Summary
Dit werk beschrijft een protocol voor het modulaire Tol2-transgenesesysteem, een gateway-gebaseerde kloonmethode om transgene constructies in zebravisembryo's te creëren en te injecteren.
Abstract
Foetale alcoholspectrumstoornissen (FASD) worden gekenmerkt door een zeer variabele reeks structurele defecten en cognitieve stoornissen die optreden als gevolg van prenatale blootstelling aan ethanol. Vanwege de complexe pathologie van FASD zijn diermodellen van cruciaal belang gebleken voor ons huidige begrip van door ethanol geïnduceerde ontwikkelingsdefecten. Zebravissen hebben bewezen een krachtig model te zijn om door ethanol geïnduceerde ontwikkelingsdefecten te onderzoeken vanwege de hoge mate van behoud van zowel genetica als ontwikkeling tussen zebravissen en mensen. Als modelsysteem bezitten zebravissen veel eigenschappen die ze ideaal maken voor ontwikkelingsstudies, waaronder grote aantallen uitwendig bevruchte embryo's die genetisch traceerbaar en doorschijnend zijn. Dit stelt onderzoekers in staat om de timing en dosering van blootstelling aan ethanol in meerdere genetische contexten nauwkeurig te regelen. Een belangrijk genetisch hulpmiddel dat beschikbaar is bij zebravissen is transgenese. Het genereren van transgene constructies en het vaststellen van transgene lijnen kan echter complex en moeilijk zijn. Om dit probleem aan te pakken, hebben zebravisonderzoekers het op transposon gebaseerde Tol2-transgenesesysteem opgezet. Dit modulaire systeem maakt gebruik van een multisite Gateway-kloonbenadering voor de snelle assemblage van complete Tol2 transposon-gebaseerde transgene constructies. Hier beschrijven we de flexibele Tol2-systeemtoolbox en een protocol voor het genereren van transgene constructies die klaar zijn voor zebravistransgenese en hun gebruik in ethanolstudies.
Introduction
Prenatale blootstelling aan ethanol geeft aanleiding tot een continuüm van structurele tekorten en cognitieve stoornissen die foetale alcoholspectrumstoornissen (FASD) worden genoemd1,2,3,4. De complexe relaties tussen meerdere factoren maken het bestuderen en begrijpen van de etiologie van FASD bij mensen een uitdaging. Om deze uitdaging op te lossen, is een grote verscheidenheid aan diermodellen gebruikt. De biologische en experimentele hulpmiddelen die beschikbaar zijn in deze modellen zijn cruciaal gebleken bij het ontwikkelen van ons begrip van de mechanistische basis van ethanolteratogeniciteit, en de resultaten van deze modelsystemen zijn opmerkelijk consistent met wat wordt gevonden in humane ethanolstudies 5,6. Onder deze zijn zebravissen naar voren gekomen als een krachtig model om ethanolteratogenese7,8 te bestuderen, deels vanwege hun externe bevruchting, hoge vruchtbaarheid, genetische tractie en doorschijnende embryo's. Deze sterke punten combineren om zebravissen ideaal te maken voor real-time live beeldvormingsstudies van FASD met behulp van transgene zebravislijnen.
Transgene zebravissen zijn op grote schaal gebruikt om meerdere aspecten van de embryonale ontwikkeling te bestuderen9. Het creëren van transgene constructies en daaropvolgende transgene lijnen kan echter buitengewoon moeilijk zijn. Een standaard transgen vereist een actief promotorelement om het transgen en een poly A-signaal of "staart" aan te sturen, allemaal in een stabiele bacteriële vector voor algemeen vectoronderhoud. De traditionele generatie van een multi-component transgeen construct vereist meerdere tijdrovende sub-klonenstappen 10. PCR-gebaseerde benaderingen, zoals Gibson-assemblage, kunnen enkele van de problemen in verband met subklonen omzeilen. Unieke primers moeten echter worden ontworpen en getest voor het genereren van elke unieke transgene constructie10. Naast transgenconstructie zijn genomische integratie, kiembaantransmissie en screening op een goede transgenintegratie ook moeilijk geweest. Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van het transposon-gebaseerde Tol2-transgenesesysteem (Tol2Kit)10,11. Dit modulaire systeem maakt gebruik van multisite Gateway-klonen om snel meerdere transgene constructies te genereren uit een steeds groter wordende bibliotheek van "entry" en "destination" vectoren. Geïntegreerde Tol2 transponeerbare elementen verhogen de snelheid van transgenese aanzienlijk, waardoor de snelle constructie en genomische integratie van meerdere transgenen mogelijk is. Met behulp van dit systeem laten we zien hoe de generatie van een endoderm transgene zebravislijn kan worden gebruikt om de weefselspecifieke structurele defecten die ten grondslag liggen aan FASD te bestuderen. Uiteindelijk laten we in dit protocol zien dat de modulaire opzet en de constructie van transgene constructies het op zebravissen gebaseerde FASD-onderzoek enorm zal helpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle zebravisembryo's die in deze procedure werden gebruikt, werden grootgebracht en gefokt volgens de vastgestelde IACUC-protocollen12. Deze protocollen werden goedgekeurd door de Universiteit van Louisville.
