geeignete Größe des transgenen Konstrukts zu bestätigen, was darauf hinweist, dass die LR-Gateway-Reaktion ordnungsgemäß funktioniert hat.
- Die korrekten transgenen Konstrukte werden unter Verwendung des in den Schritten 5.4-5.12 beschriebenen bakteriellen Standardtransformationsprotokolls unter Verwendung von 0,5-1 μl des Plasmids erneut transformiert und nur bei 37 °C für 1 h inkubiert.
- Streifen Sie die Kolonien erneut und vergewissern Sie sich, dass jede das transgene LR-Konstrukt wie in Schritt 5.14 aufweist.
- Bestimmen Sie die Plasmidkonzentration wie in Schritt 4.5 beschrieben (für die Embryoinjektion werden mindestens 150 ng/μl benötigt).
6. Injektion des Transgens in die Embryonen
- Tauen Sie eine Einweg-Transposase-mRNA-Probe und ein transgenes Tol2-Konstrukt auf Eis auf und warnen Sie eine Agarose-Injektionsplatte vor Raumtemperatur.
- Kombinieren Sie auf Eis: 150 ng Plasmid, 100 ng Transposase-mRNA und 2 % Phenolrot (0,3 μl). Fügen Sie dann RNA-freies Wasser hinzu, um das Volumen auf 3 μl zu erhöhen.
- Übertragen Sie einen Embryo im Zellstadium mit Transferpipetten auf die mit EM gefüllte Injektionsplatte (siehe Schritt 2), die den Agar vollständig bedeckt, und drücken Sie dann vorsichtig etwa 50-75 Embryonen pro Schlitz der Injektionsplatte.
- Geben Sie das mRNA/Plasmid/Phenolrot-Gemisch in das offene Ende einer Kapillarinjektionsnadel, setzen Sie die Kapillarnadel in den Anker der Injektionsanlage ein und schalten Sie die Injektionsbohrmaschine ein.
HINWEIS:Die Injektionsanlage verwendet komprimiertes Gas, z. B. Luft, um das gewünschte Volumen (wie in Schritt 6.5 beschrieben) des mRNA/Plasmid/Phenolrot-Gemisches in den Embryo zu pulsieren, wenn es aktiviert wird. - Senken Sie die Kapillarnadel in die EM der Injektionsplatte und brechen Sie die Spitze mit einer Pinzette, damit nur eine kleine Menge mRNA/Plasmid/Phenolrot-Gemisch von der Injektionsanlage abgepumpt werden kann.
- Injizieren Sie den Embryonen einen kleinen 3-nL-Bolus des mRNA/Plasmid/Phenolrot-Gemisches in den Zellkörper des Embryos.
HINWEIS: Ein Bolus von 3 nL ist ein Volumen aus mRNA/Plasmid/Phenolrot-Gemisch, bei dem theoretisch sieben Boli gleichmäßig über die Mittellinie des Embryos passen. - Wenn Sie mit der Injektion fertig sind, nehmen Sie sie von der Injektionsplatte, indem Sie sie vorsichtig aus dem Schlitz nehmen und in eine 100-mm-Petrischale mit frischem EM (ca. 40 ml) pipettieren und dann bei 28,5 °C inkubieren, damit sich die Embryonen entwickeln können.
7. Screening von Embryonen auf transgene Insertion
- Für die Expression fluoreszierender Proteine wählen Sie das geeignete Entwicklungsstadium aus, in dem das fluoreszierende Transgen exprimiert werden soll, und untersuchen Sie das Vorhandensein von Fluoreszenz unter einem Fluoreszenzpräparationsmikroskop.
HINWEIS: Diese Embryonen werden in ihrer Expression mosaikartig sein und eine genomische Insertion des transgenen Konstrukts zeigen. - Screening nach nicht-fluoreszierenden Transgenen durch Screening nach einem fluoreszierenden transgenen Marker (wie in Schritt 7.1 beschrieben), wie z.B. GFP, das durch den kardialen spezifischen Promotor für das Gen cmlc2 oder mCherry, der durch den linsenspezifischen Promotor von αcyrstallin gesteuert wird, die in unterschiedlichen Zielvektoren enthalten sind.
- Lassen Sie die Embryonen, die für die transgene Insertion positiv sind, sich vollständig zu den adulten Zebrafischstadien entwickeln.
