Summary
Este trabajo describe un protocolo para el sistema modular de transgénesis Tol2, un método de clonación basado en pasarela para crear e inyectar construcciones transgénicas en embriones de pez cebra.
Abstract
Los trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF) se caracterizan por un conjunto altamente variable de defectos estructurales y deficiencias cognitivas que surgen debido a la exposición prenatal al etanol. Debido a la compleja patología del TEAF, los modelos animales han demostrado ser críticos para nuestra comprensión actual de los defectos de desarrollo inducidos por el etanol. El pez cebra ha demostrado ser un modelo poderoso para examinar los defectos de desarrollo inducidos por el etanol debido al alto grado de conservación tanto de la genética como del desarrollo entre el pez cebra y los humanos. Como sistema modelo, el pez cebra posee muchos atributos que los hacen ideales para estudios de desarrollo, incluyendo un gran número de embriones fertilizados externamente que son genéticamente tratables y translúcidos. Esto permite a los investigadores controlar con precisión el momento y la dosis de exposición al etanol en múltiples contextos genéticos. Una herramienta genética importante disponible en el pez cebra es la transgénesis. Sin embargo, generar construcciones transgénicas y establecer líneas transgénicas puede ser complejo y difícil. Para abordar este problema, los investigadores del pez cebra han establecido el sistema de transgénesis Tol2 basado en transposones. Este sistema modular utiliza un enfoque de clonación de puerta de enlace multisitio para el ensamblaje rápido de construcciones transgénicas completas basadas en transposones Tol2. Aquí, describimos la caja de herramientas flexible del sistema Tol2 y un protocolo para generar construcciones transgénicas listas para la transgénesis del pez cebra y su uso en estudios de etanol.
Introduction
La exposición prenatal al etanol da lugar a un continuo de déficits estructurales y deficiencias cognitivas denominadas trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF)1,2,3,4. Las complejas relaciones entre múltiples factores hacen que estudiar y comprender la etiología del TEAF en humanos sea un desafío. Para resolver este desafío, se ha utilizado una amplia variedad de modelos animales. Las herramientas biológicas y experimentales disponibles en estos modelos han demostrado ser cruciales para desarrollar nuestra comprensión de las bases mecanicistas de la teratogenicidad del etanol, y los resultados de estos sistemas modelo han sido notablemente consistentes con lo que se encuentra en los estudios de etanol humano 5,6. Entre estos, el pez cebra se ha convertido en un poderoso modelo para estudiar la teratogénesis del etanol7,8, en parte debido a su fertilización externa, alta fecundidad, trazabilidad genética y embriones translúcidos. Estas fortalezas se combinan para hacer que el pez cebra sea ideal para estudios de imágenes en vivo en tiempo real de TEAF utilizando líneas transgénicas de pez cebra.
El pez cebra transgénico se ha utilizado ampliamente para estudiar múltiples aspectos del desarrollo embrionario9. Sin embargo, la creación de construcciones transgénicas y líneas transgénicas posteriores puede ser extremadamente difícil. Un transgén estándar requiere un elemento promotor activo para impulsar el transgén y una señal poli A o "cola", todo en un vector bacteriano estable para el mantenimiento general del vector. La generación tradicional de una construcción transgénica multicomponente requiere múltiples pasos de subclonación que consumen mucho tiempo10. Los enfoques basados en PCR, como el ensamblaje de Gibson, pueden eludir algunos de los problemas asociados con la subclonación. Sin embargo, los cebadores únicos deben ser diseñados y probados para la generación de cada construcción transgénica única10. Más allá de la construcción de transgenes, la integración genómica, la transmisión de la línea germinal y la detección de la integración adecuada de transgenes también han sido difíciles. Aquí, describimos un protocolo para usar el sistema de transgénesis Tol2 basado en transposones (Tol2Kit)10,11. Este sistema modular utiliza la clonación de pasarela multisitio para generar rápidamente múltiples construcciones transgénicas a partir de una biblioteca en constante expansión de vectores de "entrada" y "destino". Los elementos transponibles Tol2 integrados aumentan en gran medida la tasa de transgénesis, lo que permite la rápida construcción e integración genómica de múltiples transgenes. Usando este sistema, mostramos cómo la generación de una línea de pez cebra transgénico endodermo se puede utilizar para estudiar los defectos estructurales específicos del tejido subyacentes al TEAF. En última instancia, en este protocolo, mostramos que la configuración modular y la construcción de construcciones transgénicas ayudarán enormemente a la investigación del TEAF basada en el pez cebra.
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Protocol
Todos los embriones de pez cebra utilizados en este procedimiento fueron criados y criados siguiendo los protocolos IACUC establecidos12. Estos protocolos fueron aprobados por la Universidad de Louisville.
