Summary
Dette arbejde beskriver en protokol for det modulære Tol2 transgenesesystem, en gateway-baseret kloningsmetode til at skabe og injicere transgene konstruktioner i zebrafiskembryoner.
Abstract
Føtale alkoholspektrumforstyrrelser (FASD) er kendetegnet ved et meget variabelt sæt strukturelle defekter og kognitive svækkelser, der opstår på grund af prænatal ethanoleksponering. På grund af FASD's komplekse patologi har dyremodeller vist sig at være afgørende for vores nuværende forståelse af ethanol-inducerede udviklingsfejl. Zebrafisk har vist sig at være en stærk model til at undersøge ethanol-inducerede udviklingsfejl på grund af den høje grad af bevarelse af både genetik og udvikling mellem zebrafisk og mennesker. Som modelsystem besidder zebrafisk mange egenskaber, der gør dem ideelle til udviklingsstudier, herunder et stort antal eksternt befrugtede embryoner, der er genetisk medgørlige og gennemskinnelige. Dette giver forskere mulighed for præcist at kontrollere timingen og doseringen af ethanoleksponering i flere genetiske sammenhænge. Et vigtigt genetisk værktøj, der er tilgængeligt i zebrafisk, er transgenese. Imidlertid kan generering af transgene konstruktioner og etablering af transgene linjer være kompleks og vanskelig. For at løse dette problem har zebrafiskforskere etableret det transposonbaserede Tol2-transgenesesystem. Dette modulære system bruger en multisite Gateway-kloningsmetode til hurtig samling af komplette Tol2-transposonbaserede transgene konstruktioner. Her beskriver vi den fleksible Tol2-systemværktøjskasse og en protokol til generering af transgene konstruktioner, der er klar til zebrafisktransgenese og deres anvendelse i ethanolstudier.
Introduction
Prænatal ethanoleksponering giver anledning til et kontinuum af strukturelle underskud og kognitive svækkelser kaldet føtale alkoholspektrumforstyrrelser (FASD)1,2,3,4. De komplekse forhold mellem flere faktorer gør det udfordrende at studere og forstå ætiologien af FASD hos mennesker. For at løse denne udfordring er der anvendt en lang række dyremodeller. De biologiske og eksperimentelle værktøjer, der er tilgængelige i disse modeller, har vist sig afgørende for at udvikle vores forståelse af det mekanistiske grundlag for ethanolteratogenicitet, og resultaterne fra disse modelsystemer har været bemærkelsesværdigt konsistente med, hvad der findes i humane ethanolstudier 5,6. Blandt disse har zebrafisk vist sig som en stærk model til at studere ethanol teratogenese7,8, dels på grund af deres ydre befrugtning, høj frugtbarhed, genetisk trækbarhed og gennemskinnelige embryoner. Disse styrker kombineres for at gøre zebrafisk ideel til realtids live imaging undersøgelser af FASD ved hjælp af transgene zebrafisklinjer.
Transgene zebrafisk er blevet flittigt brugt til at studere flere aspekter af embryonal udvikling9. Imidlertid kan det være yderst vanskeligt at skabe transgene konstruktioner og efterfølgende transgene linjer. Et standardtransgen kræver et aktivt promotorelement til at drive transgenet og et poly A-signal eller "hale", alt sammen i en stabil bakterievektor til generel vektorvedligeholdelse. Den traditionelle generation af en transgen multikomponent konstruktion kræver flere tidskrævende underkloningstrin10. PCR-baserede tilgange, såsom Gibson-samling, kan omgå nogle af de problemer, der er forbundet med underkloning. Imidlertid skal unikke primere designes og testes til generering af enhver unik transgen konstruktion10. Ud over transgenkonstruktion har genomisk integration, kimlinjeoverførsel og screening for korrekt transgenintegration også været vanskelig. Her beskriver vi en protokol til brug af det transposonbaserede Tol2-transgenesesystem (Tol2Kit)10,11. Dette modulære system bruger multisite Gateway-kloning til hurtigt at generere flere transgene konstruktioner fra et stadigt voksende bibliotek med "entry" og "destination" vektorer. Integrerede Tol2 transponerbare elementer øger transgenesehastigheden kraftigt, hvilket muliggør hurtig konstruktion og genomisk integration af flere transgener. Ved hjælp af dette system viser vi, hvordan dannelsen af en endoderm transgen zebrafiskelinje kan bruges til at studere de vævsspecifikke strukturelle defekter, der ligger til grund for FASD. I sidste ende viser vi i denne protokol, at den modulære opsætning og konstruktionen af transgene konstruktioner i høj grad vil hjælpe zebrafiskbaseret FASD-forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle zebrafiskembryoner, der anvendes i denne procedure, blev opdrættet og opdrættet i henhold til etablerede IACUC-protokoller12. Disse protokoller blev godkendt af University of Louisville.