- Sobald potenzielle transgene Fische das Brutalter erreicht haben, werden sie einzeln auf Keimbahnübertragung und Transgenexpressivität untersucht, indem sie mit Wildtyp-Zebrafischen verpaart werden.
- Diejenigen erwachsenen Tiere, deren Embryonen sich normal entwickeln und die stärkste und am besten geeignete Transgenexpression liefern, werden als einzigartige transgene Zebrafischlinien für zukünftige Arbeiten und Analysen aufbewahrt.
HINWEIS: Als alternativen Ansatz für das Screening auf die genomische Insertion transgener Konstrukte sollten PCR-Primer entwickelt werden, die nur das transgene Konstrukt und keine Wildtyp-DNA amplifizieren.
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Representative Results
Um die transgenen Konstrukte zu generieren, verwendeten wir das Tol2-Transgenese-System. Drei Eintrittsvektoren, darunter p5E, das die Genpromotor/Enhancer-Elemente enthält, pME, das das Gen enthält, das von den Promotor/Enhancer-Elementen exprimiert werden soll, und p3E, das mindestens den polyA-Schwanz enthält, wurden verwendet, um das transgene Konstrukt über Multisite-Gateway-LR-Klonierung zu generieren. Der Zielvektor pDest liefert die Tol2-Wiederholungen für die genomische Insertion des transgenen Konstrukts in Zebrafischembryonen und enthält alle wesentlichen genetischen Informationen für das Bakterienwachstum (Abbildung 1A). Für die Zwecke dieses Manuskripts haben wir ein transgenes sox17:EGFPCAAX-Konstrukt erstellt und injiziert. Der Promotor des Endodermmarkers, sox17, wurde verwendet, um membranmarkiertes EGFP im sich entwickelnden Endoderm des Zebrafisches zu steuern. Für transgene Konstrukte, die Nicht-Fluorophor-Proteine exprimieren, kann ein pDest-Vektor, der einen fluoreszierenden transgenen Marker wie cmlc2:EGFP enthält, verwendet werden, um die genomische Insertion zu unterstützen (Abbildung 1A).
Unter Verwendung der im obigen Protokoll beschriebenen Werte (Tabelle 2) wurde das transgene Konstrukt sox17:EGFPCAAX generiert und 4 μL dieses Konstrukts in chemisch kompetente Escherichia coli-Zellen transformiert. Nach Inkubation bei 37 °C über Nacht enthielt die Agarplatte etwa 250 Kolonien (LR-Reaktionen in unserem Labor typischerweise durchschnittlich 150-300 Kolonien pro Platte). Das Screening dieser Kolonien wurde anhand der Opazität durchgeführt. In unseren Händen hatten Kolonien, die klar waren, >85% der Zeit das richtige sox17:EGFPCAAX-Produkt , während die undurchsichtigen Kolonien nie das richtige Rekombinationsprodukt enthielten (Abbildung 1B, Pfeilspitze vs. Pfeil). Nach der Isolierung des Plasmids aus mehreren Kolonien wurde der Restriktionsaufschluss der rekombinanten Produkte mit dem Restriktionsenzym NcoI durchgeführt. Es wurden zwei verschiedene klare Kolonien und eine undurchsichtige Kolonie verdaut. Beide klaren Kolonien hatten eine einzelne Bande in der korrekten Größe von 9.544 bp (unverdaute Plasmide, die als Verdauungskontrolle geladen wurden), während die undurchsichtige Kolonie überhaupt keine Banden aufwies (Abbildung 2A). Diese positiven sox17:EGFPCAAX-Konstrukte wurden retransformiert, die nachfolgenden Kolonien wurden neu gestreift, es wurde bestätigt, dass diese Kolonien das Plasmid besaßen, und es wurden Bakteriengefriervorräte von −80 °C erzeugt. Die Konzentrationen sowohl des sox17:EGFPCAAX-Plasmids als auch der Capped-Transposase-mRNA wurden bestimmt, so dass beide für die Injektion verwendet werden konnten (Abbildung 2B).
Die Embryonen wurden für die Injektion vorbereitet, indem ein Embryo im Zellstadium in eine vorgewärmte Embryoinjektionsform gegeben wurde (Abbildung 3A-C). Nach dem Einsetzen in die Spritzgussform wurde die Injektionsnadel mit der sox17:EGFPCAAX-mRNA in einen Mikropipettenhalter auf dem Mikromanipulator gelegt (Abbildung 3D, E). Den Embryonen wurden 100 ng Transposase-mRNA, 150 ng Sox17:EGFPCAAX-Plasmid und Phenolrot (Injektions-Tracking-Farbstoff) injiziert. Ein Bolus von 3 nL (bestimmt durch die Größe, wie im Protokoll beschrieben, Schritt 6.6) wurde in den Zellkörper und nicht in das Eigelb des Embryos injiziert, um die besten Integrationschancen zu haben (Abbildung 3F)10.
