Summary
Burada, kararlı durumdaki periferik kandan izole edilen mononükleer hücreleri kullanarak insan otolog karaciğer sferoidleri üretmek için genetik olmayan bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
İnsan karaciğer hücreleri, fonksiyonel kapasitelerini koruyarak birkaç hafta boyunca kültürde büyüyebilen üç boyutlu (3D) bir yapı oluşturabilir. Düşük yapışkan özelliklere sahip veya hiç yapışkan olmayan kültür yemeklerinde kümelenme doğaları nedeniyle, insan karaciğer sferoidleri olarak adlandırılan çoklu karaciğer hücrelerinin agregalarını oluştururlar. 3D karaciğer sferoidlerinin oluşumu, hepatik hücrelerin yapışkan bir substratın yokluğunda toplanma doğal eğilimine dayanır. Bu 3D yapılar, in vivo bir ortama daha yakın olan hücrelerden daha iyi fizyolojik tepkilere sahiptir. 3D hepatosit kültürlerinin kullanılması, klasik iki boyutlu (2D) kültürlerle karşılaştırıldığında, biyolojik olarak daha alakalı bir mikro çevre, doğal organları yeniden bir araya getiren mimari morfolojinin yanı sıra hastalık durumu ve ilaçlara in vivo benzeri yanıtlar hakkında daha iyi bir tahmin de dahil olmak üzere sayısız avantaja sahiptir. Birincil karaciğer dokusu veya ölümsüzleştirilmiş hücre hatları gibi sferoidler üretmek için çeşitli kaynaklar kullanılabilir. 3D karaciğer dokusu, hepatositleri türetmek için insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) veya indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler) kullanılarak da tasarlanabilir. İnsan zarına bağlı GPI'ye bağlı proteinin aktivasyonu ile manipüle edilmemiş periferik kandan üretilen ve insan hepatositlerine farklılaşan kan kaynaklı pluripotent kök hücreler (BD-PSC'ler) kullanarak insan karaciğer sferoidleri elde ettik. BD-PSC'lerden türetilen insan karaciğer hücreleri ve insan karaciğer sferoidleri, insan hepatosit belirteçleri kullanılarak ışık mikroskobu ve immünofenotipleme ile analiz edildi.
Introduction
Son yıllarda üç boyutlu (3D) küresel kültür sistemleri, kanser araştırmalarının, ilaç keşfinin ve toksikolojinin çeşitli alanlarını incelemek için önemli bir araç haline gelmiştir. Bu tür kültürler büyük ilgi uyandırıyor çünkü iki boyutlu (2B) hücre kültürü monokatmanları ile karmaşık organlar arasındaki boşluğu dolduruyorlar1.
Yapışkan bir yüzeyin yokluğunda, 2D hücre kültürüne kıyasla, sferoidlerin oluşumu, bu hücrelerin 3D formda kümelenmeye olan doğal afinitesine dayanır. Bu hücreler kendilerini bir veya daha fazla olgun hücre tipinden oluşan gruplar halinde düzenlerler. Yabancı maddeler içermeyen bu hücreler, orijinal mikro ortamlarında olduğu gibi birbirleriyle etkileşime girerler. 3B kültürdeki hücreler çok daha yakındır ve birbirlerine doğru doğru bir yönelime sahiptir, 2B kültürlerden daha yüksek hücre dışı matriks üretimi vardır ve doğal ortama yakın bir ortam oluştururlar 2.
Hayvan modelleri, insan biyolojisini ve hastalıklarını incelemek için uzun zamandır kullanılmaktadır3. Bu bağlamda, insanlar ve hayvanlar arasında içsel farklılıklar vardır, bu da bu modelleri ekstrapolatif çalışmalar için tamamen uygun kılmaz. 3D kültür sferoidleri ve organoidleri, in vivo olarak ortaya çıkan ve hayvan modellerinin azaltılmasına veya hatta değiştirilmesine katkıda bulunabilecek farklı hücre tipleri arasındaki doku benzeri mimariyi, etkileşimi ve çapraz konuşmayı incelemek için umut verici bir araçtır. Karaciğer hastalıklarının patogenezini ve ilaç tarama platformlarını incelemek için özellikle ilgi çekicidirler4.
