Summary
여기에서 우리는 정상 상태 말초 혈액에서 분리된 단핵 세포를 사용하여 인간 자가 간 스페로이드를 생성하는 비유전적 방법을 제시합니다.
Abstract
인간의 간 세포는 기능적 능력을 유지하면서 몇 주 동안 배양에서 성장할 수 있는 3차원(3D) 구조를 형성할 수 있습니다. 접착 특성이 낮거나 전혀 없는 배양 접시에 군집하는 특성으로 인해 인간 간 스페로이드라고 하는 여러 간 세포의 응집체를 형성합니다. 3D 간 스페로이드의 형성은 접착 기질이 없을 때 응집되는 간 세포의 자연적인 경향에 의존합니다. 이러한 3D 구조는 생체 내 환경에 더 가까운 세포보다 더 나은 생리적 반응을 보입니다. 3D 간세포 배양을 사용하면 생물학적으로 더 관련성이 높은 미세 환경, 자연 장기를 재조립하는 구조적 형태, 질병 상태 및 약물 에 대한 생체 내 유사 반응에 대한 더 나은 예측을 포함하여 기존의 2차원(2D) 배양과 비교할 때 많은 이점이 있습니다. 다양한 소스를 사용하여 일차 간 조직 또는 불멸화된 세포주와 같은 스페로이드를 생성할 수 있습니다. 3D 간 조직은 인간 배아 줄기 세포(hESC) 또는 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)를 사용하여 간세포를 유도함으로써 조작될 수도 있습니다. 인체 막 결합 GPI 연계 단백질의 활성화에 의해 조작되지 않은 말초혈액에서 생성되고 인간 간세포로 분화된 혈액유래만능줄기세포(BD-PSC)를 이용하여 인간 간 스페로이드를 획득하였습니다. BD-PSCs 유래 인간 간 세포 및 인간 간 스페로이드를 인간 간세포 마커를 사용하여 광학 현미경 및 면역 표현형으로 분석하였다.
Introduction
최근 몇 년 동안 3차원(3D) 스페로이드 배양 시스템은 암 연구, 약물 발견 및 독성학의 다양한 영역을 연구하는 중요한 도구가 되었습니다. 이러한 배양은 2차원(2D) 세포 배양 단층과 복잡한 기관 사이의 간극을 메우기 때문에 큰 관심을 불러일으킨다1.
접착 표면이 없는 경우, 2D 세포 배양과 비교하여 스페로이드의 형성은 3D 형태로 클러스터링되는 이러한 세포의 자연스러운 친화력을 기반으로 합니다. 이 세포는 하나 이상의 유형의 성숙한 세포로 구성된 그룹으로 구성됩니다. 이물질이 없는 이 세포는 원래의 미세 환경에서와 같이 서로 상호 작용합니다. 3D 배양의 세포는 2D 배양보다 세포외 기질 생산이 더 높아 훨씬 더 가깝고 서로를 향한 적절한 방향을 가지며 자연 환경에 가깝습니다 2.
동물 모델은 인간의 생물학과 질병을 연구하기 위해 오랫동안 사용되어 왔습니다3. 이와 관련하여 인간과 동물 사이에는 본질적인 차이가 있기 때문에 이러한 모델은 외계 연구에 완전히 적합하지 않습니다. 3D 배양 스페로이드 및 오가노이드는 생체 내에서 발생하는 다양한 세포 유형 간의 조직과 유사한 구조, 상호 작용 및 누화를 연구하는 유망한 도구이며 동물 모델을 줄이거나 대체하는 데 기여할 수 있습니다. 그들은 간 질환의 발병 기전과 약물 스크리닝 플랫폼을 연구하는 데 특히 관심이 있습니다4.
3D 스페로이드 배양은 2D 배양을 위한 종양 세포 단층을 준비하는 데 필요한 트립신 처리 또는 콜라게나제 처리의 필요성을 줄여 세포와 환경 간의 불연속성을 제거할 수 있기 때문에 암 연구에 특히 중요합니다. 종양 스페로이드는 정상 세포와 악성 세포가 주변 환경으로부터 어떻게 신호를 받고 반응하는지에 대한 연구를 가능하게 하며5 종양 생물학 연구의 중요한 부분이다.
