Summary
Detta arbete beskriver ett protokoll för det modulära Tol2-transgenessystemet, en gateway-baserad kloningsmetod för att skapa och injicera transgena konstruktioner i zebrafiskembryon.
Abstract
Fetala alkoholspektrumstörningar (FASD) kännetecknas av en mycket varierande uppsättning strukturella defekter och kognitiva funktionsnedsättningar som uppstår på grund av prenatal etanolexponering. På grund av FASD: s komplexa patologi har djurmodeller visat sig vara avgörande för vår nuvarande förståelse av etanolinducerade utvecklingsdefekter. Zebrafisk har visat sig vara en kraftfull modell för att undersöka etanolinducerade utvecklingsdefekter på grund av den höga graden av bevarande av både genetik och utveckling mellan zebrafisk och människor. Som modellsystem har zebrafiskar många attribut som gör dem idealiska för utvecklingsstudier, inklusive ett stort antal externt befruktade embryon som är genetiskt lätthanterliga och genomskinliga. Detta gör det möjligt för forskare att exakt kontrollera tidpunkten och doseringen av etanolexponering i flera genetiska sammanhang. Ett viktigt genetiskt verktyg som finns i zebrafisk är transgenes. Att generera transgena konstruktioner och etablera transgena linjer kan dock vara komplicerat och svårt. För att ta itu med detta problem har zebrafiskforskare etablerat det transposonbaserade Tol2-transgenessystemet. Detta modulära system använder en multisite Gateway-kloningsmetod för snabb montering av kompletta Tol2-transposonbaserade transgena konstruktioner. Här beskriver vi den flexibla verktygslådan för Tol2-systemet och ett protokoll för att generera transgena konstruktioner redo för zebrafisktransgenes och deras användning i etanolstudier.
Introduction
Prenatal etanolexponering ger upphov till ett kontinuum av strukturella underskott och kognitiva funktionsnedsättningar som kallas fetalt alkoholspektrumstörningar (FASD)1,2,3,4. De komplexa relationerna mellan flera faktorer gör det svårt att studera och förstå etiologin för FASD hos människor. För att lösa denna utmaning har en mängd olika djurmodeller använts. De biologiska och experimentella verktyg som finns tillgängliga i dessa modeller har visat sig vara avgörande för att utveckla vår förståelse av den mekanistiska grunden för etanolteratogenicitet, och resultaten från dessa modellsystem har varit anmärkningsvärt överensstämmande med vad som finns i humana etanolstudier 5,6. Bland dessa har zebrafiskar framkommit som en kraftfull modell för att studera etanolteratogenes7,8, delvis på grund av deras yttre befruktning, hög fecunditet, genetisk smidighet och genomskinliga embryon. Dessa styrkor kombineras för att göra zebrafiskar idealiska för realtidsstudier av FASD med transgena zebrafisklinjer.
Transgena zebrafiskar har använts i stor utsträckning för att studera flera aspekter av embryonal utveckling9. Att skapa transgena konstruktioner och efterföljande transgena linjer kan dock vara mycket svårt. En standardtransgen kräver ett aktivt promotorelement för att driva transgenen och en poly A-signal eller "svans", allt i en stabil bakterievektor för allmänt vektorunderhåll. Den traditionella genereringen av en multikomponenttransgen konstruktion kräver flera tidskrävande underkloning steg10. PCR-baserade metoder, såsom Gibson-montering, kan kringgå några av de problem som är förknippade med subkloning. Unika primers måste dock utformas och testas för generering av varje unik transgen konstruktion10. Utöver transgenkonstruktion har genomisk integration, överföring av könsceller och screening för korrekt transgenintegration också varit svårt. Här beskriver vi ett protokoll för användning av det transposonbaserade Tol2-transgenessystemet (Tol2Kit)10,11. Detta modulära system använder multisite Gateway-kloning för att snabbt generera flera transgena konstruktioner från ett ständigt växande bibliotek med "entry" och "destination" -vektorer. Integrerade transponerbara Tol2-element ökar kraftigt transgeneshastigheten, vilket möjliggör snabb konstruktion och genomisk integration av flera transgener. Med hjälp av detta system visar vi hur genereringen av en endoderm transgen zebrafisklinje kan användas för att studera de vävnadsspecifika strukturella defekter som ligger bakom FASD. I slutändan visar vi i detta protokoll att den modulära installationen och konstruktionen av transgena konstruktioner i hög grad kommer att hjälpa zebrafiskbaserad FASD-forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla zebrafiskembryon som användes i detta förfarande uppföddes och förädlades enligt fastställda IACUC-protokoll12. Dessa protokoll godkändes av University of Louisville.
OBS: Den vilda zebrafiskstammen, AB, och bmp4st72;smad5b1100 dubbelmutantlinjen användes i denna studie. Allt vatten som användes i denna procedur var sterilt omvänd osmosvatten. Konfokala bilder togs under ett laserskannande konfokalmikroskop. Endodermmätningarna gjordes med hjälp av mätverktyget i ImageJ. Alla statistiska analyser utfördes med hjälp av statistisk programvara.
1. Att göra lösningarna och media
- Bakteriemedia: Lös LB-buljong eller agar enligt tillverkarens instruktioner och autoklav. Innan du häller mediet i 100 mm petriskålar, tillsätt antingen ampicillin (50 μg/ml), kanamycin (50 μg/ml) eller en kombination av ampicillin/kloramfenikol (50 μg/ml respektive 30 μg/ml).
- För att göra 20x embryomedia, lös följande i 1 liter vatten: 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl2, 0,41 g K2HPO 4, 0,142 gNa2HPO4 och4,9 gMgSO4·7H2O. Filtersterilisera stamlösningen med ett 0,22 μm vakuumfiltreringssystem, och förvaras vid 4 °C.
OBS: Ignorera den vita fällningen som bildas; Detta kommer inte att påverka media. - Lös 1,2 g NaHCO3 i 19 l vatten och tillsätt 1 l av embryomediestammen 20x för att generera den fungerande embryomedielösningen och håll denna lösning vid 28 °C.
- För 2% fenolröd lösning, lös 20 mg fenolrött natriumsalt i 1 ml RNasfritt vatten och förvara vid rumstemperatur.
2. Formar för embryoinjektion
- För att göra agarosinjektionsplattan, lös agaros i embryomediet till en slutlig koncentration av 3% genom uppvärmning till koka.
- Häll 50 ml agaros i 100 mm petriskålar, och medan agarosen fortfarande är flytande, placera försiktigt formsprutningsformen i agarosen för att förhindra bubbelbildning under formen.
- Låt agarosplattorna svalna. När agarosen är fast, ta bort formsprutningsformen och förvara den vid 4 °C tills den är klar att användas.
3. Injektionspipetter
- Dra 1,0 mm (OD) kapillärer som innehåller ett filament i nålar med en vertikal pipettavdragare med solenoiden inställd på 2,5 och värmeelementet inställt på 14,6.
OBS: Varje uppvärmd avdragare fungerar om den drar kapillärerna i två nålar rent och jämnt, men injektionsnålarna måste dras inom 1 vecka efter injektion av zebrafiskembryon för konsekventa injektionsresultat.- Placera kapillären i avdragaren, dra åt klämman i varje ände och aktivera sedan värmeelementet.
- Dra kapillärerna för att skapa två injektionsnålar.
- Ta bort kapillärerna från avdragaren och förvara dem i en tom petriskål med en remsa modelleringslera som fungerar som nålhållare.
4. Transposas mRNA-preparat
- Linjärisera den Tol2Kit-plasmid som innehåller transposas med ett NotI-restriktionsendonukleas genom att kombinera följande i ett 0,5 ml mikrocentrifugrör: 10 μL transposasplasmid (150 ng/μl), 1,5 μl restriktionsendonukleasreaktionsbuffert, 0,3 μl NotI-endonukleas.
- Fyll reaktionen upp till 20 μl med RNasfritt vatten och blanda sedan och smält vid 37 °C över natten.
- Stoppa transposasuppslutningen genom att tillsätta 1 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μL 5 MNH4OAc och 80 μL 100% EtOH till digestionsreaktionen och blanda sedan och kyla vid −20 °C över natten.
- Centrifugera lösningen vid 14 000x g i 20 minuter vid 4 °C och aspirera sedan supernatanten och suspendera DNA-pelleten på nytt i RNasfritt vatten.
- Bestäm den linjära plasmidkoncentrationen i nanogram per mikroliter (ng/μl) med hjälp av en fluorometer genom att först köra 2 μl av ett RNasfritt vattenprov och sedan köra 2 μL av den linjäriserade plasmiden.
OBS: Plasmidkoncentrationerna varierar vanligtvis mellan 100-200 ng / μL - Ställ in SP6 mRNA-produktionen genom att kombinera följande komponenter i ordning i ett 0,5 ml mikrocentrifugrör: 10 μL 2x NTP / CAP, 2 μL 10x reaktionsbuffert, 0,1-1 μg linjär DNA-mall och 2 μL SP6-enzymblandning.
- Fyll reaktionen upp till 20 μl med RNasfritt vatten och blanda sedan och inkubera vid 37 °C i 2 timmar.
- Efter inkubation i 2 timmar, tillsätt 1 μl DNase, blanda väl och inkubera i ytterligare 15 minuter vid 37 °C.