3D sferoid kültür, kanser araştırmaları için özellikle önemlidir, çünkü tümör hücresi monokatmanlarını 2D kültürlere hazırlamak için gereken tripsinizasyon veya kollajenaz tedavisine olan ihtiyacı azaltarak hücreler ve çevreleri arasındaki süreksizliği ortadan kaldırabilir. Tümör sferoidleri, normal ve malign hücrelerin çevrelerinden gelen sinyalleri nasıl aldıklarının ve bunlara nasıl tepki verdiklerinin incelenmesini sağlar5 ve tümör biyolojisi çalışmalarının önemli bir parçasıdır.
Tek katmanla karşılaştırıldığında, çeşitli hücre tiplerinden oluşan 3D kültürler, yapısal ve fonksiyonel özelliklerinde tümör dokularına benzemektedir ve bu nedenle metastazı ve tümör hücrelerinin invazyonunu incelemek için uygundur. Bu nedenle bu tür küresel modeller kanser araştırmalarının hızlandırılmasına katkıdabulunuyor 6.
Sferoidler ayrıca insan organoidleri yaratma teknolojisinin geliştirilmesine yardımcı oluyor, çünkü doku ve organ biyolojisinin incelenmesi, özellikle insanlarda çok zor. Kök hücre kültüründeki ilerlemeler, kök hücrelerden ve doku progenitörlerinden oluşan organoidler gibi 3D kültürlerin yanı sıra, organ gelişimini, hastalıkları modellemek için kullanılabilecek gerçek bir organ gibi bazı fonksiyonel özelliklere sahip bir organdan farklı olgun (doku) hücre tiplerinin geliştirilmesini mümkün kılmaktadır, ancak rejeneratif tıpta da yararlı sayılabilir7.
Birincil insan hepatositleri genellikle insan hepatositlerinin, karaciğer fonksiyonunun ve ilaca bağlı toksisitenin in vitro biyolojisini incelemek için kullanılır. İnsan hepatositlerinin kültürlerinin iki ana dezavantajı vardır, birincisi, insan hepatositleri gibi birincil dokunun sınırlı mevcudiyeti ve ikincisi, hepatositlerin 2D kültürde hızla farklılaşma eğilimi ve böylece spesifik hepatosit fonksiyonlarını kaybetme eğilimi8. 3D hepatik kültürler bu konuda üstündür ve son zamanlarda farklılaşmış insan embriyonik kök hücrelerinden (hESC'ler) veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler)9 yapılmıştır. Biyomühendislik hepatik 3D sferoidler, karaciğerin gelişimini, toksisitesini, genetik ve bulaşıcı hastalıklarını incelemek ve ayrıca karaciğer hastalıklarının tedavisi için ilaç keşfinde özellikle ilgi çekicidir10. Son olarak, akut karaciğer hastalıklarının yaklaşık% 80'lik bir mortalite oranına sahip olduğunu bilerek, biyo-yapay karaciğer ve / veya hepatik sferoidlerin, uygun bir donör bulunana kadar kısmi karaciğer fonksiyonu sağlayarak bu hastaları potansiyel olarak kurtarabileceğini bilerek, klinik olarak kullanılma potansiyeline sahiptirler11.
4000 ila 1 x 106 hücre içeren farklı büyüklükteki sferoidleri hazırlamak için kan kaynaklı pluripotent kök hücreler (BD-PSC'ler) kullanarak insan hepatik sferoidlerinin üretimi için bir protokol oluşturduk ve bunları ışık mikroskobu ve immünofloresan yoluyla analiz ettik. Ayrıca, detoksifikasyon süreci boyunca hücresel ve ilaç metabolizmasında önemli rollere sahip sitokrom P450 ailesine ait sitokrom P450 3A4 (CYP3A4) ve 2E1 (CYP2E1) enzimlerinin ekspresyonunu değerlendirerek hepatosit-spesifik fonksiyonun kapasitesini test ettik12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu deneylerin yapılması için etik onay (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) alınmış ve kurumsal kılavuzlara uygun olarak kan alınmadan önce tüm donörler tarafından bilgilendirilmiş onam imzalanmıştır.
