Summary
Dette arbeidet beskriver en protokoll for det modulære Tol2 transgenesesystemet, en gateway-basert kloningsmetode for å lage og injisere transgene konstruksjoner i sebrafiskembryoer.
Abstract
Føtale alkoholspektrumforstyrrelser (FASD) er preget av et svært variabelt sett med strukturelle defekter og kognitive funksjonsnedsettelser som oppstår på grunn av prenatal etanoleksponering. På grunn av den komplekse patologien til FASD har dyremodeller vist seg å være kritiske for vår nåværende forståelse av etanolinduserte utviklingsdefekter. Sebrafisk har vist seg å være en kraftig modell for å undersøke etanolinduserte utviklingsdefekter på grunn av den høye graden av bevaring av både genetikk og utvikling mellom sebrafisk og mennesker. Som modellsystem har sebrafisk mange egenskaper som gjør dem ideelle for utviklingsstudier, inkludert et stort antall eksternt befruktede embryoer som er genetisk håndterbare og gjennomskinnelige. Dette gjør det mulig for forskere å nøyaktig kontrollere tidspunktet og doseringen av etanoleksponering i flere genetiske sammenhenger. Et viktig genetisk verktøy som er tilgjengelig i sebrafisk er transgenese. Imidlertid kan generering av transgene konstruksjoner og etablering av transgene linjer være komplisert og vanskelig. For å løse dette problemet har sebrafiskforskere etablert det transposonbaserte Tol2-transgenesesystemet. Dette modulære systemet bruker en multisite Gateway-kloningstilnærming for rask montering av komplette Tol2 transposonbaserte transgene konstruksjoner. Her beskriver vi den fleksible Tol2-systemverktøykassen og en protokoll for generering av transgene konstruksjoner klare for sebrafisktransgenese og deres bruk i etanolstudier.
Introduction
Prenatal etanoleksponering gir opphav til et kontinuum av strukturelle underskudd og kognitive funksjonsnedsettelser som kalles føtale alkoholspektrumforstyrrelser (FASD)1,2,3,4. De komplekse forholdene mellom flere faktorer gjør det utfordrende å studere og forstå etiologien til FASD hos mennesker. For å løse denne utfordringen har et bredt utvalg av dyremodeller blitt brukt. De biologiske og eksperimentelle verktøyene som er tilgjengelige i disse modellene har vist seg avgjørende for å utvikle vår forståelse av det mekanistiske grunnlaget for etanolteratogenisitet, og resultatene fra disse modellsystemene har vært bemerkelsesverdig konsistente med det som er funnet i humane etanolstudier 5,6. Blant disse har sebrafisk dukket opp som en kraftig modell for å studere etanol teratogenese7,8, delvis på grunn av deres eksterne befruktning, høy fruktbarhet, genetisk trekkbarhet og gjennomsiktige embryoer. Disse styrkene kombineres for å gjøre sebrafisk ideell for sanntids levende bildestudier av FASD ved bruk av transgene sebrafisklinjer.
Transgen sebrafisk har blitt mye brukt til å studere flere aspekter av embryonal utvikling9. Imidlertid kan det være svært vanskelig å skape transgene konstruksjoner og påfølgende transgene linjer. Et standard transgen krever et aktivt promotorelement for å drive transgenet og et poly A-signal eller "hale", alt i en stabil bakteriell vektor for generelt vektorvedlikehold. Den tradisjonelle genereringen av en multikomponent transgen konstruksjon krever flere tidkrevende underkloning trinn10. PCR-baserte tilnærminger, som Gibson-montering, kan omgå noen av problemene knyttet til underkloning. Imidlertid må unike primere designes og testes for generering av hver unike transgene konstruksjon10. Utover transgenkonstruksjon har genomisk integrasjon, kimlinjeoverføring og screening for riktig transgenintegrasjon også vært vanskelig. Her beskriver vi en protokoll for bruk av det transposonbaserte Tol2-transgenesesystemet (Tol2Kit)10,11. Dette modulære systemet bruker multisite Gateway-kloning for raskt å generere flere transgene konstruksjoner fra et stadig voksende bibliotek med "oppføring" og "destinasjon" vektorer. Integrerte Tol2 transponerbare elementer øker transgenesehastigheten sterkt, noe som muliggjør rask konstruksjon og genomisk integrasjon av flere transgener. Ved hjelp av dette systemet viser vi hvordan genereringen av en endoderm transgen sebrafisklinje kan brukes til å studere de vevsspesifikke strukturelle defektene som ligger til grunn for FASD. Til syvende og sist, i denne protokollen, viser vi at det modulære oppsettet og konstruksjonen av transgene konstruksjoner i stor grad vil hjelpe sebrafiskbasert FASD-forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle sebrafiskembryoer som ble brukt i denne prosedyren ble oppdrettet og avlet etter etablerte IACUC-protokoller12. Disse protokollene ble godkjent av University of Louisville.