BEMÆRK: Den vilde zebrafiskstamme, AB, og bmp4st72;smad5b1100 dobbeltmutantlinjen blev anvendt i denne undersøgelse. Alt det vand, der blev brugt i denne procedure, var sterilt omvendt osmosevand. Konfokale billeder blev taget under et laserscanning konfokalmikroskop. Endodermmålingerne blev foretaget ved hjælp af måleværktøjet i ImageJ. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af statistisk software.
1. Fremstilling af løsninger og medier
- Bakteriemedier: Opløs LB bouillon eller agar i henhold til producentens anvisninger og autoklave. Før mediet hældes i 100 mm petriskåle, tilsættes enten ampicillin (50 μg/ml), kanamycin (50 μg/ml) eller en ampicillin/chloramphenicol-kombination (henholdsvis 50 μg/ml og 30 μg/ml).
- For at fremstille 20x embryomediemateriale opløses følgende i 1 liter vand: 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl2, 0,41 g K2HPO 4, 0,142 g Na2HPO 4 og4,9 g MgSO4·7H2O. Stamopløsningen filtreres ved hjælp af et0,22 μm vakuumfiltreringssystem, og opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: Ignorer det hvide bundfald, der dannes; Dette vil ikke påvirke medierne. - I 19 liter vand opløses 1,2 g NaHCO3 , og der tilsættes 1 liter af 20x embryomediematerialet for at generere den fungerende embryomedieopløsning, og denne opløsning opbevares ved 28 °C.
- Til 2% phenolrød opløsning opløses 20 mg phenolrødt natriumsalt i 1 ml RNasefrit vand og opbevares ved stuetemperatur.
2. Embryo injektionsforme
- For at fremstille agaroseinjektionspladen opløses agarose i embryomediet til en endelig koncentration på 3% ved opvarmning til kogning.
- Hæld 50 ml agarose i 100 mm petriskåle, og mens agarosen stadig er flydende, placeres sprøjteformen forsigtigt i agaroseen for at forhindre bobledannelse under formen.
- Lad agarosepladerne køle af. Når agarosen er fast, fjernes sprøjtestøbeformen, og den opbevares ved 4 °C, indtil den er klar til brug.
3. Injektionspipetter
- Der trækkes 1,0 mm (OD) kapillærer indeholdende en glødetråd ind i nåle ved hjælp af en lodret pipettetrækker med magnetventilen indstillet til 2,5 og varmeelementet indstillet til 14,6.
BEMÆRK: Enhver opvarmet aftrækker fungerer, hvis den trækker kapillærerne i to nåle rent og jævnt, men injektionsnålene skal trækkes inden for 1 uge efter injektion af zebrafiskembryonerne for ensartede injektionsresultater.- Placer kapillæren i aftrækkeren, stram klemmen i hver ende, og aktiver derefter varmeelementet.
- Træk kapillærerne for at skabe to injektionsnåle.
- Fjern kapillærerne fra aftrækkeren, og opbevar dem i et tomt petrifad med en strimmel modellervoks, der fungerer som nåleholder.
4. Transposase mRNA-præparat
- Lineariser Tol2Kit-plasmidet indeholdende transposase med en NotI-restriktionsendonuklease ved at kombinere følgende i et 0,5 ml mikrocentrifugerør: 10 μL transposaseplasmid (150 ng / μL), 1,5 μL restriktionsendonukleasereaktionsbuffer, 0,3 μL NotI-endonuklease.
- Reaktionen fyldes op til 20 μL med RNasefrit vand, og derefter blandes og fordøjes ved 37 °C natten over.
- Stop transposasefordøjelsen ved at tilsætte 1 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μL 5 M NH4OAc og 80 μL 100% EtOH til fordøjelsesreaktionen, og bland derefter og afkøl ved -20 °C natten over.
- Opløsningen centrifugeres ved 14.000x g i 20 minutter ved 4 °C, hvorefter supernatanten suges op, og DNA-pelletsen resuspenderes i RNasefrit vand.
- Bestem den lineære plasmidkoncentration i nanogram pr. mikroliter (ng / μL) ved hjælp af et fluorometer ved først at køre 2 μL af et RNasefrit vandblindemne og derefter køre 2 μL af det lineariserede plasmid.
BEMÆRK: Plasmidkoncentrationerne ligger typisk mellem 100-200 ng/μL - Opsæt SP6 mRNA-produktionen ved at kombinere følgende komponenter i rækkefølge i et 0,5 ml mikrocentrifugerør: 10 μL 2x NTP / CAP, 2 μL 10x reaktionsbuffer, 0,1-1 μg lineær DNA-skabelon og 2 μL SP6 enzymblanding.
- Reaktionen fyldes op til 20 μL med RNasefrit vand, hvorefter der blandes og inkuberes ved 37 °C i 2 timer.
- Efter inkubation i 2 timer tilsættes 1 μL DNase, blandes godt og inkuberes i yderligere 15 minutter ved 37 °C.