단층에 비해 다양한 세포 유형으로 구성된 3D 배양은 구조적 및 기능적 특성에서 종양 조직과 유사하므로 종양 세포의 전이 및 침윤을 연구하는 데 적합합니다. 이것이 바로 이러한 스페로이드 모델이 암 연구를 가속화하는 데 기여하는 이유입니다6.
스페로이드는 또한 조직 및 장기 생물학, 특히 인간에서 연구하기가 매우 어렵기 때문에 인간 오가노이드를 만드는 기술을 개발하는 데 도움이 됩니다. 줄기세포 배양이 진행됨에 따라 줄기세포와 조직 전구체로 구성된 오가노이드와 같은 3D 배양을 개발할 수 있을 뿐만 아니라 실제 장기와 같은 기능적 특성을 가진 장기의 다양한 유형의 성숙(조직) 세포를 개발할 수 있어 장기 발달, 질병을 모델링하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 재생 의학7에서도 유용하다고 간주될 수 있다.
1차 인간 간세포는 일반적으로 인간 간세포, 간 기능 및 약물 유발 독성의 시험관 내 생물학을 연구하는 데 사용됩니다. 인간 간세포의 배양은 두 가지 주요 단점을 가지고 있는데, 첫째, 인간 간세포와 같은 일차 조직의 가용성이 제한적이고, 둘째, 간세포가 2D 배양에서 빠르게 역분화되어 특정 간세포 기능을 상실하는 경향이 있다8. 3D 간 배양은 이와 관련하여 우수하며 최근에는 분화된 인간 배아 줄기 세포(hESC) 또는 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)로 만들어졌습니다9. 생체공학적 간 3D 스페로이드는 간 질환 치료를 위한 약물 발견뿐만 아니라 간의 발달, 독성, 유전 및 감염성 질환을 연구하는 데 특히 중요합니다10. 마지막으로, 급성 간 질환의 치사율이 거의 80%에 달한다는 사실을 알기 때문에 임상적으로 사용될 수 있는 가능성도 있으며, 생체 인공 간 및/또는 간 스페로이드는 적절한 기증자를 찾을 때까지 부분적인 간 기능을 제공함으로써 이러한 환자들을 잠재적으로 구제할 수 있다11.
우리는 혈액 유래 만능 줄기 세포(BD-PSC)를 사용하여 4000 내지 1 x 106 세포를 포함하는 다양한 크기의 스페로이드를 제조하고 광학 현미경 및 면역형광을 통해 분석하는 인간 간 스페로이드 생성을 위한 프로토콜을 확립했습니다. 또한 해독 과정을 통해 세포 및 약물 대사에 중요한 역할을 하는 시토크롬 P450 계열에 속하는 시토크롬 P450 3A4(CYP3A4) 및 2E1(CYP2E1) 효소의 발현을 평가하여 간세포 특이적 기능의 능력을 테스트했습니다12.
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Protocol
이러한 실험을 수행하기 위한 윤리적 승인(ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1)을 얻었고 기관 지침에 따라 채혈 전에 모든 기증자가 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다.
1. 인간 말초 혈액 (PB)에서 단핵 세포 (MNC)의 제조
- 표준 프로토콜에 따라 훈련된 의료진의 도움을 받아 건강한 기증자로부터 혈액 30mL를 추출합니다.
- Becker-Kojić et al.13에 의해 발표된 프로토콜에 따라 밀도 구배 매체를 사용하여 PBMNC를 분리합니다. 피펫팅을 통해 혈장과 밀도 구배 배지 사이의 간기 층을 분리하고 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 분리된 세포를 세척합니다.
- 계수 챔버를 사용하고 표준 방법을 사용하여 세포 수를 계산합니다.
2. 인간 GPI 고정 당단백질로 활성화시 다국적 기업의 역분화
- 폴리스티렌 튜브(15mL)에 PBS/1% 소 혈청 알부민(BSA)에 6 x 106 개의 단핵 세포를 넣고 Becker-Kojić et al.13에 따라 37°C에서 30분 동안 특정 항체와 함께 배양합니다.
- 실온에서 300 x g 으로 세포를 원심분리하고 PBS/BSA를 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Iscove의 변형된 Dulbecco's 배지로 교체합니다.
- Becker-Kojić et al.13에 기재된 바와 같이 37°C에서 8-10일 동안 5%CO2 인큐베이터에서 15 mL 폴리스티렌 튜브에서 세포를 성장시킨다. 5일(D5)에 10% FBS가 보충된 Iscove 배지 1-2mL를 각 15mL 튜브에 추가합니다.
3. 새로 생성된 역분화 세포의 분류
- 원심분리기는 세포 현탁액을 실온에서 300 x g 에서 10분 동안 배양하고, 생성된 상청액을 멸균 피펫으로 흡인하고, Becker-Kojić et al.13에 따라 생성되었다.
- 90 μL의 차가운 PBS 완충액(PBS pH 7.2, 0.5% BSA 및 2 mM EDTA)에서 원심분리하여 얻은 펠릿을 재현탁하고 10μL의 CD45 양성 나노 크기 자기 비드를 추가하고 15분 동안 얼음에서 배양합니다.
- 세포 현탁액을 2mL의 PBS 완충액으로 세척하고 실온에서 10분 동안 300x g 에서 원심분리한 다음 500μL의 PBS 완충액을 세포에 첨가하고 완전히 재현탁합니다.
- 500 μL의 예냉식 PBS 완충액을 컬럼에 넣고 피펫팅하여 세척하고 마그네틱 스탠드를 사용하여 자기장에 두었다.
- 500μL의 PBS 완충액으로 컬럼에 놓인 세포를 두 번 세척하고 10% FBS가 보충된 Iscove의 배지에서 CD45 음성 세포가 포함된 플로우 스루를 수집합니다.
- 계수 챔버를 사용하여 재프로그래밍된 세포의 수를 결정합니다.
4. 인간 간세포 생성을 위한 유리 커버슬립의 제조
- 유리 커버슬립(14mm)을 분리하고 비이온성 세제에서 10분 동안 배양합니다. 기포가 남지 않을 때까지 탈이온수로 유리 커버슬립을 세척하고 1M HCl에서 30분 동안 배양합니다(Marchenko et al.14에서 수정).
- 유리 커버슬립을 탈이온수로 최소 3회 세척하고 실온에서 밤새 건조시킵니다. 오토클레이브 건조 유리 커버슬립을 적절한 용기에 담습니다.
5. BD-PSC의 2차원 간 분화를 위한 세포 배양 플레이트에 바이오라미닌 코팅
- 멸균 핀셋이 있는 오토클레이브 유리 커버슬립을 4웰 플레이트에 놓고 UV 조명을 30분 동안 켜서 멸균 상태를 보장합니다.
- 바이오라미닌 분취량을 해동하고 5μg/mL 바이오라미닌 120μL을 각 유리 커버 슬립에 추가합니다. 코팅된 유리 커버슬립을 4°C에서 밤새 그대로 두십시오.
- 과량의 바이오라미닌을 제거하고 아래에 설명된 대로 200μL의 간세포 분화 배지를 추가합니다.
6. 간세포 분화 배지의 제조
- 76.4% 녹아웃 DMEM(KO-DMEM), 20% KSR, 0.5% L-글루타민, 1% 비필수 아미노산(NEAA), 0.1% β-메르캅토에탄올, 1% DMSO 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Pen/Strep)으로 구성된 간파토블라스트 녹아웃 혈청 대체물(KSR)/디메틸 설폭사이드(DMSO) 배지 500mL를 만듭니다.
- 1% L-글루타민, 10μM 히드로코르티손 21-헤미숙신산 나트륨염(HCC) 및 1% Pen/Strep을 포함하는 간세포 성숙 배지 500mL를 준비합니다.
- 주식에서 배지를 분취하고 각 배지 변경에 대해 10ng/mL 및/또는 20ng/mL의 최종 농도로 신선한 간세포 성장 인자(HGF)와 온코스타틴 M(OSM)을 추가합니다.
참고: 온코스타틴 M은 인터루킨 6 사이토카인 그룹에 속하는 사이토카인으로 조혈 및 간 발달에 중요합니다.
7. BD-PSCs로부터 분화된 간세포 배양
- 3 x 105 BD-PSCS 세포를 바이오라미닌으로 코팅된 4웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다.
- 4-웰 플레이트를 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에 넣는다. 내배엽 분화를 지원하는 KSR/DMSO 간세포세포에서 5일간 배양하고 2일마다 배지를 교체한다.
- 5일째에 간세포 성숙 배지로 전환하고, 세포를 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에서 추가의 7-10일 동안 배양한다. 48시간마다 매체를 교체하십시오.
8.3D 스페로이드 간 분화
- 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다.