MERK: Den ville sebrafiskstammen, AB, og bmp4st72;smad5b1100 dobbel mutantlinje ble brukt i denne studien. Alt vannet som ble brukt i denne prosedyren var sterilt omvendt osmosevann. Konfokale bilder ble tatt under et laserskanning konfokalmikroskop. Endodermmålingene ble gjort ved hjelp av måleverktøyet i ImageJ. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av statistisk programvare.
1. Å lage løsningene og mediene
- Bakterielle medier: Løs opp LB-buljong eller agar i henhold til produsentens instruksjoner, og autoklav. Før mediet helles i 100 mm petriskåler, tilsettes enten ampicillin (50 μg/ml), kanamycin (50 μg/ml) eller en kombinasjon av ampicillin/kloramfenikol (henholdsvis 50 μg/ml og 30 μg/ml).
- For å lage 20x embryomediemateriale, oppløs følgende i 1 liter vann: 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl2, 0,41 g K2 HPO 4, 0,142 g Na 2 HPO 4 og 4,9 g MgSO 4 · 7H 2O. Filtrersteriliser stamløsningen ved hjelp av et 0,22 μm vakuumfiltreringssystem, og oppbevares ved 4 °C.
MERK: Ignorer det hvite bunnfallet som dannes; Dette vil ikke påvirke mediene. - Løs opp 1,2 g NaHCO3 i 19 liter vann og tilsett 1 l av 20x embryomediematerialet for å generere den arbeidende embryomedieoppløsningen, og oppretthold denne oppløsningen ved 28 °C.
- For 2% fenolrød oppløsning, oppløs 20 mg fenolrødt natriumsalt i 1 ml RNase-fritt vann og oppbevar ved romtemperatur.
2. Embryo injeksjon muggsopp
- For å lage agaroseinjeksjonsplaten, oppløs agarose i embryomediet til en endelig konsentrasjon på 3% ved oppvarming til koking.
- Hell 50 ml agarose i 100 mm petriskåler, og mens agarose fortsatt er flytende, legg injeksjonsformen forsiktig i agarose for å forhindre bobledannelse under formen.
- La agaroseplatene avkjøles. Når agarosen er fast, fjernes sprøyteformen og oppbevares ved 4 °C til den er klar til bruk.
3. Injeksjonspipetter
- Trekk 1,0 mm (OD) kapillærer som inneholder et filament inn i nåler ved hjelp av en vertikal pipettetrekker med magnetventilen satt til 2,5 og varmeelementet satt til 14,6.
MERK: Enhver oppvarmet avtrekker vil fungere hvis den trekker kapillærene i to nåler rent og jevnt, men injeksjonsnålene må trekkes innen 1 uke etter injeksjon av sebrafiskembryoene for konsistente injeksjonsresultater.- Plasser kapillæren i avtrekkeren, stram klemmen i hver ende, og aktiver deretter varmeelementet.
- Trekk kapillærene for å lage to injeksjonsnåler.
- Fjern kapillærene fra avtrekkeren, og oppbevar dem i en tom petriskål med en stripe modelleringsleire som fungerer som nåleholder.
4. Transposase mRNA forberedelse
- Linearisere Tol2Kit-plasmidet som inneholder transposase med en NotI-restriksjonsendonuklease ved å kombinere følgende i et 0,5 ml mikrosentrifugerør: 10 μL transposaseplasmid (150 ng / μL), 1,5 μL restriksjonsendonukleasereaksjonsbuffer, 0,3 μL NotI endonuklease.
- Fyll reaksjonen opp til 20 μL med RNasefritt vann, og bland og fordøy deretter ved 37 °C over natten.
- Stopp transposasefordøyelsen ved å tilsette 1 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μL 5 MNH4OAc og 80 μL 100 % EtOH til fordøyelsesreaksjonen, og bland deretter og avkjøl ved -20 °C over natten.
- Sentrifuger oppløsningen ved 14 000x g i 20 minutter ved 4 °C, og aspirer deretter supernatanten og resuspender DNA-pelleten i RNasefritt vann.
- Bestem den lineære plasmidkonsentrasjonen i nanogram per mikroliter (ng / μL) ved hjelp av et fluorometer ved først å kjøre 2 μL av et RNasefritt vannblankt og deretter kjøre 2 μL av det lineariserte plasmidet.
MERK: Plasmidkonsentrasjonene varierer vanligvis mellom 100-200 ng / μL - Sett opp SP6 mRNA-produksjonen ved å kombinere følgende komponenter i rekkefølge i et 0,5 ml mikrosentrifugerør: 10 μL 2x NTP / CAP, 2 μL 10x reaksjonsbuffer, 0,1-1 μg lineær DNA-mal og 2 μL SP6 enzymblanding.
- Fyll reaksjonen opp til 20 μL med RNase-fritt vann, og bland deretter og inkuber ved 37 °C i 2 timer.