NOTA: En este estudio se utilizaron la cepa de pez cebra de tipo salvaje, AB, y la línea mutante doble bmp4st72;smad5b1100 . Toda el agua utilizada en este procedimiento era agua estéril de ósmosis inversa. Las imágenes confocales se tomaron bajo un microscopio confocal de escaneo láser. Las mediciones del endodermo se realizaron utilizando la herramienta de medición en ImageJ. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando software estadístico.
1. Hacer las soluciones y los medios
- Medios bacterianos: Disuelva el caldo LB o el agar según las instrucciones del fabricante y el autoclave. Antes de verter el medio en placas de Petri de 100 mm, agregue ampicilina (50 μg/ml), kanamicina (50 μg/ml) o una combinación de ampicilina/cloranfenicol (50 μg/ml y 30 μg/ml, respectivamente).
- Para hacer 20 veces el stock de medios embrionarios, disuelva lo siguiente en 1 L de agua: 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl, 2,9 g de CaCl 2, 0,41 g de K 2 HPO 4, 0,142 g de Na2 HPO 4 y 4,9 g de MgSO4·7H2 O. Esterilizar por filtro la solución madre utilizandoun sistema de filtración al vacío de 0,22 μm, y conservar a 4 °C.
NOTA: Ignore el precipitado blanco que se forma; Esto no afectará a los medios de comunicación. - En 19 L de agua, disolver 1,2 g de NaHCO3 y añadir 1 L del material de medios embrionarios 20x para generar la solución de medios embrionarios de trabajo, y mantener esta solución a 28 °C.
- Para una solución de rojo de fenol al 2%, disuelva 20 mg de sal de sodio rojo fenol en 1 ml de agua libre de RNasa y guárdela a temperatura ambiente.
2. Moldes de inyección de embriones
- Para hacer la placa de inyección de agarosa, disuelva la agarosa en el medio embrionario a una concentración final del 3% calentando hasta hervir.
- Vierta 50 ml de agarosa en placas de Petri de 100 mm, y mientras la agarosa aún esté líquida, coloque suavemente el molde de inyección en la agarosa para evitar la formación de burbujas debajo del molde.
- Deja que los platos de agarosa se enfríen. Una vez que la agarosa esté sólida, retire el molde de inyección y guárdelo a 4 °C hasta que esté listo para usar.
3. Pipetas de inyección
- Tire de los capilares de 1,0 mm (OD) que contienen un filamento en agujas utilizando un extractor de pipeta vertical con el solenoide ajustado a 2,5 y el elemento calefactor ajustado a 14,6.
NOTA: Cualquier extractor calentado funcionará si tira de los capilares en dos agujas de manera limpia y uniforme, pero las agujas de inyección deben extraerse dentro de 1 semana de inyectar los embriones de pez cebra para obtener resultados de inyección consistentes.- Coloque el capilar en el extractor, apriete la abrazadera en cada extremo y luego active el elemento calefactor.
- Tire de los capilares para crear dos agujas de inyección.
- Retire los capilares del extractor y guárdelos en una placa de Petri vacía con una tira de arcilla para modelar que actúa como soporte de agujas.
4. Preparación del ARNm de la transposasa
- Linealizar el plásmido Tol2Kit que contiene transposasa con una endonucleasa de restricción NotI combinando lo siguiente en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml: 10 μL de plásmido transposasa (150 ng/μL), 1,5 μL de tampón de reacción de endonucleasa de restricción, 0,3 μL de endonucleasa NotI.
- Llene la reacción hasta 20 μL con agua libre de RNasa, y luego mezcle y digiera a 37 °C durante la noche.
- Detenga la digestión de la transposasa agregando 1 μL de 0.5 M EDTA (pH 8.0), 2 μL de 5 M NH4OAc y 80 μL de 100% EtOH a la reacción de digestión, y luego mezcle y enfríe a -20 °C durante la noche.
- Centrifugar la solución a 14.000x g durante 20 min a 4 °C, y luego aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet de ADN en agua libre de RNasa.
- Determine la concentración lineal de plásmidos en nanogramos por microlitro (ng/μL) usando un fluorómetro haciendo correr primero 2 μL de un espacio en blanco de agua libre de RNasa y luego corriendo 2 μL del plásmido linealizado.
NOTA: Las concentraciones de plásmidos suelen oscilar entre 100-200 ng/μL - Configure la producción de ARNm SP6 combinando los siguientes componentes en orden en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml: 10 μL de 2x NTP/CAP, 2 μL de tampón de reacción 10x, 0,1-1 μg de plantilla de ADN lineal y 2 μL de mezcla de enzimas SP6.
- Llenar la reacción hasta 20 μL con agua libre de RNasa, y luego mezclar e incubar a 37 °C durante 2 h.