- 실온에서 10분 동안 300 x g 에서 BD 탈분화 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 KSR/DMSO 배지에서 BD 탈분화 세포를 2 x 106 cells/mL로 재현탁합니다.
- 40μm 세포 스트레이너를 통해 세포를 통과시켜 단일 세포 현탁액을 확보하고 추가 파편을 제거합니다.
- 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수하고 웰 당 필요한 부피를 분주하기 위해 각 세포 파종 밀도에 대해 충분한 부피를 준비합니다. 1 x 106 세포의 상단 시딩을 4000 셀의 낮은 파종 밀도로 그라디언트를 준비합니다.
- 100μL의 KSR/DMSO 배지를 96웰 저 부착 플레이트에 분주하고 100μL의 세포 시딩 희석액을 추가합니다.
- 낮은 부착 플레이트를 37°C 및 5%CO2 의 인큐베이터에 넣고 5일 동안 배양합니다.
- 스페로이드가 충분히 압축될 때 파종 후 3-4일째에 배지의 50%를 변경합니다.
- 5일째에, 배지를 간세포 성숙 배지로 변경하고, 추가 성숙을 위해 추가로 7-10일 동안 세포를 배양한다. 2 일마다 매체를 변경하십시오.
9. 새로 생성된 2D 간세포 배양액의 면역형광 분석
- 상기와 같은 분화방법에 따라 세포를 4, 8, 15, 24일 동안 배양하고 배지를 제거한다.
- PBS에서 4% 파라포름알데히드로 구성된 예열 고정액으로 세포를 10분 동안 배양합니다. 고정액을 버리고 PBS로 세포를 각각 5분 동안 2배 세척합니다. 즉시 0.1 % 트리톤 X-100 용액을 첨가하고 5 분 동안 세포를 투과시킵니다. PBS로 2배 세척합니다.
- PBS와 5% BSA로 만든 블로킹 용액을 넣고 실온에서 1시간 동안 로커 플레이트에 놓습니다.
- 1차 항체를 희석 완충액 1% BSA/PBS에 다음과 같이 희석합니다: 알부민(ALB) 1:50, 알파-1 태아단백(AFP) 1:250, 사이토케라틴 18(CK18) 1:50, 간세포 핵 인자 4 알파(HNF4α) 1:1000 및 트랜스티레틴(TTR) 1:50. 웰당 50 μL의 항체 희석액을 사용하십시오.
- 실온에서 1시간 동안 세포를 배양합니다. 이어서, 항체 용액을 버리고, 세포를 5분 동안 세척하고, 세척 단계를 3x 반복한다.
- 희석 완충액에서 다음의 2차 항체를 제조한다: 토끼 항-닭 IgG (텍사스 레드) 1:1000, 염소 항-마우스 IgG (488) 1:1000, 및 염소 항-토끼 (488) 1:500. 웰 당 50 μL의 항체 희석액을 사용하고 실온에서 30 분 동안 세포를 배양합니다.
- PBS로 세포를 각각 5분 동안 3배 세척하고 현미경 분석을 위해 DAPI가 포함된 장착 매체로 커버슬립을 장착합니다.
10. 새로 형성된 간 스페로이드의 생염색
- 스페로이드를 건드리지 않고 배양 배지를 조심스럽게 버리고 0.1% 트리톤 X-100 용액으로 갓 만든 PBS를 넣고 5분 동안 배양하여 세포를 투과시킵니다.
- 5분 동안 천천히 피펫팅하여 배지로 스페로이드를 세척하고 2회 반복합니다.
- 37°C의 5%CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 1% BSA와 함께 PBS에서 제조된 1차 항체 ALB(1:50), AFP(1:250), CK18(1:50), CYP2E1(1:200) 및 CYP3A4(1:200)와 함께 스페로이드를 인큐베이션합니다. 웰당 50 μL의 항체 희석액을 사용하십시오.
- 과잉 항체 용액을 조심스럽게 제거하고 스페로이드를 배지 3x로 세척합니다.
- 염소 항-토끼(488)에 대해 1:1000 및 1:500의 희석으로 상응하는 2차 항체인 염소 항-마우스 IgG(Cy3), 염소 항-마우스 IgG(488) 및 토끼 항-닭 IgG(텍사스 레드)를 1% BSA의 PBS에서 준비합니다. 웰 당 50 μL의 항체 희석액을 사용하고 37 °C 및 5 %CO2의 인큐베이터에서 20 분 동안 인큐베이션합니다.