- Etter inkubering i 2 timer, tilsett 1 μL DNase, bland godt og inkuber i ytterligere 15 minutter ved 37 °C.
- For å stoppe SP6-reaksjonen, tilsett 30 μL LiCl utfellingsoppløsning til reaksjonsrøret, og bland deretter og avkjøl ved -20 °C over natten.
- Sentrifuger oppløsningen ved 14 000 x g i 20 minutter ved 4 °C for å pelletere mRNA, og aspirer deretter supernatanten og vask mRNA-pelleten med 1 ml 80 % EtOH (fortynnet med RNasefritt vann).
- Sentrifuger oppløsningen ved 14 000 x g i 20 minutter ved 4 °C for å pelletere mRNA, og aspirer deretter supernatanten. La pelleten lufttørke.
- Resuspender mRNA-pelleten i 20 μL RNase-fritt vann, bestem mRNA-konsentrasjonen i nanogram per mikroliter (ng / μL) ved hjelp av et fluorometer som beskrevet i trinn 4.5 (skal være minst 100 ng / μL), aliquot 100 ng mRNA per rør til engangsbruk, og lagre ved -80 ° C.
MERK: For å sikre at mRNA ikke brytes ned, kan 2 μL mRNA raskt kjøres på en DNA-elektroforesegel for å bekrefte et enkelt bånd ved 1,950 bps.
5. Multisite Gateway-kloning for å lage inngangsvektorer for transgenese
MERK: Denne protokollen er modifisert fra Kwan et al.10, med LR-reaksjonen skrevet som en halv-LR-reaksjon og med et totalt volum på 5 μL. For å generere nye inngangselementer må BP-reaksjoner ved bruk av 5', midtre og 3' donorvektorer brukes10,13.
- For å utføre reaksjonen, samle 10 fmol hver av p5E, pME og p3E og 20 fmol av destinasjonsvektoren (pDest).
MERK: Multisite LR-rekombinasjon bruker fire forskjellige plasmidvektorer: en 5' inngangsvektor (p5E), en mellominngangsvektor (pME), en 3' inngangsvektor (p3E) og en destinasjonsvektor (pDest), for å generere en unik transgen konstruksjon flankert av Tol2-repetisjoner klar til å injiseres i sebrafiskembryoer.- Identifiser størrelsen på alle fire vektorene i basepar fra plasmidkilden (tabell 1, Tol2Kit Wiki side14 eller Addgene11; se materialfortegnelsen).
MERK: For nye vektorer kan full plasmidsekvensering via kommersielle sekvenseringsselskaper gi den nøyaktige plasmidstørrelsen i bps. - Bestem konsentrasjonen av alle fire vektorer i nanogram per mikroliter (ng / μL) ved hjelp av et fluorometer, som beskrevet i trinn 4.5.
- Ved å bruke vekten av DNA som 660 g / mol og plasmidstørrelsen (i bps), beregne de totale nanogrammene (ng) plasmid som trengs for å nå enten 10 fmol (inngangsvektorer) eller 20 fmol (destinasjonsvektor).
MERK: Mosimann-laboratoriet ved University of Colorado, Anschutz Medical Campus, har generert et fritt tilgjengelig regneark for å beregne mengden plasmid som trengs (i ng) og volumet (i μL) av vektorene som trengs i LR-reaksjonen15.
- Identifiser størrelsen på alle fire vektorene i basepar fra plasmidkilden (tabell 1, Tol2Kit Wiki side14 eller Addgene11; se materialfortegnelsen).
- For å generere konstruksjonen beskrevet nedenfor, sox17: EGFPCAAX, bruk følgende vektorer: en p5E-vektor som inneholder sebrafisken sox17-promotoren , som er 6,918 bp i størrelse16; en pME-vektor som inneholder prenylert EGFP, som er 3,345 bp i størrelse10; en p3E-vektor som inneholder SV40 late poly A-signalsekvensen, som er 2,838 bp i størrelse10; og pDest, som er 5,883 bp i størrelse10.
- Bruk plasmidkonsentrasjonen bestemt i trinn 5.1.2 og mengden i nanogram (ng) for hver vektor (trinn 5.1.3), beregne de totale mikroliterne (μL) av hvert plasmid som trengs for å nå enten 10 fmol (inngangsvektorer) eller 20 fmol (destinasjonsvektor), og del deretter dette med to for bruk i 5 μL halv-LR-reaksjoner (alle verdiene nedenfor er oppført i tabell 2).
- For å generere 10 fmol p5E-sox17, bruk 45,66 ng (i en konsentrasjon på 140,3 ng / μL) og fortynn med sterilt vann med en faktor på 4 for å få 0,65 μL.
- For å generere 10 fmol pME-EGFPCAAX, bruk 22,08 ng (i en konsentrasjon på 213,5 ng / μL) og fortynn med sterilt vann med en faktor på 10 for å få 0,52 μL.