- Después de incubar durante 2 h, añadir 1 μL de DNasa, mezclar bien e incubar durante 15 min adicionales a 37 °C.
- Para detener la reacción SP6, agregue 30 μL de solución de precipitación de LiCl al tubo de reacción, y luego mezcle y enfríe a -20 ° C durante la noche.
- Centrifugar la solución a 14.000 x g durante 20 min a 4 °C para granular el ARNm, y luego aspirar el sobrenadante y lavar el pellet de ARNm con 1 ml de EtOH al 80% (diluido con agua libre de RNasa).
- Centrifugar la solución a 14.000 x g durante 20 min a 4 °C para granular el ARNm, y luego aspirar el sobrenadante. Deje que el pellet se seque al aire.
- Resuspender el pellet de ARNm en 20 μL de agua libre de RNasa, determinar la concentración de ARNm en nanogramos por microlitro (ng/μL) utilizando un fluorómetro como se describe en el paso 4.5 (debe ser de al menos 100 ng/μL), alícuota 100 ng de ARNm por tubo para un solo uso, y almacenar a -80 °C.
NOTA: Para asegurarse de que el ARNm no se degrada, se pueden ejecutar rápidamente 2 μL de ARNm en un gel de electroforesis de ADN para confirmar una sola banda a 1.950 pb.
5. Clonación de Multisite Gateway para crear vectores de entrada para la transgénesis
NOTA: Este protocolo se modifica de Kwan et al.10, con la reacción LR escrita como una reacción half-LR y con un volumen total de 5 μL. Para generar nuevos elementos de entrada, las reacciones de PA que utilizan vectores donantes de 5', medio y 3' deben usarse10,13.
- Para realizar la reacción, reúna 10 fmol cada uno de p5E, pMe y p3E y 20 fmol del vector de destino (pDest).
NOTA: La recombinación LR multisitio utiliza cuatro vectores plásmidos diferentes: un vector de entrada 5' (p5E), un vector de entrada medio (pME), un vector de entrada 3' (p3E) y un vector de destino (pDest), para generar una construcción transgénica única flanqueada por repeticiones de Tol2 listas para ser inyectadas en embriones de pez cebra.- Identifique el tamaño de los cuatro vectores en pares de bases de la fuente de plásmidos (Tabla 1, Tol2Kit Wiki página14 o Addgene11; ver la Tabla de materiales).
NOTA: Para los vectores nuevos, la secuenciación completa del plásmido a través de compañías de secuenciación comercial puede proporcionar el tamaño exacto del plásmido en bps. - Determinar la concentración de los cuatro vectores en nanogramos por microlitro (ng/μL) utilizando un fluorómetro, como se describe en el paso 4.5.
- Usando el peso del ADN como 660 g/mol y el tamaño del plásmido (en bps), calcule el total de nanogramos (ng) de plásmido necesarios para alcanzar 10 fmol (vectores de entrada) o 20 fmol (vector de destino).
NOTA: El laboratorio Mosimann de la Universidad de Colorado, Anschutz Medical Campus, ha generado una hoja de cálculo disponible gratuitamente para calcular la cantidad de plásmido necesario (en ng) y el volumen (en μL) de los vectores necesarios en la reacción LR15.
- Identifique el tamaño de los cuatro vectores en pares de bases de la fuente de plásmidos (Tabla 1, Tol2Kit Wiki página14 o Addgene11; ver la Tabla de materiales).
- Para generar la construcción descrita a continuación, sox17: EGFPCAAX, utilice los siguientes vectores: un vector p5E que contiene el promotor sox17 del pez cebra, que es 6.918 pb en tamaño16; un vector pME que contiene el EGFP prenilado, que es de 3.345 pb en tamaño10; un vector p3E que contiene la secuencia de señal poli A tardía SV40, que es de 2.838 pb de tamaño10; y el pDest, que es de 5.883 pb en tamaño10.
- Utilizando la concentración de plásmidos determinada en el paso 5.1.2 y la cantidad en nanogramos (ng) para cada vector (paso 5.1.3), calcule el total de microlitros (μL) de cada plásmido necesario para alcanzar 10 fmol (vectores de entrada) o 20 fmol (vector de destino), y luego divida esto por dos para usarlo en las reacciones de 5 μL half-LR (todos los valores enumerados a continuación se enumeran en la Tabla 2).
- Para generar 10 fmol de p5E-sox17, use 45.66 ng (a una concentración de 140.3 ng / μL) y diluya con agua estéril por un factor de 4 para obtener 0.65 μL.
- Para generar 10 fmol de pME-EGFPCAAX, use 22.08 ng (a una concentración de 213.5 ng / μL) y diluya con agua estéril por un factor de 10 para obtener 0.52 μL.
- Para generar 10 fmol de p3E-poli A, use 15.73 ng (a una concentración de 276.1 ng / μL) y diluya con agua estéril por un factor de 20 para obtener 0.57 μL.