Nach der Injektion wurden die Embryonen aus der Spritzgussform entnommen und 24 Stunden lang entwickelt. 24 h nach der Befruchtung (hpf) wurden die Embryonen auf die Endodermexpression von EGFPCAAX untersucht. Die EGFPCAAX-Expression des Mosaik-Endoderms wurde in ~75% der injizierten Embryonen beobachtet (Abbildung 4A,A'). Für das Screening der Embryonen, die mit nicht-fluoreszierenden Transgenen wie Gal4 oder CreERT2 injiziert wurden, kann ein Zielvektor verwendet werden, der auch einen transgenen Marker (d. h. cmlc2:EGFP) enthält (Abbildung 1A) (Abbildung 4B,B'). Adulte Zebrafische, die eine Keimbahntransgenese von sox17:EGFPCAAX aufwiesen, erzeugten fluoreszierende Embryonen, wobei das Endoderm vollständig mit EGFPCAAX markiert war (Abbildung 4C).
Mit Hilfe der neu geschaffenen transgenen Linie sox17:EGFPCAAX konnten wir den Einfluss von Ethanol auf die Bildung der endodermalen Pouches direkt beurteilen. Bei den Beuteln handelt es sich um Vorsprünge, die sich am lateralen Rand des Endoderms bilden und für die Bildung des Gesichtsskeletts und der multiplen Organsysteme wichtig sind17. Wir haben bereits gezeigt, dass die Blockierung des Knochen morphogenetischen Proteins (Bmp) zu einer Hypoplasie der Taschen führt18. Wir zeigen nun, dass die Ethanolbehandlung von Bmp-Mutanten von 10-18 hpf einen subtilen, aber signifikanten Einfluss auf die Beutelgröße hat. Die dorsal-ventrale Länge jedes Beutels aus den Beuteln 1-5 (Zebrafische haben sechs Beutel, aber der sechste hatte sich im abgebildeten Entwicklungsstadium noch nicht vollständig gebildet) wurde in Kontroll- und Ethanol-behandelten Wildtyp-Bmp-mutierten Embryonen gemessen (Abbildung 5A). Als Kontrolle für allgemeine Wachstumseffekte aufgrund der Ethanolexposition wurde die anterior-posteriore Länge des gesamten Endoderms gemessen (Abbildung 5A). Die Gesamtlänge des Endoderms wurde weder durch den Genotyp noch durch die Behandlung beeinflusst (Abbildung 5B). Die Beutel 1 und 3 zeigten jedoch eine signifikante Zunahme der Beutellänge zwischen den unbehandelten und den mit Ethanol behandelten Wildtyp-Embryonen, aber eine signifikante Abnahme der Länge zwischen den unbehandelten und den mit Ethanol behandelten Bmp-Mutanten (Abbildung 5C; bidirektionale ANOVA; Beutel 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; Beutel 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). Pouch 2 zeigte signifikante Anstiege der Pouch-Größe zwischen der unbehandelten und der ethanolbehandelten Wildtyp- bzw. Bmp-Mutantengruppe (Abbildung 5C; Zwei-Wege-ANOVA; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001).