- For å generere 10 fmol p3E-poly A, bruk 15,73 ng (i en konsentrasjon på 276,1 ng / μL) og fortynn med sterilt vann med en faktor på 20 for å få 0,57 μL.
- For 20 fmol av destinasjonsvektoren, bruk 77,66 ng pDest (i en konsentrasjon på 307,3 ng / μL) og fortynn med sterilt vann med en faktor på 5 for å få 1,63 μL.
- For å sette opp en 5 μL halv-LR-reaksjon, kombiner volumene av p5E, pME, p3E og pDest bestemt i trinn 5,3 i et 0,5 ml mikrosentrifugerør, og tilsett deretter sterilt vann for å nå et totalt reaksjonsvolum på 4 μL.
- Virvel LR-enzymet blandes kraftig i 1 min hver for å sikre riktig blanding, og tilsett deretter 1 μL til reaksjonen og bland godt.
- Inkuber ved 25 °C over natten (16+ timer).
- Stopp LR-reaksjonen ved å tilsette 0,5 μL proteinase K (2 μg/μL), inkuber ved 37 °C i 10 minutter, og avkjøl deretter til romtemperatur.
- Omdanne 3-4 μl plasmid til tinte, kjemisk kompetente celler ved å tilsette plasmidet og la cellene sitte på is i 25-30 minutter.
- Mens cellene sitter på is, varm to LB-ampicillin agarplater til romtemperatur.
- Varmesjokk cellene i et 42 °C vannbad i nøyaktig 30 s.
- Etter varmesjokket, tilsett 250 μL antibiotikafrie, rike flytende medier til cellene, og inkuber med risting ved 37 ° C i 1,5 timer.
- Fordel 300 μL bakterier på en ampicillinplate, og inkuber ved 37 ° C over natten.
- Neste morgen screener du koloniene for tilstedeværelsen av to fenotyper, klare og ugjennomsiktige, plukker de klare koloniene (som beskrevet i Kwan et al.10) en om gangen, inokulerer væskekulturen, og rist deretter ved 37 ° C over natten.
MERK: Klare kolonier inneholder nesten alltid riktig LR-koloni (>85% av tiden). - Bruk et kommersielt sett i henhold til produsentens instruksjoner, utfør en plasmidforberedelse på hver væskekultur og fordøy hvert plasmid diagnostisk for å bekrefte riktig størrelse på den transgene konstruksjonen, noe som indikerer at LR-gatewayreaksjonen har fungert som den skal.
- Retransformere de riktige transgene konstruksjonene ved hjelp av standard bakteriell transformasjonsprotokoll som beskrevet i trinn 5.4-5.12 ved bruk av 0,5-1 μL av plasmidet, og inkuber bare ved 37 °C i 1 time.
- Re-strek koloniene, og bekreft at hver har LR transgene konstruksjon som i trinn 5.14.
- Bestem plasmidkonsentrasjonen som beskrevet i trinn 4.5 (minst 150 ng/μL er nødvendig for embryoinjeksjonen).
6. Injeksjon av transgenet i embryoene
- Tine en engangs transposase mRNA-prøve og Tol2 transgen konstruksjon på is og prewarn en agarose injeksjonsplate til romtemperatur.
- Kombiner følgende på is: 150 ng plasmid, 100 ng transposase mRNA og 2 % fenolrødt (0,3 μL). Tilsett deretter RNA-fritt vann for å gjøre opp volumet til 3 μL.
- Overfør ett embryo i celletrinn ved hjelp av overføringspipetter til injeksjonsplaten (beskrevet i trinn 2) fylt med EM som dekker agar fullstendig, og trykk deretter forsiktig på ca. 50-75 embryoer per spalte på injeksjonsplaten.
- Tilsett mRNA/plasmid/fenolrød blanding i den åpne enden av en kapillær injeksjonsnål, plasser kapillærnålen i injeksjonsriggens armatur og slå på injeksjonsriggen.
MERK: Injeksjonsriggen bruker komprimert gass, for eksempel luft, for å pulsere ønsket volum (beskrevet i trinn 6.5) av mRNA / plasmid / fenolrød blanding inn i embryoet når den aktiveres. - Senk kapillærnålen ned i EM på injeksjonsplaten, og knekk spissen med tang slik at bare en liten mengde mRNA/plasmid/fenolrød blanding pumpes ut av injeksjonsriggen.
- Injiser embryoene med en liten 3 nL bolus av mRNA / plasmid / fenolrød blanding inn i embryoets cellekropp.
MERK: En 3 nL bolus er et volum av mRNA / plasmid / fenol rød blanding hvor syv boluser teoretisk kan passe likt over embryoets midtlinje. - Når embryoene er ferdige med å injiseres, fjernes de fra injeksjonsplaten ved å stikke dem forsiktig ut av sporet og overføre pipetterer dem til en 100 mm petriskål med fersk EM (ca. 40 ml), og inkuber deretter ved 28,5 °C slik at embryoene kan utvikle seg.
