Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Analyse van ruwe en verwerkte Cyperi Rhizoma-monsters met behulp van vloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometrie bij ratten met primaire dysmenorroe

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

Summary

Hier wordt een vergelijkende analyse van ruwe en verwerkte Cyperi rhizoma (CR) monsters gepresenteerd met behulp van ultra-high performance vloeistofchromatografie-hoge resolutie tandem massaspectrometrie (UPLC-MS / MS) bij ratten met primaire dysmenorroe. De veranderingen in de bloedspiegels van de metabolieten en de bestanddelen van het monster werden onderzocht tussen ratten behandeld met CR en CR verwerkt met azijn (CRV).

Abstract

Cyperi rhizoma (CR) wordt veel gebruikt in de gynaecologie en is een algemeen geneesmiddel voor de behandeling van vrouwenziekten in China. Omdat het analgetische effect van CR wordt versterkt na verwerking met azijn, wordt CR verwerkt met azijn (CRV) over het algemeen klinisch gebruikt. Het mechanisme waarmee het pijnstillende effect wordt versterkt door azijnverwerking is echter onduidelijk. In deze studie werd de ultrahoge druk vloeistofchromatografietandem massaspectrometrie (UPLC-MS/MS) techniek gebruikt om veranderingen in de bloedspiegels van de exogene bestanddelen en metabolieten tussen CR-behandelde en CRV-behandelde ratten met dysmenorroe te onderzoeken. De resultaten onthulden verschillende niveaus van 15 bestanddelen en twee metabolieten in het bloed van deze ratten. Onder hen waren de niveaus van (-)-myrtenol en [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]azijnzuur in de CRV-groep aanzienlijk hoger dan in de CR-groep. CRV verminderde het niveau van 2-serie prostanoïden en 4-serie leukotriënen met pro-inflammatoire, bloedplaatjesaggregatie en vasoconstrictieactiviteiten en zorgde voor pijnstillende effecten door het moduleren van arachidonzuur en linolzuurmetabolisme en de biosynthese van onverzadigde vetzuren. Deze studie toonde aan dat azijnverwerking het pijnstillende effect van CR verbetert en bijdraagt aan ons begrip van het werkingsmechanisme van CRV.

Introduction

Primaire dysmenorroe (PD) is de meest voorkomende aandoening in de klinische gynaecologie. Het wordt gekenmerkt door rugpijn, zwelling, buikpijn of ongemak voor of tijdens de menstruatie zonder bekkenpathologie in het voortplantingssysteem1. Een rapport over de prevalentie toonde aan dat 85,7% van de studenten lijdt aan PD2. Lage dosis orale anticonceptiva zijn de standaardtherapie, maar hun nadelige bijwerkingen, zoals diepe veneuze trombose, hebben steeds meer aandacht getrokken3. De prevalentie van diepe veneuze trombose onder gebruikers van orale anticonceptiva is >1 per 1.000 vrouwen, en het risico is het hoogst tijdens de eerste 6-12 maanden en bij gebruikers ouder dan 40 jaar4.

Lang gebruikt in de traditionele Chinese geneeskunde (TCM), is Cyperi rhizoma (CR) afgeleid van de gedroogde wortelstok van de Cyperus rotundus L. van de Cyperaceae-familie. CR reguleert menstruatiestoornissen en verlicht depressie en pijn5. CR wordt veel gebruikt in de gynaecologie en wordt beschouwd als een algemeen geneesmiddel voor de behandeling van vrouwenziekten6. CR verwerkt met azijn (CRV) wordt meestal klinisch gebruikt. In vergelijking met CRV toont CRV een verbeterde regulatie van menstruatie en pijnverlichting. Moderne studies hebben aangetoond dat CR cyclooxygenase-2 (COX-2) en de daaropvolgende synthese van prostaglandinen (PG's) remt, waardoor een ontstekingsremmend effect wordt bereikt. Ondertussen vertoont CR een analgetisch effect zonder bijwerkingen7, waardoor CR een goede keuze is voor dysmenorroepatiënten. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de regulering van de menstruatie en het verstrekken van pijnverlichting door CRV is echter onduidelijk. CR-onderzoek heeft zich voornamelijk gericht op veranderingen in de actieve chemische componenten en farmacologische activiteiten, zoals de ontstekingsremmende, antidepressieve en pijnstillende effecten 8,9,10,11,12.

Hoewel de ingrediënten van TCM complex zijn, worden ze opgenomen in het bloed en moeten ze een specifieke bloedconcentratie bereiken om effectief te zijn13. De reikwijdte van het screenen van de actieve ingrediënten van TCM kan worden beperkt door gebruik te maken van de strategie van samenstellingsbepaling in het bloed. Blindheid kan worden vermeden bij het bestuderen van de chemische componenten in vitro, en eenzijdigheid kan worden vermeden bij het bestuderen van de afzonderlijke bestanddelen14. Door de samenstellingen van CR en CRV in het bloed te vergelijken, kunnen veranderingen in de actieve ingrediënten van de verwerkte CR effectief en snel worden gedetecteerd. De werkzaamheid van geneesmiddelen is het proces waarbij een medicijn het lichaam beïnvloedt. Veranderingen in de geneesmiddelcomponenten als gevolg van de metabole respons van het lichaam, die mogelijk verband houden met het werkingsmechanisme van het medicijn, kunnen worden bepaald met metabonomics. Metabonomics is gericht op het meten van de algemene en dynamische metabole reacties, wat consistent is met het bepalen van de algehele werkzaamheid van de traditionele Chinese geneeskunde15. Bovendien zijn metabolieten het eindproduct van genexpressie, dat het nauwst verwant is aan fenotypen16. Metabonomics kan dus geschikt zijn voor het onderzoeken van de verschillen in de metabole routes tussen CR en CRV bij de behandeling van PD. Vloeistofchromatografie-hoge resolutie tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS)-gebaseerde ongerichte metabolomica wordt gekenmerkt door een hoge doorvoer, hoge gevoeligheid en hoge resolutie en kan worden gebruikt om veel verschillende kleine moleculaire componenten te meten17,18 . Deze methode kan tegelijkertijd de endogene metabolieten en exogene bestanddelen bepalen die in het bloed worden opgenomen. Metaboonomics is op grote schaal gebruikt in studies over TCM19, drug toxicologie 20, gezondheidsmanagement 21, sport22, voedsel 23 en andere gebieden.

In deze studie werden de verschillen in de exogene bestanddelen die in het bloed werden geabsorbeerd en de endogene metabolieten gemeten tussen CR-behandelde en CRV-behandelde dysmenorroe-modelratten met behulp van LC-MS / MS-gebaseerde ongerichte metabolomica om de mechanismen van de pijnstillende effecten van CRV te onthullen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle diergerelateerde experimenten werden uitgevoerd met goedkeuring van de Experiment Ethics Committee van het Chongqing Institute of TCM. Vierentwintig vrouwelijke Sprague Dawley-ratten (SD) die 8-10 weken oud waren en 200 g ± 20 g wogen, werden in dit experiment gebruikt.

