Summary
这项工作描述了模块化Tol2转基因系统的协议，这是一种基于网关的克隆方法，用于创建转基因构建体并将其注入斑马鱼胚胎。
Abstract
胎儿酒精谱系障碍 （FASD） 的特征是一组高度可变的结构缺陷和认知障碍，这些缺陷和认知障碍是由于产前乙醇暴露引起的。由于胎儿酒精谱系障碍的复杂病理学，动物模型已被证明对我们目前对乙醇诱导的发育缺陷的理解至关重要。斑马鱼已被证明是检查乙醇诱导的发育缺陷的有力模型，因为斑马鱼和人类之间的遗传和发育高度保守。作为一种模型系统，斑马鱼具有许多属性，使其成为发育研究的理想选择，包括大量遗传可处理和半透明的外部受精胚胎。这使研究人员能够在多种遗传环境中精确控制乙醇暴露的时间和剂量。斑马鱼中可用的一个重要遗传工具是转基因。然而，生成转基因构建体和建立转基因系可能是复杂和困难的。为了解决这个问题，斑马鱼研究人员建立了基于转座子的Tol2转基因系统。该模块化系统使用多位点网关克隆方法快速组装完整的基于Tol2转座子的转基因构建体。在这里，我们描述了灵活的Tol2系统工具箱和用于生成可用于斑马鱼转基因的转基因构建体及其在乙醇研究中的使用的方案。
Introduction
产前乙醇暴露会导致连续的结构缺陷和认知障碍，称为胎儿酒精谱系障碍（FASD）1，2，3，4。多种因素之间的复杂关系使得研究和理解人类胎儿酒精谱系障碍的病因具有挑战性。为了解决这一挑战，已经使用了各种各样的动物模型。事实证明，这些模型中可用的生物学和实验工具对于发展我们对乙醇致畸性的机理基础的理解至关重要，并且这些模型系统的结果与人类乙醇研究中发现的结果非常一致5，6。其中，斑马鱼已成为研究乙醇致畸7，8的有力模型，部分原因是它们的外部受精，高繁殖力，遗传可移植性和半透明胚胎。这些优势相结合，使斑马鱼成为使用转基因斑马鱼系对胎儿酒精谱系进行实时实时成像研究的理想选择。
转基因斑马鱼已被广泛用于研究胚胎发育的多个方面9。然而，创建转基因构建体和随后的转基因品系可能非常困难。标准转基因需要一个活性启动子元件来驱动转基因和一个多聚A信号或“尾巴”，所有这些都在一个稳定的细菌载体中，用于一般载体维护。传统一代的多组分转基因构建体需要多个耗时的亚克隆步骤10。基于聚合酶链反应的方法，如吉布森组装，可以规避与亚克隆相关的一些问题。然而，必须设计和测试独特的引物，以产生每个独特的转基因构建体10。除了转基因构建之外，基因组整合、种系传播和筛选适当的转基因整合也很困难。在这里，我们描述了使用基于转座子的Tol2转基因系统（Tol2Kit）的协议10，11。该模块化系统使用多位点网关克隆，从不断扩展的“入口”和“目标”载体库中快速生成多个转基因构建体。集成的Tol2转座元件大大提高了转基因速率，允许多个转基因的快速构建和基因组整合。使用该系统，我们展示了如何使用内胚层转基因斑马鱼系的产生来研究胎儿酒精谱系背后的组织特异性结构缺陷。最终，在该协议中，我们表明转基因构建体的模块化设置和构建将极大地帮助基于斑马鱼的FASD研究。
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Protocol
该程序中使用的所有斑马鱼胚胎均按照既定的IACUC协议12进行饲养和繁殖。这些协议得到了路易斯维尔大学的批准。
注意：本研究使用了野生型斑马鱼品系AB和 bmp4st72;smad5b1100 双突变株系。该程序中使用的所有水都是无菌反渗透水。在激光扫描共聚焦显微镜下拍摄共聚焦图像。内胚层测量是使用ImageJ中的测量工具进行的。所有统计分析均使用统计软件进行。
1. 制定解决方案和媒体
- 细菌培养基：按照制造商的说明溶解LB肉汤或琼脂，然后高压灭菌。在将培养基倒入 100 mm 培养皿之前，加入氨苄西林 （50 μg/mL）、卡那霉素 （50 μg/mL） 或氨苄西林/氯霉素组合（分别为 50 μg/mL 和 30 μg/mL）。