7. Screening av embryoer for transgen innsetting
- For ekspresjon av fluorescerende proteiner, velg riktig utviklingsstadium når fluorescerende transgen skal uttrykkes, og skjerm for tilstedeværelse av fluorescens under et fluorescerende dissekerende mikroskop.
MERK: Disse embryoene vil være mosaikk i sitt uttrykk og vise en genomisk innsetting av den transgene konstruksjonen. - Skjerm for ikke-fluorescerende transgener ved screening for en fluorescerende transgen markør (som beskrevet i trinn 7.1), slik som GFP drevet av den hjertespesifikke promotoren for genet cmlc2 eller mCherry drevet av den linsespesifikke promotoren av αcyrstallin, som finnes i forskjellige destinasjonsvektorer.
- La embryoene som er positive for transgen innsetting utvikle seg fullt ut til de voksne sebrafiskstadiene.
- Når potensiell transgen fisk når avlsalder, kan du screene dem individuelt for både kimlinjeoverføring og transgen ekspressivitet ved å avle dem til villtype sebrafisk.
- De voksne hvis embryoer utvikler seg normalt og gir det sterkeste og mest hensiktsmessige transgene uttrykket, beholdes som unike transgene sebrafisklinjer for fremtidig arbeid og analyser.
MERK: Som en alternativ tilnærming til screening for genomisk innsetting av transgene konstruksjoner, design PCR-primere som bare forsterker den transgene konstruksjonen og ikke villtype-DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å generere de transgene konstruksjonene brukte vi Tol2-transgenesesystemet. Tre inngangsvektorer, inkludert p5E, som inneholder genpromotor/forsterkerelementene, pME, som holder genet som skal uttrykkes av promotor/forsterkerelementene, og p3E som minst holder polyA-halen, ble brukt til å generere den transgene konstruksjonen via multisite gateway LR-kloning. Destinasjonsvektoren, pDest, gir Tol2-repetisjonene for genomisk innsetting av den transgene konstruksjonen i sebrafiskembryoer og inneholder all viktig genetisk informasjon for bakterievekst (figur 1A). I forbindelse med dette manuskriptet opprettet og injiserte vi en sox17: EGFPCAAX transgen konstruksjon. Promotoren av endodermmarkøren, sox17, ble brukt til å drive membranmerket EGFP i den utviklende endodermen til sebrafisken. For transgene konstruksjoner som uttrykker ikke-fluoroforproteiner, kan en pDest-vektor som inneholder en fluorescerende transgen markør som cmlc2: EGFP brukes til å hjelpe til med genomisk innsetting (figur 1A).
Ved å bruke verdiene beskrevet i protokollen ovenfor (tabell 2) ble sox17: EGFPCAAX transgen konstruksjon generert, og 4 μL av denne konstruksjonen ble transformert til kjemisk kompetente Escherichia coli-celler . Etter å ha ruget ved 37 °C over natten, inneholdt agarplaten ca. 250 kolonier (LR-reaksjoner er vanligvis gjennomsnittlig 150-300 kolonier per plate i laboratoriet vårt). Screeningen av disse koloniene ble utført basert på opasitet. I våre hender hadde kolonier som var klare riktig sox17: EGFPCAAX-produkt >85% av tiden, mens de ugjennomsiktige koloniene aldri inneholdt riktig rekombinasjonsprodukt (figur 1B, pilspiss vs. pil). Etter isolering av plasmidet fra flere kolonier ble restriksjonsfordøyelsen av de rekombinante produktene utført med restriksjonsenzymet NcoI. To forskjellige klare kolonier og en ugjennomsiktig koloni ble fordøyd. Begge de klare koloniene hadde et enkelt bånd i riktig størrelse på 9 544 bp (ufordøyde plasmider lastet som fordøyelseskontroll), mens den ugjennomsiktige kolonien ikke hadde noen bånd i det hele tatt (figur 2A). Disse positive sox17: EGFPCAAX-konstruksjonene ble omformet, de påfølgende koloniene ble stripet på nytt, disse koloniene ble bekreftet å ha plasmidet, og -80 ° C bakterielle fryselagre ble generert. Konsentrasjonene av både sox17:EGFPCAAX-plasmidet og capped-transposase mRNA ble bestemt slik at de begge kunne brukes til injeksjon (figur 2B).
Embryoene ble klargjort for injeksjon ved å plassere ett embryostadium i en forvarmet embryoinjeksjonsform (figur 3A-C). Når injeksjonsformen var plassert, ble injeksjonsnålen som inneholdt sox17:EGFPCAAX mRNA plassert i en mikropipettholder på mikromanipulatoren (figur 3D,E). Embryoene ble injisert med 100 ng transposase mRNA, 150 ng sox17: EGFPCAAX plasmid og fenolrødt (injeksjonssporingsfargestoff). En 3 nL bolus (bestemt av størrelse som beskrevet i protokollen, trinn 6.6) ble injisert i cellekroppen og ikke i eggeplommen til embryoet for best mulig integrering (figur 3F)10.