1. İnsan periferik kanından (PB) mononükleer hücrelerin (ÇUŞ'lar) hazırlanması
- Standart protokole göre eğitimli tıbbi personelin yardımıyla sağlıklı donörlerden 30 mL kan alın.
- PBMNC'leri yoğunluk gradyanı ortamını kullanarak Becker-Kojić ve ark.13 tarafından yayınlanan protokole göre izole edin. Pipetleme yoluyla, plazma ve yoğunluk gradyanı ortamı arasındaki fazlar arası tabakayı izole edin ve izole edilmiş hücreleri yıkamak için steril fosfat tampon salin (PBS) kullanın.
- Bir sayım odası kullanın ve standart yöntemleri kullanarak hücre sayısını sayın.
2. İnsan GPI'sına bağlı glikoprotein ile aktivasyon üzerine ÇUŞ'ların farklılaşması
- Bir polistiren tüpünde (15 mL) PBS / % 1 sığır serum albüminine (BSA) 6 x 106 mononükleer hücre yerleştirin ve Becker-Kojić ve ark.13'e göre 37 ° C'de 30 dakika boyunca spesifik antikor ile inkübe edin.
- Hücreleri oda sıcaklığında 300 x g'da santrifüj edin ve PBS / BSA'yı, Iscove'un% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş modifiye edilmiş Dulbecco ortamı ile değiştirin.
- Becker-Kojić ve ark.13'te açıklandığı gibi, 15 mL polistiren tüplerdeki hücreleri, 37 ° C'de 37 ° C'de% 5'lik bir CO2 inkübatöründe 8-10 gün boyunca büyütün. 5. günde (D5), her 15 mL tüpe %10 FBS ile desteklenmiş 1-2 mL Iscove ortamı ekleyin.
3. Yeni oluşturulan farklılaşmış hücrelerin sıralanması
- Oda sıcaklığında kültürlü hücre süspansiyonunu 300 x g'da 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve Becker-Kojić ve ark.13'e göre elde edilen süpernatantı steril bir pipetle aspire edin.
- 90 μL soğuk PBS tamponunda (PBS pH 7.2, % 0.5 BSA ve 2 mM EDTA) santrifüjleme ile elde edilen peleti yeniden askıya alın ve 10 μL CD45 pozitif nano boyutlu manyetik boncuk ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- Hücre süspansiyonunu 2 mL PBS tamponu ile yıkayın, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve hücrelere 500 μL PBS tamponu ekleyin ve iyice askıya alın.
- Pipet 500 μL önceden soğutulmuş PBS tamponunu kolona yıkayıp manyetik bir stand kullanarak manyetik alana yerleştirin.
- Kolon üzerine yerleştirilen hücreleri, 500 μL PBS tamponu ile iki kez yıkayın ve% 10 FBS ile desteklenmiş Iscove'un ortamında CD45 negatif hücreleri içeren akış toplayın.
- Yeniden programlanmış hücrelerin sayısını belirlemek için bir sayım odası kullanın.
4. İnsan hepatositlerinin üretimi için cam kapakların hazırlanması
- Cam kapakları ayırın (14 mm) ve 10 dakika boyunca iyonik olmayan deterjanda inkübe edin. Cam kapakları deiyonize suda kabarcık kalmayana kadar yıkayın ve 30 dakika boyunca 1M HCl'de inkübe edin (Marchenko ve ark.14'ten uyarlanmıştır).
- Cam kapakları deiyonize suyla en az 3 kat yıkayın ve gece boyunca oda sıcaklığında kurutun. Otoklav kurutulmuş cam kapaklar uygun bir kapta kayar.
5. BD-PSC'lerin 2D hepatik farklılaşması için hücre kültürü plakalarının biyolaminin ile kaplanması
- Steril bir çift cımbızla otoklavlanmış cam kapakları 4 kuyucuk plakasına yerleştirin ve steril koşullar sağlamak için UV ışıklarını 30 dakika boyunca açın.
- Biyolaminin alikotlarını çözün ve her cam kapak kaymasına 120 μL 5 μg / mL biyolaminin ekleyin. Kaplamalı cam kapakları gece boyunca 4 °C'de bırakın.