1. Voorbereiding van de extractie

  1. Berekening
    1. Plan om het CR- of CRV-extract gedurende 3 dagen toe te dienen aan een behandelingsgroep van zes Sprague-Dawley-ratten (10 g/[kg∙dag]). Gebruik een CR- of CRV-extractconcentratie van 1 g / ml (1 ml van het extract wordt verkregen uit 1 g kruiden).
      OPMERKING: De dosering van CR is 6-10 g. In deze studie werd de maximale dosis van 10 g als dosering gebruikt. Aangezien het gemiddelde gewicht van een volwassen persoon 60 kg is, is de dosis voor volwassenen 0,1667 g / kg. Volgens het gewichtsconversiealgoritme24, aangezien de dosisconversiecoëfficiënt tussen mensen en ratten 6,3 is, is de dosering voor ratten 1,05 g / kg. De dosering van het geneesmiddel werd met 10 keer verhoogd tot 10,5 g / kg voor ratten. De dosering werd vastgesteld op 10 g / kg voor het gemak van de berekening en het eigenlijke experiment. Bijvoorbeeld, door de berekening, als in totaal 36 g CR of CRV nodig is, moet het Chinese kruidengeneesmiddel minstens twee keer worden bereid. Er was dus 200 g CR nodig- 100 g CR werd gebruikt als de CR en 100 g CR werd verwerkt tot CRV.
    2. Bereken het volume CR of CRV dat per rat moet worden toegepast met behulp van vergelijking (1):
      V = 10 g/(kg∙dag) × 200 g/(1 g/ml) = 2 ml (1)
  2. Verwerking van de CRV
    1. Meng 100 g CR en 20 g azijn (>5,5 g azijnzuur/100 ml) grondig en incubeer gedurende 12 uur.
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat het binnenste van de CR na 12 uur door azijn werd bevochtigd, werden de CR en azijn gemengd, goed geroerd en vervolgens opnieuw geroerd totdat het binnenste gedeelte vochtig was.
    2. Roerbak het mengsel in een ijzeren pan gedurende 10 minuten op 110-120 °C. Haal vervolgens het mengsel eruit en laat het afkoelen bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Om te voorkomen dat de CR verschroeit, is het noodzakelijk om continu te roeren tijdens het verwarmen. Als de verwerkte CRV te nat is, kan deze worden gedroogd bij 60 °C. Wanneer het oppervlak van de CR sepia is, kan het roerbakken worden gestopt.
  3. Extractie
    1. CR-extract
      1. Voeg 10 keer (de hoeveelheid CR) zuiver water toe aan de CR en laat 2 uur weken. Zorg ervoor dat de geneesmiddelen zich tijdens het weken onder het vloeistofniveau bevinden.
        OPMERKING: De CR hoeft alleen maar in tweeën te worden gesneden voordat deze wordt geëxtraheerd. Het doel van weken is om de actieve bestanddelen effectiever te extraheren. Het proces van weken is essentieel.
      2. Breng het mengsel van water en medicijnen op hoog vuur aan de kook en houd het 20 minuten koken op een laag vuur. Filtreer met een filterdoek (100 mesh) en vang het filtraat op.
        OPMERKING: Bij het afkooksel werd een hoog vuur gebruikt voor het koken en een laag vuur om het koken te behouden.
      3. Herhaal stap 1.3.1.2 eenmaal en combineer de filtraten.
      4. Concentreer het extract met een roterende verdamper tot 1 g/ml (op basis van het oorspronkelijke geneesmiddel moet de concentratietemperatuur lager zijn dan 60 °C).
        OPMERKING: De actieve componenten in CR zijn vluchtig, dus de concentratietemperatuur mag niet hoger zijn dan 60 °C.
    2. CRV-extract
      1. Voer dezelfde stappen (1.3.1.1-1.3.1.3) uit als voor de CR-extractiemethode.
    3. CR-extract voor testen
      1. Pipetteer 500 μL van het CR-extract en 500 μL methanol in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en vortex gedurende 30 s om te mengen.
        OPMERKING: Een mengsel van methanol en water extraheert de actieve componenten beter. Het extract mag niet direct worden gefilterd voor testen.
      2. Centrifugeer elk monster gedurende 15 minuten bij 1,6502 × g bij 4 °C. Filter het supernatant en breng het vervolgens over naar de injectieflacon met het monster om te testen.
        OPMERKING: Na de snelle centrifugatie van het mengsel van methanol en extract kan het supernatant direct in de monsterfles worden overgebracht voor bepaling zonder filtratie. Vanwege de warmte die door het centrifugatieproces wordt gegenereerd, heeft het de voorkeur om een cryogene centrifuge te gebruiken.
    4. CRV-extract voor testen
      1. Voer de stappen 1.3.3.1-1.3.3.2 uit om het CRV-extract voor te bereiden voor het testen.

2. Dieren

  1. Berekening
    1. Neem 50 mg oestradiolbenzoaat en voeg het toe aan 50 ml olijfolie om een oplossing van 1 mg / ml te bereiden. Neem 50 mg oxytocine en voeg het toe aan 50 ml normale zoutoplossing om een oplossing van 1 mg / ml te bereiden.
      OPMERKING: De dosis van de intraperitoneale injectie van oestradiolbenzoaat en oxytocine is 10 mg/(kg∙dag). Estradiolbenzoaat wordt opgelost in olijfolie en oxytocine wordt opgelost in een normale zoutoplossing. Estradiolbenzoaat is niet gemakkelijk op te lossen in olijfolie en kan worden behandeld met echografie om het oplossen te versnellen. Zowel de oestradiolbenzoaat als de oxytocine-oplossingen moeten dagelijks worden bereid.
    2. Bereken het volume oestradiolbenzoaatoplossing dat per rat moet worden aangebracht (d.w.z. V = 10 mg/[kg∙dag] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml). Bereken het volume oxytocine-oplossing dat per rat moet worden aangebracht (d.w.z. V = 10 mg/[kg∙dag] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml).
  2. Groepering en toediening van dieren
    OPMERKING: Tien dagen werden toegewezen voor administratie25,26. Tijdens de behandeling hadden de ratten onbeperkte toegang tot standaard chow en water. Binnen 30 minuten na toediening van oxytocine werd de kronkelende activiteit van elke rat gevolgd. Het PD-rattenmodel werd met succes ontwikkeld, zoals blijkt uit de draaireacties van de modelratten, waaronder samentrekking van de baarmoeder, rotatie van één ledemaat, extensie van de achterpoten, een holle romp en buikcontractie26.
    1. Wijs 24 vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten (SD-ratten, 8-10 weken oud, met een gewicht van 200 g ± 20 g) toe aan vier groepen bij willekeurige controle, model, CR en CRV - en voed ze gedurende 7 dagen.
    2. Administratie van dieren
      1. Injecteer ratten in de model-, CR- en CRV-groepen intraperitoneaal elke dag met 2 ml oestradiolbenzoaatoplossing. Injecteer de ratten in de controlegroep intraperitoneaal met 2 ml normale zoutoplossing.
      2. Voltooi vanaf dag 8 stap 2.2.2.1. Dien vervolgens intragastrisch 2 ml CRV-extract toe aan de ratten in de CRV-groep, 2 ml CR-extract aan de ratten in de CR-groep en 2 ml normale zoutoplossing aan de ratten in de controle- en modelgroepen.
      3. Voltooi op dag 10 stap 2.2.2.2. Injecteer vervolgens intraperitoneaal de ratten in de model-, CR- en CRV-groepen met 2 ml oxytocine-oplossing en de ratten in de controlegroep met 2 ml normale zoutoplossing.
    3. Noteer de kronkeltijden van de ratten binnen 30 minuten na de oxytocine-injectie.
  3. Monsterverzameling
    1. Verzamel abdominale aorta-bloedmonsters, snijd de baarmoeder snel en volledig weg en scheid zorgvuldig het bindweefsel en vet dat zich aan de baarmoederwand hecht.
      OPMERKING: Bloed werd verzameld zo dicht als binnen 1 uur na de laatste dosis.
    2. Gebruik microcentrifugebuizen om het baarmoederweefsel te bewaren en over te brengen naar vloeibare stikstof. Bewaar de weefselmonsters bij −80 °C.
    3. Centrifugeer de bloedmonsters gedurende 10 minuten bij 4.125 × g. Verwijder het serumbevattende supernatant en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 16.502 × g . Centrifugeer het serum en houd het vervolgens in de buis bij −80 °C voor opslag.
      OPMERKING: De bloedmonsters moeten gedurende 1 uur bij kamertemperatuur worden bewaard voor herverwerking.
  4. Monsterverwerking
    1. Serummonsters
      1. Doe 400 μL methanol en 200 μL serum in een microcentrifugebuis en draaikolk gedurende 30 s om te mengen. Centrifugeer elk monster gedurende 15 minuten bij 16,502 × g bij 4 °C. Vul monsterflessen met het supernatant na verzameling en filtratie. Meng alle supernatanten van elk monster met hetzelfde volume om kwaliteitscontrolemonsters voor te bereiden voor testen.
    2. Baarmoederweefselmonsters
      1. Neem 100 mg baarmoederweefsel uit het ipsilaterale segment en maal het met een negenvoudig volume van de normale zoutoplossing. Centrifugeer het homogenaat gedurende 10 minuten bij 4,125 × g en verzamel het supernatant. Plaats het supernatant in een koelkast bij 4 °C om te testen of bij −80 °C als het niet op dezelfde dag moet worden getest.
      2. Plaats normale zoutoplossing, weefsel en stalen ballen in een microcentrifugebuis van 2 ml, plaats de microcentrifugebuis gedurende 3-5 s in vloeibare stikstof en plaats het weefsel vervolgens in een weefselmolen om te malen.
  5. Testen van monsters
    1. Gebruik een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) om het PGF2α - en PGE2-gehalte in de baarmoederweefsels van de rattenmonsters te meten.
      OPMERKING: De rat PGE 2 ELISA-kit werd gebruikt om het PGE 2-gehalte te meten en de rat PGF2α ELISA-kit werd gebruikt om het PGF 2α-niveau te meten. De gedetailleerde stappen zijn te vinden in de instructies van de fabrikant. De details van de kit worden gegeven in de Tabel met materialen.
    2. Beoordeel het serummonster, het CR-extract en het CRV-extract met behulp van UPLC-MS/MS.
      1. Gebruik voor UPLC een C18-kolom (2,6 μm, 2,1 mm x 100 mm) en een binaire gradiëntmethode met mobiele fase A met 0,1% mierenzuur en mobiele fase B met acetonitril. Stel het elutieverloop als volgt in: van 0 min tot 1 min, 15% B; van 1 min tot 8,5 min, 15% tot 85% B; van 8,5 min tot 11,5 min, 85% B; van 11,5 min tot 11,6 min, 99% tot 1% B; en van 11,6 min tot 15 min, 15% B. Stel het debiet in op 0,35 ml/min en het injectievolume op 2 μl.
      2. Stel voor MS de temperatuur in op 600 °C, het gordijngasdebiet (CUR) op 0,17 MPa en zowel de mantel- als hulpgasdebieten op 0,38 MPa. Stel de ionensproeispanning van de positieve ionmodus en de negatieve ionmodus in op respectievelijk 5,5 kV en −4,5 kV, de declusteringspotentiaal (DP) spanning op 80 V of −80 V, de botsingsenergie (CE) op 40 eV of −25 eV en de botsingsenergiesuperpositie (CES) op 35 eV ± 15 eV.
      3. Voer de test uit volgens het protocol van de fabrikant met behulp van UPLC-MS/MS. Voer MS uit voor een massabereik van 50-1.000 m/z.
      4. Verkrijg de UPLC-MS/MS-resultaten met behulp van het bijpassende werkstationprogramma in combinatie met de informatieafhankelijke acquisitie van de detectiemodus, het filter voor meerdere massadefecten en de dynamische achtergrondaftrek. Gebruik de kwaliteitscontrolemonsters van gepoold serum om de herhaalbaarheid en stabiliteit van de UPLC-MS/MS-apparatuur te testen om de conventionele aanpak te verifiëren. Injecteer vóór de onderzoeksmonsters de kwaliteitscontrolemonsters gedurende vier opeenvolgende runs en injecteer ze vervolgens na elke vijf serummonsters.