- 要制作 20 倍胚胎培养基原液，请将以下内容溶解在 1 L 水中：17.5 g NaCl、0.75 g KCl、2.9 g CaCl 2、0.41 g K 2 HPO 4、0.142 g Na 2 HPO 4 和4.9 g MgSO4·7H2O。 使用0.22μm真空过滤系统过滤灭菌储备溶液， 并储存在4°C。
注意：忽略形成的白色沉淀物;这不会影响媒体。 - 在19L水中，溶解1.2gNaHCO3 并加入1L的20x胚胎培养基储备液以生成工作胚胎培养基溶液，并将该溶液保持在28°C。
- 对于 2% 酚红溶液，将 20 mg 酚红钠盐溶解在 1 mL 无 RNase 的水中，并在室温下储存。
2. 胚胎注射模具
- 要制作琼脂糖注射板，通过加热至沸腾将琼脂糖溶解在胚胎培养基中至终浓度为3%。
- 将 50 mL 琼脂糖倒入 100 mm 培养皿中，当琼脂糖仍为液体时，将注射模具轻轻放入琼脂糖中，以防止模具下方形成气泡。
- 让琼脂糖板冷却。琼脂糖固体后，取出注射模具，并在4°C下储存直至准备使用。
3. 注射移液器
- 使用垂直移液器拉拔器将含有灯丝的 1.0 mm （OD） 毛细管拉入针中，电磁阀设置为 2.5，加热元件设置为 14.6。
注意：任何加热的拉拔器如果将毛细血管干净均匀地拉入两根针头，就会起作用，但注射针需要在注射斑马鱼胚胎后 1 周内拉动以获得一致的注射效果。- 将毛细管放入拉拔器中，拧紧两端的夹具，然后激活加热元件。
- 拉动毛细血管以形成两个注射针。
- 从拉拔器中取出毛细管，并将它们储存在空的培养皿中，并带有一条用作持针器的造型粘土条。
4. 转座酶mRNA制备
- 通过在 0.5 mL 微量离心管中组合以下内容，将含有转座酶的 Tol2Kit 质粒与 NotI 限制性核酸内切酶线性化：10 μL 转座酶质粒 （150 ng/μL）、1.5 μL 限制性核酸内切酶反应缓冲液、0.3 μL NotI 核酸内切酶。
- 用不含RNase的水填充反应至20μL，然后在37°C下混合并消化过夜。
- 通过在消化反应中加入 1 μL 0.5 M EDTA （pH 8.0）、2 μL 5 M NH4OAc 和 80 μL 100% EtOH 来停止转座酶消化，然后在 −20 °C 下混合并冷却过夜。
- 在4°C下以14，000×g 离心溶液20分钟，然后吸出上清液并将DNA沉淀重悬于无RNA酶的水中。
- 使用荧光计测定线性质粒浓度（以纳克/微升 （ng/μL） 为单位），首先运行 2 μL 不含 RNase 的水空白，然后运行 2 μL 线性化质粒。
注意：质粒浓度通常在 100-200 ng/μL 之间 - 通过在 0.5 mL 微量离心管中按顺序组合以下组分来设置 SP6 mRNA 生产：10 μL 2x NTP/CAP、2 μL 10x 反应缓冲液、0.1-1 μg 线性 DNA 模板和 2 μL SP6 酶混合物。
- 用不含RNase的水填充反应至20μL，然后混合并在37°C孵育2小时。
- 孵育2小时后，加入1μLDNA酶，充分混合，并在37°C下再孵育15分钟。
- 要停止SP6反应，向反应管中加入30μLLiCl沉淀溶液，然后在-20°C下混合并冷却过夜。
- 在4°C下以14，000× g 离心溶液20分钟以沉淀mRNA，然后吸出上清液并用1mL的80%EtOH（用无RNase的水稀释）洗涤mRNA沉淀。
- 将溶液在4°C下以14，000× g 离心20分钟以沉淀mRNA，然后吸出上清液。让颗粒风干。
- 将 mRNA 沉淀重悬于 20 μL 无 RNase 的水中，按照步骤 4.5 所述使用荧光计测定 mRNA 浓度（以纳克/μL （ng/μL） 为单位）（应至少为 100 ng/μL），每管等分 100 ng mRNA 供一次性使用，并储存在 −80 °C。
注意：为确保mRNA不被降解，可以在DNA电泳凝胶上快速运行2 μLmRNA，以确认1，950 bps的单个条带。
5. 多站点网关克隆以创建用于转基因的入口载体