- Biyolaminin fazlalığını çıkarın ve aşağıda açıklandığı gibi 200 μL hepatosit farklılaşma ortamı ekleyin.
6. Hepatosit farklılaşma ortamının hazırlanması
- % 76.4 nakavt DMEM (ko-dmem),% 20 KSR,% 0.5 L-glutamin,% 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA),% 0.1 β-merkaptoetanol,% 1 DMSO ve% 1 penisilin-streptomisin (Pen / Strep) içeren 500 mL hepatoblast nakavt serum replasmanı (KSR) / dimetil sülfoksit (DMSO) ortamı yapın.
- % 1 L-glutamin, 10 μM hidrokortizon 21-hemissüksinat sodyum tuzu (HCC) ve% 1 Pen / Strep içeren 500 mL hepatosit olgunlaşma ortamı hazırlayın.
- Stoktan alınan alikot besiyeri ve her ortam değişimi için 10 ng / mL ve / veya 20 ng / mL'lik son konsantrasyonlarda taze hepatosit büyüme faktörü (HGF) ve onkostatin M (OSM) ekleyin.
NOT: Onkostatin M, hematopoez ve karaciğer gelişimi için önemli olan interlökin 6 sitokin grubuna ait bir sitokindir.
7. BD-PSC'lerden farklılaşmış hepatik hücrelerin kültürlenmesi
- 3 x 105 BD-PSCS hücresini, biyolaminin ile kaplanmış 4 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna koyun.
- 4 delikli plakaları inkübatöre 37 °C ve% 5 CO2'ye yerleştirin. Endodermal farklılaşmayı destekleyen KSR / DMSO hepatoblast ortamında hücreleri 5 gün boyunca kültürleyin ve ortamı her iki günde bir değiştirin.
- 5. günde hepatosit olgunlaşma ortamına geçin ve hücreleri inkübatörde 37 ° C ve% 5 CO2'de 7-10 gün daha kültürleyin. Ortamı her 48 saatte bir değiştirin.
8.3D küresel hepatik farklılaşma
- Bir sayım odası kullanarak hücreleri sayın.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj BD-farklılaştırılmış hücre süspansiyonu. Süpernatantı çıkarın ve BD-farklılaştırılmış hücreleri KSR / DMSO ortamında 2 x 106 hücre / mL'de yeniden askıya alın.
- Tek hücreli bir süspansiyon sağlamak ve ek kalıntıları gidermek için hücreleri 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
- Bir sayım odası kullanarak hücreleri sayın ve kuyucuk başına gerekli hacmi dağıtmak için her hücre tohumlama yoğunluğu için yeterli bir hacim hazırlayın. 4000 hücrelik düşük bir tohumlama yoğunluğuna 1 x 106 hücreli üst tohumlama ile bir gradyan hazırlayın.
- 96 iyi düşük bağlantı plakasına 100 μL KSR / DMSO ortamı dağıtın ve 100 μL hücre tohumlama seyreltmesi ekleyin.
- Düşük bağlantı plakasını inkübatöre 37 ° C ve% 5 CO2'ye yerleştirin ve 5 gün boyunca kültürleyin.
- Sferoidler yeterince kompakt olduğunda, tohumlamadan sonra ortamın% 50'sini 3-4 gün arasında değiştirin.
- 5. günde, ortamı hepatosit olgunlaşma ortamına değiştirin ve daha fazla olgunlaşma için hücreleri 7-10 gün daha kültürleyin. Ortamı her iki günde bir değiştirin.
9. Yeni üretilen 2D karaciğer hücre kültürlerinin immünofloresan analizi
- Hücreleri yukarıda açıklanan farklılaşma yöntemine göre 4, 8, 15 ve 24 gün boyunca kültürleyin ve ortamları çıkarın.
- PBS'de 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içeren önceden ısıtılmış fiksatif ile hücreleri inkübe edin. Fiksatifi atın ve hücreleri her biri 5 dakika boyunca PBS ile 2 kat yıkayın. Hemen% 0.1 triton X-100 çözeltisi ekleyin ve hücreleri 5 dakika geçirgenleştirin. PBS ile 2 kat yıkayın.