- 배지로 3x 세척하고 형광 현미경을 수행하기 전에 플레이트를 37°C 및 5%CO2 의 인큐베이터에 30분 동안 방치합니다.
11. 형광 현미경을 이용한 스페로이드 검사
- 사용하기 10분 전에 형광 광원을 켜고 컴퓨터를 켜고 이미징 소프트웨어를 엽니다.
- 4배 배율의 대물렌즈를 사용하고 도구 모음에서 버튼 4x 를 클릭하여 올바른 스케일 바를 선택한 다음 96웰 플레이트를 스테이지 중앙 플레이트에 놓습니다.
- LED 광원을 켜고 명시야 필터를 사용한 다음 x-y-축을 사용하여 플레이트를 관심 있는 웰에 배치합니다.tage 조정 노브.
- 카메라 조명 경로로 변경하고 이미징 소프트웨어에서 라이브 버튼을 클릭하여 화면에 이미지를 시각화하고 x-y-축 노브를 사용하여 스페로이드가 중앙에 있는지 확인하고 거친/미세 초점 노브를 사용하여 초점을 맞춥니다.
참고: 스페로이드의 모양은 라이브 염색을 적용한 후에도 일정하게 유지됩니다. - 도구 모음에서 명시야 관찰 방법을 선택하고 노출 설정을 자동으로 설정한 다음 카메라 제어판에서 스냅샷 버튼을 클릭하여 사진을 찍습니다. 그런 다음 관심 있는 폴더에 적절한 이름을 사용하여 그림을 .vsi 파일로 저장합니다.
- 주변광 차폐판을 배치하여 LED 조명을 끄고, B-여기 필터로 변경하고, 도구 모음에서 488 관찰 방법을 선택하고, 셔터를 열고, 스냅샷 버튼을 클릭하여 사진을 찍고, 셔터를 닫은 다음, 위에서 설명한 대로 파일을 저장합니다.
- 적절한 관찰 방법(텍사스 레드 또는 CY3)을 사용하여 G-여기용 필터로 이 작업을 반복합니다. 그런 다음 관심있는 각 우물에 대한 전체 절차를 반복하십시오.
- 플레이트를 37°C에서 5%CO2 인큐베이터로 되돌리고, 이를 상기와 같이 배양한다.
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Representative Results
우리는 2단계 프로토콜을 적용하여 인간 BD-PSC를 내배엽/간 전구 세포와 간세포로 성공적으로 분화했습니다. 간 분화 과정 동안의 형태학적 변화는 그림 1에 나와 있습니다. BD-PSC는 세 가지 단계를 거치는 간세포로 분화됩니다. 첫 번째 단계는 내배엽 세포 L4로의 분화를 나타내고, 두 번째 단계는 전형적인 다각형 형태를 나타내는 간전구세포(hepatoblast) L8로의 분화를 나타내며, 세 번째 단계는 간세포 L15-L24로의 성숙을 나타낸다.
도 2에 제시된 바와 같이 BD-PSCs의 간 분화를 확인하기 위해 면역형광 분석을 수행하였다. 태아 혈청의 주요 혈장 단백질인 알파-태아단백(alpha-fetoprotein, AFP)과 같은 내배엽/인간 간 전구체 마커의 강력한 발현은 성인 유기체에서 농도가 매우 낮아 간세포의 전구체15 및 혈류에서 뇌로 티록신을 운반하는 데 관여하는 주요 갑상선 호르몬 결합 단백질인 트랜스티레틴(TTR)의 마커로 간주됩니다16 L4 내지 L8에서 간 분화 과정의 첫 번째 단계에서 세포에서 발견됩니다. 그러나, 이들의 발현은 L15에서 감소하는 반면, 주로 간에서 생산되는 가장 풍부한 혈장 단백질인 알부민(ALB)의 발현은 간세포 분화에 매우 중요하며, 간세포 특이적 유전자의 발현에 관여하는 간세포 전사인자인 4알파(HNF-4α)도17 먼저 L4에서 나타나고, 분화 시간 L4-L15에 걸쳐 상승하여 성숙 시간 L15-L24 동안 강력하고 안정적인 발현에 도달합니다.