3. Gegevensverwerking

  1. Voorbereiding van gegevens
    1. Gebruik conversiesoftware om de onbewerkte gegevens naar het mzXML-formaat te converteren. Normaliseer de totale ionenstroom (TIC) gegevens van elk monster.
      OPMERKING: Een interne R-gebaseerde toepassing (www.lims2.com) gebouwd op XCMS werd gebruikt om de informatie voor de integratie, uitlijning, extractie en piekdetectiete analyseren 27.
    2. Voer metabolitannotatie uit met behulp van een eigen MS2-database (www.lims2.com). Stel de annotatiedrempel in op 0,328.
      OPMERKING: De endogene metabolieten werden in elke groep geïdentificeerd.
  2. Hoofdcomponentenanalyse en orthogonale partiële kleinste kwadratische discriminantanalyse
    1. Gebruik analysesoftware om de principal component analysis (PCA) en de modellering uit te voeren. Importeer de gestandaardiseerde gegevens van de metabolieten naar de analysesoftware. Gebruik vervolgens autofit om het analysemodel te bouwen. Gebruik ten slotte de score om de scorespreidingsplot van de PCA te verkrijgen.
      OPMERKING: De clustering van elke groep werd verkregen met de score scatter plot van de PCA. PCA is een onbewaakte analysemodus die de monsters voornamelijk groepeert door middel van dimensiereductie zonder interventie.
    2. Gebruik de analysesoftware om de orthogonale partiële kleinste kwadratische discriminantanalyse (OPLS-DA) uit te voeren.
      1. Importeer de gestandaardiseerde gegevens over de metabolieten in de CR- en CRV-groepen in de analysesoftware.
      2. Importeer de gegevens uit de CR-groep in de gemaakte CR-groep en importeer de gegevens uit de CRV-groep in de gemaakte CRV-groep.
        OPMERKING: OPLS-DA is een gecontroleerde analysemodus en het groeperen van de monsters is noodzakelijk.
      3. Gebruik vervolgens autofit om het analysemodel te bouwen en gebruik de score om de scorespreidingsplot van de OPLS-DA te verkrijgen. Gebruik ten slotte VIP om de variabele significantie in de projectiewaarde ( VIP ) in de OPLS-DA te verkrijgen.
        OPMERKING: De variabele significantie in de projectiewaarden (VIP) van de metabolieten in de CR- en CRV-groepen werd verkregen via de OPLS-DA.
  3. Identificatie van de potentiële differentiële metabolieten
    1. Screen de metabolieten met VIP-waarden groter dan 1 in stap 3.2.2.3.
    2. Gebruik statistische software om de P-waarde te berekenen van de metabolieten die in stap 3.3.1 zijn gescreend door de t-test van de student.
      OPMERKING: Significante verschillen in de potentiële differentiële metabolieten in de CR- en CRV-groepen werden bepaald door een student's t-test. De potentiële differentiële metabolieten waren die met een Student's t-test p-waarde < 0,05 en een variabele significantie in de projectie (VIP) groter dan 1. De voorstelling werd bereikt met behulp van een vulkanisch complot.
  4. Identificatie van de differentiële metabolieten
    1. Screen de potentiële differentiële metabolieten in stap 3.3. Gebruik de resultaten van stap 3.1.2 om deze differentiële metabolieten te identificeren.
      OPMERKING: Een klein aantal potentiële differentiële metabolieten werd geïdentificeerd en zij werden de kandidaat-differentiële metabolieten.
    2. Screen de differentiële metabolieten die moeten worden gematcht in de KEGG-database. Toon de veranderingen in de differentiële metabolieten in de CR- en CRV-groepen door een heatmap te tekenen.
      OPMERKING: Een klein aantal kandidaat-differentiële metabolieten werd gematcht en ze werden de differentiële metabolieten.
  5. Onderzoek van de potentiële metabole routes
    1. Upload de verschillende metabolieten naar de Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca) database.
    2. Gebruik Pathways Analysis om de potentiële metabole routes te verkrijgen.
      OPMERKING: De potentiële metabole routes werden verkregen in de CR- en CRV-groepen. De P-waarde en impactwaarde waren twee zeer belangrijke indicatoren bij de selectie van de kritieke trajecten. De P-waarde was belangrijker dan de impactwaarde. Significantie werd gedefinieerd door een P-waarde < 0,05; Grotere impactwaarden werden geassocieerd met betere correlaties.
    3. Analyseer de potentiële metabole routes door de verschillende metabolieten te uploaden naar de KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) database.
      OPMERKING: De relatie tussen de functie van de metabole route en PD moet ook worden overwogen. De kritische metabole routes werden verkregen.
  6. Identificatie van de bestanddelen die in het bloed worden opgenomen
    1. Identificeer de chemische bestanddelen in de CR- en CRV-extracten met behulp van de interne MS2-database (www.lims2.com), de Human Metabolome Database (HMDB) en de Massbank- en Chemspider-databases.
    2. Bepaal de bestanddelen die in het bloed worden opgenomen in de CR- en CRV-groepen en vergelijk de bestanddelen tussen de CR- en CRV-groepen.
      OPMERKING: De bestanddelen die in het bloed worden opgenomen, moeten worden gedetecteerd in de CR- of CRV-groepen, maar kunnen niet worden gedetecteerd in de controlegroep.
  7. Statistische analyse
    1. Analyseer de gegevens met behulp van univariate analyse (UVA) en multivariate statistische methoden, waaronder de variantieanalyse (ANOVA) en de t-test van de student.
      OPMERKING: De experimentele informatie werd gepresenteerd met behulp van statistische software als gemiddelde ± standaarddeviatie (±SD). P < 0,01 werd beschouwd als een zeer significant verschil en P < 0,05 vertegenwoordigde een significant verschil28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analyse van het dysmenorroe model experiment
Er was geen kronkelende respons binnen 30 minuten in de controlegroep omdat deze ratten niet intraperitoneaal werden geïnjecteerd met oxytocine en oestradiolbenzoaat om pijn te veroorzaken. De ratten in de model-, CR- en CRV-groepen vertoonden aanzienlijke kronkelende reacties na de oxytocine-injectie. Deze uitkomsten tonen de werkzaamheid aan van de combinatie van oestradiolbenzoaat en oxytocine voor het induceren van dysmenorroe. De verschillen in de PGF 2α-, PGE 2- en PGF2α/PGE 2-niveaus tussen het model en de controlegroepen waren significant (P < 0,001, P < 0,05), wat de werkzaamheid van het model aantoont (figuur 1).