Abbildung 1: LR-Gateway-Reaktion für den Aufbau von Transgenen . (A) Schematische Darstellung der modularen vierteiligen LR-Gateway-Klonierungsreaktion. LR Clonase rekombiniert die drei Eintrittsvektoren p5E, pME und p3E sowie den Zielvektor pDest in einer hochspezifischen Reaktion, um ein neuartiges transgenes Produkt zu erzeugen, das für die Embryoinjektion bereit ist. Für das Screening von nicht-fluoreszierenden Transgenen können pDest-Vektoren optionale transgene Marker enthalten (z. B. cmlc2:EGFP). (B) Beispielhafte Bakterienkolonien, die aus der Transformation der LR-Rekombinationsprodukte gewonnen wurden. Klare Kolonien enthielten >85% der Zeit ein korrektes LR-Rekombinationsprodukt (Pfeilspitze), während undurchsichtige Kolonien nie ein korrektes Rekombinationsprodukt enthielten (Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Analyse der Plasmid-DNA und der Transposase-mRNA . (A) Diagnostischer Verdau der drei Kolonien aus der Transformation der LR-Rekombinationsprodukte. Die einzelne undurchsichtige Kolonie enthielt kein Plasmid zum Screenen, während die beiden klaren Kolonien eine einzelne Bande mit 9.544 bp (uncut vs. cut) enthielten. (B) Transposase mRNA bei 1.950 bp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Aufbau der Injektion von Zebrafisch-Embryonen. (A) Eine Spritzgussform wird in flüssige Agarose gegeben, die in EM verdünnt ist (3 % v/v). (B) Nach dem Erstarren wird die Form von der Agaroseplatte entfernt. (C) Die Embryonen werden in den Spritzgussformen angeordnet. (D,E) Das mRNA/Plasmid/Phenolrot-Gemisch wird in die Injektionsnadel pipettiert, die im Mikropipettenhalter des Mikromanipulators platziert wird. (F) Ein 3-ml-Bolus wird im Ein-Zell-Stadium in den Zellkörper des Embryos injiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Screening von Zebrafischen, denen das transgene Konstrukt injiziert wurde. (A,A') Die konfokale Aufnahme eines Embryos, die bei 24 hpf aufgenommen wurde, zeigt die Mosaikexpression des sox17:EGFPCAAX-Transgens. (B,B') Transgene Markerexpression von cmlc2:EGFP im sich entwickelnden Herzen bei 24 hpf. Seitliche Ansichten der Embryonen, mit vorne nach links und dorsal oben. (C) Konfokales Bild eines Embryos, der von einem transgentragenden adulten Zebrafisch erzeugt wurde. Das gesamte Endoderm exprimiert EGFPCAAX. Seitliche Ansicht des Embryos, mit vorne links und ventral oben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Pouch-Messungen in ethanolbehandelten Wildtyp- und Bmp-mutierten Embryonen. (A) Schematische Darstellung der Messung der Gesamtlänge des Endoderms und der Länge der Beutel. (B) Die Messungen der Gesamtlänge des anterior-posterioren Endoderms zeigen keinen Unterschied zwischen unbehandelten und ethanolbehandelten Wildtyp- und Bmp-mutierten Embryonen. (C) Die Messungen der dorsal-ventralen Beutellänge deuten darauf hin, dass die Beutel 1 und 3 eine Zunahme der Beutellänge zwischen den unbehandelten und den mit Ethanol behandelten Wildtyp-Embryonen aufweisen, aber zwischen den unbehandelten und den mit Ethanol behandelten Bmp-Mutanten abnehmen (Zwei-Wege-ANOVA; Beutel 1: F(1,54) = 10,39 , p = 0,0021; Beutel 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). Pouch 2 zeigt eine Längenzunahme zwischen der unbehandelten und der ethanolbehandelten Wildtyp- und Bmp-Mutantengruppe (zweifache ANOVA; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001). Es wurden keine Unterschiede in der Beutellänge zwischen den Beuteln 4 und 5 beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Tol2Kit-Komponenten, die im Lovely Lab untergebracht sind. Alle Einträge und Zielvektoren, die im Lovely Lab verfügbar sind, ihre Beschreibungen und ihr Herkunftslabor. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Berechnung der Menge und Abstimmung der einzelnen Vektoren in der LR-Rekombinationsreaktion. Die Menge jedes Vektors wurde aus der Größe (in bp) und dem fmol berechnet, das für jede Komponente benötigt wird: 10 fmol jedes Eingangsvektors und 20 fmol des Zielvektors. Aus der Plasmidkonzentration wird jeder Vektor in sterilem Wasser verdünnt, um der LR-Reaktion 1 μl oder weniger hinzuzufügen. Steriles Wasser wird in den Vektorpool gegeben, um 4 μl zu entsprechen, 1 μl LR-Reaktionsmischung wird der Reaktion zugesetzt und es wird über Nacht bei 25 °C inkubiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Zebrafische eignen sich hervorragend, um die Auswirkungen einer Ethanolexposition auf Entwicklungs- und Krankheitszustände zu untersuchen 7,8. Zebrafische produzieren eine große Anzahl von durchscheinenden, extern befruchteten, genetisch beherrschbaren Embryonen, was die Live-Bildgebung mehrerer transgenmarkierter Gewebe und Zelltypen gleichzeitig in mehreren Umweltkontexten ermöglicht19,20. Diese Stärken, kombiniert mit der starken entwicklungsgenetischen Konservierung beim Menschen, machen Zebrafische zu einem leistungsfähigen Modellsystem für die Abbildung der Auswirkungen von Ethanol 7,8. In dieser Arbeit haben wir das Protokoll für einen modularen Ansatz zur Generierung und Injektion transgener Konstrukte und zur Etablierung transgener Zebrafischlinien für zukünftige Ethanolstudien beschrieben.