- Para 20 fmol del vector de destino, use 77.66 ng de pDest (a una concentración de 307.3 ng / μL) y diluya con agua estéril por un factor de 5 para obtener 1.63 μL.
- Para configurar una reacción semiLR de 5 μL, combine los volúmenes de p5E, pME, p3E y pDest determinados en el paso 5.3 en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml y luego agregue agua estéril para alcanzar un volumen de reacción total de 4 μL.
- Vortex vigorosamente la mezcla de enzimas LR 2x durante 1 min cada una para asegurar una mezcla adecuada, y luego agregue 1 μL a la reacción y mezcle bien.
- Incubar a 25 °C durante la noche (16+ h).
- Detenga la reacción LR añadiendo 0,5 μL de proteinasa K (2 μg/μL), incubar a 37 °C durante 10 min y luego enfriar a temperatura ambiente.
- Transformar 3-4 μL de plásmido en células descongeladas y químicamente competentes añadiendo el plásmido y dejando que las células reposen sobre hielo durante 25-30 min.
- Mientras las células se asientan sobre hielo, caliente dos placas de agar LB-ampicilina a temperatura ambiente.
- Golpee térmicamente las células en un baño de agua a 42 ° C durante exactamente 30 s.
- Después del choque térmico, añadir 250 μL de medios líquidos ricos y libres de antibióticos a las células, e incubar con agitación a 37 °C durante 1,5 h.
- Extienda 300 μL de bacterias en una placa de ampicilina e incube a 37 ° C durante la noche.
- A la mañana siguiente, examinar las colonias para detectar la presencia de dos fenotipos, claro y opaco, recoger las colonias claras (como se describe en Kwan et al.10) una a la vez, inocular el cultivo líquido y luego agitar a 37 °C durante la noche.
NOTA: Las colonias claras casi siempre contienen la colonia LR correcta (>85% del tiempo). - Usando un kit comercial según las instrucciones del fabricante, realice una preparación de plásmido en cada cultivo líquido y digiera diagnósticamente cada plásmido para confirmar el tamaño apropiado de la construcción transgénica, lo que indica que la reacción de la puerta de enlace LR ha funcionado correctamente.
- Vuelva a transformar las construcciones transgénicas correctas utilizando el protocolo estándar de transformación bacteriana como se describe en los pasos 5.4-5.12 utilizando 0.5-1 μL del plásmido, y solo incubar a 37 °C durante 1 h.
- Vuelva a rayar las colonias y confirme que cada una tiene la construcción transgénica LR como en el paso 5.14.
- Determinar la concentración de plásmidos como se describe en el paso 4.5 (se necesitan al menos 150 ng/μL para la inyección del embrión).
6. Inyección del transgén en los embriones
- Descongele una muestra de ARNm transposasa de un solo uso y una construcción transgénica de Tol2 en hielo y advierta previamente una placa de inyección de agarosa a temperatura ambiente.
- Combine lo siguiente en hielo: 150 ng de plásmido, 100 ng de ARNm de transposasa y 2% de rojo de fenol (0,3 μL). Luego, agregue agua sin ARN para compensar el volumen a 3 μL.
- Transfiera embriones en estadio celular utilizando pipetas de transferencia a la placa de inyección (descrita en el paso 2) llena de EM que cubre completamente el agar, y luego presione suavemente aproximadamente 50-75 embriones por ranura de la placa de inyección.
- Agregue la mezcla de ARNm/plásmido/rojo fenol al extremo abierto de una aguja de inyección capilar, coloque la aguja capilar en la armadura del equipo de inyección y encienda el equipo de inyección.
NOTA:La plataforma de inyección utiliza gas comprimido, como aire, para pulsar el volumen deseado (descrito en el paso 6.5) de la mezcla de ARNm/plásmido/rojo fenol en el embrión cuando se activa. - Baje la aguja capilar en la EM de la placa de inyección y rompa la punta con pinzas para permitir que la plataforma de inyección bombee solo una pequeña cantidad de mRNA/plásmido/mezcla de rojo fenol.
- Inyecte los embriones con un pequeño bolo de 3 nL de la mezcla de ARNm/plásmido/rojo fenol en el cuerpo celular del embrión.
NOTA: Un bolo de 3 nL es un volumen de mezcla de ARNm/plásmido/rojo fenol en el que siete bolos pueden teóricamente encajar por igual a través de la línea media del embrión. - Cuando termine de inyectar los embriones, retírelos de la placa de inyección sacándolos suavemente de la ranura y transfiriéndolos pipeteándolos a una placa de Petri de 100 mm con EM fresca (aproximadamente 40 ml), y luego incubar a 28.5 ° C para permitir que los embriones se desarrollen.