Figure 1
Figuur 1: Het PGF 2α en PGE2 gehalte in het baarmoederweefsel en het kronkelende getal in elke groep. (A) Het PGF2-α gehalte in het baarmoederweefsel in elke groep. (B) Het PGE2-gehalte in het baarmoederweefsel in elke groep. (C) Het PGF 2 α/PGE2-gehalte in het baarmoederweefsel in elke groep. (D) Het kronkelende getal in elke groep. De kolommen vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM van vier groepen (zes muizen per groep). * P < 0,05 of ** P < 0,01 vertegenwoordigen een significant verschil ten opzichte van de modelgroep, en Δ P < 0,05 of ΔΔ P < 0,01 vertegenwoordigen een significant verschil ten opzichte van de CR-groep. De ratten in de model-, CR- en CRV-groepen vertoonden een aanzienlijke kronkelende reactie na de oxytocine-injectie. Afkortingen: PG = prostaglandine; CR = Cyperi wortelstok; CRV = CR verwerkt met azijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De concentraties van PGF 2α en PGF2α/PGE2 waren verlaagd in de CRV- en CR-groepen, en deze afname was meer uitgesproken in de CRV-groep. Er waren ook significante (P < 0,001 en P < 0,05) verschillen in de concentraties van PGF 2α en PGF2α/PGE2 tussen de CRV- en de CR-groepen. In vergelijking met de modelgroep was de PGE2-concentratie significant groter in de CRV- en CR-groepen (P < 0,001), waarbij het niveau het meest toenam in de CRV-groep.

Kwaliteitscontrole
Er werd een goede overeenkomst waargenomen tussen de retentietijden van de BPC-chromatografische pieken en signaalintensiteiten in de kwaliteitscontrolemonsters, wat een hoge mate van instrumentstabiliteit en opmerkelijk consistente gegevenskwaliteit aantoont (aanvullend dossier 1-aanvullende figuur 1 en aanvullende figuur 2). Bovendien lagen alle kwaliteitscontrolemonsters binnen ±2 standaardafwijkingen (figuur 2A,B) en was de correlatie tussen de kwaliteitscontrolemonsters groter dan 0,7 (figuur 2C,D). Deze resultaten suggereren dat de procedure betrouwbaar was en dat de resultaten geloofwaardig waren.

Figure 2
Figuur 2: PCA-X eendimensionale verdeling van de kwaliteitscontrolemonsters. (A) positieve modus, (B) negatieve modus; correlatieanalyse van de kwaliteitscontrolemonsters in (C) positieve modus en (D) negatieve modus. Alle kwaliteitscontrolemonsters lagen binnen ±2 standaardafwijkingen en de correlaties tussen de kwaliteitscontrolemonsters waren groter dan 0,7. Deze resultaten suggereerden dat de procedure betrouwbaar was en dat de informatie geloofwaardig was. Afkortingen: PC = hoofdcomponent; PCA = analyse van de hoofdcomponenten; kwaliteitscontrole; CR = Cyperi wortelstok; CRV = CR verwerkt met azijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Analyse van hoofdcomponenten
Zoals weergegeven in figuur 3, gaf de abscis-PC (1) de scores van de eerste hoofdcomponenten aan, terwijl de ordinaat PC (2) de scores van de tweede hoofdcomponenten aangaf. In de afbeelding geeft de groene cirkel de controlegroep aan, de rode cirkel de modelgroep, de blauwe cirkel de CR-groep, de witte cirkel de CRV-groep en de roze cirkel de kwaliteitscontrolegroep.

Figure 3
Figuur 3: Score spreidingsdiagram van de PCA . (A) Positieve modus en (B) negatieve modus. De monsters van de kwaliteitscontrole overlappen elkaar, wat aangeeft dat het instrument zeer stabiel was. Elke groep is verdeeld in zijn eigen gebied, waarbij alleen de CR-groep en de CRV-groep af en toe paden kruisen. Afkortingen: PC = hoofdcomponent; PCA = analyse van de hoofdcomponenten; QC = kwaliteitscontrole; CR = Cyperi wortelstok; CRV = CR verwerkt met azijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De resultaten van de PCA-analyse toonden aan dat de clusters van de CR en de modelgroepen significant gescheiden waren in zowel de positieve als de negatieve ionenmodus. De clusters waren significant gescheiden tussen de CRV en modelgroepen in de positieve en negatieve ionenmodi. De kwaliteitscontrole-, model- en controlegroepen werden gescheiden van de andere behandelingsgroepen (CR, CRV). De CR- en CRV-groepen overlapten elkaar af en toe in de positieve ionenmodus. In de negatieve ionenmodus werd elke groep aanzienlijk gescheiden.

Orthogonale partiële kleinste kwadraten methode discriminante analyse
OPLS-DA werd gebruikt om te screenen op metabole verschillen. De OPLS-DA scatter plot toonde aan dat alle monsters zich binnen het 95% betrouwbaarheidsinterval bevonden (Hotelling's T-square ellips). Figuur 4A,C toont aan dat de CR- en CRV-groepen gescheiden waren. Model overfitting werd getest met behulp van de permutatietest (n = 200) en de statistische significantie van het model werd beoordeeld. In figuur 4B,D geeft de ordinaat de waarde van R 2 Y of de Q2-waardeweer en de abscis geeft de vervangende retentie aan. R 2Y wordt weergegeven door de groene stip, Q2 wordt weergegeven door de blauwe vierkante stip en de twee stippellijnen vertegenwoordigen hun overeenkomstige regressielijnen. In de positieve en negatieve modi waren de R 2 Y-waarden 0,8 en 0,84 en de Q2-waardenrespectievelijk -0,59 en -0,57. Dit toont de hoge betrouwbaarheid van het model en de afwezigheid van overfitting.

Figure 4
Figuur 4: OPLS-DA modellen voor de CR groep versus de CRV groep. Score spreidingsplot in (A) positieve modus en (C) negatieve modus. Permutatietest van het OPLS-DA-model voor de CR-groep versus de CRV-groep in (B) positieve modus en (D) negatieve modus. R 2Y was 0,8 en 0,84, en Q2 was −0,59 en −0,57 in respectievelijk de positieve en negatieve modus. Dit toont de hoge betrouwbaarheid van het model en de afwezigheid van overfittingsgedrag. Afkortingen: OPLS-DA = orthogonale partiële kleinste kwadraten discriminante analyse; CR = Cyperi wortelstok; CRV = CR verwerkt met azijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Univariate statistische analyse
Univariate statistische analyses werden uitgevoerd om metabole variaties te identificeren. Onder de standaardscreening van VIP > 1 en P < 0,05, 339 en 394 potentiële differentiële metabolieten werden gedetecteerd in respectievelijk de positieve en negatieve ionenmodus. Een vulkaanplot is weergegeven in figuur 5, waarbij elk punt overeenkomt met een andere metaboliet. De ordinaat toont de P-waarde van de T-toets van de Student en de abscis weerspiegelt meerdere veranderingen in het niveau van elk molecuul in de groep. De spreidingsgrootte vertegenwoordigt de VIP-waarde van het OPLS-DA-model; de VIP-waarde neemt toe met de grootte van de scatter. De rode stippen geven een toename aan, de blauwe stippen geven een afname aan en de grijze geeft geen significant verschil aan.

Een kwalitatieve analyse van de kandidaat-differentiële metabolieten werd uitgevoerd met behulp van secundaire massaspectrometrie. Significante veranderingen werden waargenomen in 63 metabolieten in positieve modus (aanvullend dossier 1-aanvullende tabel 1) en in 30 metabolieten in negatieve modus (aanvullend dossier 1-aanvullende tabel 2). De differentiële metabolieten werden bepaald met behulp van de KEGG- en HDMB-databases. De nauwkeurig overeenkomende verbindingen werden geïdentificeerd als differentiële metabolieten en deze zijn vermeld in tabel 3 en tabel 4.

Figure 5
Figuur 5: Vulkaanplot voor de CR-groep versus de CRV-groep . (A) Positieve modus en (B) negatieve modus. In de weergegeven vulkaangrafiek komt elk punt overeen met een andere metaboliet. De ordinaat toont de P-waarde van de T-toets van de Student en de abscis weerspiegelt de meerdere veranderingen in elke stof in de groep. De spreidingsgrootte vertegenwoordigt de VIP-waarde van het OPLS-DA-model. De VIP-waarde neemt toe met de grootte van de scatter. Rode stippen geven stijgingen aan, blauwe stippen geven dalingen aan en grijs geeft geen significante verschillen aan. Afkortingen: OPLS-DA = orthogonale partiële kleinste kwadraten discriminante analyse; VIP = variabele significantie in de projectie; CR = Cyperi wortelstok; CRV = CR verwerkt met azijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Metabolietvergelijkingen
De Euclidische afstandsmatrix van de kwantitatieve waarden van de differentiële metabolieten tussen de CR- en CRV-groepen werd berekend en de differentiële metabolieten werden geclusterd met behulp van een uitgebreide correlatiebenadering.