- For at stoppe SP6-reaktionen tilsættes 30 μL LiCl-udfældningsopløsning til reaktionsrøret og blandes og afkøles derefter ved -20 °C natten over.
- Opløsningen centrifugeres ved 14.000 x g i 20 minutter ved 4 °C for at pelletere mRNA'et, hvorefter supernatanten aspireres, og mRNA-pelleten vaskes med 1 ml 80 % EtOH (fortyndet med RNasefrit vand).
- Opløsningen centrifugeres ved 14.000 x g i 20 minutter ved 4 °C for at pelletere mRNA'et, hvorefter supernatanten aspireres. Lad pelleten lufttørre.
- Resuspender mRNA-pellet i 20 μL RNasefrit vand, bestem mRNA-koncentrationen i nanogram pr. mikroliter (ng/μL) ved hjælp af et fluorometer som beskrevet i trin 4.5 (skal være mindst 100 ng/μL), alikvote 100 ng mRNA pr. rør til engangsbrug og opbevar ved -80 °C.
BEMÆRK: For at sikre, at mRNA'et ikke nedbrydes, kan 2 μL mRNA hurtigt køres på en DNA-elektroforesegel for at bekræfte et enkelt bånd ved 1,950 bps.
5. Multisite Gateway-kloning for at oprette indgangsvektorer til transgenese
BEMÆRK: Denne protokol er modificeret fra Kwan et al.10, med LR-reaktionen skrevet som en halv LR-reaktion og med et samlet volumen på 5 μL. For at generere nye indgangselementer skal BP-reaktioner ved hjælp af 5', midterste og 3' donorvektorer bruges10,13.
- For at udføre reaktionen skal du samle 10 fmol hver af p5E, pME og p3E og 20 fmol af destinationsvektoren (pDest).
BEMÆRK: Multisite LR-rekombination bruger fire forskellige plasmidvektorer: en 5' indgangsvektor (p5E), en midterindgangsvektor (pME), en 3' indgangsvektor (p3E) og en destinationsvektor (pDest) til at generere en unik transgen konstruktion flankeret af Tol2-gentagelser, der er klar til at blive injiceret i zebrafiskembryoner.- Identificer størrelsen af alle fire vektorer i basepar fra plasmidkilden (tabel 1, Tol2Kit Wiki side14 eller Addgene11; se materialetabellen).
BEMÆRK: For nye vektorer kan fuld plasmidsekventering via kommercielle sekventeringsvirksomheder give den nøjagtige plasmidstørrelse i bps. - Koncentrationen af alle fire vektorer i nanogram pr. mikroliter (ng/μL) bestemmes ved hjælp af et fluorometer som beskrevet i trin 4.5.
- Brug vægten af DNA som 660 g / mol og plasmidstørrelsen (i bps) til at beregne de samlede nanogram (ng) plasmid, der er nødvendige for at nå enten 10 fmol (indgangsvektorer) eller 20 fmol (destinationsvektor).
BEMÆRK: Mosimann-laboratoriet ved University of Colorado, Anschutz Medical Campus, har genereret et frit tilgængeligt regneark til beregning af den nødvendige mængde plasmid (i ng) og volumenet (i μL) af vektorerne, der er nødvendige i LR-reaktionen15.
- Identificer størrelsen af alle fire vektorer i basepar fra plasmidkilden (tabel 1, Tol2Kit Wiki side14 eller Addgene11; se materialetabellen).
- For at generere konstruktionen beskrevet nedenfor, sox17: EGFPCAAX, skal du bruge følgende vektorer: en p5E-vektor indeholdende zebrafisken sox17-promotoren , som er 6,918 bp i størrelse16; en pME-vektor, der indeholder den prenylerede EGFP, som er 3,345 bp i størrelse10 en p3E-vektor indeholdende SV40 late poly A-signalsekvensen, som er 2,838 bp i størrelse10 og pDest, som er 5,883 bp i størrelse10.
- Ved hjælp af plasmidkoncentrationen bestemt i trin 5.1.2 og mængden i nanogram (ng) for hver vektor (trin 5.1.3) beregnes de samlede mikroliter (μL) af hvert plasmid, der er nødvendigt for at nå enten 10 fmol (indgangsvektorer) eller 20 fmol (destinationsvektor), og divideres derefter med to til brug i 5 μL halv-LR-reaktionerne (alle nedenstående værdier er angivet i tabel 2).
- For at generere 10 fmol p5E-sox17 skal du bruge 45,66 ng (i en koncentration på 140,3 ng / μL) og fortyndes med sterilt vand med en faktor 4 for at få 0,65 μL.
- For at generere 10 fmol pME-EGFPCAAX skal du bruge 22,08 ng (i en koncentration på 213,5 ng / μL) og fortyndes med sterilt vand med en faktor på 10 for at få 0,52 μL.