- PBS ve% 5 BSA'dan yapılmış blokaj çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca rocker plakasına yerleştirin.
- Seyreltme tamponundaki primer antikorları %1 BSA/PBS olarak aşağıdaki gibi seyreltin: albümin (ALB) 1:50, alfa-1 fetoprotein (AFP) 1:250, sitokeratin 18 (CK18) 1:50, hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) 1:1000 ve transtiretin (TTR) 1:50. Kuyucuk başına 50 μL antikor seyreltme kullanın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra antikor çözeltisini atın, hücreleri 5 dakika yıkayın ve yıkama adımını 3x tekrarlayın.
- Seyreltme tamponunda aşağıdaki ikincil antikorları hazırlayın: tavşan anti-tavuk IgG (Teksas kırmızısı) 1:1000, keçi anti-fare IgG (488) 1:1000 ve keçi anti-tavşan (488) 1:500. Kuyucuk başına 50 μL antikor seyreltmesi kullanın ve hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Hücreleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kat yıkayın ve mikroskobik analiz için kapak kapaklarını DAPI içeren montaj ortamıyla monte edin.
10. Yeni oluşan karaciğer sferoidlerinin canlı boyanması
- Sferoidlere dokunmadan kültür ortamını dikkatlice atın,% 0.1 triton X-100 çözeltisi ile taze yapılmış PBS ekleyin ve hücreleri geçirgenleştirmek için 5 dakika boyunca inkübe edin.
- Sferoidleri 5 dakika boyunca yavaşça pipetleyerek ortamla yıkayın, 2x tekrarlayın.
- Sferoidleri, PBS'de hazırlanan birincil antikorlar ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) ve CYP3A4 (1:200) ile 37 °C'de %5 CO2 inkübatöründe 1 saat boyunca %1 BSA ile inkübe edin. Kuyucuk başına 50 μL antikor seyreltme kullanın.
- Fazla antikor çözeltisini dikkatlice çıkarın ve sferoidleri orta 3x ile yıkayın.
- PBS'de keçi anti-tavşan (488) için karşılık gelen ikincil antikorları keçi anti-fare IgG (Cy3), keçi anti-fare IgG (488) ve tavşan anti-tavuk IgG (Teksas kırmızısı)% 1 BSA'da PBS'de keçi anti-tavşan (488) için 1:1000 ve 1:500 seyreltmede hazırlayın. Kuyucuk başına 50 μL antikor seyreltme kullanın ve inkübatörde 37 °C ve% 5 CO2'de 20 dakika inkübe edin.
- 3x'i orta dereceli olarak dikkatlice yıkayın ve floresan mikroskobu yapmadan önce plakayı inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 30 dakika bekletin.
11. Floresan mikroskobu kullanılarak sferoidlerin incelenmesi
- Kullanmadan 10 dakika önce floresan ışık kaynağını açın, bilgisayarı açın ve görüntüleme yazılımını açın.
- 4x büyütmeli bir hedef kullanın, doğru ölçek çubuğunun seçilmesi için araç çubuğundaki 4x düğmesine tıklayın, ardından 96 delikli plakayı sahne alanı orta plakasına yerleştirin.
- LED ışık kaynağını açın, parlak alan filtresini kullanın ve x-y ekseni sahne alanı ayarlama düğmesini kullanarak plakayı ilgilendiğiniz kuyuya yerleştirin.
- Kamera ışık yoluna geçin, ekrandaki görüntüyü görselleştirmek için Görüntüleme yazılımında yaşa düğmesine tıklayın ve x-y ekseni düğmeleri kullanılarak kürenin ortalandığından emin olun ve kaba/ince netleme düğmesini kullanarak netleyin.
NOT: Sferoidlerin şekli, canlı boyama uygulandıktan sonra sabit kalır. - Araç çubuğunda Brightfield Gözlem yöntemini seçin, pozlama ayarlarını otomatik konuma getirin ve fotoğraf çekmek için fotoğraf makinesi kontrol panelindeki Anlık Görüntü düğmesini tıklatın. Ardından, ilgilendiğiniz klasördeki uygun adı kullanarak resmi .vsi dosyası olarak kaydedin.