사이토케라틴 18(CK18)은 간에서 발현되는 중간 필라멘트의 주요 성분 중 하나인 세포골격 단백질입니다18. 결과는 예상대로 CK18 발현이 성숙한 간세포(L15-L24)와 상관관계가 있으며 간세포 전구 세포에서는 발현되지 않는다는 것을 보여줍니다.
2D 배양에서 간세포 분화를 위해 잘 정의된 프로토콜은 BD-PSC로 시작하는 간 3D 배양의 엔지니어링을 가능하게 합니다.
우리는 여기에서 간세포 유도/성숙 배지를 포함하는 낮은 부착 플레이트에서 이러한 세포의 자발적인 응집이 스페로이드 형성을 시작한다는 것을 보여줍니다. 성장 트랙에 이어 L2, L4 및 L7에서 세포를 이미징했습니다. (그림 3A) 스페로이드 부피와 다양한 세포 수 사이에는 그림 3B에 제시된 바와 같이 일관된 상관관계가 있습니다.
간은 인체에 있는 대부분의 약물이 대사되는 기관입니다. 시토크롬 P450은 약물 및 세포 대사, 생체 이물의 해독 및 항상성 과정에서 중추적인 역할을 하는 효소(모노옥시게나제)의 슈퍼패밀리입니다. BD-PSC 유래 간 스페로이드의 잠재적인 기능적 활성을 평가하기 위해 CYP3 및 CYP2 계열의 구성원인 CYP3A4 및 CYP2E1과 같은 약물 대사 효소의 발현을 분석했습니다19.
코데인, 사이클로스포린 A, 에리스로마이신, 아세트아미노펜, 디아제팜 등 오늘날 사용되는 대부분의 약물과 많은 스테로이드 및 발암 물질은 CY3A4 효소20의 활성으로 인해 대사됩니다. CYP2E1은 에틸렌 글리콜, 벤젠, 사염화탄소와 같은 내인성 기질, 특히 니트로사민21과 같은 가장 중요한 돌연변이 유발 화합물의 대사에 관여합니다.
D14의 프로토콜에 따라 형성되고 분화된 스페로이드는 이 두 효소에 대한 항체로 생염색되어 BD-PSC 유래 스페로이드의 잠재적인 간 기능 활성을 보여줍니다(그림 4).
그림 1 : BD-PSC의 간 유사 세포로의 분화. 내배엽 L4 또는 다각형 모양 L8 형태가 L15에서 L24까지 마침내 성숙 상태에 도달하는 것을 보여주는 BD-PSC의 간 분화 전반에 걸친 형태학적 변화의 대표적인 현미경 사진. 스케일 바: 윗줄 50 μm, 아랫줄 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 간세포로의 BD-PSC 재분화의 면역형광 분석. 내배엽/간세포 전구체 및 간세포 특이적 마커는 2D 배양에서 BD-PSC의 간 분화 동안 발현됩니다. L4일에서 L8일까지의 날에 현미경 사진은 내배엽/간 전구체 AFP 및 TTR의 발현이 감소한 반면 L8-L24에서는 발현이 사라진 것을 보여줍니다. 간세포 ALB 및 HNFα 마커의 발현은 L4에서 발생하고 성숙 동안 증가하는 반면, CK18의 발현은 L15에서 먼저 나타나 L24에서 최대치에 도달합니다. 그래프 L4-L15의 스케일 바: 50 μm 및 L24의 스케일 바: 20 μm. 제어는 보충 그림 1에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : BD-PSC의 간 분화시 3D 스페로이드 형성. (A) 1 x 106에서 4000 세포로 시작하는 BD-PSC의 가변 세포 수를 낮은 부착 플레이트에 파종하고 프로토콜에 명시된 2 단계 절차에 따라 분화를 수행했습니다. 3D 인간 간 스페로이드의 생성은 상이한 시점에서 영상화되었으며, 배양 기간 동안 각 시점에서의 대표적인 위상차 영상이 나타났다. 스케일 바: 200μm. (B) 현미경 이미징 소프트웨어를 사용하여 L4에서 각 크기에 대해 최소 4개의 간 스페로이드의 직경을 측정하고 부피를 계산했습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 간세포 기능 마커는 BD-PSC 유래 간 스페로이드에서 발현됩니다. BD-PSC는 간세포로 분화되었습니다. 시토크롬 P450 패밀리의 구성원인 ALB, AFP, CK18, CYP2E1 및 CYP3A4에 대한 항체를 사용하여 L14에서 살아있는 세포에 대해 직접 면역형광 분석을 수행했습니다. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 간세포로의 BD-PSC 재분화의 면역형광 분석을 위한 음성 대조군. 내배엽/간세포 전구체 및 간세포 특이적 마커는 2D 배양에서 BD-PSC의 간 분화 동안 발현됩니다. 스케일 바: 100 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
간은 대사 산물의 해독과 같은 많은 필수 생물학적 기능을 가진 인체의 주요 기관입니다. 간경변 및/또는 바이러스성 간염과 같은 심각한 간부전으로 인해 전 세계적으로 연간 거의 200만 명이 사망합니다. 간 이식은 전 세계적으로 고형 장기 이식에서 2위를 차지하지만 현재 수요의 약 10%만이 충족됩니다22.