7. Cribado de embriones para inserción transgénica
- Para la expresión de proteínas fluorescentes, elija la etapa de desarrollo apropiada cuando se debe expresar el transgén fluorescente y detecte la presencia de fluorescencia bajo un microscopio de disección fluorescente.
NOTA: Estos embriones serán mosaicos en su expresión y mostrarán una inserción genómica del constructo transgénico. - Detectar transgenes no fluorescentes mediante la detección de un marcador transgénico fluorescente (como se describe en el paso 7.1), como GFP impulsado por el promotor específico del corazón para el gen cmlc2 o mCherry impulsado por el promotor específico del cristalino de αcyrstallin, que están contenidos en distintos vectores de destino.
- Permitir que los embriones positivos para la inserción transgénica se desarrollen completamente a las etapas adultas de pez cebra.
- Una vez que los peces transgénicos potenciales alcancen la edad reproductiva, selecciónelos individualmente para detectar tanto la transmisión de la línea germinal como la expresividad transgénica criándolos en peces cebra de tipo salvaje.
- Aquellos adultos cuyos embriones se desarrollan normalmente y dan la expresión transgénica más fuerte y apropiada se mantienen como líneas únicas de pez cebra transgénico para futuros trabajos y análisis.
NOTA: Como enfoque alternativo a la detección de la inserción genómica de construcciones transgénicas, diseñe cebadores de PCR que solo amplifiquen la construcción transgénica y no el ADN de tipo salvaje.
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Representative Results
Para generar las construcciones transgénicas, utilizamos el sistema de transgénesis Tol2. Se utilizaron tres vectores de entrada, incluido p5E, que contiene los elementos promotores / potenciadores de genes, pME, que sostiene que el gen se expresa por los elementos promotores / potenciadores, y p3E que, como mínimo, contiene la cola de poliA, para generar la construcción transgénica a través de la clonación LR de puerta de enlace multisitio. El vector de destino, pDest, proporciona las repeticiones Tol2 para la inserción genómica de la construcción transgénica en embriones de pez cebra y contiene toda la información genética esencial para el crecimiento bacteriano (Figura 1A). Para los propósitos de este manuscrito, creamos e inyectamos una construcción transgénica sox17:EGFPCAAX . El promotor del marcador endodermo, sox17, se utilizó para impulsar EGFP marcado con membrana en el endodermo en desarrollo del pez cebra. Para construcciones transgénicas que expresan proteínas no fluoróforas, se puede usar un vector pDest que contiene un marcador transgénico fluorescente como cmlc2: EGFP para ayudar en la inserción genómica (Figura 1A).
Utilizando los valores descritos en el protocolo anterior (Tabla 2), se generó la construcción transgénica sox17:EGFPCAAX , y 4 μL de esta construcción se transformaron en células de Escherichia coli químicamente competentes. Después de incubar a 37 ° C durante la noche, la placa de agar contenía aproximadamente 250 colonias (las reacciones LR típicamente promedian 150-300 colonias por placa en nuestro laboratorio). El cribado de estas colonias se realizó en base a la opacidad. En nuestras manos, las colonias que estaban claras tenían el producto correcto sox17:EGFPCAAX >85% del tiempo, mientras que las colonias opacas nunca contenían el producto de recombinación correcto (Figura 1B, punta de flecha vs. flecha). Después de aislar el plásmido de varias colonias, la digestión de restricción de los productos recombinantes se realizó con la enzima de restricción, NcoI. Se digirieron dos colonias claras diferentes y una colonia opaca. Ambas colonias claras tenían una sola banda en el tamaño correcto de 9.544 pb (plásmidos no digeridos cargados como control de digestión), mientras que la colonia opaca no tenía ninguna banda en absoluto (Figura 2A). Estas construcciones positivas de sox17:EGFPCAAX se retransformaron, las colonias posteriores se volvieron a rayar, se confirmó que esas colonias tenían el plásmido y se generaron existencias de congeladores bacterianos de -80 °C. Se determinaron las concentraciones tanto del plásmido sox17:EGFPCAAX como del ARNm de la transposasa tapada para que ambos pudieran usarse para inyección (Figura 2B).
Los embriones se prepararon para la inyección colocando embriones en estadio celular en un molde de inyección de embriones precalentados (Figura 3A-C). Una vez colocada en el molde de inyección, la aguja de inyección que contenía el ARNm de sox17:EGFPCAAX se colocó en un soporte de micropipeta en el micromanipulador (Figura 3D,E). Los embriones fueron inyectados con 100 ng de ARNm transposasa, 150 ng de plásmido sox17:EGFPCAAX y rojo fenol (colorante de seguimiento de inyección). Se inyectó un bolo de 3 nL (determinado por el tamaño descrito en el protocolo, paso 6.6) en el cuerpo celular y no en la yema del embrión para tener la mejor oportunidad de integración (Figura 3F)10.
Después de la inyección, los embriones se retiraron del molde de inyección y se dejaron desarrollar durante 24 h. A las 24 h después de la fertilización (hpf), los embriones fueron examinados para la expresión endodermo de EGFPCAAX. Se observó expresión de EGFPCAAX del endodermo en mosaico en ~75% de los embriones inyectados (Figura 4A,A'). Para cribar los embriones inyectados con transgenes no fluorescentes como Gal4 o CreERT2, se puede utilizar un vector de destino que también contiene un marcador transgénico (es decir, cmlc2:EGFP) (Figura 1A) (Figura 4B,B'). El pez cebra adulto que tenía transgénesis germinal de sox17:EGFPCAAX generó embriones fluorescentes con el endodermo completamente marcado con EGFPCAAX (Figura 4C).
Utilizando la recién creada línea transgénica sox17:EGFPCAAX, pudimos evaluar directamente el impacto del etanol en la formación de las bolsas endodérmicas. Las bolsas son protuberancias que se forman en el borde lateral del endodermo y son importantes para la formación del esqueleto facial y sistemas de órganos múltiples17. Hemos demostrado previamente que el bloqueo de la señalización de la proteína morfogenética ósea (Bmp) resulta en hipoplasia de las bolsas18. Ahora mostramos que el tratamiento con etanol de los mutantes Bmp de 10-18 hpf tiene un impacto sutil pero significativo en el tamaño de la bolsa. La longitud dorsal-ventral de cada bolsa de las bolsas 1-5 (el pez cebra tiene seis bolsas, pero la sexta aún no se había formado completamente en la etapa de desarrollo fotografiada) se midió en embriones mutantes Bmp de tipo salvaje tratados con control y etanol (Figura 5A). Como control de los impactos generales en el crecimiento debido a la exposición al etanol, se midió la longitud anterior-posterior de todo el endodermo (Figura 5A). La longitud total del endodermo no se vio afectada por el genotipo o el tratamiento (Figura 5B). Sin embargo, las bolsas 1 y 3 mostraron aumentos significativos en la longitud de la bolsa entre los embriones de tipo salvaje no tratados y tratados con etanol, pero disminuciones significativas en la longitud entre los mutantes Bmp no tratados y tratados con etanol (Figura 5C; ANOVA bidireccional; bolsa 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; bolsa 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). La bolsa 2 mostró aumentos significativos en el tamaño de la bolsa entre los grupos mutantes de tipo salvaje y Bmp no tratados y tratados con etanol, respectivamente (Figura 5C; ANOVA de dos vías; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001).
Figura 1: Reacción de la pasarela LR para la construcción transgénica . (A) Esquema de la reacción modular de clonación de la puerta de enlace LR en cuatro partes. LR Clonase recombina los tres vectores de entrada, p5E, pMe y p3E, y el vector de destino, pDest, en una reacción altamente específica para generar un nuevo producto transgénico listo para la inyección de embriones. Para el cribado de transgenes no fluorescentes, los vectores pDest pueden contener marcadores transgénicos opcionales (cmlc2:EGFP, por ejemplo). (B) Ejemplos de colonias bacterianas obtenidas de la transformación de los productos de recombinación LR. Las colonias claras contenían un producto de recombinación LR correcto >85% del tiempo (punta de flecha), mientras que las colonias opacas nunca contenían un producto de recombinación correcto (flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis del ADN plásmido y del ARNm de la transposasa . (A) Digestión diagnóstica de las tres colonias a partir de la transformación de los productos de recombinación LR. La única colonia opaca no contenía ningún plásmido para cribar, mientras que las dos colonias claras contenían una sola banda a 9.544 pb (sin cortar vs. cortada). (B) ARNm de transposasa a 1.950 pb. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Configuración de la inyección de embriones de pez cebra. (A) Se coloca un molde de inyección en agarosa líquida diluida en EM (3% v/v). (B) Una vez solidificado, el molde se retira de la placa de agarosa. (C) Los embriones están dispuestos en los moldes de inyección. (D,E) La mezcla de ARNm/plásmido/rojo fenol se pipetea en la aguja de inyección, que se coloca en el soporte de micropipeta del micromanipulador. (F) Se inyecta un bolo de 3 nL en el cuerpo celular del embrión en la etapa de una célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cribado de pez cebra inyectado con la construcción transgénica. (A,A') La imagen confocal de un embrión fotografiado a 24 hpf muestra la expresión en mosaico del transgén sox17:EGFPCAAX. (B,B') Expresión del marcador transgénico de cmlc2:EGFP en el corazón en desarrollo a 24 hpf. Vistas laterales de los embriones, con anterior a la izquierda y dorsal en la parte superior. (C) Imagen