- LED ışığını kapatmak için ortam ışığı koruma plakasını yerleştirin, B-uyarımı filtresine geçin, araç çubuğunda 488 Gözlem yöntemini seçin, deklanşörü açın, Anlık Görüntü düğmesini tıklayarak fotoğraf çekin, deklanşörü kapatın, ardından dosyayı yukarıda açıklandığı gibi kaydedin.
- Bunu, uygun gözlem yöntemini (Teksas kırmızısı veya CY3) kullanarak G-uyarma için bir filtre ile tekrarlayın. Ardından, her bir ilgi kuyusu için tüm prosedürü tekrarlayın.
- Plakayı 37 °C'de% 5 CO2 inkübatöre geri koyun ve yukarıda açıklandığı gibi kültürleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İki aşamalı bir protokol uygulayarak insan BD-PSC'lerini endoderm/hepatik progenitör hücrelere ve hepatositlere başarıyla ayırdık. Hepatik farklılaşma sürecindeki morfolojik değişiklikler Şekil 1'de gösterilmiştir. BD-PSC'ler üç farklı aşamadan geçen hepatositlere farklılaşır. İlk aşama, tipik bir poligonal morfoloji sergileyen hepatik progenitör hücrelere (hepatoblast) L8'e farklılaşmayı ve üçüncüsü, hepatositler L15-L24'e olgunlaşmayı temsil eder.
Şekil 2'de gösterildiği gibi BD-PSC'lerin hepatik farklılaşmasını doğrulamak için immünofloresan analizi yapıldı. Fetal serumda yetişkin organizmalarda konsantrasyonu çok düşük olan ve bu nedenle hepatositlerin öncüsü15 ve tiroksinin kan dolaşımından beyne taşınmasında rol oynayan önemli bir tiroid hormonu bağlayıcı protein olan transtiretin (TTR) için bir belirteç olarak kabul edilen alfa-fetoprotein (AFP) gibi endoderm / insan karaciğer progenitör belirtecinin güçlü ekspresyonu16 L4 ila L8'deki hepatik farklılaşma sürecinin ilk aşamasında hücrelerde bulunur. Bununla birlikte, ekspresyonları L15'te azalırken, esas olarak karaciğer tarafından üretilen ve hepatik farklılaşma için tamamen kritik olan en bol plazma proteini olan albümin (ALB) ekspresyonunun yanı sıra karaciğere özgü genlerin ekspresyonunda rol oynayan bir hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF-4α)17 ilk olarak L4'te ortaya çıkar, farklılaşma süresi boyunca yükselir L4-L15, olgunlaşma süresi L15-L24 sırasında güçlü ve istikrarlı bir ifadeye ulaşır.
Sitokeratin 18 (CK18), karaciğer18'de eksprese edilen ara filamentin ana bileşenlerinden biri olan bir sitoiskelet proteinidir. Sonuçlar, beklendiği gibi, CK18 ekspresyonunun olgun hepatositlerle (L15-L24) ilişkili olduğunu ve hepatosit progenitör hücrelerinde eksprese edilmediğini göstermektedir.
2D kültürlerde hepatosit farklılaşması için iyi tanımlanmış protokol, BD-PSC'lerden başlayarak hepatik 3D kültürlerin mühendisliğini mümkün kılar.
Burada, bu hücrelerin hepatosit indüksiyonu/olgunlaşma ortamı içeren düşük ataşman plakalarında kendiliğinden toplanmasının sferoid oluşumu başlattığını gösteriyoruz. Büyüme izini L2, L4 ve L7'deki görüntüleme hücreleri izledi. (Şekil 3A) Şekil 3B'de gösterildiği gibi, küresel hacim ile değişken hücre sayısı arasında tutarlı bir korelasyon vardır.
Karaciğer, insan vücudundaki ilaçların çoğunun metabolize olduğu bir organdır. Sitokrom P450, ilaç ve hücresel metabolizma, ksenobiyotiklerin detoksifikasyonu ve homeostaz süreçlerinde çok önemli olan enzimlerin (monooksijenazlar) bir üst ailesidir. BD-PSC'lerden türetilen hepatik sferoidlerin potansiyel fonksiyonel aktivitesini değerlendirmek için, CYP3A4 ve CYP2E1 gibi ilaç metabolize edici enzimlerin, CYP3 ve CYP2 ailelerinin üyeleri19'un ekspresyonunu analiz ettik.