De abscis vertegenwoordigt verschillende experimentele groepen, terwijl de ordinaat het relatieve niveau in figuur 6 vertegenwoordigt. De plaatsing van de kleurvlakken geeft aan hoe elke metaboliet tot expressie komt ten opzichte van de andere. In de positieve ionenmodus, vergeleken met de CR-groep, namen de niveaus van vier differentiële metabolieten in de CRV-groep toe, terwijl de niveaus van 11 differentiële metabolieten afnamen. In de negatieve ionenmodus, vergeleken met de CR-groep, namen de niveaus van vier differentiële metabolieten in de CRV-groep toe en daalden de niveaus van 7 differentiële metabolieten.

Figure 6
Figuur 6: Heatmapanalyse voor de CRV-groep versus de CR-groep . (A) Positieve modus en (B) negatieve modus. De abscis vertegenwoordigt de verschillende experimentele groepen en de ordinaat vertegenwoordigt de relatieve expressieniveaus. De plaatsing van de kleurvlakken geeft aan hoe elke metaboliet tot expressie komt ten opzichte van de andere. Afkortingen: CR = Cyperi wortelstok; CRV = CR verwerkt met azijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Vergeleken met de CR-groep waren de metabolieten die in de CRV-groep toenamen sfingosine 1-fosfaat, nobiletine, glycerofosfocholine, lysopc (18: 1 (9z)), 2-hydroxy-6-pentadecylbenzoëzuur, 9,10-epoxyoctadeceenzuur, 13s-hydroxyoctadecadienoic acid en 2-methoxyestrone, terwijl degenen die daalden corticosteron, indoolazijnzuur, glycocholzuur, berberine, dibutylftalaat, retinol, leukotrieen B4, prostaglandine J2, 21-hydroxypregnenolone, zeranol, homocysteïne, propynoïnezuur waren, stearinezuur, docosahexaeenzuur, fenylacetylglycine, L-fenylalanine, oestronglucuronide en citroenzuur (figuur 7).

Figure 7
Figuur 7: De relatieve niveautrends van de potentiële metabolieten in de CRV- en CR-groepen . (A) Positieve modus en (B) negatieve modus. In de positieve modus, vergeleken met de CR-groep, namen de niveaus van vier differentiële metabolieten toe in de CRV-groep en daalden de niveaus van 11. In de negatieve modus namen de niveaus van vier differentiële metabolieten toe in de CRV-groep en daalden de niveaus van zeven differentiële metabolieten. De kolommen vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM van vier groepen (zes muizen per groep). * P < 0,05, ** P < 0,01, of *** P < 0,01 vertegenwoordigen een significant verschil tussen de CRV- en CR-groepen. Afkortingen: CR = Cyperi wortelstok; CRV = CR verwerkt met azijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

KEGG pathway analyse
De differentiële metabolieten werden geannoteerd en de KEGG-routes werden geanalyseerd. De resultaten toonden aan dat de differentiële metabolieten geassocieerd waren met negen routes in respectievelijk de positieve en negatieve modus (tabel 1 en tabel 2). In figuur 8 worden de metabole routes elk weergegeven door een bel in het bellendiagram, waarbij een meer significante schaal een grotere effectfactor aangeeft. De grootte van het pad dat de factoren in de topologieanalyse beïnvloedt, wordt weergegeven door de abscis van het bellendiagram en de bubbelgrootte. De ordinaat van het bellendiagram en de bellenkleur geven de P-waarde van de verrijkingsanalyse aan (waarbij de negatieve natuurlijke logaritme wordt genomen, d.w.z. −ln (p)). De mate van verrijking is belangrijker, de P-waarde is kleiner, de ordinaatwaarde is prominenter en de kleur is donkerder. De P-waarde en impactwaarde zijn twee zeer belangrijke indicatoren bij de selectie van kritieke trajecten. Over het algemeen is de P-waarde belangrijker dan de impactwaarde.

Figure 8
Figuur 8: Pathway-analyse voor de CRV-groep versus de CR-groep . (A) Positieve modus en (B) negatieve modus. De metabole routes worden elk weergegeven door een bel in het bellendiagram. De abscis van het bellendiagram en de bubbelgrootte geven de grootte aan van de padbeïnvloedende factoren in de topologieanalyse. De ordinaat van het bellendiagram en de bellenkleur geven de P-waarde van de verrijkingsanalyse aan. De belangrijkste metabole routes omvatten de biosynthese van onverzadigde vetzuren en linolzuurmetabolisme. Afkortingen: CR = Cyperi wortelstok; CRV = CR verwerkt met azijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 3 en tabel 4 tonen metabole routes met significante verschillen- fenylalaninemetabolisme en linolzuurmetabolisme, evenals de biosynthese van onverzadigde vetzuren, fenylalanine, tyrosine en tryptofaan. Hoewel de metabole routes steroïde hormoonbiosynthese, sfingolipide en arachidonzuurmetabolisme omvatten, waren er geen significante verschillen, die verband hielden met dysmenorroe. De resultaten toonden aan dat linolzuurmetabolisme en de biosynthese van onverzadigde vetzuren de kritieke metabole routes waren die geassocieerd waren met de verhoogde werkzaamheid van CRV.

Bestanddelen opgenomen in het bloed
Vijftien bestanddelen en twee producten van het metabolisme van de CRV- en CR-extracten werden gedetecteerd in het rattenserum in de CR- en CRV-groepen (tabel 5). Alle 17 componenten werden gevonden in positieve ionenmodus.

De relatieve samenstellende niveaus in de bloedmonsters van de twee groepen werden vergeleken met behulp van de student's t-test. De abscis in figuur 9 toont verschillende experimentele groepen; De ordinaat vertegenwoordigt de responswaarde van het massaspectrum. Er waren twee componenten met significante verschillen. De analyse toonde aan dat de niveaus van deze twee componenten verhoogd waren in de CRV-groep in vergelijking met de CR-groep, terwijl de niveaus van 15 elementen geen significante veranderingen vertoonden.

Figure 9
Figuur 9: Bestanddelen opgenomen in het bloed voor de CRV-groep versus de CR-groep. Er waren 15 bestanddelen en twee producten van het metabolisme van de CRV- en CR-extracten in het rattenserum in de CR- en CRV-groepen. De analyse toonde aan dat de bloedspiegels van twee componenten verhoogd waren in de CRV-groep in vergelijking met de CR-groep, terwijl de bloedspiegels van 15 componenten geen significante veranderingen vertoonden. Onder hen was het niveau van (-)-myrtenol en [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]azijnzuur in de CRV-groep aanzienlijk hoger dan in de CR-groep. * P < 0,05 of ** P < 0,01 vertegenwoordigen een significant verschil tussen de CRV-groep en de CR-groep. Afkortingen: CR = Cyperi wortelstok; CRV = CR verwerkt met azijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Metabole verschillen in positieve modus. Afkortingen: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; VIP = variabele significantie in de projectie; RT = bewaartijd. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Metabole verschillen in negatieve modus. Afkortingen: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; VIP = variabele significantie in de projectie; RT = bewaartijd. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Metabole routeanalyse in positieve modus. Afkorting: KEGG = Kyoto Encyclopedie van Genen en Genomen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4 Metabole routeanalyse in negatieve modus. Afkorting: KEGG = Kyoto Encyclopedie van Genen en Genomen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: Identificatie van de prototype ingrediënten en metabolieten in rattenserum. Opmerking: M1 en M2 zijn metabolieten; Andere bestanddelen zijn prototype-ingrediënten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend dossier 1: BPC-diagrammen en MS 2-chromatogram van de bestanddelen die in het bloed van naakte muizen worden opgenomen. BPC-diagrammen van alle kwaliteitscontrolemonsters in positieve en negatieve modi; MS 2-chromatogram van de 17 bestanddelen die in het bloed van de ratten worden opgenomen: D-kamfeen, (-)-myrtenol, ethylparaben, calameneen, α-cyperon, (+)-nootkaton, (1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]azijnzuur, 4-(2-(2.2.1)-bicycloheptylmethyl)benzoëzuur, 10,12-peroxycalameneen, (1aS,10aR)-1a,5,9-trimethyl-1a,3,6,10a-tetrahydrooxireno[4,5]cyclodeca[1,2-b]furan-10(2H)-one, pterosine D, terrecyclisch zuur, sugeonylacetaat, 3-acetyl-13-deoxyphomenoom, isocurcumenol, ligucyperonol, procurcumadiol. De differentiële metabolieten geïdentificeerd door secundaire massaspectrometrie, evenals de HDMB- en KEGG-databases, in de positieve en negatieve ionmodi zijn ook opgenomen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vanwege de grote verscheidenheid en verschillende aard van TCM's werken deze kruiden soms niet in de klinische praktijk, en dit kan te wijten zijn aan de onjuiste verwerking en decocting van TCM's. De mechanismen van TCM worden duidelijker met het gebruik van hedendaagse wetenschap en technologie29,30. Deze studie toont aan dat zowel CR als CRV therapeutische effecten hebben bij PD-modelratten en dat het therapeutische effect van CRV substantiëler is. Het werkingsmechanisme van CRV kan verband houden met het feit dat azijnverwerking de bestanddelen van CR kan beïnvloeden die in het bloed worden opgenomen en kan worden geassocieerd met linolzuurmetabolisme en de biosynthese van onverzadigde vetzuren. Figuur 10 toont de potentiële paden van de werking van CRV bij pijnverlichting.