confocal de un embrión generado a partir de un pez cebra adulto portador de transgenes. Todo el endodermo está expresando EGFPCAAX. Vista lateral del embrión, con anterior a la izquierda y ventral en la parte superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Medidas de bolsa en embriones silvestres tratados con etanol y mutantes Bmp. (A) Esquema que muestra la medición de la longitud total del endodermo y la longitud de las bolsas. (B) Las mediciones de la longitud total del endodermo anterior-posterior no muestran diferencias entre embriones silvestres de tipo salvaje no tratados y tratados con etanol y embriones mutantes Bmp. (C) Las mediciones de la longitud de la bolsa dorsal-ventral indican que las bolsas 1 y 3 muestran aumentos en la longitud de la bolsa entre los embriones de tipo salvaje no tratados y tratados con etanol, pero disminuyen en longitud entre los mutantes Bmp no tratados y tratados con etanol (ANOVA bidireccional; bolsa 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; bolsa 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). La bolsa 2 muestra un aumento en la longitud entre los grupos mutantes de tipo salvaje y Bmp no tratados y tratados con etanol (ANOVA bidireccional; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001). No se observaron diferencias en la longitud de la bolsa entre las bolsas 4 y 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Componentes de Tol2Kit alojados en el Lovely Lab. Cada vector de entrada y destino disponible en el Lovely Lab, sus descripciones y su laboratorio de origen. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Cálculo de la cantidad y concertación de cada vector en la reacción de recombinación LR. La cantidad de cada vector se calculó a partir del tamaño (en pb) y el fmol necesario para cada componente: 10 fmol de cada vector de entrada y 20 fmol del vector de destino. A partir de la concentración de plásmidos, cada vector se diluye en agua estéril para añadir 1 μL o menos a la reacción LR. Se agrega agua estéril al grupo vectorial para igualar 4 μL, se agrega 1 μL de mezcla de reacción LR a la reacción y se incuba a 25 ° C durante la noche. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
El pez cebra es ideal para estudiar el impacto de la exposición al etanol en el desarrollo y los estados de enfermedad 7,8. El pez cebra produce un gran número de embriones translúcidos, fertilizados externamente y genéticamente tratables, lo que permite la obtención de imágenes en vivo de varios tejidos y tipos de células marcados con transgenes simultáneamente en múltiples contextos ambientales19,20. Estas fortalezas, combinadas con la fuerte conservación genética del desarrollo con humanos, hacen del pez cebra un poderoso sistema modelo para obtener imágenes del impacto del etanol 7,8. Aquí, describimos el protocolo para un enfoque modular para generar e inyectar construcciones transgénicas y establecer líneas de pez cebra transgénico para futuros estudios de etanol.
Se han establecido muchos enfoques diferentes para generar pez cebra transgénico. Sin embargo, generar tanto construcciones transgénicas como líneas transgénicas puede ser desalentador. Si bien las técnicas tradicionales de subclonación, la clonación BAC o los enfoques basados en PCR, como el ensamblaje de Gibson, permiten generar construcciones transgénicas, tienen un bajo rendimiento y carecen de versatilidad en su construcción10. Además, estas estrategias deben ser rediseñadas para cada construcción transgénica creada. La subclonación requiere múltiples digestiones y ligaduras, asumiendo que todos los sitios de restricción necesarios están presentes y son únicos. La clonación de BAC requiere la secuenciación y prueba de múltiples clones de BAC. Para el ensamblaje de Gibson, se deben diseñar nuevos cebadores de PCR para cada construcción transgénica. Además, la inyección de ADN no cortado o linealizado conduce a una baja transmisión de la línea germinal21,22,23.
El Tol2Kit es un sistema modular que utiliza la clonación de pasarela para generar construcciones transgénicas completas flanqueadas por repeticiones de Tol2 que, cuando se combinan con ARNm transposasa, aumentan en gran medida la transgénesis y la transmisión de la línea germinal 10,11,24,25. Docenas de vectores de entrada y destino están disponibles en el laboratorio Kwan y el Cole Lab10,11. Además, los laboratorios de pez cebra que utilizan el Tol2Kit han generado y curado muchos más vectores de entrada y destino. Como ejemplo de la amplitud de vectores disponibles, hemos agrupado y utilizado más de 70 vectores (Tabla 1). Con todos estos recursos comunitarios, uno puede generar rápidamente miles de construcciones transgénicas diferentes simplemente combinando los vectores de elección en una reacción LR.