Günümüzde kodein, siklosporin A, eritromisin, asetaminofen ve diazepamın yanı sıra birçok steroid ve kanserojen de dahil olmak üzere kullanılan ilaçların çoğu, CY3A4 enzimi20'nin aktivitesi nedeniyle metabolize edilir. CYP2E1, etilen glikol, benzen, karbon tetraklorür gibi endojen substratların ve özellikle nitrozamin21 gibi en önemli yüksek mutajenik bileşiğin metabolizmasında rol oynar.
D14'teki protokole göre oluşan ve farklılaşan, bu iki enzime karşı antikorlarla boyanmış olarak yaşayan sferoidler, BD-PSC'lerden türetilen sferoidlerin potansiyel hepatik fonksiyonel aktivitesini ortaya koymaktadır (Şekil 4).
Şekil 1: BD-PSC'lerin hepatik benzeri hücrelere farklılaşması. Endodermal L4 veya çokgen şekil L8 morfolojisini gösteren BD-PSC'lerin hepatik farklılaşması boyunca morfolojik değişikliklerin temsili mikrografları sonunda L15 ila L24'te olgunlaşma durumuna ulaşır. Ölçek çubukları: üst sıra 50 μm, alt satır 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: BD-PSC'lerin hepatik hücrelere doğru yeniden farklılaşmasının immünofloresan analizi. Endoderm/hepatositler progenitör ve hepatositlere özgü belirteçler, 2D kültürlerde BD-PSC'lerin karaciğer farklılaşması sırasında eksprese edilir. L4 ila L8 günlerinde, mikrograflar endoderm / hepatik progenitör AFP ve TTR'nin ekspresyonunun azaldığını gösterirken, ekspresyonları L8-L24'ten kayboldu. Hepatositlerin ALB ve HNFa belirteçlerinin ekspresyonu L4'te ortaya çıkar ve olgunlaşma sırasında artarken, CK18 ekspresyonu ilk olarak L15'te ortaya çıktı ve L24'te maksimuma ulaştı. L4-L15: 50 μm ve L24: 20 μm grafikler için ölçek çubukları. Kontrol Ek Şekil 1'de sunulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: BD-PSC'lerin hepatik farklılaşması üzerine 3D sferoidlerin oluşumu. (A) BD-PSC'lerin 1 x 106 ila 4000 hücre ile başlayan değişken hücre sayıları düşük bağlantı plakalarına tohumlandı ve Protokolde belirtildiği gibi iki aşamalı prosedüre göre farklılaşma yapıldı. 3D insan karaciğeri sferoidlerinin oluşumu farklı zaman noktalarında görüntülendi, kültür zaman periyodu boyunca her seferinde temsili faz kontrast görüntüleri gösterildi. Ölçek çubuğu: 200 μm. (B) Her boyut için en az 4 hepatik sferoidin çapları mikroskop görüntüleme yazılımı kullanılarak L4'te ölçüldü ve hacimler hesaplandı. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hepatosit fonksiyonel belirteçleri BD-PSC kaynaklı karaciğer sferoidlerinde eksprese edilir. BD-PSC'ler hepatositlere ayrıldı. L14'teki canlı hücreler üzerinde, sitokrom P450 ailesinin üyeleri olan ALB, AFP, CK18 ve CYP2E1 ve CYP3A4'e karşı antikorlar kullanılarak doğrudan immünofloresan analizi yapıldı. Ölçek çubuğu: 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: BD-PSC'lerin hepatik hücrelere doğru yeniden farklılaşmasının immünofloresan analizi için negatif kontrol. Endoderm/hepatositler progenitör ve hepatositlere özgü belirteçler, 2D kültürlerde BD-PSC'lerin karaciğer farklılaşması sırasında eksprese edilir. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karaciğer, insan vücudunda, metabolitlerin detoksifikasyonu gibi birçok temel biyolojik fonksiyona sahip önemli bir organdır. Siroz ve / veya viral hepatit gibi ciddi karaciğer yetmezliği nedeniyle, dünya çapında yılda yaklaşık 2 milyon ölüm vardır. Karaciğer nakilleri tüm dünyada solid organ nakillerinde ikinci sırada yer almakla birlikte mevcut ihtiyacın sadece %10'u karşılanmaktadır22.