- För att stoppa SP6-reaktionen, tillsätt 30 μL LiCl-utfällningslösning till reaktionsröret och blanda sedan och kyla vid -20 ° C över natten.
- Centrifugera lösningen vid 14 000 x g i 20 minuter vid 4 °C för att pellet mRNA och aspirera sedan supernatanten och tvätta mRNA-pelleten med 1 ml 80% EtOH (utspätt med RNasfritt vatten).
- Centrifugera lösningen vid 14 000 x g i 20 minuter vid 4 °C för att pellet mRNA och aspirera sedan supernatanten. Låt pelletsen lufttorka.
- Återsuspendera mRNA-pelleten i 20 μL RNasfritt vatten, bestäm mRNA-koncentrationen i nanogram per mikroliter (ng/μL) med hjälp av en fluorometer enligt beskrivningen i steg 4.5 (bör vara minst 100 ng/μl), alikvot 100 ng mRNA per rör för engångsbruk och lagra vid −80 °C.
OBS: För att säkerställa att mRNA inte bryts ned kan 2 μL mRNA snabbt köras på en DNA-elektroforesgel för att bekräfta ett enda band vid 1,950 bps.
5. Multisite Gateway-kloning för att skapa ingångsvektorer för transgenes
OBS: Detta protokoll är modifierat från Kwan et al.10, med LR-reaktionen skriven som en halv-LR-reaktion och med en total volym på 5 μL. För att generera nya ingångselement måste BP-reaktioner med 5', mellersta och 3' givarvektorer användas10,13.
- För att utföra reaktionen, samla 10 fmol vardera av p5E, pME och p3E och 20 fmol av destinationsvektorn (pDest).
OBS: Multisite LR-rekombination använder fyra olika plasmidvektorer: en 5'-ingångsvektor (p5E), en mittingångsvektor (pME), en 3'-ingångsvektor (p3E) och en destinationsvektor (pDest), för att generera en unik transgen konstruktion flankerad av Tol2-upprepningar redo att injiceras i zebrafiskembryon.- Identifiera storleken på alla fyra vektorerna i baspar från plasmidkällan (tabell 1, Tol2Kit Wiki sidan14 eller Addgene11; se materialförteckningen).
OBS: För nya vektorer kan fullständig plasmidsekvensering via kommersiella sekvenseringsföretag ge den exakta plasmidstorleken i bps. - Bestäm koncentrationen av alla fyra vektorerna i nanogram per mikroliter (ng / μL) med hjälp av en fluorometer, som beskrivs i steg 4.5.
- Använd DNA-vikten som 660 g / mol och plasmidstorleken (i bps), beräkna det totala nanogrammet (ng) plasmid som behövs för att nå antingen 10 fmol (ingångsvektorer) eller 20 fmol (destinationsvektor).
Mosimann-laboratoriet vid University of Colorado, Anschutz Medical Campus, har genererat ett fritt tillgängligt kalkylblad för att beräkna mängden plasmid som behövs (i ng) och volymen (i μL) av vektorerna som behövs i LR-reaktionen15.
- Identifiera storleken på alla fyra vektorerna i baspar från plasmidkällan (tabell 1, Tol2Kit Wiki sidan14 eller Addgene11; se materialförteckningen).
- För att generera konstruktionen som beskrivs nedan, sox17:EGFPCAAX, använd följande vektorer: en p5E-vektor som innehåller zebrafiskpromotorn sox17, som är 6 918 bp i storlek16; En pME-vektor som innehåller det prenylerade EGFP-programmet, som är 3,345 bp stort10. en p3E-vektor som innehåller SV40-signalsekvensen för sen poly A, som är 2,838 bp i storlek10, och pDest, som är 5 883 bp i storlek10.
- Beräkna med hjälp av den plasmidkoncentration som bestämts i steg 5.1.2 och mängden i nanogram (ng) för varje vektor (steg 5.1.3) den totala mikroliter (μL) av varje plasmid som behövs för att nå antingen 10 fmol (ingångsvektorer) eller 20 fmol (destinationsvektor) och dela sedan denna med två för användning i 5 μL halv-LR-reaktioner (alla värden som anges nedan anges i tabell 2).
- För att generera 10 fmol p5E-sox17, använd 45,66 ng (vid en koncentration av 140,3 ng / μL) och späd med sterilt vatten med en faktor 4 för att få 0,65 μL.
- För att generera 10 fmol pME-EGFPCAAX, använd 22,08 ng (vid en koncentration av 213,5 ng / μL) och späd med sterilt vatten med en faktor 10 för att få 0,52 μL.