- For at generere 10 fmol p3E-poly A skal du bruge 15,73 ng (i en koncentration på 276,1 ng / μL) og fortyndes med sterilt vand med en faktor på 20 for at få 0,57 μL.
- For 20 fmol af destinationsvektoren skal du bruge 77,66 ng pDest (i en koncentration på 307,3 ng / μL) og fortyndes med sterilt vand med en faktor på 5 for at få 1,63 μL.
- For at indstille en 5 μL halv LR-reaktion kombineres volumenerne af p5E, pME, p3E og pDest bestemt i trin 5.3 i et 0,5 ml mikrocentrifugeglas og tilsættes derefter sterilt vand for at nå et samlet reaktionsvolumen på 4 μL.
- Vortex kraftigt LR-enzymblandingen 2x i 1 min hver for at sikre korrekt blanding, og tilsæt derefter 1 μL til reaktionen og bland grundigt.
- Der inkuberes ved 25 °C natten over (16+ timer).
- LR-reaktionen standses ved tilsætning af 0,5 μL proteinase K (2 μg/μL), inkuberes ved 37 °C i 10 minutter og afkøles derefter til stuetemperatur.
- Omdan 3-4 μL plasmid til optøede, kemisk kompetente celler ved at tilsætte plasmidet og lade cellerne sidde på is i 25-30 min.
- Mens cellerne sidder på is, opvarmes to LB-ampicillin agarplader til stuetemperatur.
- Varmechok cellerne i et 42 °C vandbad i præcis 30 sekunder.
- Efter varmechokket tilsættes 250 μL antibiotikafri, rige flydende medier til cellerne og inkuberes med omrystning ved 37 °C i 1,5 timer.
- Spred 300 μL bakterier på en ampicillinplade og inkuber ved 37 °C natten over.
- Næste morgen screenes kolonierne for tilstedeværelse af to fænotyper, klare og uigennemsigtige, plukker de klare kolonier (som beskrevet i Kwan et al.10) en ad gangen, inokulerer den flydende kultur og ryster derefter ved 37 ° C natten over.
BEMÆRK: Klare kolonier indeholder næsten altid den korrekte LR-koloni (>85% af tiden). - Brug et kommercielt sæt i henhold til producentens anvisninger til at udføre en plasmidforberedelse på hver flydende kultur og diagnostisk fordøje hvert plasmid for at bekræfte den passende størrelse af den transgene konstruktion, hvilket indikerer, at LR-gatewayreaktionen har fungeret korrekt.
- De korrekte transgene konstruktioner omtransformeres ved hjælp af standardprotokollen for bakteriel transformation som beskrevet i trin 5.4-5.12 under anvendelse af 0,5-1 μL plasmidet, og der inkuberes kun ved 37 °C i 1 time.
- Striber kolonierne igen, og bekræft, at hver har LR-transgene konstruktioner som i trin 5.14.
- Plasmidkoncentrationen bestemmes som beskrevet i trin 4.5 (mindst 150 ng/μl er nødvendig for embryoinjektionen).
6. Injektion af transgenet i embryonerne
- Optø en transposase mRNA-prøve til engangsbrug og Tol2-transgen konstruktion på is, og advar en agaroseinjektionsplade til stuetemperatur.
- Kombiner følgende på is: 150 ng plasmid, 100 ng transposase mRNA og 2% phenolrødt (0,3 μL). Derefter tilsættes RNA-frit vand for at kompensere for volumenet til 3 μL.
- Et cellestadium embryoner overføres ved hjælp af overførselspipetter til injektionspladen (beskrevet i trin 2) fyldt med EM, der dækker agaren fuldstændigt, og tryk derefter forsigtigt ca. 50-75 embryoner pr. sprække på injektionspladen.
- Tilsæt mRNA / plasmid / phenolrød blanding til den åbne ende af en kapillær injektionsnål, placer kapillærnålen i injektionsrigarmaturet, og tænd injektionsriggen.
BEMÆRK: Injektionsriggen bruger komprimeret gas, såsom luft, til at pulsere det ønskede volumen (beskrevet i trin 6.5) af mRNA / plasmid / phenolrød blanding i embryoet, når den aktiveres. - Sænk kapillærnålen ned i injektionspladens EM, og knæk spidsen ved hjælp af pincet, så kun en lille mængde mRNA/plasmid/phenolrød blanding kan pumpes ud af injektionsriggen.
- Injicer embryonerne med en lille 3 nL bolus af mRNA/plasmid/phenol rød blanding i embryoets cellelegeme.
BEMÆRK: En 3 nL bolus er et volumen af mRNA / plasmid / phenolrød blanding, hvor syv boluser teoretisk kan passe lige over embryoets midterlinje. - Når du er færdig med at injicere embryonerne, fjernes de fra injektionspladen ved forsigtigt at poppe dem ud af åbningen og overføre dem til en 100 mm petriskål med frisk EM (ca. 40 ml) og derefter inkubere ved 28,5 °C, så embryonerne kan udvikle sig.