Etter injeksjon ble embryoene fjernet fra injeksjonsformen og fikk utvikle seg i 24 timer. Ved 24 timer etter befruktning (hpf) ble embryoene screenet for endodermuttrykk av EGFPCAAX. Mosaikkendoderm EGFPCAAX-uttrykk ble observert i ~75 % av de injiserte embryoene (figur 4A,A'). For å screene embryoer injisert med ikke-fluorescerende transgener som Gal4 eller CreERT2, kan en destinasjonsvektor som også inneholder en transgen markør (dvs. cmlc2: EGFP) (figur 1A) brukes (figur 4B, B '). Voksen sebrafisk som hadde germline transgenese av sox17: EGFPCAAX genererte fluorescerende embryoer med endoderm fullt merket med EGFPCAAX (figur 4C).
Ved å bruke den nyopprettede sox17: EGFPCAAX transgene linjen, var vi i stand til å direkte vurdere virkningen av etanol på dannelsen av endodermale poser. Posene er fremspring som dannes på sidekanten av endoderm og er viktige for dannelsen av ansiktsskjelettet og flere organsystemer17. Vi har tidligere vist at blokkering av benmorfogenetisk protein (Bmp) signalering resulterer i hypoplasi av posene18. Vi viser nå at etanolbehandling av Bmp-mutanter fra 10-18 hpf har en subtil, men betydelig innvirkning på posestørrelsen. Den dorsal-ventrale lengden på hver pose fra pose 1-5 (sebrafisk har seks poser, men den sjette hadde ennå ikke blitt fullstendig dannet på utviklingsstadiet avbildet) ble målt i kontroll og etanolbehandlede villtype Bmp muterte embryoer (figur 5A). Som kontroll for generelle veksteffekter på grunn av etanoleksponering ble fremre-bakre lengde av hele endoderm målt (figur 5A). Den totale lengden på endoderm ble ikke påvirket av genotype eller behandling (figur 5B). Posene 1 og 3 viste imidlertid signifikante økninger i poselengden mellom de ubehandlede og etanolbehandlede villtypeembryoene, men signifikant reduksjon i lengde mellom de ubehandlede og etanolbehandlede Bmp-mutantene (figur 5C; toveis ANOVA; pose 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; pose 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). Pose 2 viste signifikante økninger i posestørrelse mellom henholdsvis de ubehandlede og etanolbehandlede villtype- og Bmp-mutantgruppene (figur 5C; toveis ANOVA; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001).
Figur 1: LR-gatewayreaksjon for transgen konstruksjon . (A) Skjematisk fremstilling av den modulære firedelte LR-gateway-kloningsreaksjonen. LR Clonase rekombinerer de tre inngangsvektorene, p5E, pME og p3E, og destinasjonsvektoren, pDest, i en svært spesifikk reaksjon for å generere et nytt transgent produkt klart for embryoinjeksjon. For screening av ikke-fluorescerende transgener kan pDest-vektorer inneholde valgfrie transgene markører (cmlc2: EGFP, som et eksempel). (B) Eksempel bakteriekolonier oppnådd ved transformasjon av LR rekombinasjonsprodukter. Clear colonies inneholdt et korrekt LR rekombinasjonsprodukt >85% av tiden (pilspiss), mens ugjennomsiktige kolonier aldri inneholdt et korrekt rekombinasjonsprodukt (pil). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Analyse av plasmid-DNA og transposase mRNA . (A) Diagnostisk fordøyelse av de tre koloniene fra transformasjonen av LR-rekombinasjonsproduktene. Den ene ugjennomsiktige kolonien inneholdt ikke noe plasmid til skjermen, mens de to klare koloniene inneholdt et enkelt bånd på 9,544 bp (uklippet vs. kuttet). (B) Transposase mRNA ved 1,950 bp. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Oppsett av sebrafiskembryoinjeksjon. (A) En injeksjonsform plasseres i flytende agarose fortynnet i EM (3% v / v). (B) Når formen er størknet, fjernes den fra agaroseplaten. (C) Embryoene er ordnet i injeksjonsformene. (D,E) Den røde blandingen mRNA/plasmid/fenol pipetteres inn i kanylen, som plasseres i mikropipettholderen i mikromanipulatoren. (F) En 3 nL bolus injiseres i embryoets cellekropp på encellestadiet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Screening sebrafisk injisert med transgen konstruksjon. (A,A') Konfokalbilde av et embryo avbildet ved 24 hpf viser mosaikkuttrykket til sox17:EGFPCAAX-transgenet. (B,B') Transgen markøruttrykk av cmlc2: EGFP i utviklingshjertet ved 24 hpf. Laterale visninger av embryoene, med fremre til venstre og dorsale øverst. (C) Konfokalt bilde av et embryo generert fra en transgenbærende voksen sebrafisk. Hele endoderm uttrykker EGFPCAAX. Lateral visning av embryoet, med fremre til venstre og ventral øverst. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Pouch måler i etanolbehandlede villtype og Bmp muterte embryoer. (A) Skjematisk som viser måling av endodermens totale lengde og posenes lengde. (B) Målingene av den totale fremre-bakre endodermlengden viser ingen forskjell mellom ubehandlede og etanolbehandlede villtype- og Bmp-muterte embryoer. (C) Målingene av lengden på dorsal-ventrale poser indikerer at posene 1 og 3 viser økninger i posens lengde mellom de ubehandlede og etanolbehandlede villtypeembryoene, men avtar i lengde mellom de ubehandlede og etanolbehandlede Bmp-mutantene (toveis ANOVA; pose 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; pose 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). Pose 2 viser en økning i lengde mellom de ubehandlede og etanolbehandlede villtype- og Bmp-mutantgruppene (toveis ANOVA; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001). Det ble ikke observert forskjeller i poselengde mellom pose 4 og 5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Tol2Kit-komponenter plassert i Lovely Lab. Hver oppføring og destinasjonsvektor tilgjengelig i Lovely Lab, deres beskrivelser og deres opprinnelseslaboratorium. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Beregning av mengde og samspill av hver vektor i LR-rekombinasjonsreaksjonen. Mengden av hver vektor ble beregnet ut fra størrelsen (i bp) og fmol som trengs for hver komponent: 10 fmol av hver inngangsvektor og 20 fmol av destinasjonsvektoren. Fra plasmidkonsentrasjonen fortynnes hver vektor i sterilt vann for å tilsette 1 μL eller mindre til LR-reaksjonen. Sterilt vann tilsettes vektorbassenget til lik 4 μL, 1 μL LR-reaksjonsblanding tilsettes til reaksjonen, og den inkuberes ved 25 ° C over natten. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sebrafisk er ideelt egnet for å studere virkningen av etanoleksponering på utvikling og sykdomstilstander 7,8. Sebrafisk produserer et stort antall gjennomskinnelige, eksternt befruktede, genetisk traktable embryoer, noe som muliggjør levende avbildning av flere transgenmerkede vev og celletyper samtidig i flere miljøsammenhenger19,20. Disse styrkene, kombinert med den sterke utviklingsgenetiske bevaringen med mennesker, gjør sebrafisk til et kraftig modellsystem for avbildning av virkningen av etanol 7,8. Her beskrev vi protokollen for en modulær tilnærming til generering og injeksjon av transgene konstruksjoner og etablering av transgene sebrafisklinjer for fremtidige etanolstudier.
Mange forskjellige tilnærminger har blitt etablert for å generere transgen sebrafisk. Imidlertid kan generering av både transgene konstruksjoner og transgene linjer være skremmende. Mens tradisjonelle underkloningsteknikker, BAC-kloning eller PCR-baserte tilnærminger som Gibson-montering tillater generering av transgene konstruksjoner, har de lav gjennomstrømning og mangler allsidighet i konstruksjonen10. I tillegg må disse strategiene redesignes for hver transgen konstruksjon som opprettes. Sub-kloning krever flere fordøyelser og ligeringer, forutsatt at alle restriksjonsstedene som er nødvendige er til stede og unike. BAC-kloning krever sekvensering og testing av flere BAC-kloner. For Gibson-montering må nye PCR-primere designes for hver transgen konstruksjon. Videre fører injeksjon av enten uklippet eller linearisert DNA til lav kimlinjeoverføring21,22,23.
Tol2Kit er et modulært system som bruker gateway-kloning for å generere komplette transgene konstruksjoner flankert av Tol2-repetisjoner som, når de kombineres med transposase mRNA, øker transgenesen og kimlinjeoverføringen 10,11,24,25. Dusinvis av inngangs- og destinasjonsvektorer er tilgjengelige fra Kwan-laboratoriet og Cole Lab10,11. I tillegg har sebrafisklaboratorier som bruker Tol2Kit generert og kuratert mange flere inngangs- og destinasjonsvektorer. Som et eksempel på bredden av tilgjengelige vektorer har vi samlet og brukt over 70 vektorer (tabell 1). Med alle disse samfunnsressursene kan man raskt generere tusenvis av forskjellige transgene konstruksjoner ved ganske enkelt å kombinere de valgte vektorene i en LR-reaksjon.