- För att generera 10 fmol p3E-poly A, använd 15,73 ng (vid en koncentration av 276,1 ng / μL) och späd med sterilt vatten med en faktor 20 för att få 0,57 μL.
- För 20 fmol av destinationsvektorn, använd 77,66 ng pDest (vid en koncentration av 307,3 ng / μL) och späd med sterilt vatten med en faktor 5 för att få 1,63 μL.
- För att ställa in en 5 μL halv-LR-reaktion, kombinera volymerna av p5E, pME, p3E och pDest bestämda i steg 5.3 i ett 0,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt sedan sterilt vatten för att nå en total reaktionsvolym på 4 μL.
- Virvla LR-enzymblandningen kraftigt 2x i 1 minut vardera för att säkerställa korrekt blandning och tillsätt sedan 1 μL till reaktionen och blanda noggrant.
- Inkubera vid 25 °C över natten (16+ timmar).
- Avbryt LR-reaktionen genom att tillsätta 0,5 μl proteinas K (2 μg/μl), inkubera vid 37 °C i 10 minuter och låt sedan svalna till rumstemperatur.
- Omvandla 3-4 μL plasmid till tinade, kemiskt kompetenta celler genom att tillsätta plasmiden och låta cellerna sitta på is i 25-30 minuter.
- Medan cellerna sitter på is, värm två LB-ampicillinagarplattor till rumstemperatur.
- Värmechocka cellerna i ett 42 ° C vattenbad i exakt 30 sekunder.
- Efter värmechocken tillsätts 250 μl antibiotikafritt, rikt flytande medium till cellerna och inkuberas med skakning vid 37 °C i 1,5 timmar.
- Sprid 300 μL bakterier på en ampicillinplatta och inkubera vid 37 ° C över natten.
- Nästa morgon, screena kolonierna för förekomst av två fenotyper, klara och ogenomskinliga, plocka de klara kolonierna (som beskrivs i Kwan et al.10) en i taget, inokulera den flytande kulturen och skaka sedan vid 37 ° C över natten.
OBS: Klara kolonier innehåller nästan alltid rätt LR-koloni (>85% av tiden). - Använd ett kommersiellt kit enligt tillverkarens instruktioner, utför en plasmidberedning på varje flytande kultur och smälta diagnostiskt varje plasmid för att bekräfta lämplig storlek på den transgena konstruktionen, vilket indikerar att LR-gatewayreaktionen har fungerat korrekt.
- Omforma de korrekta transgena konstruktionerna med hjälp av standardprotokollet för bakteriell transformation enligt beskrivningen i steg 5.4–5.12 med användning av 0,5–1 μl plasmid, och inkubera endast vid 37 °C i 1 timme.
- Stryk kolonierna igen och bekräfta att var och en har den transgena LR-konstruktionen som i steg 5.14.
- Bestäm plasmidkoncentrationen enligt beskrivningen i steg 4.5 (minst 150 ng/μl behövs för embryoinjektionen).
6. Injektion av transgenen i embryon
- Tina ett transposas-mRNA-prov för engångsbruk och Tol2-transgen konstruktion på is och förvarna en agarosinjektionsplatta till rumstemperatur.
- Kombinera följande på is: 150 ng plasmid, 100 ng transposas mRNA och 2% fenolrött (0,3 μL). Tillsätt sedan RNA-fritt vatten för att fylla volymen till 3 μL.
- Överför ett embryo i cellstadiet med överföringspipetter till injektionsplattan (beskriven i steg 2) fylld med EM som helt täcker agaren och tryck sedan försiktigt in cirka 50-75 embryon per spår på injektionsplattan.
- Tillsätt den röda blandningen mRNA/plasmid/fenol i den öppna änden av en kapillärinjektionsnål, placera kapillärnålen i insprutningsriggens armatur och slå på insprutningsriggen.
OBS: Insprutningsriggen använder komprimerad gas, såsom luft, för att pulsera den önskade volymen (beskrivs i steg 6.5) av mRNA / plasmid / fenolröd blandning i embryot när den aktiveras. - Sänk ner kapillärnålen i EM på injektionsplattan och bryt spetsen med pincett så att endast en liten mängd mRNA/plasmid/fenolröd blandning kan pumpas ut av injektionsriggen.
- Injicera embryona med en liten 3 nL bolus av mRNA/plasmid/fenolröd blandning i embryots cellkropp.
OBS: En 3 nL bolus är en volym mRNA / plasmid / fenol röd blandning vid vilken sju bolusar teoretiskt kan passa lika över embryots mittlinje. - När embryona injicerats färdigt avlägsnas de från injektionsplattan genom att försiktigt poppa ut dem ur spåret och överföra dem till en 100 mm petriskål med färsk EM (ca 40 ml) och inkubera sedan vid 28,5 °C så att embryona kan utvecklas.