Figure 10
Figuur 10: Mechanismen van het versterkte analgetische effect van CRV. De resultaten toonden aan dat 15 bestanddelen en twee metabolieten in het bloed werden gevonden. Onder hen waren de niveaus van (-)-myrtenol en [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]azijnzuur in de CRV-groep aanzienlijk hoger dan in de CR-groep. CRV kan het niveau van 2-serie prostanoïden en 4-serie leukotriënen gemaakt van ARA verminderen en pijnstillende effecten bereiken via de modulatie van arachidonzuurmetabolisme, de biosynthese van onverzadigde vetzuren en linolzuurmetabolisme. Afkortingen: ARA = arachidonzuur; COX = cyclooxygenase; LA = linolzuur; PUFA = meervoudig onverzadigde vetzuren; GLA =γ-linoleenzuur; DGLA = dihomo-γ-linoleen; PD = primaire dysmenorroe; PG = prostaglandine; LT = leukotriënen; TX = tromboxaan; SDA = stearidonzuur; ETA = eicosatetetraeenzuur; EPA = eicosapentaeenzuur; CR = Cyperi wortelstok; CRV = CR verwerkt met azijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voorzorgsmaatregelen tijdens het experiment
Aangezien de olie van het effectieve bestanddeel van CR vluchtig is, mag de tijd voor het extraheren van de CR niet langer zijn dan 20 minuten en wanneer deze kookt, moet deze op een laag vuur zijn met een temperatuur van niet meer dan 60 °C tijdens de concentratie. Om de succesvolle extractie van de effectieve ingrediënten te garanderen, moeten de kruiden minstens 2 uur vóór het afkooksel in water worden gedrenkt, zodat de kruiden nat zijn wanneer het weken is voltooid. Tijdens de CR-verwerking moet de azijn goed gemengd worden met de kruiden, zodat de azijn er volledig in kan doordringen. Als het azijnvolume te laag is om de kruiden grondig nat te maken, kan een kleine hoeveelheid water worden toegevoegd om de azijn te verdunnen en vervolgens kan de azijn volledig met de kruiden worden gemengd. Wanneer het mengen is voltooid, zullen de kruiden alle azijn absorberen. Omdat azijn azijnzuur bevat, mag het mengsel niet in contact komen met ijzer om een chemische reactie te voorkomen.

In het rattenexperiment wordt de eerste intraperitoneale injectie van oestradiolbenzoaat gegeven op dag 10, vervolgens wordt de intragastrische toediening van het extract van CR of CRV gegeven en ten slotte wordt de intraperitoneale injectie van oxytocine toegediend. Na de intraperitoneale injectie van oxytocine wordt het dier gedurende 30 minuten geobserveerd en wordt onmiddellijk bloed afgenomen. Meestal bereikt de bloedconcentratie een piek binnen 1 uur na intragastrische toediening13, wat de beste tijd is om bloed af te nemen.

Bij het bepalen van de extract- en serummonsters met LC-MS/MS moeten deze in dezelfde batch worden bepaald om ervoor te zorgen dat de retentietijd van hetzelfde bestanddeel in verschillende monsters consistent is. In dit experiment was de identificatie van de componenten een moeilijk punt. Hoewel een relatief volwassen database kan worden gebruikt voor endogene metabolieten, was er geen overeenkomende database voor het identificeren van de bestanddelen die in het bloed zijn opgenomen, dus er moet meer zorg worden besteed aan de identificatie.

Verschillen in de bestanddelen die in het bloed worden opgenomen tussen de CR- en CRV-groepen
Om het werkzame bestanddeel van CR te bepalen, onderzocht dit experiment de bestanddelen die in het bloed werden opgenomen bij dysmenorroe-modelratten. In dit experiment bleek dat 15 bestanddelen en twee metabolieten in het bloed verschilden tussen de CR- en CRV-groepen. Onder hen waren de niveaus van (-)-myrtenol en [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]azijnzuur in de CRV-groep aanzienlijk hoger dan in de CR-groep, maar de niveaus van andere componenten waren niet significant verschillend. (-)-Myrtenol en [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]azijnzuur zijn terpenoïden en worden beschouwd als de effectieve componenten van CRV.

Ligucyperonol en procurcumadiol worden geproduceerd door de oxidatie van respectievelijk α-cyperon en isocurcumenol, en α-cyperon heeft een sterk analgetisch effect. Het voorgestelde werkingsmechanisme kan lps-geïnduceerde COX-2-expressie en PGE2-synthese verminderen door de negatieve regulatie van NF-kB-signalering31. (+)-Nootkaton remt ook COX-2 activiteit32,33. Isocurcumenol is de kerncomponent van Curcumae rhizoma bij de behandeling van dysmenorroe3, en de metaboliet procurcumadiol kan een analgetisch effect hebben. In vergelijking met de CR-groep vertoonde de CRV-groep aanzienlijk hogere niveaus van (-)-myrtenol, wat een analgetisch effect heeft34. Het mogelijke werkingsmechanisme kan zijn dat veranderingen in de expressie van COX-2 35 de niveaus van ontstekingsremmend cytokine (IL-10, IFN-γ) verhogen en de niveaus van pro-inflammatoire cytokines (TNF-α, IL-1β) niveaus36 verlagen. Verwerking met azijn verbetert de niveaus van de actieve ingrediënten in het bloed, wat de reden kan zijn waarom producten geproduceerd met azijn effectiever zijn.

Verschillen in de metabole routes tussen de CR- en CRV-groepen
Pathway-analyse toonde significant verschillende metabole routes tussen de CR- en CRV-groepen, waaronder in termen van fenylalaninemetabolisme, de biosynthese van onverzadigde vetzuren, fenylalanine, tyrosine en tryptofaanbiosynthese en linolzuurmetabolisme. De metabole routes van fenylalaninemetabolisme en fenylalanine, tyrosine en tryptofaan biosynthese zijn echter niet gerelateerd aan PD. Deze resultaten tonen aan dat de metabole routes geassocieerd met de verhoogde werkzaamheid van CRV linolzuurmetabolisme en de biosynthese van onverzadigde vetzuren zijn.

Onverzadigde vetzuren omvatten twee soorten: omega-3 en omega-637. Drie voorlopers van mediatoren, waaronder eicosapentaeenzuur (20:5ω3; EPA), docosahexaeenzuur (22:5ω3; DHA) en arachidonzuur (20:5ω6; ARA), zijn betrokken bij de biosynthese van onverzadigde vetzuren route37,38. EPA- en ARA-metabolisme produceren beide prostaglandinen en leukotriënen onder invloed van COX. ARA produceert 2-serie prostanoïden, waaronder PGF 2 α, PGE 2, PGI 2 en tromboxaan (TXA 2, TXB 2), en 4-serie leukotriënen, waaronder leukotrieen A 4 (LTA 4) leukotrieen B 4 (LTB 4), leukotrieen C 4 (LTC4) en leukotrieen D 4 (LTD 4). De 3-serie prostanoïden omvatten prostaglandine E 3 (PGE 3), prostacycline I 3 (PGI 3) en tromboxaan A2 (TXA 3), en de 5-serie leukotriënen omvatten leukotrieen A 5 (LTA 5) leukotrieen B 5 (LTB 5), leukotrieen C 5 (LTC 5) en leukotrieen D 5 (LTD 5), die grotendeels worden geproduceerd door EPA.