注意：该协议是从Kwan等人10修改的，LR反应写为半LR反应，总体积为5μL。为了产生新的进入元件，需要使用5'，中间和3'供体载体的BP反应10，13。
- 为了进行反应，收集 p5E、pME 和 p3E 各 10 fmol 和 20 fmol 目标载体 （pDest）。
注意：多位点LR重组使用四种不同的质粒载体：5'进入载体（p5E），中间进入载体（pME），3'进入载体（p3E）和目标载体（pDest），以产生独特的转基因构建体，两侧是Tol2重复，准备注射到斑马鱼胚胎中。- 从质粒来源鉴定碱基对中所有四种载体的大小（表1，Tol2Kit Wiki第14 页或Addgene11;参见 材料表）。
注意：对于新型载体，通过商业测序公司 进行 的完整质粒测序可以提供以bps为单位的确切质粒大小。 - 使用荧光计测定所有四种载体的浓度，单位为纳克/微升（ng/μL），如步骤4.5中所述。
- 使用660 g/mol的DNA重量和质粒大小（以bps为单位），计算达到10 fmol（进入载体）或20 fmol（目标载体）所需的质粒总纳克（ng）。
注意：科罗拉多大学安舒茨医学院的Mosimann实验室生成了一个免费提供的电子表格，用于计算LR反应15中所需的质粒量（以ng为单位）和载体的体积（以μL为单位）。
- 从质粒来源鉴定碱基对中所有四种载体的大小（表1，Tol2Kit Wiki第14 页或Addgene11;参见 材料表）。
- 要生成下面描述的构造 sox17： EGFPCAAX，请使用以下载体：包含斑马鱼 sox17 启动子的 p5E 载体，其大小为 6，918 bp，大小为 16;含有异戊烯化EGFP的pME载体，其大小为10，345 bp;包含 SV40 晚期多聚 A 信号序列的 p3E 向量，大小为 10 的 2，838 bp;和 pDest，大小为 5，883 bp，大小为 10。
- 使用步骤5.1.2中测定的质粒浓度和每个载体（步骤5.1.3）的纳克（ng）量，计算达到10 fmol（进入载体）或20 fmol（目标载体）所需的每个质粒的总微升（μL），然后将其除以2用于5 μL半LR反应（下面列出的所有值都列在 表2中）。
- 要生成 10 fmol 的 p5E-sox17，请使用 45.66 ng（浓度为 140.3 ng/μL），并用无菌水稀释 4 倍以获得 0.65 μL。
- 要生成 10 fmol 的 pME-EGFPCAAX，请使用 22.08 ng（浓度为 213.5 ng/μL），并用无菌水稀释 10 倍以获得 0.52 μL。
- 要生成 10 fmol 的 p3E-poly A，请使用 15.73 ng（浓度为 276.1 ng/μL），并用无菌水稀释 20 倍以获得 0.57 μL。
- 对于 20 fmol 的目标载体，使用 77.66 ng 的 pDest（浓度为 307.3 ng/μL），并用无菌水稀释 5 倍以获得 1.63 μL。
- 要设置 5 μL 半 LR 反应，请将步骤 5.3 中测定的 p5E、pME、p3E 和 pDest 的体积合并到 0.5 mL 微量离心管中，然后加入无菌水以达到 4 μL 的总反应体积。
- 剧烈涡旋LR酶混合物2x，每次1分钟以确保正确混合，然后在反应中加入1μL并充分混合。
- 在25°C孵育过夜（16 +小时）。
- 通过加入0.5μL蛋白酶K（2μg/ μL）停止LR反应，在37°C下孵育10分钟，然后冷却至室温。
- 通过添加质粒并使细胞在冰上放置 25-30 分钟，将 3-4 μL 质粒转化为解冻的化学感受态细胞。
- 当细胞坐在冰上时，将两个LB-氨苄西林琼脂平板加热至室温。
- 在 42°C 水浴中对细胞进行热冲击 30 秒。
- 热休克后，向细胞中加入250μL不含抗生素的富液体培养基，并在37°C振荡孵育1.5小时。
- 将 300 μL 细菌散布在一个氨苄西林平板上，并在 37°C 下孵育过夜。
- 第二天早上，筛选菌落是否存在两种表型，透明和不透明，一次挑选一个透明菌落（如Kwan等人10中所述），接种液体培养物，然后在37°C下摇匀过夜。
注意：清除菌落几乎总是包含正确的 LR 菌落（>85% 的时间）。 - 按照制造商的说明使用商业试剂盒，对每种液体培养物进行质粒制备，并诊断性地消化每个质粒以确认转基因构建体的适当大小，这表明LR网关反应已正常工作。
- 使用步骤5.4-5.12中所述的标准细菌转化方案使用0.5-1μL质粒重新转化正确的转基因构建体，并且仅在37°C下孵育1小时。
- 重新划线菌落，并确认每个菌落都具有LR转基因构建体，如步骤5.14所示。
- 如步骤4.5所述测定质粒浓度（胚胎注射至少需要150ng / μL）。
6. 将转基因注射到胚胎中
- 在冰上解冻一次性转座酶mRNA样品和Tol2转基因构建体，并将琼脂糖注射板预先警告至室温。
- 在冰上组合以下内容：150 ng 质粒、100 ng 转座酶 mRNA 和 2% 酚红 （0.3 μL）。然后，加入不含 RNA 的水，使体积补足至 3 μL。
- 使用移液管将一个细胞期胚胎转移到充满EM的注射板（如步骤2中所述）中，完全覆盖琼脂，然后轻轻按压注射板的每个插槽约50-75个胚胎。
- 将mRNA/质粒/酚红混合物加入毛细管注射针的开口端，将毛细管针放入注射台电枢中，然后打开注射装置。
注意：注射装置使用压缩气体（例如空气）在激活时将所需体积（如步骤6.5中所述）的mRNA/质粒/酚红混合物脉冲到胚胎中。 - 将毛细管针降低到注射板的EM中，并使用镊子折断尖端，以使注射台仅泵出少量mRNA/质粒/酚红混合物。
- 将少量3nL的mRNA /质粒/酚红混合物注射到胚胎的细胞体中。
注意：3 nL 推注是 mRNA/质粒/酚红混合物的体积，理论上七次推注可以平等地穿过胚胎的中线。 - 完成注射胚胎后，将它们轻轻地从插槽中弹出并将它们转移到带有新鲜EM（约40mL）的100mm培养皿中，然后孵育在28.5°C下以使胚胎发育。
7. 筛选胚胎进行转基因植入
- 对于荧光蛋白的表达，选择应表达荧光转基因的适当发育阶段，并在荧光解剖显微镜下筛选荧光的存在。
注意：这些胚胎的表达将是马赛克的，并显示转基因构建体的基因组插入。 - 通过筛选荧光转基因标记物（如步骤7.1中所述）来筛选非荧光转基因，例如由基因 cmlc2 的心脏特异性启动子驱动的GFP或由αcyrstallin晶状体特异性启动子驱动的mCherry，它们包含在不同的目标载体中。
- 让转基因植入阳性的胚胎完全发育到成年斑马鱼阶段。
- 一旦潜在的转基因鱼达到繁殖年龄，通过将它们繁殖为野生型斑马鱼来单独筛选它们的种系传播和转基因表达能力。
- 那些胚胎正常发育并给予最强和最合适的转基因表达的成虫被保留为独特的转基因斑马鱼品系，以备将来的工作和分析。
注意：作为筛选转基因构建体基因组插入的替代方法，设计仅扩增转基因构建体而不是野生型DNA的PCR引物。
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Representative Results
为了生成转基因构建体，我们使用了Tol2转基因系统。三种进入载体，包括包含基因启动子/增强子元件的p5E，保存由启动子/增强子元件表达的基因的pME和至少包含polyA尾巴的p3E，用于通过多位点网关LR克隆 生成 转基因构建体。目标载体pDest为斑马鱼胚胎中转基因构建体的基因组插入提供Tol2重复序列，并包含细菌生长的所有基本遗传信息（图1A）。出于本文的目的，我们创建并注射了 sox17：EGFPCAAX 转基因构建体。内胚层标志物 sox17的启动子用于驱动斑马鱼发育内胚层中的膜标记的EGFP。对于表达非荧光团蛋白的转基因构建体，可以使用含有荧光转基因标记物（例如 cmlc2：EGFP ）的pDest载体来帮助基因组插入（图1A）。