7. Screening av embryon för transgen insättning
- För uttryck av fluorescerande proteiner, välj lämpligt utvecklingsstadium när den fluorescerande transgenen ska uttryckas och screena för närvaron av fluorescens under ett fluorescerande dissekeringsmikroskop.
OBS: Dessa embryon kommer att vara mosaik i sitt uttryck och visa en genomisk insättning av den transgena konstruktionen. - Screena för icke-fluorescerande transgener genom screening för en fluorescerande transgen markör (som beskrivs i steg 7.1), såsom GFP driven av den hjärtspecifika promotorn för genen cmlc2 eller mCherry driven av den linsspecifika promotorn för αcyrstallin, som finns i distinkta destinationsvektorer.
- Låt embryon som är positiva för transgen insättning utvecklas fullt ut till de vuxna zebrafiskstadierna.
- När potentiella transgena fiskar når avelsålder, screena dem individuellt för både germlineöverföring och transgen uttrycksfullhet genom att odla dem till zebrafisk av vildtyp.
- De vuxna vars embryon utvecklas normalt och ger det starkaste och mest lämpliga transgenuttrycket hålls som unika transgena zebrafisklinjer för framtida arbete och analyser.
OBS: Som ett alternativt tillvägagångssätt för screening för genomisk insättning av transgena konstruktioner, designa PCR-primrar som bara förstärker den transgena konstruktionen och inte vildtyp-DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att generera de transgena konstruktionerna använde vi Tol2-transgenessystemet. Tre ingångsvektorer, inklusive p5E, som håller genpromotorn / förstärkareelementen, pME, som håller genen som ska uttryckas av promotorn / förstärkareelementen, och p3E som åtminstone håller polyA-svansen, användes för att generera den transgena konstruktionen via multisite gateway LR-kloning. Destinationsvektorn, pDest, tillhandahåller Tol2-upprepningarna för genomisk insättning av den transgena konstruktionen i zebrafiskembryon och innehåller all väsentlig genetisk information för bakterietillväxt (figur 1A). För detta manuskript skapade och injicerade vi en sox17: EGFPCAAX transgen konstruktion. Promotorn för endodermmarkören, sox17, användes för att driva membranmärkt EGFP i zebrafiskens utvecklande endoderm. För transgena konstruktioner som uttrycker icke-fluoroforproteiner kan en pDest-vektor som innehåller en fluorescerande transgen markör såsom cmlc2: EGFP användas för att underlätta genomisk insättning (figur 1A).
Med hjälp av de värden som beskrivs i protokollet ovan (tabell 2) genererades den transgena konstruktionen sox17: EGFPCAAX och 4 μL av denna konstruktion omvandlades till kemiskt kompetenta Escherichia coli-celler . Efter inkubation vid 37 °C över natten innehöll agarplattan cirka 250 kolonier (LR-reaktioner är vanligtvis i genomsnitt 150-300 kolonier per platta i vårt laboratorium). Screeningen av dessa kolonier utfördes baserat på opacitet. I våra händer hade kolonier som var klara rätt sox17: EGFPCAAX-produkt >85% av tiden, medan de ogenomskinliga kolonierna aldrig innehöll rätt rekombinationsprodukt (Figur 1B, pilspets kontra pil). Efter isolering av plasmiden från flera kolonier utfördes restriktionsuppslutningen av de rekombinanta produkterna med restriktionsenzymet NcoI. Två olika klara kolonier och en ogenomskinlig koloni smältes. Båda klara kolonierna hade ett enda band med rätt storlek på 9 544 bp (osmälta plasmider laddade som en smältkontroll), medan den ogenomskinliga kolonin inte hade några band alls (figur 2A). Dessa positiva sox17:EGFPCAAX-konstruktioner omvandlades, de efterföljande kolonierna strimlades på nytt, dessa kolonier bekräftades ha plasmiden och bakteriefrysbestånd på −80 °C genererades. Koncentrationerna av både sox17:EGFPCAAX-plasmiden och capped-transposas-mRNA bestämdes så att de båda kunde användas för injektion (figur 2B).
Embryona förbereddes för injektion genom att placera ett cellstegembryo i en förvärmd embryoinjektionsform (figur 3A-C). En gång placerad i injektionsformen placerades injektionsnålen innehållande sox17: EGFPCAAX mRNA i en mikropipetthållare på mikromanipulatorn (figur 3D, E). Embryona injicerades med 100 ng transposas mRNA, 150 ng sox17: EGFPCAAX plasmid och fenolrött (injektionsspårningsfärgämne). En 3 nL bolus (bestämd av storlek enligt beskrivningen i protokollet, steg 6.6) injicerades i cellkroppen och inte i äggulan på embryot för bästa chans till integration (figur 3F)10.