OPMERKING: De wild-type zebravis stam, AB, en de bmp4st72;smad5b1100 dubbele mutant lijn werden gebruikt in deze studie. Al het water dat bij deze procedure werd gebruikt, was steriel omgekeerde osmosewater. Confocale beelden werden gemaakt onder een laser-scanning confocale microscoop. De endodermmetingen zijn gedaan met behulp van de meettool in ImageJ. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van statistische software.
1. Het maken van de oplossingen en media
- Bacteriële media: Los LB-bouillon of agar op volgens de instructies van de fabrikant en autoclaaf. Voordat u de media in petrischalen van 100 mm giet, voegt u ampicilline (50 μg / ml), kanamycine (50 μg / ml) of een ampicilline / chlooramfenicolcombinatie (respectievelijk 50 μg / ml en 30 μg / ml) toe.
- Om 20x embryo mediamateriaal te maken, lost u het volgende op in 1 L water: 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl 2, 0,41 g K 2 HPO 4, 0,142 g Na 2 HPO 4 en 4,9 g MgSO 4·7H 2O. Filtersteriliseer de stamoplossing met behulp van een vacuümfiltratiesysteem van 0,22 μm, en bewaren bij 4 °C.
OPMERKING: Negeer het witte neerslag dat zich vormt; Dit heeft geen invloed op de media. - Los in 19 L water 1,2 g NaHCO3 op en voeg 1 L van de 20x embryo media stock toe om de werkende embryo media-oplossing te genereren en houd deze oplossing op 28 °C.
- Los voor 2% fenolrode oplossing 20 mg fenolrood natriumzout op in 1 ml RNase-vrij water en bewaar bij kamertemperatuur.
2. Embryo spuitgietmatrijzen
- Om de agarose-injectieplaat te maken, lost u agarose op in de embryomedia tot een uiteindelijke concentratie van 3% door verhitting tot een kookpunt.
- Giet 50 ml agarose in petrischalen van 100 mm en terwijl de agarose nog vloeibaar is, plaatst u de spuitgietmatrijs voorzichtig in de agarose om bubbelvorming onder de mal te voorkomen.
- Laat de agarose borden afkoelen. Zodra de agarose stevig is, verwijdert u de spuitgietmatrijs en bewaart u deze bij 4 °C totdat deze klaar is voor gebruik.
3. Injectiepipetten
- Trek capillairen van 1,0 mm (OD) met een gloeidraad in naalden met behulp van een verticale pipettrekker met de solenoïde ingesteld op 2,5 en het verwarmingselement op 14,6.
OPMERKING: Elke verwarmde trekker zal werken als het de haarvaten schoon en gelijkmatig in twee naalden trekt, maar de injectienaalden moeten binnen 1 week na het injecteren van de zebravisembryo's worden getrokken voor consistente injectieresultaten.- Plaats het capillair in de trekker, draai de klem aan elk uiteinde vast en activeer vervolgens het verwarmingselement.
- Trek aan de haarvaten om twee injectienaalden te maken.
- Verwijder de haarvaten uit de trekker en bewaar ze in een lege petrischaal met een strook boetseerklei die als naaldhouder fungeert.
4. Transposase mRNA-preparaat
- Lineariseer het Tol2Kit-plasmide dat transposase bevat met een NotI-restrictie-endonuclease door het volgende te combineren in een microcentrifugebuis van 0,5 ml: 10 μl transposaseplasmide (150 ng / μl), 1,5 μl restrictie-endonucleasereactiebuffer, 0,3 μl NotI-endonuclease.
- Vul de reactie tot 20 μL met RNase-vrij water en meng en verteer vervolgens een nacht bij 37 °C.
- Stop de transposasevertering door 1 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μL 5 M NH4OAc en 80 μL 100% EtOH toe te voegen aan de verteringsreactie en vervolgens 's nachts te mengen en af te koelen bij −20 °C.
- Centrifugeer de oplossing gedurende 20 minuten bij 4 °C bij 14.000x g en zuig vervolgens het supernatant op en resuspensie de DNA-pellet in RNase-vrij water.
- Bepaal de lineaire plasmideconcentratie in nanogram per microliter (ng/μL) met behulp van een fluorometer door eerst 2 μL van een RNase-vrij water blanco te laten lopen en vervolgens 2 μL van het gelineariseerde plasmide.
OPMERKING: De plasmideconcentraties variëren meestal tussen 100-200 ng / μL - Stel de SP6-mRNA-productie in door de volgende componenten in volgorde te combineren in een microcentrifugebuis van 0,5 ml: 10 μl 2x NTP / CAP, 2 μl 10x reactiebuffer, 0,1-1 μg lineaire DNA-sjabloon en 2 μl SP6-enzymmix.
- Vul de reactie tot 20 μL met RNase-vrij water en meng en incubeer vervolgens bij 37 °C gedurende 2 uur.
- Voeg na 2 uur broeden 1 μL DNase toe, meng goed en incubeer nog eens 15 minuten bij 37 °C.