원발성 인간 간세포(PHH)는 종종 간 독성을 연구하는 데 사용됩니다. 이 세포는 특정 기능을 유지하면서 짧은 시간 동안 배양 상태를 유지할 수 있습니다. 또한, 단일 기증자로부터 이용 가능한 세포의 수는 제한되어 있으며, 또한 이러한 세포는 배양에서 확장 될 수 없으므로 기증자 PHH의 부족은 간독성 연구의 주요 장애물로 남아 있습니다. PSC는 인간 조직의 재생 공급원을 나타내며 3D 간 배양11의 생성에 사용될 수 있다.
간 3D 배양 시스템은 2D와 비교할 때 여러 가지 장점을 보여줍니다. 분화 시간이 짧아지고 생체 내 공정을 정확하게 모방하여 약물 유발 독성에 대한 보다 정확한 연구를 수행할 수 있고, 간 책임을 더 잘 예측할 수 있으며, 비용 효율성이 더 높습니다23. 자가 특성으로 인한 간 스페로이드 배양은 사용과 관련된 단점을 우회하여 일차 인간 간세포(PHH)에 비해 큰 이점이 될 수 있으며 약물 독성 테스트에 적용하기 위한 황금 표준이 될 수 있으며 재생 의학에 잠재적으로 적용될 수 있습니다.
우리는 여기에서 정상 상태 말초 혈액에서 생성된 BD-PSC가 꾸준한 알부민 분비와 간세포 마커를 발현하는 표현형 안정성을 가진 내배엽/간세포 전구체/성숙 간세포로 성공적으로 분화될 수 있음을 입증했습니다. 또한, 조작된 3D 인간 간세포 스페로이드 배양은 CYP3A4 및 CYP2E1과 같은 시토크롬 P450에 속하는 효소를 발현하여 잠재적인 기능적 활성을 입증합니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 재프로그래밍 프로세스를 위한 양질의 신선한 인간 다국적 물질을 확보하는 것입니다. 냉동된 MNC를 사용하면 재프로그래밍된 세포의 수가 줄어듭니다.
우리는 재프로그래밍된 세포를 성숙한 혈액 세포에서 분리하는 면역자기 분류를 적용하거나 적용하지 않고 활성화된 PBMNC 배양을 사용하여 인간 간 스페로이드를 설계했습니다. 이 두 가지 방법을 사용하는 데 있어 약간의 차이는 정제된 재프로그래밍된 세포를 사용할 때 더 높은 밀도의 3D 구조에 의존합니다. 간세포 마커의 발현은 두 세포 배양 제제 모두에서 일관되게 유지됩니다.
PHH의 제한된 가용성으로 인해 이 방법은 생체 이물 대사 및 간 독성, 숙주-병원체 개입 및 일반적으로 세포 생물학과 같은 시험관 내 간 기능을 연구하기 위해 자가 신선한 간세포에 대한 생물학적으로 가장 가까운 대안을 잠재적으로 나타냅니다. 자가 및 비 기형 유발 성 동안 재생 의학에서 BD-PSC를 사용할 수있는 가능성은 우리 실험실에서 추가 연구의 주제입니다.
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Disclosures
교신 저자는 자신이 Novel human GPI 연결 단백질과 관련된 특허 보유자임을 선언합니다. 그녀는 ACA CELL Biotech GmbH를 공동 설립하고 협력하고 있습니다. 다른 저자들은 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 특히 Oksana와 John Greenacre가 제공 한 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 독일 하이델베르크에 있는 ACA CELL Biotech GmbH의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
References
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