Birincil insan hepatositleri (PHH) genellikle karaciğer toksisitesini incelemek için kullanılır. Bu hücreler, spesifik işlevlerini koruyarak kısa bir süre kültürde tutulabilir. Ayrıca, tek bir donörden elde edilebilecek hücre sayısı sınırlıdır, ayrıca bu hücreler kültürde genişletilemez, bu nedenle donör PHH eksikliği hepatotoksisite çalışmaları için ana engel olmaya devam etmektedir. PSC'ler insan dokularının yenilenme kaynağını temsil eder ve 3D hepatik kültürlerin oluşturulması için kullanılabilir11.
Karaciğer 3D kültür sistemleri, 2D ile karşılaştırıldığında birçok avantaj göstermektedir. Daha kısa farklılaşma süresi ve in vivo süreçlerin doğru bir şekilde taklit edilmesi, ilaca bağlı toksisite hakkında daha kesin çalışmalar, karaciğer sorumluluğunun daha iyi tahmin edilmesini sağlar ve daha uygun maliyetlidir23. Otolog özelliklerinden dolayı karaciğer sferoid kültürleri, kullanımlarıyla ilgili dezavantajları ortadan kaldıran primer insan hepatositlerine (PHH) göre büyük bir avantaj olabilir ve ilaç toksisitesinin test edilmesinde uygulama için altın standart haline gelebilir ve rejeneratif tıpta gelecekteki potansiyel bir uygulamaya sahip olabilir.
Burada, kararlı durumdaki periferik kandan üretilen BD-PSC'lerin, stabil albümin sekresyonu ve hepatosit belirteçlerini eksprese eden fenotipik stabilite ile endodermal/hepatosit progenitörleri/matür hepatositlere başarılı bir şekilde ayırt edilebileceğini gösterdik. Ayrıca, mühendislik ürünü 3D insan hepatosit sferoid kültürleri, CYP3A4 ve CYP2E1 gibi sitokrom P450'ye ait enzimleri eksprese ederek potansiyel fonksiyonel aktiviteyi göstermektedir.
Protokoldeki en önemli adım, yeniden programlama süreci için kaliteli ve sayıda taze insan ÇUŞ'u elde etmektir. Dondurulmuş MNC'lerin kullanımı, yeniden programlanmış hücre sayısının azalmasına neden olur.
İnsan karaciğer sferoidlerini, yeniden programlanmış hücreleri olgun kan hücrelerinden ayıran immünomanyetik sıralama uygulayan ve uygulamayan aktif PBMNC kültürlerini kullanarak tasarladık. Bu iki yöntemi kullanmadaki küçük fark, saflaştırılmış yeniden programlanmış hücreler kullanıldığında 3D yapının daha yüksek yoğunluğuna dayanır. Hepatosit belirteçlerinin ekspresyonu her iki hücre kültürü preparatında da tutarlı kalır.
PHH'nin sınırlı mevcudiyeti nedeniyle, yöntem potansiyel olarak ksenobiyotik metabolizmalar ve karaciğer toksisitesi, konakçı-patojen müdahalesi ve genel olarak hücre biyolojisi gibi in vitro hepatik fonksiyonu incelemek için otolog taze hepatositlere biyolojik olarak en yakın alternatifi temsil eder. BD-PSC'lerin rejeneratif tıpta otolog ve teratojenik olmayan bir dönemde kullanılma olasılığı laboratuvarımızda ileri çalışmalara konu olmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sorumlu yazar, Yeni insan GPI'ya bağlı protein ile ilgili bir patent sahibi olduğunu beyan eder. ACA CELL Biotech GmbH'nin kurucu ortağı ve çalışanıdır. Diğer yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar özellikle Oksana ve John Greenacre tarafından sağlanan teknik yardım için minnettarlar. Bu çalışma ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Almanya tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
- Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
- Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
- Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
- Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
- Crandall, B. F.
- Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
- Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
- Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
- Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
- Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
- Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S.
- Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).