- Om de SP6-reactie te stoppen, voegt u 30 μL LiCl-precipitatieoplossing toe aan de reactiebuis en mengt en koelt u vervolgens een nacht bij −20 °C.
- Centrifugeer de oplossing op 14.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C om het mRNA te pelleteren, en zuig vervolgens het supernatant op en was de mRNA-pellet met 1 ml 80% EtOH (verdund met RNase-vrij water).
- Centrifugeer de oplossing bij 14.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C om het mRNA te pelleteren en zuig vervolgens het supernatant op. Laat de pellet aan de lucht drogen.
- Resuspensie van de mRNA-pellet in 20 μL RNase-vrij water, bepaal de mRNA-concentratie in nanogram per microliter (ng/μL) met behulp van een fluorometer zoals beschreven in stap 4.5 (moet ten minste 100 ng/μL zijn), aliquot 100 ng mRNA per buis voor eenmalig gebruik, en bewaren bij −80 °C.
OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat het mRNA niet wordt afgebroken, kan 2 μL mRNA snel worden uitgevoerd op een DNA-elektroforesegel om een enkele band bij 1.950 bps te bevestigen.
5. Multisite Gateway klonen om invoervectoren voor transgenese te maken
OPMERKING: Dit protocol is gewijzigd van Kwan et al.10, waarbij de LR-reactie wordt geschreven als een half-LR-reactie en met een totaal volume van 5 μL. Om nieuwe invoerelementen te genereren, moeten BP-reacties met behulp van 5', middelste en 3'-donorvectoren10,13 worden gebruikt.
- Om de reactie uit te voeren, verzamelt u 10 fmol elk van p5E, pME en p3E en 20 fmol van de bestemmingsvector (pDest).
OPMERKING: Multisite LR-recombinatie maakt gebruik van vier verschillende plasmidevectoren: een 5'-ingangsvector (p5E), een middelste ingangsvector (pME), een 3'-invoervector (p3E) en een bestemmingsvector (pDest), om een unieke transgene constructie te genereren geflankeerd door Tol2-herhalingen die klaar zijn om te worden geïnjecteerd in zebravisembryo's.- Identificeer de grootte van alle vier vectoren in basenparen uit de plasmidebron (Tabel 1, Tol2Kit Wiki pagina14 of Addgene11; zie de Tabel met materialen).
OPMERKING: Voor nieuwe vectoren kan volledige plasmide-sequencing via commerciële sequencingbedrijven de exacte plasmidegrootte in bps bieden. - Bepaal de concentratie van alle vier de vectoren in nanogram per microliter (ng/μL) met behulp van een fluorometer, zoals beschreven in stap 4.5.
- Met behulp van het gewicht van DNA als 660 g / mol en de plasmidegrootte (in bps), berekent u de totale nanogram (ng) plasmide die nodig is om 10 fmol (invoervectoren) of 20 fmol (bestemmingsvector) te bereiken.
OPMERKING: Het Mosimann-laboratorium aan de Universiteit van Colorado, Anschutz Medical Campus, heeft een vrij beschikbare spreadsheet gegenereerd om de benodigde hoeveelheid plasmide (in ng) en het volume (in μL) van de vectoren die nodig zijn in de LR-reactie15 te berekenen.
- Identificeer de grootte van alle vier vectoren in basenparen uit de plasmidebron (Tabel 1, Tol2Kit Wiki pagina14 of Addgene11; zie de Tabel met materialen).
- Om de hieronder beschreven constructie, sox17: EGFPCAAX, te genereren, gebruikt u de volgende vectoren: een p5E-vector met de zebravis sox17-promotor , die 6.918 bp is in grootte16; een pME-vector die de geprenyleerde EGFP bevat, die 3,345 bp is in maat10; een p3E-vector met de SV40 late poly A-signaalreeks, die 2.838 bp is in grootte10; en de pDest, die 5.883 bp is in maat10.
- Bereken met behulp van de plasmideconcentratie bepaald in stap 5.1.2 en de hoeveelheid in nanogram (ng) voor elke vector (stap 5.1.3) de totale microliter (μL) van elk plasmide die nodig is om 10 fmol (invoervectoren) of 20 fmol (bestemmingsvector) te bereiken en deel dit vervolgens door twee voor gebruik in de 5 μL half-LR-reacties (alle onderstaande waarden zijn vermeld in tabel 2).
- Om 10 fmol p5E-sox17 te genereren, gebruikt u 45,66 ng (in een concentratie van 140,3 ng / μL) en verdunt u met steriel water met een factor 4 om 0,65 μL te krijgen.
- Om 10 fmol pME-EGFPCAAX te genereren, gebruikt u 22,08 ng (in een concentratie van 213,5 ng / μL) en verdunt u met steriel water met een factor 10 om 0,52 μL te krijgen.
- Om 10 fmol p3E-poly A te genereren, gebruikt u 15,73 ng (in een concentratie van 276,1 ng / μL) en verdunt u met steriel water met een factor 20 om 0,57 μL te krijgen.
- Gebruik voor 20 fmol van de bestemmingsvector 77,66 ng pDest (in een concentratie van 307,3 ng/μL) en verdun met steriel water met een factor 5 om 1,63 μL te krijgen.