Es gibt viele verschiedene Ansätze, um transgene Zebrafische zu erzeugen. Die Erzeugung sowohl transgener Konstrukte als auch transgener Linien kann jedoch entmutigend sein. Herkömmliche Subklonierungstechniken, BAC-Klonierung oder PCR-basierte Ansätze wie die Gibson-Assemblierung ermöglichen zwar die Erzeugung transgener Konstrukte, weisen jedoch einen geringen Durchsatz auf und es fehlt ihnen an Vielseitigkeit in ihrer Konstruktion10. Darüber hinaus müssen diese Strategien für jedes erzeugte transgene Konstrukt neu konzipiert werden. Das Subklonen erfordert mehrere Verdauungen und Ligaturen, vorausgesetzt, alle erforderlichen Restriktionsstellen sind vorhanden und einzigartig. Das Klonen von BACs erfordert die Sequenzierung und das Testen mehrerer BAC-Klone. Für die Gibson-Assemblierung müssen für jedes transgene Konstrukt neue PCR-Primer entwickelt werden. Darüber hinaus führt die Injektion von entweder ungeschnittener oder linearisierter DNA zu einer geringen Keimbahnübertragung21,22,23.
Das Tol2Kit ist ein modulares System, das die Gateway-Klonierung nutzt, um vollständige transgene Konstrukte zu erzeugen, die von Tol2-Wiederholungen flankiert werden, die in Kombination mit Transposase-mRNA die Transgenese und Keimbahnübertragung stark erhöhen 10,11,24,25. Dutzende von Eingangs- und Zielvektoren sind im Kwan-Labor und im Cole-Labor10,11 verfügbar. Darüber hinaus haben Zebrafischlabore, die das Tol2Kit verwenden, viele weitere Eingangs- und Zielvektoren generiert und kuratiert. Als Beispiel für die Breite der verfügbaren Vektoren haben wir über 70 Vektoren zusammengefasst und verwendet (Tabelle 1). Mit all diesen gemeinschaftlichen Ressourcen kann man schnell Tausende von verschiedenen transgenen Konstrukten erzeugen, indem man einfach die Vektoren der Wahl in einer LR-Reaktion kombiniert.
Optimale LR-Reaktionen erfordern exakte Berechnungen der Plasmidgröße und -konzentration. Die Berechnungen für jeden Vektor werden in Femtomol-Werten (fmol) durchgeführt, so dass jede Reaktion kein hohes Plasmidvolumen benötigt, um ein transgenes Konstrukt zu erzeugen. Diese geringe Menge an Plasmid macht jedoch Verdünnungen und richtiges Pipettieren äußerst entscheidend für den Erfolg der Reaktion10. Weitere Faktoren, die die LR-Reaktion beeinflussen können, sind die Größe der Inserts in den verschiedenen Eintrittsvektoren. Zum Beispiel ist das in dieser Studie verwendete p5E-sox17-Element über 4 kb groß, was in Kombination mit gleich großen pME- und p3E-Elementen zu einem sehr großen transgenen Vektor führt. Ein großes Plasmid in Bakterien kann schwer zu kultivieren sein, wodurch die Anzahl der Kolonien, die durch die bakterielle Transformation entstehen, verringert wird. Dies führt auch zu einem langsameren Wachstum und verringerten Plasmidspiegeln, wenn isoliertwird 10. Wichtig ist, dass hochkompetente Bakterienzellen sowie die Erhöhung der Inkubation der Bakterienzellen während der Transformation des Rekombinationsplasmids der Schlüssel zur Bildung ausreichender Kolonien sind, um die richtige Transgenbildung zu erfassen. Darüber hinaus spielt auch die Verwendung des richtigen LR-Reaktionsenzyms (aufgeführt in der Materialtabelle) eine große Rolle für den Erfolg der LR-Reaktion.