Efter injektion avlägsnades embryon från injektionsformen och fick utvecklas i 24 timmar. Vid 24 timmar efter befruktning (hpf) screenades embryona för endodermuttryck av EGFPCAAX. Mosaikendoderm EGFPCAAX-uttryck observerades i ~ 75% av de injicerade embryona (figur 4A, A'). För att screena embryon injicerade med icke-fluorescerande transgener såsom Gal4 eller CreERT2 kan en destinationsvektor som också innehåller en transgen markör (dvs. cmlc2: EGFP) (figur 1A) användas (figur 4B, B'). Vuxna zebrafiskar som hade germlinetransgenes av sox17: EGFPCAAX genererade fluorescerande embryon med endodermen helt märkt med EGFPCAAX (figur 4C).
Med hjälp av den nyskapade sox17: EGFPCAAX transgena linjen kunde vi direkt bedöma etanolens inverkan på bildandet av endodermala påsar. Påsarna är utsprång som bildas på endodermens laterala kant och är viktiga för bildandet av ansiktsskelettet och flera organsystem17. Vi har tidigare visat att blockering av benmorfogenetiskt protein (Bmp) signalering resulterar i hypoplasi hos påsar18. Vi visar nu att etanolbehandlingen av Bmp-mutanter från 10-18 hpf har en subtil men signifikant inverkan på påsstorleken. Den dorsala ventrala längden på varje påse från påsar 1-5 (zebrafiskar har sex påsar, men den sjätte hade ännu inte bildats helt i utvecklingsstadiet på bilden) mättes i kontroll- och etanolbehandlade Bmp-muterade embryon av vildtyp (figur 5A). Som en kontroll för allmänna tillväxteffekter på grund av etanolexponering mättes den främre-bakre längden på hela endodermen (figur 5A). Den totala längden av endoderm påverkades inte av genotyp eller behandling (figur 5B). Påsar 1 och 3 visade dock signifikanta ökningar i påslängden mellan de obehandlade och etanolbehandlade vildtypembryona men signifikanta längdminskningar mellan de obehandlade och etanolbehandlade Bmp-mutanterna (figur 5C; tvåvägs ANOVA; påse 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; påse 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). Påse 2 visade signifikanta ökningar i påsstorlek mellan de obehandlade och etanolbehandlade vildtyps- respektive Bmp-mutantgrupperna (figur 5C; tvåvägs ANOVA; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001).
Figur 1: LR-gatewayreaktion för transgenkonstruktion . (A) Schematisk bild av den modulära fyrdelade LR-gateway-kloningsreaktionen. LR Clonase rekombinerar de tre ingångsvektorerna, p5E, pME och p3E, och destinationsvektorn, pDest, i en mycket specifik reaktion för att generera en ny transgen produkt redo för embryoinjektion. För screening av icke-fluorescerande transgener kan pDest-vektorer innehålla valfria transgena markörer (cmlc2: EGFP, som ett exempel). (B) Exempel på bakteriekolonier erhållna genom omvandling av LR-rekombinationsprodukterna. Klara kolonier innehöll en korrekt LR-rekombinationsprodukt >85% av tiden (pilspets), medan ogenomskinliga kolonier aldrig innehöll en korrekt rekombinationsprodukt (pil). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Analys av plasmid-DNA och transposas-mRNA . (A) Diagnostisk nedbrytning av de tre kolonierna från omvandlingen av LR-rekombinationsprodukterna. Den enda ogenomskinliga kolonin innehöll ingen plasmid att screena, medan de två klara kolonierna innehöll ett enda band vid 9 544 bp (oklippt kontra skuret). (B) Transposas mRNA vid 1 950 bp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Inställning av injektion av zebrafiskembryon. (A) En formsprutningsform placeras i flytande agaros utspädd i EM (3% v/v). (B) När den stelnat avlägsnas formen från agarosplattan. (C) Embryona är ordnade i formsprutorna. (D,E) Den röda blandningen mRNA/plasmid/fenol pipetteras in i injektionsnålen, som placeras i mikropipetthållaren i mikromanipulatorn. F) En 3 nL bolus injiceras i embryots cellkropp i encellsstadiet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Screening av zebrafiskar injicerade med den transgena konstruktionen. (A,A') Konfokal bild av ett embryo avbildat vid 24 hpf visar mosaikuttrycket för sox17:EGFPCAAX-transgenen. (B,B') Transgent marköruttryck av cmlc2: EGFP i utvecklingshjärtat vid 24 hpf. Sidovyer av embryon, med främre till vänster och dorsal på toppen. (C) Konfokalbild av ett embryo genererat från en transgenbärande vuxen zebrafisk. Hela endoderm uttrycker EGFPCAAX. Lateral vy av embryot, med främre till vänster och ventral på toppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Påsmätningar i etanolbehandlade vildtyps- och Bmp-muterade embryon. A) Schematisk bild av mätningen av endodermens totala längd och påsarnas längd. (B) Mätningarna av den totala längden på den främre och bakre endodermen visar ingen skillnad mellan obehandlade och etanolbehandlade vildtyps- och Bmp-muterade embryon. (C) Mätningarna av längd på dorsalventrala påsar visar att påsarna 1 och 3 visar ökningar i påslängden mellan de obehandlade och etanolbehandlade vildtypembryona men minskar i längd mellan de obehandlade och etanolbehandlade Bmp-mutanterna (tvåvägs ANOVA; påse 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021 ; påse 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). Påse 2 visar en ökning i längd mellan de obehandlade och etanolbehandlade vildtyps- och Bmp-mutantgrupperna (tvåvägs ANOVA; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001). Inga skillnader observerades i påslängd mellan påsarna 4 och 5. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Tol2Kit-komponenter inrymda i Lovely Lab. Varje post- och destinationsvektor som finns i Lovely Lab, deras beskrivningar och deras ursprungslaboratorium. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Beräkning av mängden och samordningen av varje vektor i LR-rekombinationsreaktionen. Mängden av varje vektor beräknades utifrån storleken (i bp) och fmol som behövdes för varje komponent: 10 fmol för varje ingångsvektor och 20 fmol för destinationsvektorn. Från plasmidkoncentrationen späds varje vektor i sterilt vatten för att tillsätta 1 μL eller mindre till LR-reaktionen. Sterilt vatten tillsätts till vektorpoolen till lika med 4 μL, 1 μL LR-reaktionsblandning tillsätts till reaktionen och inkuberas vid 25 °C över natten. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafiskar är idealiska för att studera effekterna av etanolexponering på utvecklings- och sjukdomstillstånd 7,8. Zebrafisk producerar ett stort antal genomskinliga, externt befruktade, genetiskt lätthanterliga embryon, vilket möjliggör levande avbildning av flera transgenmärkta vävnader och celltyper samtidigt i flera miljösammanhang19,20. Dessa styrkor, i kombination med det starka utvecklingsgenetiska bevarandet med människor, gör zebrafisk till ett kraftfullt modellsystem för att avbilda effekterna av etanol 7,8. Här beskrev vi protokollet för ett modulärt tillvägagångssätt för att generera och injicera transgena konstruktioner och etablera transgena zebrafisklinjer för framtida etanolstudier.
Många olika metoder har etablerats för att generera transgena zebrafiskar. Att generera både transgena konstruktioner och transgena linjer kan dock vara skrämmande. Medan traditionella subkloningstekniker, BAC-kloning eller PCR-baserade metoder som Gibson-montering möjliggör generering av transgena konstruktioner, har de låg genomströmning och saknar mångsidighet i sin konstruktion10. Dessutom måste dessa strategier omformas för varje transgen konstruktion som skapas. Subkloning kräver flera digestioner och ligationer, förutsatt att alla nödvändiga restriktionsställen är närvarande och unika. BAC-kloning kräver sekvensering och testning av flera BAC-kloner. För Gibson-montering måste nya PCR-primers utformas för varje transgen konstruktion. Dessutom leder injektionen av antingen oklippt eller linjäriserat DNA till låg germlineöverföring21,22,23.
Tol2Kit är ett modulärt system som använder gatewaykloning för att generera kompletta transgena konstruktioner flankerade av Tol2-upprepningar som, i kombination med transposas mRNA, kraftigt ökar transgenesen och germlineöverföringen 10,11,24,25. Dussintals ingångs- och destinationsvektorer finns tillgängliga från Kwan-labbet och Cole Lab10,11. Dessutom har zebrafisklaboratorier som använder Tol2Kit genererat och kuraterat många fler ingångs- och destinationsvektorer. Som ett exempel på bredden av tillgängliga vektorer har vi slagit samman och använt över 70 vektorer (tabell 1). Med alla dessa samhällsresurser kan man snabbt generera tusentals olika transgena konstruktioner genom att helt enkelt kombinera de vektorer som valts i en LR-reaktion.