- Om een 5 μL half-LR-reactie op te zetten, combineert u de volumes van de p5E, pME, p3E en pDest bepaald in stap 5.3 in een microcentrifugebuis van 0,5 ml en voegt u vervolgens steriel water toe om een totaal reactievolume van 4 μL te bereiken.
- Draai de LR-enzymmix 2x gedurende 1 minuut krachtig om een goede menging te garanderen en voeg vervolgens 1 μL toe aan de reactie en meng grondig.
- Incubeer bij 25 °C gedurende een nacht (16+ uur).
- Stop de LR-reactie door 0,5 μl proteïnase K (2 μg/μl) toe te voegen, gedurende 10 minuten bij 37 °C te incuberen en vervolgens af te koelen tot kamertemperatuur.
- Transformeer 3-4 μL plasmide in ontdooide, chemisch competente cellen door het plasmide toe te voegen en de cellen 25-30 minuten op ijs te laten zitten.
- Terwijl de cellen op ijs zitten, verwarm je twee LB-ampicilline agarplaten tot kamertemperatuur.
- Hitteschok de cellen in een waterbad van 42 °C gedurende precies 30 s.
- Voeg na de hitteschok 250 μL antibioticavrije, rijke vloeibare media toe aan de cellen en incubeer met schudden bij 37 °C gedurende 1,5 uur.
- Verdeel 300 μL bacteriën op één ampicillineplaat en incubeer 's nachts bij 37°C.
- De volgende ochtend screent u de kolonies op de aanwezigheid van twee fenotypen, helder en ondoorzichtig, plukt u de heldere kolonies (zoals beschreven in Kwan et al.10) één voor één, ent u de vloeibare cultuur en schudt u vervolgens 's nachts bij 37 °C.
OPMERKING: Heldere kolonies bevatten bijna altijd de juiste LR-kolonie (>85% van de tijd). - Gebruik een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant, voer een plasmidevoorbereiding uit op elke vloeibare cultuur en verteer diagnostisch elk plasmide om de juiste grootte van het transgene construct te bevestigen, wat aangeeft dat de LR-gatewayreactie goed heeft gewerkt.
- Transformeer de juiste transgene constructen opnieuw met behulp van het standaard bacteriële transformatieprotocol zoals beschreven in stap 5.4-5.12 met 0,5-1 μL van het plasmide en incubeer slechts bij 37 °C gedurende 1 uur.
- Streep de kolonies opnieuw en bevestig dat elk de LR-transgene constructie heeft zoals in stap 5.14.
- Bepaal de plasmideconcentratie zoals beschreven in stap 4.5 (voor de embryo-injectie is ten minste 150 ng/μl nodig).
6. Injectie van het transgen in de embryo's
- Ontdooi een transposase mRNA-monster voor eenmalig gebruik en Tol2-transgene constructie op ijs en voorspoel een agarose-injectieplaat naar kamertemperatuur.
- Combineer het volgende op ijs: 150 ng plasmide, 100 ng transposase-mRNA en 2% fenolrood (0,3 μL). Voeg vervolgens RNA-vrij water toe om het volume aan te vullen tot 3 μL.
- Breng één celstadiumembryo's met behulp van transferpipetten over naar de injectieplaat (beschreven in stap 2) gevuld met EM die de agar volledig bedekt en druk vervolgens voorzichtig ongeveer 50-75 embryo's per sleuf van de injectieplaat.
- Voeg het mRNA/plasmide/fenolrode mengsel toe aan het open uiteinde van een capillaire injectienaald, plaats de capillaire naald in de armatuur van de injectiebank en zet de injectiebank aan.
OPMERKING:De injectiebank gebruikt gecomprimeerd gas, zoals lucht, om het gewenste volume (beschreven in stap 6.5) van het mRNA/plasmide/fenolrood mengsel in het embryo te pulseren wanneer het wordt geactiveerd. - Laat de capillaire naald in de EM van de injectieplaat zakken en breek de punt met een tang om slechts een kleine hoeveelheid mRNA / plasmide / fenolrood mengsel door de injectiebank te laten wegpompen.
- Injecteer de embryo's met een kleine bolus van 3 nL van het mRNA/plasmide/fenolrood mengsel in het cellichaam van het embryo.
OPMERKING: Een bolus van 3 nL is een volume mRNA/plasmide/fenolrood mengsel waarbij zeven bolussen theoretisch gelijkelijk over de middellijn van het embryo passen. - Wanneer u klaar bent met het injecteren van de embryo's, verwijdert u ze van de injectieplaat door ze voorzichtig uit de sleuf te halen en ze over te brengen naar een petrischaal van 100 mm met verse EM (ongeveer 40 ml) en vervolgens te incuberen bij 28,5 ° C om de embryo's te laten ontwikkelen.
7. Screening van embryo's op transgene inbrenging
- Kies voor de expressie van fluorescerende eiwitten het juiste ontwikkelingsstadium waarin het fluorescerende transgen tot expressie moet worden gebracht en screen op de aanwezigheid van fluorescentie onder een fluorescerende ontleedmicroscoop.