7. Screening af embryoner for transgen indsættelse
- For ekspression af fluorescerende proteiner vælges det passende udviklingstrin, når det fluorescerende transgen skal udtrykkes, og screenes for tilstedeværelse af fluorescens under et fluorescerende dissekeringsmikroskop.
BEMÆRK: Disse embryoner vil være mosaik i deres udtryk og vise en genomisk indsættelse af den transgene konstruktion. - Screening for ikke-fluorescerende transgener ved screening for en fluorescerende transgen markør (som beskrevet i trin 7.1), såsom GFP drevet af den hjertespecifikke promotor for genet cmlc2 eller mCherry drevet af den linsespecifikke promotor af αcyrstallin, som er indeholdt i forskellige destinationsvektorer.
- Lad embryoner, der er positive for transgen indsættelse, udvikle sig fuldt ud til de voksne zebrafiskstadier.
- Når potentielle transgene fisk når ynglealderen, screenes de individuelt for både kimlinjeoverførsel og transgenekspressivitet ved at opdrætte dem til vildtype zebrafisk.
- De voksne, hvis embryoner udvikler sig normalt og giver den stærkeste og mest hensigtsmæssige transgene ekspression, bevares som unikke transgene zebrafiskelinjer til fremtidigt arbejde og analyser.
BEMÆRK: Som en alternativ tilgang til screening for genomisk indsættelse af transgene konstruktioner skal du designe PCR-primere, der kun forstærker den transgene konstruktion og ikke vildtype-DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at generere de transgene konstruktioner brugte vi Tol2-transgenesesystemet. Tre indgangsvektorer, herunder p5E, som indeholder genpromotor/forstærkerelementerne, pME, som holder genet, der skal udtrykkes af promotor/forstærkerelementerne, og p3E, som mindst holder polyA-halen, blev brugt til at generere den transgene konstruktion via multisite gateway LR-kloning. Destinationsvektoren, pDest, giver Tol2-gentagelserne til genomisk indsættelse af den transgene konstruktion i zebrafiskembryoner og indeholder al den væsentlige genetiske information for bakterievækst (figur 1A). Med henblik på dette manuskript skabte og injicerede vi en sox17:EGFPCAAX transgen konstruktion. Promotoren af endodermmarkøren, sox17, blev brugt til at drive membranmærket EGFP i zebrafiskens udviklende endoderm. For transgene konstruktioner, der udtrykker ikke-fluoroforproteiner, kan en pDest-vektor, der indeholder en fluorescerende transgen markør såsom cmlc2: EGFP , bruges til at hjælpe med genomisk indsættelse (figur 1A).
Ved hjælp af værdierne beskrevet i protokollen ovenfor (tabel 2) blev sox17:EGFPCAAX transgene konstruktion genereret, og 4 μL af denne konstruktion blev omdannet til kemisk kompetente Escherichia coli-celler . Efter inkubation ved 37 °C natten over indeholdt agarpladen ca. 250 kolonier (LR-reaktioner er typisk gennemsnitligt 150-300 kolonier pr. plade i vores laboratorium). Screeningen af disse kolonier blev udført baseret på uigennemsigtighed. I vores hænder havde kolonier, der var klare, det korrekte sox17:EGFPCAAX produkt >85% af tiden, mens de uigennemsigtige kolonier aldrig indeholdt det korrekte rekombinationsprodukt (figur 1B, pilespids vs. pil). Efter isolering af plasmidet fra flere kolonier blev restriktionsfordøjelsen af de rekombinante produkter udført med restriktionsenzymet, NcoI. To forskellige klare kolonier og en uigennemsigtig koloni blev fordøjet. Begge klare kolonier havde et enkelt bånd i den korrekte størrelse på 9.544 bp (ufordøjede plasmider indlæst som fordøjelseskontrol), mens den uigennemsigtige koloni slet ikke havde nogen bånd (figur 2A). Disse positive sox17:EGFPCAAX konstruktioner blev omdannet, de efterfølgende kolonier blev re-stribet, disse kolonier blev bekræftet at have plasmidet, og -80 °C bakterielle fryselagre blev genereret. Koncentrationerne af både sox17:EGFPCAAX plasmidet og capped-transposase mRNA blev bestemt, så de begge kunne anvendes til injektion (figur 2B).
Embryonerne blev forberedt til injektion ved at placere et celle-fase embryoner i en forvarmet embryoinjektionsform (figur 3A-C). Når injektionskanylen indeholdende sox17:EGFPCAAX mRNA var anbragt i sprøjtestøbeformen, blev den anbragt i en mikropipetteholder på mikromanipulatoren (figur 3D,E). Embryonerne blev injiceret med 100 ng transposase mRNA, 150 ng sox17:EGFPCAAX plasmid og phenolrød (injektionssporingsfarvestof). En 3 nul l bolus (bestemt efter størrelse som beskrevet i protokollen, trin 6.6) blev injiceret i cellekroppen og ikke i æggeblommen i embryoet for at opnå den bedste chance for integration (figur 3F)10.