Optimala LR-reaktioner kräver exakta beräkningar av plasmidstorlek och koncentration. Beräkningarna för varje vektor görs i femtomol (fmol) värden, så varje reaktion kräver inte en hög plasmidvolym för att generera en transgen konstruktion. Denna lilla mängd plasmid gör emellertid utspädningar och korrekt pipettering ytterst avgörande för reaktionens framgång10. Ytterligare faktorer som kan påverka LR-reaktionen är storleken på skären i de olika ingångsvektorerna. Till exempel är p5E-sox17-elementet som används i denna studie över 4 kb, vilket, om det kombineras med lika stora pME- och p3E-element, kommer att resultera i en mycket stor transgen vektor. En stor plasmid i bakterier kan vara svår att odla, vilket minskar antalet kolonier som genereras från bakterietransformationen. Detta kommer också att resultera i långsammare tillväxt och minskade plasmidnivåer när de isoleras10. Det är viktigt att ha mycket kompetenta bakterieceller, liksom att öka inkubationen av bakteriecellerna under omvandlingen av rekombinationsplasmiden, är nyckeln till att generera tillräckligt med kolonier för att fånga korrekt transgenbildning. Dessutom spelar användning av rätt LR-reaktionsenzym (listat i materialtabellen) också en viktig roll i framgången för LR-reaktionen.
Utöver genereringen av en transgen konstruktion och bakterietransformationer kan embryoinjektionen och genomintegrationen också vara svår. Genereringen av högkvalitativt transposas mRNA ökar kraftigt frekvensen av genomisk integration10. De dragna kapillärerna måste göras strax före injektion av embryon eftersom äldre nålar kan förlora kapillärverkan (dvs. injektionsvätskan misslyckas med att röra sig till nålspetsen) (figur 3E). Både att bryta nålspetsen för att bara injicera ~ 3 nL vätska och injicera cellkroppen kräver övning. Vårt träningsprotokoll innebär att injicera cellkroppen med endast fenolrött injektionsfärgämne tills nålen bryts och injektionsembryon behärskas. Att injicera cellkroppen ökar drastiskt graden av genomintegration10. Genom att kombinera allt detta har vi i genomsnitt 75% eller mer genominsättning och mosaikuttryck, men detta kan variera från konstruktion till konstruktion.
Eftersom genomisk insättning kan vara slumpmässig är varje embryo som visar mosaikuttryck en unik transgen insättning och kräver fortsatt screening. Denna fortsatta screening är nödvändig för att visa att integrationsstället inte är skadligt för embryots utveckling, att överföring av könsceller sker och att uttrycket av transgenen inte försvagas eller potentiellt tystas. När en transgen linje har etablerats kan den lätt användas för flera analyser i etanolstudier. För dessa icke-fluorescerande transgena konstruktioner inkluderar vanliga transgena markörer cmlc2: GFP och αcrystallin: RFP, som märker hjärtat respektive näthinnan och möjliggör fortsatt transgen screening. Förutom transgena markörer för screening kan dessa två transgener användas för att direkt studera etanolens inverkan på hjärt- och näthinneutveckling.
Med hjälp av protokollet som beskrivs ovan genererade vi en sox17: EGFPCAAX transgen zebrafisklinje som hade stabil germlineöverföring av en endodermspecifik membranmärkt EGFP-konstruktion. Med hjälp av denna linje kunde vi mäta effekten av etanol på endodermal påsbildning i etanolkänsliga Bmp-muterade embryon. Vi visade att storleken på påsar 1-3 men inte på påsar 4 och 5 eller den totala endodermlängden påverkades i etanolbehandlade Bmp-mutanter (Fig 5). Detta pilotarbete tyder på att Bmp-etanolinteraktionen stör endodermbildning, särskilt cellbeteendet som ligger bakom påsbildning. Detta arbete exemplifierar nyttan av att generera transgena zebrafisklinjer för etanolstudier. Som ett resultat kommer skapandet av nya transgena linjer att öka vår förståelse för etanolkänsliga cellulära processer och vävnadshändelser i FASD.
I slutändan har transgena zebrafiskar, och zebrafiskar i allmänhet, visat sig vara otroligt kraftfulla i studien av FASD 7,8. Tol2Kit är en extremt mångsidig verktygslåda som gör det möjligt för forskare att snabbt generera flera transgena konstruktioner redo att injiceras i zebrafiskar. Den modulära designen och lättheten att generera nya ingångsvektorer resulterar i extrem flexibilitet när det gäller att generera transgena konstruktioner utan att behöva omforma några komponenter. Sammantaget kommer denna verktygslåda att avsevärt förbättra både zebrafiskforskning och forskning i allmänhet som syftar till att förbättra förståelsen av FASD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskningen som presenteras i denna artikel stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health / National Institute on Alcohol Abuse (NIH / NIAAA) R00AA023560 till CBL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawson Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
- Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
- Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
- Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
- Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Lovely, C. B.
- Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).
- Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017).
- The Tol2Kit. , Available from: http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page (2007).
- Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
- Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
- Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
- Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
- Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).