OPMERKING: Deze embryo's zullen mozaïek zijn in hun expressie en een genomische insertie van het transgene construct vertonen. - Screen op niet-fluorescerende transgenen door screening op een fluorescerende transgene marker (zoals beschreven in stap 7.1), zoals GFP aangedreven door de hartspecifieke promotor voor het gen cmlc2 of mCherry aangedreven door de lensspecifieke promotor van αcyrstallin, die zich in verschillende bestemmingsvectoren bevinden.
- Laat de embryo's die positief zijn voor transgene inbrenging zich volledig ontwikkelen tot de volwassen zebravisstadia.
- Zodra potentiële transgene vissen de broedleeftijd bereiken, screent u ze individueel op zowel kiembaantransmissie als transgene expressiviteit door ze te fokken tot wildtype zebravissen.
- De volwassenen van wie de embryo's zich normaal ontwikkelen en de sterkste en meest geschikte transgenexpressie geven, worden bewaard als unieke transgene zebravislijnen voor toekomstig werk en analyses.
OPMERKING: Als een alternatieve benadering voor screening op de genomische insertie van transgene constructen, ontwerp PCR-primers die alleen het transgene construct versterken en niet wild-type DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de transgene constructen te genereren, gebruikten we het Tol2-transgenesesysteem. Drie ingangsvectoren, waaronder p5E, dat de genpromotor/enhancer-elementen bevat, pME, dat het gen bevat dat tot expressie moet worden gebracht door de promotor/enhancer-elementen, en p3E, dat minimaal de polyA-staart bevat, werden gebruikt om het transgene construct te genereren via multisite gateway LR-klonen. De bestemmingsvector, pDest, levert de Tol2-herhalingen voor de genomische insertie van het transgene construct in zebravisembryo's en bevat alle essentiële genetische informatie voor bacteriegroei (figuur 1A). Voor dit manuscript hebben we een sox17:EGFPCAAX transgene constructie gemaakt en geïnjecteerd. De promotor van de endodermmarker, sox17, werd gebruikt om membraan-gelabelde EGFP aan te drijven in het zich ontwikkelende endoderm van de zebravis. Voor transgene constructies die niet-fluorofooreiwitten tot expressie brengen, kan een pDest-vector die een fluorescerende transgene marker zoals cmlc2:EGFP bevat, worden gebruikt om te helpen bij genomische insertie (figuur 1A).
Met behulp van de in het bovenstaande protocol beschreven waarden (tabel 2) werd het transgene construct sox17:EGFPCAAX gegenereerd en werd 4 μL van dit construct omgezet in chemisch competente Escherichia coli-cellen . Na een nacht bij 37 °C te hebben geïncubeerd, bevatte de agarplaat ongeveer 250 kolonies (LR-reacties gemiddeld 150-300 kolonies per plaat in ons laboratorium). De screening van deze kolonies werd uitgevoerd op basis van ondoorzichtigheid. In onze handen hadden kolonies die helder waren >85% van de tijd het juiste sox17:EGFPCAAX-product , terwijl de ondoorzichtige kolonies nooit het juiste recombinatieproduct bevatten (figuur 1B, pijlpunt versus pijl). Na het isoleren van het plasmide uit verschillende kolonies, werd de restrictievertering van de recombinante producten uitgevoerd met het restrictie-enzym NcoI. Twee verschillende heldere kolonies en een ondoorzichtige kolonie werden verteerd. Beide heldere kolonies hadden een enkele band met de juiste grootte van 9.544 bp (onverteerde plasmiden geladen als verteringscontrole), terwijl de ondoorzichtige kolonie helemaal geen banden had (figuur 2A). Deze positieve sox17:EGFPCAAX-constructies werden opnieuw getransformeerd, de volgende kolonies werden opnieuw gestreept, die kolonies bleken plasmide te hebben en -80 °C bacteriële diepvriesvoorraden werden gegenereerd. De concentraties van zowel het sox17:EGFPCAAX-plasmide als het afgedekt-transposase-mRNA werden bepaald, zodat ze beide voor injectie konden worden gebruikt (figuur 2B).
De embryo's werden voorbereid voor injectie door embryo's in één celstadium in een voorverwarmde embryo-spuitgietmatrijs te plaatsen (figuur 3A-C). Eenmaal in de spuitgietmatrijs geplaatst, werd de injectienaald met het sox17:EGFPCAAX-mRNA in een micropipethouder op de micromanipulator geplaatst (figuur 3D,E). De embryo's werden geïnjecteerd met 100 ng transposase mRNA, 150 ng sox17:EGFPCAAX plasmide en fenolrood (injectie tracking kleurstof). Een bolus van 3 nL (bepaald door de grootte zoals beschreven in het protocol, stap 6.6) werd geïnjecteerd in het cellichaam en niet in de dooier van het embryo voor de beste kans op integratie (figuur 3F)10.
Na injectie werden de embryo's uit de spuitgietmatrijs verwijderd en gedurende 24 uur laten ontwikkelen. 24 uur na de bevruchting (hpf) werden de embryo's gescreend op de endodermexpressie van EGFPCAAX. Mozaïek endoderm EGFPCAAX expressie werd waargenomen in ~75% van de geïnjecteerde embryo's (Figuur 4A,A'). Om de embryo's te screenen die zijn geïnjecteerd met niet-fluorescerende transgenen zoals Gal4 of CreERT2, kan een bestemmingsvector worden gebruikt die ook een transgene marker bevat (d.w.z. cmlc2:EGFP) (figuur 1A) (figuur 4B,B'). Volwassen zebravissen met kiembaantransgenese van sox17:EGFPCAAX genereerden fluorescerende embryo's met het endoderm volledig gelabeld met EGFPCAAX (figuur 4C).
Met behulp van de nieuw gecreëerde sox17:EGFPCAAX transgene lijn konden we de impact van ethanol op de vorming van de endodermale zakjes direct beoordelen. De zakjes zijn uitsteeksels die zich vormen op de laterale rand van het endoderm en zijn belangrijk voor de vorming van het gezichtsskelet en meerdere orgaansystemen17. We hebben eerder aangetoond dat het blokkeren van botmorfogenetisch eiwit (Bmp) signalering resulteert in hypoplasie van de zakjes18. We laten nu zien dat de ethanolbehandeling van Bmp-mutanten van 10-18 hpf een subtiele maar significante invloed heeft op de grootte van de buidel. De dorsaal-ventrale lengte van elk zakje uit zakjes 1-5 (zebravissen hebben zes zakjes, maar de zesde moest zich nog volledig vormen in het afgebeelde ontwikkelingsstadium) werd gemeten in controle- en ethanolbehandelde wildtype Bmp-mutante embryo's (figuur 5A). Als controle voor algemene groei-effecten als gevolg van blootstelling aan ethanol werd de voorste-posterieure lengte van het gehele endoderm gemeten (figuur 5A). De totale lengte van het endoderm werd niet beïnvloed door genotype of behandeling (figuur 5B). Zakjes 1 en 3 vertoonden echter een significante toename van de buidellengte tussen de onbehandelde en met ethanol behandelde wildtype-embryo's, maar een significante afname in lengte tussen de onbehandelde en met ethanol behandelde Bmp-mutanten (figuur 5C; tweeweg ANOVA; buidel 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; zakje 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). Pouch 2 vertoonde een significante toename van de buidelgrootte tussen respectievelijk de onbehandelde en met ethanol behandelde wildtype- en Bmp-mutantengroepen (figuur 5C; tweeweg ANOVA; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001).
Figuur 1: LR-gatewayreactie voor transgenconstructie . (A) Schema van de modulaire vierdelige LR-gateway-kloonreactie. LR Clonase recombineert de drie ingangsvectoren, p5E, pME en p3E, en de bestemmingsvector, pDest, in een zeer specifieke reactie om een nieuw transgeen product te genereren dat klaar is voor embryo-injectie. Voor het screenen van niet-fluorescerende transgenen kunnen pDest-vectoren optionele transgene markers bevatten (cmlc2:EGFP, als voorbeeld). (B) Voorbeeld van bacteriekolonies verkregen door de transformatie van de LR-recombinatieproducten. Heldere kolonies bevatten >85% van de tijd een correct LR-recombinatieproduct (pijlpunt), terwijl ondoorzichtige kolonies nooit een correct recombinatieproduct (pijl) bevatten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Analyse van het plasmide-DNA en transposase-mRNA . (A) Diagnostische vertering van de drie kolonies door de transformatie van de LR-recombinatieproducten. De enkele ondoorzichtige kolonie bevatte geen plasmide om te screenen, terwijl de twee heldere kolonies een enkele band bevatten op 9.544 bp (ongesneden versus gesneden). (B) Transposase mRNA bij 1.950 bp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Zebravis embryo-injectieopstelling. (A) Een spuitgietmatrijs wordt geplaatst in vloeibare agarose verdund in EM (3% v/v). (B) Eenmaal gestold, wordt de mal van de agaroseplaat verwijderd. (C) De embryo's worden gerangschikt in de spuitgietmatrijzen. (D,E) Het mRNA/plasmide/fenolrood mengsel wordt gepipetteerd in de injectienaald, die in de micropipethouder in de micromanipulator wordt geplaatst. F) Een bolus van 3 nL wordt in het cellichaam van het embryo geïnjecteerd in het stadium van één cel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Screening zebravissen geïnjecteerd met het transgene construct. (A,A') Confocale afbeelding van een embryo afgebeeld op 24 hpf toont de mozaïekexpressie van het sox17:EGFPCAAX-transgen. (B,B') Transgene markerexpressie van cmlc2:EGFP in het ontwikkelende hart bij 24 hpf. Zijaanzichten van de embryo's, met voorste aan de linkerkant en dorsale aan de bovenkant. (C) Confocale afbeelding van een embryo dat is gegenereerd uit een transgen-dragende volwassen zebravis. Het hele endoderm brengt EGFPCAAX tot expressie. Lateraal zicht op het embryo, met voorste naar links en ventrale naar boven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Pouch-metingen in met ethanol behandelde wild-type en Bmp-mutante embryo's. (A) Schema met de meting van de totale lengte van het endoderm en de lengte van de zakjes. B) De metingen van de totale lengte van het voorste en achterste endoderm laten geen verschil zien tussen onbehandelde en met ethanol behandelde wilde embryo's en Bmp-mutantenembryo's. (C) Uit de metingen van de lengte van de dorsale ventrale buidel blijkt dat de zakjes 1 en 3 tussen de onbehandelde en met ethanol behandelde wildtype-embryo's in buidellengte toenemen, maar tussen de onbehandelde en met ethanol behandelde Bmp-mutanten in lengte afnemen (tweeweg ANOVA; buidel 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; zakje 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). Pouch 2 vertoont een toename in lengte tussen de onbehandelde en met ethanol behandelde wild-type en Bmp mutantengroepen (tweeweg ANOVA; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001). Er werden geen verschillen waargenomen in buidellengte tussen zakjes 4 en 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Tol2Kit componenten ondergebracht in het Lovely Lab. Elke invoer- en bestemmingsvector die beschikbaar is in het Lovely Lab, hun beschrijvingen en hun lab van herkomst. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Berekening van de hoeveelheid en afstemming van elke vector in de LR-recombinatiereactie. De hoeveelheid van elke vector werd berekend op basis van de grootte (in bp) en de fmol die nodig was voor elke component: 10 fmol van elke invoervector en 20 fmol van de bestemmingsvector. Vanaf de plasmideconcentratie wordt elke vector verdund in steriel water om 1 μL of minder aan de LR-reactie toe te voegen. Steriel water wordt toegevoegd aan de vectorpool tot 4 μL, 1 μL LR-reactiemengsel wordt toegevoegd aan de reactie en het wordt 's nachts geïncubeerd bij 25 °C. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebravissen zijn bij uitstek geschikt voor het bestuderen van de impact van blootstelling aan ethanol op ontwikkeling en ziektetoestanden 7,8. Zebravissen produceren grote aantallen doorschijnende, extern bevruchte, genetisch verhandelbare embryo's, waardoor verschillende transgen-gelabelde weefsels en celtypen tegelijkertijd in meerdere omgevingscontexten live kunnen worden afgebeeld19,20. Deze sterke punten, gecombineerd met het sterke genetische ontwikkelingsbehoud bij mensen, maken zebravissen tot een krachtig modelsysteem voor het in beeld brengen van de impact van ethanol 7,8. Hier beschreven we het protocol voor een modulaire benadering van het genereren en injecteren van transgene constructies en het opzetten van transgene zebravislijnen voor toekomstige ethanolstudies.
Er zijn veel verschillende benaderingen vastgesteld om transgene zebravissen te genereren. Het genereren van zowel transgene constructies als transgene lijnen kan echter ontmoedigend zijn. Hoewel traditionele sub-kloontechnieken, BAC-klonen of PCR-gebaseerde benaderingen zoals Gibson-assemblage het genereren van transgene constructies mogelijk maken, hebben ze een lage doorvoer en missen ze veelzijdigheid in hun constructie10. Bovendien moeten deze strategieën opnieuw worden ontworpen voor elke transgene constructie die wordt gecreëerd. Subklonen vereist meerdere verteringen en ligaties, ervan uitgaande dat alle benodigde beperkingsplaatsen aanwezig en uniek zijn. BAC-klonen vereist het sequentiëren en testen van meerdere BAC-klonen. Voor Gibson-assemblage moeten nieuwe PCR-primers worden ontworpen voor elke transgene constructie. Bovendien leidt de injectie van ongesneden of gelineariseerd DNA tot een lage kiembaantransmissie21,22,23.
De Tol2Kit is een modulair systeem dat gateway-klonen gebruikt om complete transgene constructies te genereren, geflankeerd door Tol2-herhalingen die, in combinatie met transposase-mRNA, de transgenese en kiembaantransmissie aanzienlijk verhogen 10,11,24,25. Tientallen invoer- en bestemmingsvectoren zijn beschikbaar bij het Kwan-lab en het Cole Lab10,11. Daarnaast hebben zebravislaboratoria die de Tol2Kit gebruiken veel meer invoer- en bestemmingsvectoren gegenereerd en gecureerd. Als voorbeeld van de breedte van de beschikbare vectoren hebben we meer dan 70 vectoren samengevoegd en gebruikt (tabel 1). Met al deze gemeenschapsbronnen kan men snel duizenden verschillende transgene constructies genereren door simpelweg de vectoren van keuze te combineren in een LR-reactie.
Optimale LR-reacties vereisen exacte berekeningen van plasmidegrootte en -concentratie. De berekeningen voor elke vector worden uitgevoerd in femtomole (fmol) waarden, dus elke reactie vereist geen hoog plasmidevolume om een transgene constructie te genereren. Deze kleine hoeveelheid plasmide maakt verdunningen en goed pipetteren echter buitengewoon kritisch voor het succes van de reactie10. Bijkomende factoren die de LR-reactie kunnen beïnvloeden, zijn de grootte van de inserts in de verschillende invoervectoren. Het p5E-sox17-element dat in deze studie wordt gebruikt, is bijvoorbeeld meer dan 4 kb, wat, in combinatie met even grote pME- en p3E-elementen, zal resulteren in een zeer grote transgene vector. Een groot plasmide in bacteriën kan moeilijk te kweken zijn, waardoor het aantal kolonies dat wordt gegenereerd door de bacteriële transformatie afneemt. Dit zal ook resulteren in een langzamere groei en verlaagde plasmidespiegels wanneer geïsoleerd10. Belangrijk is dat het hebben van zeer competente bacteriële cellen, evenals het verhogen van de incubatie van de bacteriële cellen tijdens de transformatie van het recombinatieplasmide, de sleutel zijn tot het genereren van voldoende kolonies om de juiste transgenvorming vast te leggen. Daarnaast speelt het gebruik van het juiste LR-reactie-enzym (opgenomen in de Materiaaltabel) ook een grote rol in het succes van de LR-reactie.
Naast het genereren van een transgene constructie en bacteriële transformaties, kan de embryo-injectie en genoomintegratie ook moeilijk zijn. De generatie van hoogwaardig transposase-mRNA verhoogt de frequentie van genomische integratie aanzienlijk10. De getrokken haarvaten moeten kort voor het injecteren van de embryo's worden gemaakt, omdat oudere naalden capillaire werking kunnen verliezen (d.w.z. dat de injectievloeistof niet naar de punt van de naald beweegt) (figuur 3E). Zowel het breken van de punt van de naald om slechts ~ 3 ml vloeistof te injecteren als het injecteren van het cellichaam vereisen oefening. Ons trainingsprotocol omvat het injecteren van het cellichaam met alleen fenolrode injectiekleurstof totdat de naald wordt gebroken en de embryo's worden geïnjecteerd. Het injecteren van het cellichaam verhoogt de snelheid van genoomintegratie drastisch10. Als we dit alles combineren, hebben we gemiddeld 75% of meer genoominbrenging en mozaïekexpressie, maar dit kan van construct tot construct verschillen.
Omdat genomische insertie willekeurig kan zijn, is elk embryo dat mozaïekexpressie vertoont een unieke transgene insertie en vereist voortdurende screening. Deze voortdurende screening is nodig om aan te tonen dat de integratieplaats niet schadelijk is voor de ontwikkeling van het embryo, dat kiembaanoverdracht plaatsvindt en dat de expressie van het transgen niet wordt verzwakt of mogelijk tot zwijgen wordt gebracht. Zodra een transgene lijn is vastgesteld, kan deze gemakkelijk worden gebruikt voor meerdere analyses in ethanolstudies. Voor die niet-fluorescerende transgene constructen omvatten veelgebruikte transgene markers cmlc2: GFP en αcrystallin: RFP, die respectievelijk het hart en het netvlies labelen en voortdurende transgene screening mogelijk maken. Naast transgene markers voor screening kunnen deze twee transgenen worden gebruikt om de impact van ethanol op de ontwikkeling van hart en netvlies direct te bestuderen.
Met behulp van het hierboven beschreven protocol genereerden we een sox17: EGFPCAAX transgene zebravislijn met stabiele kiembaantransmissie van een endoderm-specifiek membraan-gelabeld EGFP-construct. Met behulp van deze lijn konden we de impact van ethanol op de vorming van endodermale buidels in ethanolgevoelige Bmp-mutante embryo's meten. We toonden aan dat de maten van zakjes 1-3, maar niet van zakjes 4 en 5, noch de totale endodermlengte werden beïnvloed in met ethanol behandelde Bmp-mutanten (fig. 5). Dit pilotwerk suggereert dat de Bmp-ethanolinteractie de endodermvorming verstoort, met name het celgedrag dat ten grondslag ligt aan de vorming van zakjes. Dit werk illustreert het nut van het genereren van transgene zebravislijnen voor ethanolstudies. Als gevolg hiervan zal het creëren van nieuwe transgene lijnen ons begrip van ethanolgevoelige cellulaire processen en weefselgebeurtenissen in FASD aanzienlijk vergroten.
Uiteindelijk hebben transgene zebravissen, en zebravissen in het algemeen, bewezen ongelooflijk krachtig te zijn in de studie van FASD 7,8. De Tol2Kit is een uiterst veelzijdige toolkit waarmee onderzoekers snel meerdere transgene constructies kunnen genereren die klaar zijn om in zebravissen te injecteren. Het modulaire ontwerp en het gemak van het genereren van nieuwe invoervectoren resulteren in extreme flexibiliteit bij het genereren van transgene constructies zonder componenten opnieuw te hoeven ontwerpen. Over het algemeen zal deze toolkit zowel het onderzoek naar zebravissen als het onderzoek in het algemeen gericht op het verbeteren van het begrip van FASD aanzienlijk verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het onderzoek dat in dit artikel wordt gepresenteerd, werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health / National Institute on Alcohol Abuse (NIH / NIAAA) R00AA023560 aan C.B.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawson Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
- Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
- Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
- Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
- Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Lovely, C. B.
- Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).
- Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017).
- The Tol2Kit. , Available from: http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page (2007).
- Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
- Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
- Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
- Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
- Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).