Efter injektion blev embryonerne fjernet fra sprøjtestøbeformen og fik lov til at udvikle sig i 24 timer. 24 timer efter befrugtning (hpf) blev embryonerne screenet for endodermekspression af EGFPCAAX. Mosaisk endoderm EGFPCAAX ekspression blev observeret i ~75% af de injicerede embryoner (figur 4A,A'). Til screening af embryoner injiceret med ikke-fluorescerende transgener såsom Gal4 eller CreERT2 kan der anvendes en destinationsvektor, der også indeholder en transgen markør (dvs. cmlc2:EGFP) (figur 1A) (figur 4B,B'). Voksne zebrafisk, der havde kimlinjetransgenese af sox17:EGFPCAAX genererede fluorescerende embryoner med endoderm fuldt mærket med EGFPCAAX (figur 4C).
Ved hjælp af den nyoprettede transgene sox17:EGFPCAAX linje var vi i stand til direkte at vurdere virkningen af ethanol på dannelsen af endodermale poser. Poserne er fremspring, der dannes på endodermens laterale kant og er vigtige for dannelsen af ansigtsskelettet og flere organsystemer17. Vi har tidligere vist, at blokering af knoglemorfogenetisk protein (Bmp) signalering resulterer i hypoplasi af poserne18. Vi viser nu, at ethanolbehandlingen af Bmp-mutanter fra 10-18 hpf har en subtil, men betydelig indvirkning på posens størrelse. Den dorsal-ventrale længde af hver pose fra poserne 1-5 (zebrafisk har seks poser, men den sjette var endnu ikke fuldt ud dannet på udviklingsstadiet afbildet) blev målt i kontrol- og ethanolbehandlede vildtype Bmp-mutantembryoner (figur 5A). Som en kontrol for generelle vækstpåvirkninger som følge af ethanoleksponering blev den forreste bageste længde af hele endoderm målt (figur 5A). Den samlede længde af endoderm blev ikke påvirket af genotype eller behandling (figur 5B). Pose 1 og 3 viste imidlertid signifikante stigninger i poselængden mellem de ubehandlede og ethanolbehandlede vildtypeembryoner, men signifikante fald i længden mellem de ubehandlede og ethanolbehandlede Bmp-mutanter (figur 5C; tovejs ANOVA; pose 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; pose 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). Pose 2 viste signifikante stigninger i posens størrelse mellem henholdsvis de ubehandlede og ethanolbehandlede vildtype- og Bmp-mutantgrupper (figur 5C; tovejs ANOVA; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001).
Figur 1: LR gateway-reaktion for transgenkonstruktion . (A) Skematisk oversigt over den modulære firedelte LR-gatewaykloningsreaktion. LR Clonase kombinerer de tre indgangsvektorer, p5E, pME og p3E, og destinationsvektoren, pDest, i en meget specifik reaktion for at generere et nyt transgent produkt, der er klar til embryoinjektion. Til screening af ikke-fluorescerende transgener kan pDest-vektorer indeholde valgfrie transgene markører (cmlc2:EGFP, som et eksempel). B) Eksempler på bakteriekolonier opnået ved omdannelse af LR-rekombinationsprodukterne. Klare kolonier indeholdt et korrekt LR-rekombinationsprodukt >85% af tiden (pilespids), mens uigennemsigtige kolonier aldrig indeholdt et korrekt rekombinationsprodukt (pil). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Analyse af plasmid-DNA og transposase-mRNA . (A) Diagnostisk fordøjelse af de tre kolonier fra transformationen af LR-rekombinationsprodukterne. Den enkelte uigennemsigtige koloni indeholdt ikke noget plasmid til skærmning, mens de to klare kolonier indeholdt et enkelt bånd på 9.544 bp (uskåret vs. skåret). (B) Transposase mRNA ved 1,950 bp. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Opsætning af injektion af zebrafiskembryoner. (A) En sprøjtestøbeform anbringes i flydende agarose fortyndet i EM (3% v/v). (B) Når formen er størknet, fjernes den fra agarosepladen. (C) Embryonerne er anbragt i sprøjteformene. (D,E) Den mRNA/plasmid/phenolrøde blanding pipetteres ind i injektionsnålen, som placeres i mikropipetteholderen i mikromanipulatoren. F) En 3 nul l bolus injiceres i embryonets cellelegeme på encellestadiet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Screening af zebrafisk injiceret med den transgene konstruktion. (A,A') Konfokalbillede af et embryo afbildet ved 24 hpf viser mosaikekspressionen af sox17:EGFPCAAX transgenet. (B,B') Transgen markørekspression af cmlc2: EGFP i det udviklende hjerte ved 24 hpf. Sidebilleder af embryonerne, med forreste til venstre og dorsal øverst. C) Konfokal afbildning af et embryon genereret af en transgenbærende voksen zebrafisk. Hele endoderm udtrykker EGFPCAAX. Sidebillede af embryoet, med forreste til venstre og ventral øverst. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Posemål i ethanolbehandlede vildtypeembryoner og Bmp-mutantembryoner. (A) Skematisk visning af målingen af endodermens samlede længde og posernes længde. B) Målingerne af den samlede anterior-posterior endoderm længde viser ingen forskel mellem ubehandlede og ethanolbehandlede vildtypeembryoner og Bmp-mutante embryoner. (C) Målingerne af dorsal-ventral poselængde indikerer, at pose 1 og 3 viser stigninger i poselængden mellem de ubehandlede og ethanolbehandlede vildtypeembryoner, men falder i længden mellem de ubehandlede og ethanolbehandlede Bmp-mutanter (tovejs ANOVA; pose 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; pose 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). Pose 2 viser en stigning i længden mellem de ubehandlede og ethanolbehandlede vildtype- og Bmp-mutantgrupper (tovejs ANOVA; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001). Der blev ikke observeret forskelle i poselængde mellem pose 4 og 5. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Tol2Kit-komponenter i Lovely Lab. Hver indgangs- og destinationsvektor, der er tilgængelig i Lovely Lab, deres beskrivelser og deres oprindelseslaboratorium. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Beregning af mængden og samordningen af hver vektor i LR-rekombinationsreaktionen. Mængden af hver vektor blev beregnet ud fra størrelsen (i bp) og den fmol, der var nødvendig for hver komponent: 10 fmol af hver indgangsvektor og 20 fmol af destinationsvektoren. Fra plasmidkoncentrationen fortyndes hver vektor i sterilt vand for at tilsætte 1 μL eller mindre til LR-reaktionen. Sterilt vand tilsættes vektorpuljen svarende til 4 μL, 1 μL LR-reaktionsblanding tilsættes til reaktionen, og det inkuberes ved 25 °C natten over. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafisk er ideelle til at studere virkningen af ethanoleksponering på udvikling og sygdomstilstande 7,8. Zebrafisk producerer et stort antal gennemsigtige, eksternt befrugtede, genetisk medgørlige embryoner, hvilket muliggør levende billeddannelse af flere transgenmærkede væv og celletyper samtidigt i flere miljøsammenhænge19,20. Disse styrker kombineret med den stærke udviklingsmæssige genetiske bevarelse hos mennesker gør zebrafisk til et stærkt modelsystem til billeddannelse af virkningen af ethanol 7,8. Her beskrev vi protokollen for en modulær tilgang til generering og injektion af transgene konstruktioner og etablering af transgene zebrafiskelinjer til fremtidige ethanolstudier.
Mange forskellige tilgange er blevet etableret for at generere transgene zebrafisk. Imidlertid kan generering af både transgene konstruktioner og transgene linjer være skræmmende. Mens traditionelle underkloningsteknikker, BAC-kloning eller PCR-baserede tilgange såsom Gibson-samling giver mulighed for at generere transgene konstruktioner, har de lav gennemstrømning og mangler alsidighed i deres konstruktion10. Derudover skal disse strategier redesignes for hver transgen konstruktion, der skabes. Underkloning kræver flere fordøjelser og ligationer, forudsat at alle de nødvendige begrænsningssteder er til stede og unikke. BAC-kloning kræver sekventering og testning af flere BAC-kloner. Til Gibson-samling skal nye PCR-primere designes til hver transgen konstruktion. Desuden fører injektion af enten uslebet eller lineært DNA til lav kimlinjeoverførsel21,22,23.
Tol2Kit er et modulært system, der bruger gateway-kloning til at generere komplette transgene konstruktioner flankeret af Tol2-gentagelser, der, når de kombineres med transposase-mRNA, i høj grad øger transgenese og kimlinjetransmission 10,11,24,25. Dusinvis af indgangs- og destinationsvektorer er tilgængelige fra Kwan-laboratoriet og Cole Lab10,11. Derudover har zebrafisklaboratorier, der bruger Tol2Kit, genereret og kurateret mange flere indgangs- og destinationsvektorer. Som et eksempel på bredden af tilgængelige vektorer har vi samlet og brugt over 70 vektorer (tabel 1). Med alle disse fællesskabsressourcer kan man hurtigt generere tusindvis af forskellige transgene konstruktioner ved blot at kombinere de valgte vektorer i en LR-reaktion.