Optimale LR-reaksjoner krever nøyaktige beregninger av plasmidstørrelse og konsentrasjon. Beregningene for hver vektor gjøres i femtomol (fmol) verdier, slik at hver reaksjon ikke krever et høyt plasmidvolum for å generere en transgen konstruksjon. Imidlertid gjør denne lille mengden plasmid fortynninger og riktig pipettering svært kritisk for suksessen til reaksjonen10. Ytterligere faktorer som kan påvirke LR-reaksjonen er størrelsen på innsatsene i de forskjellige inngangsvektorene. For eksempel er p5E-sox17-elementet som brukes i denne studien over 4 kb, som, hvis det kombineres med like store pME- og p3E-elementer, vil resultere i en veldig stor transgen vektor. Et stort plasmid i bakterier kan være vanskelig å dyrke, og dermed redusere antall kolonier generert fra bakteriell transformasjon. Dette vil også resultere i langsommere vekst og reduserte plasmidnivåer når isolert10. Det er viktig at det å ha høyt kompetente bakterieceller, samt øke inkubasjonen av bakteriecellene under transformasjonen av rekombinasjonsplasmidet, er nøkkelen til å generere nok kolonier til å fange riktig transgendannelse. I tillegg spiller bruk av riktig LR-reaksjonsenzym (oppført i materialfortegnelsen) også en viktig rolle i suksessen til LR-reaksjonen.
Utover genereringen av en transgen konstruksjon og bakterielle transformasjoner, kan embryoinjeksjonen og genomintegrasjonen også være vanskelig. Genereringen av høykvalitets transposase mRNA øker frekvensen av genomisk integrasjon10. De trukne kapillærene må gjøres like før injeksjon av embryoene, da eldre nåler kan miste kapillærvirkning (dvs. injeksjonsvæsken ikke beveger seg til nålspissen) (figur 3E). Både bryte tuppen av nålen for å bare injisere ~ 3 nL av væske og injisere cellelegemet krever praksis. Vår treningsprotokoll innebærer å injisere cellekroppen med bare fenolrødt injeksjonsfargestoff til nålen brytes og embryoene injiseres. Injisering av cellekroppen øker hastigheten på genomintegrasjondrastisk 10. Ved å kombinere alt dette har vi gjennomsnittlig 75% eller større genominnsetting og mosaikkuttrykk, men dette kan variere fra konstruksjon til konstruksjon.
Siden genomisk innsetting kan være tilfeldig, er hvert embryo som viser mosaikkuttrykk en unik transgen innsetting og krever fortsatt screening. Denne fortsatte screeningen er nødvendig for å vise at integrasjonsstedet ikke er skadelig for utviklingen av embryoet, at kimlinjeoverføring oppstår, og at ekspresjonen av transgenet ikke er dempet eller potensielt brakt til taushet. Når en transgen linje er etablert, kan den lett brukes til flere analyser i etanolstudier. For de ikke-fluorescerende transgene konstruksjonene inkluderer ofte brukte transgene markører cmlc2: GFP og αcrystallin: RFP, som merker henholdsvis hjertet og netthinnen, og tillater fortsatt transgen screening. I tillegg til transgene markører for screening, kan disse to transgenene brukes til å studere virkningen av etanol direkte på hjerte- og netthinneutvikling.
Ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor genererte vi en sox17: EGFPCAAX transgen sebrafisklinje som hadde stabil kimlinjeoverføring av en endodermspesifikk membranmerket EGFP-konstruksjon. Ved hjelp av denne linjen var vi i stand til å måle effekten av etanol på endodermal posedannelse i etanolfølsomme Bmp-mutante embryoer. Vi viste at størrelsen på poser 1-3, men ikke på poser 4 og 5, eller den totale endodermlengden ble påvirket i etanolbehandlede Bmp-mutanter (figur 5). Dette pilotarbeidet antyder at Bmp-etanol-interaksjonen forstyrrer endodermdannelsen, spesielt celleadferdene som ligger til grunn for posedannelse. Dette arbeidet eksemplifiserer nytten av å generere transgene sebrafisklinjer for etanolstudier. Som et resultat vil skape nye transgene linjer øke vår forståelse av etanolfølsomme cellulære prosesser og vevhendelser i FASD.
Til syvende og sist har transgen sebrafisk og sebrafisk generelt vist seg å være utrolig kraftig i studien av FASD 7,8. Tol2Kit er en ekstremt allsidig verktøykasse som gjør det mulig for forskere å raskt generere flere transgene konstruksjoner klare til å injisere i sebrafisk. Den modulære designen og den enkle genereringen av nye inngangsvektorer resulterer i ekstrem fleksibilitet i å generere transgene konstruksjoner uten å måtte redesigne noen komponenter. Samlet sett vil denne verktøykassen i stor grad forbedre både sebrafiskforskning og forskning generelt med sikte på å forbedre forståelsen av FASD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskningen som presenteres i denne artikkelen ble støttet av et tilskudd fra National Institutes of Health / National Institute on Alcohol Abuse (NIH / NIAAA) R00AA023560 til CBL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawson Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
- Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
- Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
- Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
- Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Lovely, C. B.
- Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).
- Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017).
- The Tol2Kit. , Available from: http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page (2007).
- Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
- Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
- Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
- Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
- Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).