Het transformatieproces van EPA is hetzelfde als dat van ARA en wordt gemedieerd door vergelijkbare enzymen39. De 2-serie prostanoïden en 4-serie leukotriënen hebben voornamelijk pro-inflammatoire, bloedplaatjesaggregatie en vasoconstrictie effecten. Daarentegen vertonen 3-serie prostanoïden en 5-serie leukotriënen ontstekingsremmende, bloedplaatjesaggregatieremmers en vaatverwijdende effecten38. TXA 2 en TXB2 worden geproduceerd uit ARA, waardoor de bloedvaten vernauwen. EPA-afgeleide BGA 3, PGE 3 en TXA 3 fungeren alleen als vaatverwijders38,40. EPA en ARA concurreren om omzetting in PG's door het COX-enzym. Wanneer de membraan-EPA/AA-verhouding wordt verhoogd, kunnen de eicosanoïden PGI 2 en TXA2, die aggregatie bevorderen, worden omgezet in TXA 3 en PGI3, die anti-aggregatie bevorderen, wat resulteert in ontstekingsremmende en anti-aggregatie-effecten40. Bovendien is het gecombineerde gebruik van EPA, DHA en linolzuur (C18:2ω6; LIN) kan de afgifte van PGF 2 α en PGE2 in het endometrium en de trofoblasten van runderenverminderen 41,42.

PD wordt waarschijnlijk veroorzaakt door de productie van PG's en leukotriënen 43,44,45, met name PG's 46. Ondertussen kan een onbalans in vasopressine, β-endorfines, oestrogeen, progesteron, neurotransmitters, IL, ET-1 en NO ook verband houden met dysmenorroe47. Volgens de ELISA-resultaten daalden de PGF 2α- en PGF2α/PGE 2-niveaus in de CRV-groep, terwijl het PGE 2-niveau toenam ten opzichte van de CR-groep. Bovendien waren leukotrieen B4 (C02165) en prostaglandine J2 (C05957) lager in de CRV-groep. Dit geeft aan dat er in de CRV-groep lagere niveaus waren van 2-serie prostanoïden gemaakt van ARA, waaronder PGF2α, de belangrijkste factor voor dysmenorroe. Therapie met PGE 2 in hoge concentraties verwijdt de bloedvaten en PGE2 veroorzaakt vasoconstrictie bij lage concentraties48. Daarom is de baarmoeder ontspannen met vaatverwijding en wordt dysmenorroe verlicht.

Omdat het menselijk lichaam niet voldoende C18 onverzadigde vetzuren kan synthetiseren, zijn linolzuur en α-linoleenzuur, die de enige bron van C18 onverzadigde vetzuren zijn, erg belangrijk38. Linolzuur en α-linoleenzuur zijn de bron van respectievelijk omega-6 en omega-3 onverzadigde vetzuurmetabolisme. In het bijzonder is de voorloper van prostaglandinesynthese ARA en ARA wordt gesynthetiseerd uit linolzuur49. Linolzuur is een voorloper en daaruit wordt een reeks metabolieten gesynthetiseerd, waaronder ARA, prostaglandinen (PGF 2α, PGE 2), prostacycline (PGI 2) en tromboxaan (TXA 2)50. Linolzuur is nauw verwant aan het versterkte analgetische effect van CRV. Bovendien kan de metabole route van steroïde hormoonbiosynthese progesteron 51,52,53 en sfingosine-1-fosfaat (C06124) produceren, die worden geproduceerd door de metabole route van sfingolipidemetabolisme, COX-2 induceren en PGE2 produceren via TNF54,55,56,57. Deze kunnen ook gerelateerd zijn aan PD.

Er zijn enkele beperkingen aan het protocol. Alleen de relatieve niveaus van de bestanddelen werden vergeleken en het standaardmonster werd niet gebruikt om de bestanddelen in het kruid en die in het bloed te kwantificeren. De uitwerpselen en urine van ratten werden niet verzameld in de dierproeven, wat resulteerde in de ontdekking van minder metabolieten van CR in vivo. Validatie-experimenten moeten het mechanisme dat door de metabonomics-analyse is ontdekt, verder bevestigen.

De strategie en het protocol dat in deze studie werd gebruikt, vermeden blindheid bij de studie van chemische componenten in vitro en de eenzijdige studie van individuele componenten in vivo. Daarom was het zeer geschikt voor het verkennen van mechanismen. De strategie kan veel tijd en werk besparen en kan nauwkeurig de kritieke bestanddelen en het mechanisme voor therapeutische werkzaamheid identificeren.

In deze studie bleek dat er 15 bestanddelen en twee metabolieten in het bloed waren. Onder hen waren de niveaus van (-)-myrtenol en [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]azijnzuur significant verhoogd in de CRV-groep in vergelijking met de CR-groep, wat aantoont dat verwerking met azijn de niveaus van de actieve ingrediënten in het bloed kan verhogen. Nadat CR was verwerkt met azijn, namen de niveaus van 2-serie prostanoïden en 4-serie leukotriënen met pro-inflammatoire, bloedplaatjesaggregatie en vasoconstrictie-eigenschappen af, waaronder PGF2α, leukotrieen B4 en prostaglandine J2. Dit kan het mechanisme zijn waarmee CRV een versterkt analgetisch effect aantoont.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het Chongqing Municipal Health and Family Planning Commission Chinese Medicine Science and Technology Project (projectnummer: ZY201802297), Algemeen project van Chongqing Natural Science Foundation (projectnummer: cstc2019jcyj-msxmX065), Chongqing Modern Mountain Area Characteristic High-efficiency Agricultural Technology System Innovation Team Building Plan 2022 [10], en Chongqing Municipal Health Commission Key Discipline Construction Project of Chinese Materia Medica-verwerking.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile  Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20 Beckman Coulter, Inc. MRZ15K047
Estradiol benzoate Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd C10042616
formic acid Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 177799
LC 30A system Shimadzu, Kyoto, Japan 228-45162-46
Olive oil Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd H25A11P111909
Oxytocin synthetic Zhejiang peptide biology Co., Ltd  2019092001
Rat PGF2α ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd 202101
Rat PGFE2 ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd EDL202006217
SPF Sprague-Dawley rats Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
Triple TOF 4600 system SCIEX, Framingham, MA, USA BK20641402
water Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 152720