Optimale LR-reaktioner kræver nøjagtige beregninger af plasmidstørrelse og koncentration. Beregningerne for hver vektor udføres i femtomol (fmol) værdier, så hver reaktion kræver ikke et højt plasmidvolumen for at generere en transgen konstruktion. Denne lille mængde plasmid gør imidlertid fortyndinger og korrekt pipettering yderst kritisk for reaktionens succes10. Yderligere faktorer, der kan påvirke LR-reaktionen, er størrelsen af indsatserne i de forskellige indgangsvektorer. For eksempel er p5E-sox17-elementet , der anvendes i denne undersøgelse, over 4 kb, hvilket, hvis det kombineres med lige store pME- og p3E-elementer, vil resultere i en meget stor transgen vektor. Et stort plasmid i bakterier kan være vanskeligt at dyrke, hvilket reducerer antallet af kolonier, der genereres fra bakterietransformationen. Dette vil også resultere i langsommere vækst og nedsat plasmidniveau, når det isoleres10. Det er vigtigt at have meget kompetente bakterieceller samt øge inkubationen af bakteriecellerne under transformationen af rekombinationsplasmidet er nøglen til at generere nok kolonier til at fange korrekt transgendannelse. Derudover spiller brugen af det korrekte LR-reaktionsenzym (angivet i materialetabellen) også en vigtig rolle i LR-reaktionens succes.
Ud over dannelsen af en transgen konstruktion og bakterielle transformationer kan embryoinjektionen og genomintegrationen også være vanskelig. Genereringen af transposase mRNA af høj kvalitet øger frekvensen af genomisk integration10 kraftigt. De udtrukne kapillærer skal laves kort før injektion af embryonerne, da ældre nåle kan miste kapillær virkning (dvs. injektionsvæsken bevæger sig ikke til spidsen af nålen) (figur 3E). Både at bryde spidsen af nålen for kun at injicere ~ 3 nL væske og injicere cellekroppen kræver øvelse. Vores træningsprotokol indebærer at injicere cellekroppen med kun phenolrødt injektionsfarvestof, indtil nålen brydes, og embryonerne injiceres. Injektion af cellekroppen øger drastisk hastigheden af genomintegration10. Ved at kombinere alt dette har vi i gennemsnit 75% eller større genomindsættelse og mosaikekspression, men dette kan variere fra konstruktion til konstruktion.
Da genomisk indsættelse kan være tilfældig, er hvert embryo, der viser mosaikekspression, en unik transgen indsættelse og kræver fortsat screening. Denne fortsatte screening er nødvendig for at påvise, at integrationsstedet ikke er skadeligt for embryonets udvikling, at der forekommer kimlinjeoverførsel, og at ekspressionen af transgenet ikke svækkes eller potentielt bringes til tavshed. Når en transgen linje er etableret, kan den let anvendes til flere analyser i ethanolundersøgelser. For disse ikke-fluorescerende transgene konstruktioner omfatter almindeligt anvendte transgene markører cmlc2: GFP og αkrystallin: RFP, som mærker henholdsvis hjertet og nethinden og giver mulighed for fortsat transgen screening. Ud over transgene markører til screening kan disse to transgener bruges til direkte at studere virkningen af ethanol på hjerte- og nethindeudvikling.
Ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor genererede vi en sox17:EGFPCAAX transgen zebrafisklinje, der havde stabil kimlinjetransmission af en endoderm-specifik membranmærket EGFP-konstruktion. Ved hjælp af denne linje var vi i stand til at måle virkningen af ethanol på endodermal posedannelse i ethanolfølsomme Bmp-mutante embryoner. Vi viste, at størrelserne på poser 1-3, men ikke på pose 4 og 5 eller den samlede endodermlængde blev påvirket i ethanolbehandlede Bmp-mutanter (fig. 5). Dette pilotarbejde tyder på, at Bmp-ethanol-interaktionen forstyrrer endodermdannelse, især celleadfærden bag posedannelse. Dette arbejde eksemplificerer nytten af at generere transgene zebrafiskelinjer til ethanolundersøgelser. Som følge heraf vil skabelsen af nye transgene linjer i høj grad øge vores forståelse af ethanolfølsomme cellulære processer og vævshændelser i FASD.
I sidste ende har transgene zebrafisk og zebrafisk generelt vist sig at være utroligt kraftfulde i studiet af FASD 7,8. Tol2Kit er et ekstremt alsidigt værktøjssæt, der gør det muligt for forskere hurtigt at generere flere transgene konstruktioner, der er klar til at injicere i zebrafisk. Det modulære design og letheden ved at generere nye indgangsvektorer resulterer i ekstrem fleksibilitet i generering af transgene konstruktioner uden at skulle redesigne nogen komponenter. Samlet set vil denne værktøjskasse i høj grad forbedre både zebrafiskforskning og forskning generelt med henblik på at forbedre forståelsen af FASD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskningen præsenteret i denne artikel blev støttet af et tilskud fra National Institutes of Health / National Institute on Alcohol Abuse (NIH / NIAAA) R00AA023560 til CBL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawson Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
- Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
- Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
- Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
- Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Lovely, C. B.
- Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).
- Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017).
- The Tol2Kit. , Available from: http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page (2007).
- Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
- Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
- Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
- Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
- Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).