Las reacciones LR óptimas requieren cálculos exactos del tamaño y la concentración del plásmido. Los cálculos para cada vector se realizan en valores de femtomole (fmol), por lo que cada reacción no requiere un alto volumen de plásmido para generar una construcción transgénica. Sin embargo, esta pequeña cantidad de plásmido hace que las diluciones y el pipeteo adecuado sean extremadamente críticos para el éxito de la reacción10. Los factores adicionales que pueden afectar la reacción LR son el tamaño de las inserciones en los diferentes vectores de entrada. Por ejemplo, el elemento p5E-sox17 utilizado en este estudio es superior a 4 kb, lo que, si se combina con elementos pME y p3E igualmente grandes, dará como resultado un vector transgénico muy grande. Un plásmido grande en bacterias puede ser difícil de cultivar, disminuyendo así el número de colonias generadas a partir de la transformación bacteriana. Esto también resultará en un crecimiento más lento y una disminución de los niveles de plásmidos cuando se aíslan10. Es importante destacar que tener células bacterianas altamente competentes, así como aumentar la incubación de las células bacterianas durante la transformación del plásmido de recombinación, son clave para generar suficientes colonias para capturar la formación adecuada de transgenes. Además, el uso de la enzima de reacción LR correcta (enumerada en la Tabla de materiales) también juega un papel importante en el éxito de la reacción LR.
Más allá de la generación de una construcción transgénica y las transformaciones bacterianas, la inyección de embriones y la integración del genoma también pueden ser difíciles. La generación de ARNm transposasa de alta calidad aumenta considerablemente la frecuencia de integración genómica10. Los capilares extraídos deben fabricarse poco antes de inyectar los embriones, ya que las agujas más viejas pueden perder la acción capilar (es decir, el líquido de inyección no se mueve a la punta de la aguja) (Figura 3E). Tanto romper la punta de la aguja para inyectar solo ~ 3 nL de líquido como inyectar el cuerpo celular requieren práctica. Nuestro protocolo de entrenamiento consiste en inyectar el cuerpo celular solo con colorante de inyección rojo fenol hasta que se rompa la aguja e inyecte los embriones. La inyección del cuerpo celular aumenta drásticamente la tasa de integración del genoma10. Combinando todo esto, promediamos el 75% o más de inserción del genoma y expresión en mosaico, pero esto puede variar de una construcción a otra.
Dado que la inserción genómica puede ser aleatoria, cada embrión que muestra expresión en mosaico es una inserción transgénica única y requiere un cribado continuo. Este cribado continuo es necesario para demostrar que el sitio de integración no es perjudicial para el desarrollo del embrión, que se produce la transmisión de la línea germinal y que la expresión del transgén no está atenuada o potencialmente silenciada. Una vez que se ha establecido una línea transgénica, se puede utilizar fácilmente para múltiples análisis en estudios de etanol. Para aquellas construcciones transgénicas no fluorescentes, los marcadores transgénicos comúnmente utilizados incluyen cmlc2: GFP y αcrystallin: RFP, que marcan el corazón y la retina, respectivamente, y permiten la detección transgénica continua. Además de los marcadores transgénicos para la detección, estos dos transgenes se pueden utilizar para estudiar directamente el impacto del etanol en el desarrollo del corazón y la retina.
Usando el protocolo descrito anteriormente, generamos una línea de pez cebra transgénico sox17: EGFPCAAX que tenía una transmisión estable de la línea germinal de una construcción EGFP marcada con membrana específica del endodermo. Usando esta línea, pudimos medir el impacto del etanol en la formación de bolsas endodérmicas en embriones mutantes Bmp sensibles al etanol. Demostramos que los tamaños de las bolsas 1-3 pero no de las bolsas 4 y 5 ni la longitud total del endodermo se vieron afectados en los mutantes Bmp tratados con etanol (Fig. 5). Este trabajo piloto sugiere que la interacción Bmp-etanol interrumpe la formación de endodermo, en particular los comportamientos celulares subyacentes a la formación de bolsas. Este trabajo ejemplifica la utilidad de generar líneas transgénicas de pez cebra para estudios de etanol. Como resultado, la creación de nuevas líneas transgénicas aumentará en gran medida nuestra comprensión de los procesos celulares sensibles al etanol y los eventos tisulares en el TEAF.
En última instancia, el pez cebra transgénico, y el pez cebra en general, han demostrado ser increíblemente poderosos en el estudio del TEAF 7,8. El Tol2Kit es un conjunto de herramientas extremadamente versátil que permite a los investigadores generar rápidamente múltiples construcciones transgénicas listas para inyectar en el pez cebra. El diseño modular y la facilidad de generar nuevos vectores de entrada dan como resultado una flexibilidad extrema en la generación de construcciones transgénicas sin tener que rediseñar ningún componente. En general, este conjunto de herramientas mejorará en gran medida tanto la investigación del pez cebra como la investigación en general destinada a mejorar la comprensión del TEAF.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación presentada en este artículo fue apoyada por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional sobre el Abuso de Alcohol (NIH/NIAAA) R00AA023560 a C.B.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawson Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
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