Neben der Erzeugung eines transgenen Konstrukts und bakteriellen Transformationen können auch die Embryoinjektion und die Genomintegration schwierig sein. Die Erzeugung von qualitativ hochwertiger Transposase-mRNA erhöht die Häufigkeit der genomischen Integration erheblich10. Die gezogenen Kapillaren müssen kurz vor der Injektion der Embryonen hergestellt werden, da ältere Nadeln ihre Kapillarwirkung verlieren können (d. h. die Injektionsflüssigkeit bewegt sich nicht zur Nadelspitze) (Abbildung 3E). Sowohl das Brechen der Nadelspitze, um nur ~3 nL Flüssigkeit zu injizieren, als auch das Injizieren des Zellkörpers erfordern Übung. Unser Trainingsprotokoll sieht vor, den Zellkörper nur mit phenolrotem Injektionsfarbstoff zu injizieren, bis das Abbrechen der Nadel und die Injektion der Embryonen gemeistert sind. Die Injektion des Zellkörpers erhöht die Rate der Genomintegration drastisch10. Wenn wir all dies kombinieren, erhalten wir durchschnittlich 75 % oder mehr Genominsertion und Mosaikexpression, aber dies kann von Konstrukt zu Konstrukt variieren.
Da die genomische Insertion zufällig sein kann, ist jeder Embryo, der eine Mosaikexpression zeigt, eine einzigartige transgene Insertion und erfordert ein kontinuierliches Screening. Dieses fortgesetzte Screening ist notwendig, um zu zeigen, dass die Integrationsstelle die Entwicklung des Embryos nicht beeinträchtigt, dass eine Keimbahnübertragung stattfindet und dass die Expression des Transgens nicht abgeschwächt oder möglicherweise zum Schweigen gebracht wird. Sobald eine transgene Linie etabliert ist, kann sie problemlos für mehrere Analysen in Ethanolstudien verwendet werden. Zu den häufig verwendeten transgenen Markern für diese nicht-fluoreszierenden transgenen Konstrukte gehören cmlc2:GFP und αcrystallin:RFP, die das Herz bzw. die Netzhaut markieren und ein kontinuierliches transgenes Screening ermöglichen. Zusätzlich zu transgenen Markern für das Screening können diese beiden Transgene verwendet werden, um den Einfluss von Ethanol auf die Entwicklung von Herz und Netzhaut direkt zu untersuchen.
Mit Hilfe des oben beschriebenen Protokolls generierten wir eine transgene Zebrafischlinie sox17:EGFPCAAX , die eine stabile Keimbahnübertragung eines Endoderm-spezifischen membranmarkierten EGFP-Konstrukts aufwies. Mit dieser Linie konnten wir den Einfluss von Ethanol auf die Bildung von endodermalen Beuteln in ethanolsensitiven Bmp-mutierten Embryonen messen. Wir konnten zeigen, dass die Größe der Beutel 1-3, aber nicht die der Beutel 4 und 5 oder die Gesamtlänge des Endoderms in ethanolbehandelten Bmp-Mutanten beeinflusst wurden (Abb. 5). Diese Pilotarbeit deutet darauf hin, dass die Bmp-Ethanol-Wechselwirkung die Endodermbildung stört, insbesondere das Zellverhalten, das der Pouch-Bildung zugrunde liegt. Diese Arbeit veranschaulicht beispielhaft die Nützlichkeit der Generierung transgener Zebrafischlinien für Ethanolstudien. Infolgedessen wird die Schaffung neuartiger transgener Linien unser Verständnis von ethanolsensitiven zellulären Prozessen und Gewebeereignissen bei FASD erheblich verbessern.
Letztendlich haben sich transgene Zebrafische und Zebrafische im Allgemeinen bei der Untersuchung von FASD als unglaublich leistungsfähig erwiesen 7,8. Das Tol2Kit ist ein äußerst vielseitiges Toolkit, das es Forschern ermöglicht, schnell mehrere transgene Konstrukte zu generieren, die in Zebrafische injiziert werden können. Der modulare Aufbau und die einfache Generierung neuer Eintrittsvektoren führen zu einer extremen Flexibilität bei der Erzeugung transgener Konstrukte, ohne dass Komponenten neu entworfen werden müssen. Insgesamt wird dieses Toolkit sowohl die Zebrafischforschung als auch die Forschung im Allgemeinen, die darauf abzielt, das Verständnis von FASD zu verbessern, erheblich verbessern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die in diesem Artikel vorgestellte Forschung wurde durch einen Zuschuss der National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 an C.B.L. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawson Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
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