使用上述方案（表2）中描述的值，生成 sox17：EGFPCAAX 转基因构建体，并将该构建体的4μL转化为化学感受态 大肠杆菌 细胞。在37°C孵育过夜后，琼脂平板含有约250个菌落（在我们的实验室中，LR反应通常平均每个平板150-300个菌落）。这些菌落的筛选是基于不透明度进行的。在我们手中，透明的菌落具有正确的 sox17：EGFPCAAX 产物>85%的时间，而不透明的菌落从未包含正确的重组产物（图1B，箭头与箭头）。从几个菌落中分离质粒后，使用限制性内切酶NcoI对重组产物进行限制性酶切。消化了两个不同的透明菌落和一个不透明的菌落。两个透明菌落都有一个正确大小为9，544 bp的条带（未消化的质粒作为消化对照加载），而不透明菌落根本没有任何条带（图2A）。这些阳性 sox17：EGFPCAAX 构建体被重新转化，随后的菌落被重新划线，这些菌落被确认具有质粒，并产生-80°C细菌冷冻储备液。测定了 sox17：EGFPCAAX 质粒和加帽转座酶mRNA的浓度，因此它们都可用于注射（图2B）。
通过将一个细胞期胚胎放入预热的胚胎注射模具中来制备用于注射的胚胎（图3A-C）。一旦放入注射模具中，将含有sox17：EGFPCAAX mRNA的注射针放置在显微操纵器上的微量移液器支架中（图3D，E）。胚胎注射100 ng转座酶mRNA，150 ng sox17：EGFPCAAX质粒和酚红（注射示踪染料）。将3nL推注（由协议步骤6.6中所述的大小确定）注射到细胞体内而不是胚胎的蛋黄中，以获得最佳的整合机会（图3F）10。
注射后，将胚胎从注射模具中取出并使其发育24小时。在受精后24小时（hpf），筛选胚胎EGFPCAAX的内胚层表达。 在~75%的注射胚胎中观察到镶嵌内胚层EGFPCAAX表达（图4A，A'）。为了筛选注射有非荧光转基因（如 Gal4 或 CreERT2 ）的胚胎，可以使用还包含转基因标记物（即 cmlc2：EGFP）（图1A）的目标载体（图4B，B'）。具有sox17：EGFPCAAX种系转基因的成年斑马鱼产生荧光胚胎，内胚层完全用 EGFPCAAX 标记（图4C）。
使用新创建的sox17：EGFPCAAX转基因系，我们能够直接评估乙醇对内胚层袋形成的影响。袋子是在内胚层侧缘形成的突起，对于面部骨骼和多器官系统的形成很重要17。我们之前已经证明，阻断骨形态发生蛋白（Bmp）信号传导会导致袋子发育不全18。我们现在表明，10-18 hpf 的 Bmp 突变体的乙醇处理对袋子尺寸有微妙但显着的影响。在对照和乙醇处理的野生型Bmp突变胚胎中测量每个袋子1-5的背腹长度（斑马鱼有六个袋，但第六个在成像的发育阶段尚未完全形成）（图5A）。作为乙醇暴露引起的一般生长影响的对照，测量了整个内胚层的前后长度（图5A）。内胚层的总长度不受基因型或治疗的影响（图5B）。然而，袋子 1 和 3 在未经处理和乙醇处理的野生型胚胎之间显示出袋长度显着增加，但在未处理和乙醇处理的 Bmp 突变体之间长度显着减少（图 5C; 双向方差分析; 袋 1：F（1，54） = 10.39，p = 0.0021; 袋 3：F（1，54） = 12.70，p = 0.0008）。袋 2 分别在未处理和乙醇处理的野生型和 Bmp 突变组之间显示袋尺寸显着增加（图 5C; 双向方差分析;F（1，54） = 18.94，p < 0.0001）。
图1：用于转基因构建的LR网关反应 。 （A）模块化四部分LR网关克隆反应示意图。LR Clonase在高度特异性的反应中重新组合三种进入载体p5E，pME和p3E以及目标载体pDest，以产生准备用于胚胎注射的新型转基因产物。为了筛选非荧光转基因，pDest载体可以包含可选的转基因标记（例如cmlc2：EGFP）。（B）从LR重组产物的转化中获得的细菌菌落的实施例。透明菌落含有正确的LR重组产物>85%的时间（箭头），而不透明菌落从未包含正确的重组产物（箭头）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：质粒DNA和转座酶mRNA的分析 。 （A）LR重组产物转化对三个菌落的诊断消化。单个不透明菌落不包含任何要筛选的质粒，而两个透明菌落包含9，544 bp（未切割与切割）的单个条带。（B） 转座酶 mRNA 在 1，950 bp。 请点击此处查看此图的大图。
图3：斑马鱼胚胎注射设置 。 （A）将注射模具置于用EM（3%v / v）稀释的液体琼脂糖中。（B）一旦固化，将模具从琼脂糖板上除去。（C）胚胎排列在注射模具中。（D，E）将mRNA/质粒/酚红混合物移液到注射针中，注射针放置在显微操纵器的微量移液器支架中。（F）在单细胞阶段将3nL推注物注射到胚胎的细胞体内。 请点击此处查看此图的大图。
图4：筛选注射有转基因构建体的斑马鱼。 （A，A'）在24 hpf下成像的胚胎的共聚焦图像显示了sox17：EGFPCAAX转基因的镶嵌表达。（B，B'）cmlc2：EGFP在发育中的心脏中以24 hpf的转基因标志物表达。胚胎的侧视图，前方在左侧，背部在顶部。（C）由携带转基因的成年斑马鱼产生的胚胎的共聚焦图像。整个内胚层表达EGFPCAAX。胚胎的侧视图，前方在左侧，腹侧在顶部。请点击此处查看此图的大图。
图 5：乙醇处理的野生型和 Bmp 突变胚胎中的袋测量。 （A）显示内胚层总长度和袋子长度的测量示意图。（B）对整体前后内胚层长度的测量显示，未经处理和乙醇处理的野生型和Bmp突变胚胎之间没有差异。（C）背腹袋长度的测量表明，袋1和3在未经处理和乙醇处理的野生型胚胎之间显示袋长度增加，但在未处理和乙醇处理的Bmp突变体之间长度减小（双向方差分析;袋1：F（1，54）= 10.39，p = 0.0021;袋3：F（1，54）= 12.70，p = 0.0008）。袋 2 显示未经处理和乙醇处理的野生型和 Bmp 突变组之间的长度增加（双向方差分析;F（1，54） = 18.94，p < 0.0001）。在袋子 4 和 5 之间的袋子长度上没有观察到差异。请点击此处查看此图的大图。
表 1：可爱实验室中的 Tol2Kit 组件。 可爱实验室中可用的每个条目和目标载体、它们的描述和它们的原产地实验室。 请按此下载此表格。
表2：LR重组反应中每个载体的量和协调的计算。 每个载体的量是根据每个组分所需的大小（以bp为单位）和fmol计算的：每个进入载体10 fmol和目标载体20 fmol。根据质粒浓度，将每个载体稀释在无菌水中，以向LR反应中添加1μL或更少。将无菌水加入载体池中以等于 4 μL，向反应中加入 1 μL LR 反应混合物，并在 25°C 下孵育过夜。 请按此下载此表格。
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Discussion
斑马鱼非常适合研究乙醇暴露对发育和疾病状态的影响7，8。斑马鱼产生大量半透明、外部受精、可遗传处理的胚胎，这允许在多种环境背景下同时对几种转基因标记的组织和细胞类型进行活体成像19，20。这些优势，加上对人类强大的发育遗传保护，使斑马鱼成为对乙醇7，8的影响进行成像的强大模型系统。在这里，我们描述了用于生成和注入转基因构建体并为未来的乙醇研究建立转基因斑马鱼系的模块化方法的方案。
已经建立了许多不同的方法来产生转基因斑马鱼。然而，生成转基因构建体和转基因系可能令人生畏。虽然传统的亚克隆技术、BAC 克隆或基于 PCR 的方法（如 Gibson 组装）允许生成转基因构建体，但它们的通量低且构建缺乏多功能性10.此外，这些策略需要针对创建的每个转基因构建体重新设计。亚克隆需要多次酶切和连接，假设所有必要的限制性位点都存在且唯一。BAC 克隆需要对多个 BAC 克隆进行测序和测试。对于Gibson组装，必须为每个转基因构建体设计新的PCR引物。此外，注射未切割或线性化的DNA会导致低种系传播21，22，23。
Tol2Kit是一个模块化系统，它使用网关克隆来生成完整的转基因构建体，两侧是Tol2重复，当与转座酶mRNA结合使用时，可大大增加转基因和种系传播10，11，24，25。Kwan实验室和Cole Lab10，11提供了数十种入口和目标载体。此外，使用 Tol2Kit 的斑马鱼实验室已经生成并策划了更多的入口和目标载体。作为可用载体广度的一个例子，我们已经汇集并使用了70多个载体（表1）。利用所有这些社区资源，只需在LR反应中组合选择的载体，就可以快速生成数千种不同的转基因构建体。
最佳LR反应确实需要精确计算质粒大小和浓度。每个载体的计算都是以飞摩尔（fmol）值完成的，因此每个反应不需要高质粒体积来生成转基因构建体。然而，这种少量质粒使得稀释和适当的移液对反应的成功至关重要10。可能影响LR反应的其他因素是不同入口载体中插入片段的大小。例如，本研究中使用的 p5E-sox17 元件超过4 kb，如果与同样大的pME和p3E元件结合使用，将产生非常大的转基因载体。细菌中的大质粒可能难以培养，从而减少了细菌转化产生的菌落数量。分离时，这也将导致生长缓慢和质粒水平降低10。重要的是，具有高感受态细菌细胞，以及在重组质粒转化过程中增加细菌细胞的孵育，是产生足够菌落以捕获适当转基因形成的关键。此外，使用正确的LR反应酶（列在 材料表中）对LR反应的成功也起着重要作用。
除了产生转基因构建体和细菌转化之外，胚胎注射和基因组整合也可能很困难。高质量转座酶mRNA的产生大大提高了基因组整合的频率10。拉动的毛细血管需要在注射胚胎前不久制作，因为较旧的针头可能会失去毛细管作用（即，注射液无法移动到针尖）（图3E）。打破针尖仅注射~3 nL液体和注射细胞体都需要练习。我们的训练方案包括仅用酚红注射染料注射细胞体，直到折断针头并掌握注射胚胎。注射细胞体可大幅提高基因组整合率10。结合所有这些，我们平均有75%或更高的基因组插入和镶嵌表达，但这可能因构建体而异。
由于基因组插入可以是随机的，因此每个显示镶嵌表达的胚胎都是独特的转基因插入，需要继续筛选。这种持续的筛选对于证明整合位点对胚胎的发育无害，发生种系传播，并且转基因的表达没有减弱或可能沉默是必要的。一旦建立了转基因系，就可以很容易地将其用于乙醇研究中的多种分析。对于那些非荧光转基因构建体，常用的转基因标记物包括 cmlc2：GFP 和 αcrystallin：RFP，它们分别标记心脏和视网膜，并允许继续转基因筛选。除了用于筛选的转基因标记物外，这两种转基因还可用于直接研究乙醇对心脏和视网膜发育的影响。
使用上述协议，我们生成了一个 sox17：EGFPCAAX 转基因斑马鱼系，该系具有内胚层特异性膜标记EGFP构建体的稳定种系传播。使用该线，我们能够测量乙醇对乙醇敏感的Bmp突变胚胎中内胚层袋形成的影响。我们发现，在乙醇处理的Bmp突变体中，袋1-3的尺寸而不是袋4和5的尺寸以及总内胚层长度受到影响（图5）。这项试点工作表明，Bmp-乙醇相互作用破坏了内胚层的形成，特别是袋形成背后的细胞行为。这项工作说明了为乙醇研究生成转基因斑马鱼品系的效用。因此，创造新的转基因品系将大大增加我们对胎儿酒精谱系中乙醇敏感细胞过程和组织事件的理解。
最终，转基因斑马鱼和一般斑马鱼已被证明在FASD7，8的研究中非常强大。Tol2Kit是一种用途极其广泛的工具包，使研究人员能够快速生成多种转基因构建体，准备注射到斑马鱼中。模块化设计和易于生成新的进入载体，在生成转基因构建体时具有极大的灵活性，而无需重新设计任何组件。总体而言，该工具包将大大改善斑马鱼研究和旨在提高对胎儿酒精谱系障碍的理解的一般研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本文中介绍的研究得到了美国国立卫生研究院/国家酒精滥用研究所（NIH/NIAAA）R00AA023560对C.B.L的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawson Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
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