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, W. Y., et al. Acupuncture for primary dysmenorrhea: A potential mechanism from an anti-inflammatory perspective. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 1907009 (2021).
  2. Rafique, N., Al-Sheikh, M. H. Prevalence of primary dysmenorrhea and its relationship with body mass index. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 44 (9), 1773-1778 (2018).
  3. Tong, H., et al. Bioactive constituents and the molecular mechanism of Curcumae Rhizoma in the treatment of primary dysmenorrhea based on network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 86, 153558 (2021).
  4. Ferries-Rowe, E., Corey, E., Archer, J. S. Primary dysmenorrhea: Diagnosis and therapy. Obstetrics & Gynecology. 136 (5), 1047-1058 (2020).
  5. Lu, J., et al. The association study of chemical compositions and their pharmacological effects of Cyperi Rhizoma (Xiangfu), a potential traditional Chinese medicine for treating depression. Journal of Ethnopharmacology. 287, 114962 (2021).
  6. Lu, J., et al. Quality status analysis and intrinsic connection research of growing place, morphological characteristics, and quality of Chinese medicine: Cyperi Rhizoma (Xiangfu) as a case study. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2022, 8309832 (2022).
  7. Taheri, Y., et al. Cyperus spp.: A review on phytochemical composition, biological activity, and health-promoting effects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 4014867 (2021).
  8. El-Wakil, E. A., Morsi, E. A., Abel-Hady, H. Phytochemical screening, antimicrobial evaluation and GC-MS analysis of Cyperus rotundus. World Journal Of Pharmacy And Pharmaceutical Sciences. 8 (9), 129-139 (2019).
  9. Rocha, F. G., et al. Preclinical study of the topical anti-inflammatory activity of Cyperus rotundus L. extract (Cyperaceae) in models of skin inflammation. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112709 (2020).
  10. Hao, G., Tang, M., Wei, Y., Che, F., Qian, L. Determination of antidepressant activity of Cyperus rotundus L extract in rats. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 16 (4), 867-871 (2017).
  11. Kakarla, L., et al. Free radical scavenging, α-glucosidase inhibitory and anti-inflammatory constituents from Indian sedges, Cyperus scariosus R.Br and Cyperus rotundus L. Pharmacognosy Magazine. 12 (47), 488-496 (2016).
  12. Shakerin, Z., et al. Effects of Cyperus rotundus extract on spatial memory impairment and neuronal differentiation in rat model of Alzheimer's disease. Advanced Biomedical Research. 9 (1), 17-24 (2020).
  13. Li, J., et al. Pharmacokinetics of caffeic acid, ferulic acid, formononetin, cryptotanshinone, and tanshinone IIA after oral Administration of naoxintong capsule in rat by HPLC-MS/MS. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2017, 9057238 (2017).
  14. Zhang, A., et al. Metabolomics: Towards understanding traditional Chinese medicine. Planta Medica. 76 (17), 2026-2035 (2010).
  15. Li, L., Ma, S., Wang, D., Chen, L., Wang, X. Plasma metabolomics analysis of endogenous and exogenous metabolites in the rat after administration of Lonicerae Japonicae Flos. Biomedical Chromatography. 34 (3), 4773 (2020).
  16. Guijas, C., Montenegro-Burke, J. R., Warth, B., Spilker, M. E., Siuzdak, G. Metabolomics activity screening for identifying metabolites that modulate phenotype. Nature Biotechnology. 36 (4), 316-320 (2018).
  17. Hu, L., et al. Functional metabolomics decipher biochemical functions and associated mechanisms underlie small-molecule metabolism. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 417-433 (2020).
  18. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  19. Liu, F., et al. Metabonomics study on the hepatoprotective effect of Panax notoginseng leaf saponins using UPLC/Q-TOF-MS analysis. The American Journal of Chinese Medicine. 47 (3), 559-575 (2019).
  20. Zhao, L., Hartung, T. Metabonomics and toxicology. Methods in Molecular Biology. 1277, 209-231 (2015).
  21. Martin, F. J., Montoliu, I., Kussmann, M. Metabonomics of ageing - Towards understanding metabolism of a long and healthy life. Mechanisms of Ageing and Development. 165, 171-179 (2017).
  22. Heaney, L. M., Deighton, K., Suzuki, T. Non-targeted metabolomics in sport and exercise science. Journal of Sports Sciences. 37 (9), 959-967 (2019).
  23. Yang, Y., et al. Metabonomics profiling of marinated meat in soy sauce during processing. Journal of the Science of Food and Agriculture. 98 (4), 1325-1331 (2018).
  24. Xu, S. Y. Methodology of Pharmacological Experiment. , People's Medical Publishing House. Beijing, China. (2002).
  25. Ma, B., et al. An integrated study of metabolomics and transcriptomics to reveal the anti-primary dysmenorrhea mechanism of Akebiae Fructus. Journal of Ethnopharmacology. 270, 113763 (2021).
  26. Li, X., et al. Regulation of mild moxibustion on uterine vascular and prostaglandin contents in primary dysmenorrhea rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 9949642 (2021).
  27. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 73 (3), 779-787 (2006).
  28. Wang, D., et al. UPLC-MS/MS-based rat serum metabolomics reveals the detoxification mechanism of Psoraleae Fructus during salt processing. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5597233 (2021).
  29. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
  30. Xie, H., et al. Raw and vinegar processed Curcuma wenyujin regulates hepatic fibrosis via bloking TGF-β/Smad signaling pathways and up-regulation of MMP-2/TIMP-1 ratio. Journal of Ethnopharmacology. 246, 111768 (2020).
  31. Jung, S. H., et al. α-Cyperone, isolated from the rhizomes of Cyperus rotundus, inhibits LPS-induced COX-2 expression and PGE2 production through the negative regulation of NFkappaB signalling in RAW 264.7 cells. Journal of Ethnopharmacology. 147 (1), 208-214 (2013).
  32. Dantas, L. B. R., et al. Nootkatone inhibits acute and chronic inflammatory responses in mice. Molecules. 25 (9), 2181 (2020).
  33. Xu, Y., et al. Nootkatone protects cartilage against degeneration in mice by inhibiting NF- κB signaling pathway. International Immunopharmacology. 100, 108119 (2021).
  34. Heimfarth, L., et al. Characterization of β-cyclodextrin/myrtenol complex and its protective effect against nociceptive behavior and cognitive impairment in a chronic musculoskeletal pain model. Carbohydrate Polymers. 244, 116448 (2020).
  35. Viana, A., et al. (-)-Myrtenol accelerates healing of acetic acid-induced gastric ulcers in rats and in human gastric adenocarcinoma cells. European Journal of Pharmacology. 854, 139-148 (2019).
  36. Bejeshk, M. A., et al. Anti-inflammatory and anti-remodeling effects of myrtenol in the lungs of asthmatic rats: Histopathological and biochemical findings. Allergologia et Immunopathologica. 47 (2), 185-193 (2019).
  37. Christie, W. W., Harwood, J. L. Oxidation of polyunsaturated fatty acids to produce lipid mediators. Essays in Biochemistry. 64 (3), 401-421 (2020).
  38. Wiktorowska-Owczarek, A., Berezinska, M., Nowak, J. Z. PUFAs: Structures, metabolism and functions. Advances in Clinical and Experimental. 24 (6), 931-941 (2015).
  39. Araujo, P., et al. The effect of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids on the production of cyclooxygenase and lipoxygenase metabolites by human umbilical vein endothelial cells. Nutrients. 11 (5), 966 (2019).
  40. Shahidi, F., Ambigaipalan, P. Omega-3 polyunsaturated fatty acids and their health benefits. Annual Review of Food Science and Technology. 9, 345-381 (2018).
  41. Meier, S., Ledgard, A. M., Sato, T. A., Peterson, A. J., Mitchell , M. D. Polyunsaturated fatty acids differentially alter PGF(2α) and PGE2 release from bovine trophoblast and endometrial tissues during short-term culture. Animal Reproduction Science. 111 (2), 353-360 (2009).
  42. Cheng, Z., et al. Altering n-3 to n-6 polyunsaturated fatty acid ratios affects prostaglandin production by ovine uterine endometrium. Animal Reproduction Science. 143 (1-4), 38-47 (2013).
  43. Sultan, C., Gaspari, L., Paris, F. Adolescent dysmenorrhea. Endocrine Development. 22, 171-180 (2012).
  44. Zeev, H. M. D., Craig, L. M. D., Suzanne, R. M. D., Rosalind, V. M. D., Jeffrey, D. M. D. Urinary leukotriene (LT) E4 in adolescents with dysmenorrhea: A pilot study. Journal of Adolescent Health. 27 (3), 151-154 (2000).
  45. Fajrin, I., Alam, G., Usman, A. N. Prostaglandin level of primary dysmenorrhea pain sufferers. Enfermería Clínica. 30, 5-9 (2020).
  46. Iacovides, S., Avidon, I., Baker, F. C. What we know about primary dysmenorrhea today: a critical review. Human Reproduction Update. 21 (6), 762-778 (2015).
  47. Barcikowska, Z., Rajkowska-Labon, E., Grzybowska, M. E., Hansdorfer-Korzon, R., Zorena , K. Inflammatory markers in dysmenorrhea and therapeutic options. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1191 (2020).
  48. Wang, T., et al. Arachidonic acid metabolism and kidney inflammation. International Journal of Molecular Science. 20 (15), 3683 (2019).
  49. Szczuko, M., et al. The role of arachidonic and linoleic acid derivatives in pathological pregnancies and the human reproduction process. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9628 (2020).
  50. Serrano-Mollar, A., Closa, D. Arachidonic acid signaling in pathogenesis of allergy: Therapeutic implications. Current Drug Targets-Inflammation and Allergy. 4 (2), 151-155 (2005).
  51. Toit, R. L., Storbeck, K. H., Cartwright, M., Cabral, A., Africander, D. Progestins used in endocrine therapy and the implications for the biosynthesis and metabolism of endogenous steroid hormones. Molecular and Cellular Endocrinology. 441, 31-45 (2017).
  52. Ghayee, H. K., Auchus, R. J. Basic concepts and recent developments in human steroid hormone biosynthesis. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 8 (4), 289-300 (2007).
  53. Liang, J. J., Rasmusson, A. M. Overview of the molecular steps in steroidogenesis of the GABAergic neurosteroids allopregnanolone and pregnanolone. Chronic Stress. 2, 2470547018818555 (2018).
  54. Pettus, B. J., et al. The sphingosine kinase 1/sphingosine-1-phosphate pathway mediates COX-2 induction and PGE2 production in response to TNF-α. The FASEB Journal. 17 (11), 1411-1421 (2003).
  55. Zeidan, Y. H., et al. Acid ceramidase but not acid sphingomyelinase is required for tumor necrosis factor-α-induced PGE2 production. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24695-24703 (2006).
  56. Kawamori, T., et al. Role for sphingosine kinase 1 in colon carcinogenesis. The FASEB Journal. 23 (2), 405-414 (2009).
  57. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).

Tags

Intrekking Nummer 190
Analyse van ruwe en verwerkte Cyperi Rhizoma-monsters met behulp van vloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometrie bij ratten met primaire dysmenorroe
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., … More

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., Chu, R., Li, S. Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea. J. Vis. Exp. (190), e64691, doi:10.3791/64691 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter