Summary
Здесь мы представляем негенетический метод получения аутологичных сфероидов печени человека с использованием мононуклеарных клеток, выделенных из стационарной периферической крови.
Abstract
Клетки печени человека могут образовывать трехмерную (3D) структуру, способную расти в культуре в течение нескольких недель, сохраняя свою функциональную способность. Из-за своей природы группироваться в культуральных чашках с низкими или отсутствующими адгезионными характеристиками они образуют агрегаты из нескольких клеток печени, которые называются сфероидами печени человека. Формирование 3D-сфероидов печени зависит от естественной склонности печеночных клеток к агрегации в отсутствие адгезивного субстрата. Эти 3D-структуры обладают лучшими физиологическими реакциями, чем клетки, которые ближе к среде in vivo . Использование 3D-культур гепатоцитов имеет множество преимуществ по сравнению с классическими двумерными (2D) культурами, включая более биологически значимое микроокружение, архитектурную морфологию, которая воссобирает естественные органы, а также лучшее прогнозирование состояния болезни и реакций in vivo на лекарства. Для получения сфероидов могут использоваться различные источники, такие как первичная ткань печени или иммортализированные клеточные линии. 3D-ткань печени также может быть сконструирована с использованием эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) для получения гепатоцитов. Мы получили сфероиды печени человека с использованием плюрипотентных стволовых клеток, полученных из крови (BD-PSCs), полученных из необработанной периферической крови путем активации связанного с мембраной GPI-связанного белка человека и дифференцированного в гепатоциты человека. Клетки печени человека, полученные из BD-PSCs, и сфероиды печени человека были проанализированы с помощью световой микроскопии и иммунофенотипирования с использованием маркеров гепатоцитов человека.
Introduction
В последние годы трехмерные (3D) системы культивирования сфероидов стали важным инструментом для изучения различных областей исследований рака, открытия лекарств и токсикологии. Такие культуры вызывают большой интерес, поскольку они устраняют разрыв между двумерными (2D) монослоями клеточных культур и сложными органами1.
При отсутствии адгезивной поверхности, по сравнению с 2D-культурой клеток, образование сфероидов основано на естественном сродстве этих клеток к кластеризации в 3D-форме. Эти клетки организуются в группы, состоящие из одного или нескольких типов зрелых клеток. Свободные от чужеродных материалов, эти клетки взаимодействуют друг с другом, как в своем первоначальном микроокружении. Клетки в 3D-культуре намного ближе и имеют правильную ориентацию друг к другу, с более высокой продукцией внеклеточного матрикса, чем в 2D-культурах, и представляют собой близкую к естественной среду 2.
Модели на животных уже давно используются для изучения биологии и болезней человека3. В связи с этим существуют внутренние различия между людьми и животными, что делает эти модели не совсем пригодными для экстраполятивных исследований. Сфероиды и органоиды 3D-культур представляют собой многообещающий инструмент для изучения тканеподобной архитектуры, взаимодействия и перекрестных помех между различными типами клеток, которые происходят in vivo и могут способствовать уменьшению или даже замене моделей животных. Они представляют особый интерес для изучения патогенеза заболеваний печени, а также платформ скрининга лекарств4.
3D-сфероидная культура имеет особое значение для исследований рака, поскольку она может устранить разрыв между клетками и их окружением, уменьшая потребность в трипсинизации или лечении коллагеназой, необходимой для подготовки монослоев опухолевых клеток к 2D-культурам. Опухолевые сфероиды позволяют изучать, как нормальные и злокачественные клетки получают и реагируют на сигналы из своего окружения5 , и являются важной частью исследований биологии опухолей.
По сравнению с монослоем 3D-культуры, состоящие из различных типов клеток, по своим структурным и функциональным свойствам напоминают опухолевые ткани и поэтому подходят для изучения метастазирования и инвазии опухолевых клеток. Вот почему такие сфероидные модели способствуют ускорению исследований рака6.
Сфероиды также помогают разрабатывать технологию создания органоидов человека, потому что биология тканей и органов очень сложна для изучения, особенно у людей. Прогресс в культивировании стволовых клеток позволяет разрабатывать 3D-культуры, такие как органоиды, состоящие из стволовых клеток и тканевых предшественников, а также различные типы зрелых (тканевых) клеток из органа с некоторыми функциональными характеристиками, такими как реальный орган, которые могут быть использованы для моделирования развития органов, заболеваний, но их также можно считать полезными в регенеративной медицине7.
Первичные гепатоциты человека обычно используются для изучения in vitro биологии гепатоцитов человека, функции печени и лекарственно-индуцированной токсичности. Культуры гепатоцитов человека имеют два основных недостатка, во-первых, ограниченную доступность первичной ткани, такой как гепатоциты человека, и, во-вторых, склонность гепатоцитов к быстрой дедифференцировке в 2D-культуре, тем самым теряя свою специфическую функцию гепатоцитов8. 3D-культуры печени превосходят в этом отношении и недавно были изготовлены из дифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs)9. Биоинженерные печеночные 3D-сфероиды представляют особый интерес для изучения развития, токсичности, генетических и инфекционных заболеваний печени, а также при открытии лекарств для лечения заболеваний печени10. Наконец, они также могут быть использованы клинически, зная, что острые заболевания печени имеют уровень смертности почти 80%, биоискусственная печень и / или сфероиды печени потенциально могут спасти этих пациентов, обеспечивая частичную функцию печени до тех пор, пока не будет найден подходящий донор11.
Мы разработали протокол генерации сфероидов печени человека с использованием плюрипотентных стволовых клеток, полученных из крови (BD-PSCs), для получения сфероидов разного размера, содержащих от 4000 до 1 x 106 клеток, и проанализировали их с помощью световой микроскопии и иммунофлуоресценции. Мы также проверили способность гепатоцит-специфической функции, оценив экспрессию ферментов цитохрома P450 3A4 (CYP3A4) и 2E1 (CYP2E1), принадлежащих к семейству цитохрома P450, которые играют важную роль в клеточном и лекарственном метаболизме в процессе детоксикации12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Было получено этическое одобрение (ACA CELL Biotech GmbH / 25b-5482.2-64-1) для проведения этих экспериментов, и информированное согласие было подписано всеми донорами перед извлечением крови в соответствии с руководящими принципами учреждения.
1. Получение мононуклеарных клеток (ТНК) из периферической крови человека (ПБ)
- Извлеките 30 мл крови от здоровых доноров с помощью обученного медицинского персонала по стандартному протоколу.
- Изолируйте PBMNC с использованием сред с градиентом плотности в соответствии с протоколом, опубликованным Becker-Kojić et al.13. Изолируют с помощью пипетки межфазный слой между плазмой и средой с градиентом плотности и используют стерильный фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) для промывки изолированных клеток.
- Используйте счетную камеру и подсчитайте количество ячеек стандартными методами.
2. Дедифференцировка МНК при активации гликопротеином, закрепленным на GPI человека
- Поместите 6 x 106 мононуклеарных клеток в PBS / 1% бычий сывороточный альбумин (BSA) в полистирольную пробирку (15 мл) и инкубируйте со специфическим антителом в течение 30 мин при 37 ° C в соответствии с Becker-Kojić et al.13.
- Центрифугируйте клетки при 300 x g при комнатной температуре и замените PBS/BSA модифицированной средой Дульбекко от Iscove, дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS).
- Выращивайте клетки в полистирольных пробирках объемом 15 мл в инкубаторе с 5% CO2 при 37 ° C в течение 8-10 дней, как описано в Becker-Kojić et al.13. На 5-й день (D5) добавьте 1-2 мл среды Iscove с добавлением 10% FBS в каждую пробирку объемом 15 мл.
3. Сортировка вновь образованных дедифференцированных клеток
- Центрифугу культивируют клеточную суспензию при комнатной температуре в течение 10 мин при 300 х г и аспирируют стерильной пипеткой полученную надосадочную жидкость по Becker-Kojić et al.13.
- Ресуспендируют гранулы, полученные центрифугированием, в 90 мкл холодного буфера PBS (рН PBS 7,2, 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА) и добавляют 10 мкл положительных наноразмерных магнитных шариков CD45 и инкубируют на льду в течение 15 мин.
- Промойте клеточную суспензию 2 мл буфера PBS, центрифугируйте ее при 300 x g в течение 10 мин при комнатной температуре, добавьте 500 мкл буфера PBS в клетки и тщательно ресуспендируют.
- Пипетка 500 мкл предварительно охлажденного буфера PBS в колонку для промывки и поместить ее в магнитное поле с помощью магнитной подставки.
- Промойте клетки, помещенные на колонку, дважды 500 мкл буфера PBS и соберите проточные клетки, содержащие отрицательные клетки CD45, в среду Iscove, дополненную 10% FBS.
- Используйте счетную камеру для определения количества перепрограммированных ячеек.
4. Подготовка стеклянных покровных листов для генерации гепатоцитов человека
- Отделите стеклянные покровные стекла (14 мм) и инкубируйте их в неионогенном моющем средстве в течение 10 минут. Промойте стекла в деионизированной воде до тех пор, пока не останется пузырьков, и инкубируйте их в 1M HCl в течение 30 минут (адаптировано из Marchenko et al.14).
- Вымойте стеклянные покровные стекла деионизированной водой не менее 3 раз и высушите их в течение ночи при комнатной температуре. В автоклаве высушите стеклянные покровные стекла в подходящей таре.
5. Покрытие планшетов для клеточных культур биоламинином для 2D-дифференцировки печени BD-PSC
- Поместите автоклавные стеклянные покровные стекла стерильным пинцетом в 4-луночные пластины и включите ультрафиолетовое излучение на 30 минут, чтобы обеспечить стерильные условия.
- Разморозьте аликвоты биоламинина и добавьте 120 мкл 5 мкг/мл биоламинина в каждый стакан. Оставьте покровные стекла с покрытием на ночь при температуре 4 °C.
- Удалите избыток биоламинина и добавьте 200 мкл среды для дифференцировки гепатоцитов, как описано ниже.
6. Приготовление сред для дифференцировки гепатоцитов
- Сделайте 500 мл среды для замены сыворотки с нокаутом гепатобласта (KSR)/диметилсульфоксида (ДМСО), состоящей из 76,4% нокаута DMEM (KO-DMEM), 20% KSR, 0,5% L-глютамина, 1% заменимых аминокислот (NEAA), 0,1% β-меркаптоэтанола, 1% DMSO и 1% пенициллина-стрептомицина (Pen / Streptoring).
- Приготовьте 500 мл среды для созревания гепатоцитов, содержащей 1% L-глютамина, 10 мкМ гидрокортизона-21-гемисукцината натриевой соли (ГЦК) и 1% Pen/Strep.
- Аликвотируйте среду из запаса и добавляйте свежий фактор роста гепатоцитов (HGF) и онкостатин М (OSM) в конечных концентрациях 10 нг/мл и/или 20 нг/мл для каждой смены среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Онкостатин М представляет собой цитокин, принадлежащий к группе цитокинов интерлейкина 6, важный для кроветворения, а также для развития печени.
7. Культивирование печеночных клеток, дифференцированных из BD-PSC
- Поместите 3 x 105 клеток BD-PSCS в каждую лунку 4-луночной пластины, покрытой биоламинином.
- Поместите 4-луночные планшеты в инкубатор при температуре 37 °C и 5% CO2. Культивируйте клетки в течение 5 дней в среде гепатобласта KSR/DMSO, которая поддерживает энтодермальную дифференцировку, и меняйте среду через день.
- Переключитесь на среду для созревания гепатоцитов на 5-й день и культивируйте клетки еще 7-10 дней в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2. Меняйте среду каждые 48 ч.
8.3D сфероидная дифференцировка печени
- Подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры.
- Центрифуга BD-дедифференцированная клеточная суспензия в 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать BD-дедифференцированные клетки в среде KSR/DMSO в дозе 2 x 106 клеток/мл.
- Пропустите клетки через сетчатый фильтр 40 мкм, чтобы обеспечить суспензию одной ячейки и удалить дополнительный мусор.
- Подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры и подготовьте достаточный объем для каждой ячейки плотности посева, чтобы распределить необходимый объем на лунку. Подготовьте градиент с верхним посевом 1 x 10 6 ячеек до низкой плотности посева 4000ячеек .
- Распределите 100 мкл среды KSR/DMSO в 96 пластинах с низкой посадкой и добавьте 100 мкл разбавления ячеек.
- Поместите пластину с низкой насадкой в инкубатор при температуре 37 ° C и 5% CO2 и культивируйте их в течение 5 дней.
- Меняйте 50% среды с 3-4 дня после посева, когда сфероиды достаточно уплотняются.
- На 5-й день смените среду на среду созревания гепатоцитов и культивируйте клетки еще 7-10 дней для дальнейшего созревания. Меняйте носитель через день.
9. Иммунофлуоресцентный анализ вновь генерируемых 2D-культур клеток печени
- Культивируют клетки в соответствии с описанным выше методом дифференцировки в течение 4, 8, 15 и 24 дней и удаляют среду.
- Инкубируют клетки с предварительно подогретым фиксатором, состоящим из 4% параформальдегида, в PBS в течение 10 мин. Откажитесь от фиксатора и промойте клетки 2 раза с помощью PBS в течение 5 минут каждая. Немедленно добавьте 0,1% раствор тритона X-100 и проведите в клетках 5 мин. Стирайте 2 раза с помощью PBS.
- Добавьте блокирующий раствор из ПБС и 5% БСА и поместите на коромысло на 1 час при комнатной температуре.
- Разбавляют первичные антитела в буфере разбавления 1% BSA/PBS следующим образом: альбумин (ALB) 1:50, альфа-1-фетопротеин (AFP) 1:250, цитокератин 18 (CK18) 1:50, ядерный фактор гепатоцитов 4 альфа (HNF4α) 1:1000 и транстиретин (TTR) 1:50. Используйте 50 мкл разведения антител на лунку.
- Инкубируют клетки в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем выбросьте раствор антител, промойте клетки в течение 5 минут и повторите шаг промывки 3 раза.
- Приготовьте следующие вторичные антитела в буфере для разведения: кролик против куриного IgG (техасский красный) 1:1000, козий антимышиный IgG (488) 1:1000 и козий антикролик (488) 1:500. Используйте 50 мкл разведения антител на лунку и инкубируйте клетки в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Промойте ячейки 3 раза с помощью PBS в течение 5 минут каждая и установите покровные стекла с монтажными носителями, содержащими DAPI, для микроскопического анализа.
10. Живое окрашивание новообразованных сфероидов печени
- Осторожно выбросьте питательные среды, не касаясь сфероидов, добавьте свежеприготовленный PBS с 0,1% раствором тритона X-100 и инкубируйте в течение 5 минут, чтобы проникнуть в клетки.
- Промойте сфероиды средством, медленно пипетируя в течение 5 минут, повторите 2 раза.
- Инкубируют сфероиды с первичными антителами ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) и CYP3A4 (1:200), приготовленными в PBS с 1% BSA в течение 1 ч в 5%CO2 инкубаторе при 37 °C. Используйте 50 мкл разведения антител на лунку.
- Тщательно удалите излишки раствора антител и промойте сфероиды средой 3х.
- Приготовьте соответствующие вторичные антитела козьего антимышиного IgG (Cy3), козьего антимышиного IgG (488) и кролика антикуриного IgG (техасский красный) в разведении 1:1000 и 1:500 для козьего антикролика (488) в PBS в 1% BSA. Используйте 50 мкл разведения антител на лунку и инкубируйте в течение 20 мин в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
- Тщательно промойте 3 раза средой и оставьте планшет на 30 мин в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 перед проведением флуоресцентной микроскопии.
11. Исследование сфероидов с помощью флуоресцентного микроскопа
- Включите источник флуоресцентного света за 10 минут до использования, включите компьютер и откройте программное обеспечение для обработки изображений.
- Используйте объектив с 4-кратным увеличением, нажмите кнопку 4x на панели инструментов, чтобы выбрать правильную масштабную линейку, затем поместите 96-луночную пластину на центральную пластину сцены.
- Включите светодиодный источник света, используйте фильтр светлого поля и поместите пластину в интересующий колодец с помощью ручки регулировки ступени по оси x-y.
- Измените путь освещения камеры, нажмите кнопку Live in Программное обеспечение для обработки изображений, чтобы визуализировать изображение на экране, и убедитесь, что сфероид центрирован с помощью ручек оси X-Y, и сфокусируйтесь с помощью ручки грубой/точной фокусировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Форма сфероидов остается постоянной после нанесения живого окрашивания. - Выберите метод наблюдения за светлым полем на панели инструментов, установите автоматические настройки экспозиции и нажмите кнопку «Снимок» на панели управления камерой, чтобы сделать снимок . Затем сохраните картинку в виде файла .vsi, используя соответствующее имя в интересующей папке.
- Поместите экранирующую пластину окружающего света, чтобы выключить светодиодную подсветку, переключитесь на фильтр для B-возбуждения, выберите метод наблюдения 488 на панели инструментов, откройте затвор, сделайте снимок, нажав кнопку «Снимок», закройте затвор, затем сохраните файл, как описано выше.
- Повторите это с фильтром для G-возбуждения, используя соответствующий метод наблюдения (техасский красный или CY3). Затем повторите всю процедуру для каждой интересующей скважины.
- Верните планшет в инкубатор с 5% CO2 при 37 ° C и культивируйте его, как описано выше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы успешно дифференцировали BD-PSC человека в клетки-предшественники энтодермы / печени и гепатоциты, применяя двухэтапный протокол. Морфологические изменения в процессе дифференцировки печени показаны на рисунке 1. BD-PSC дифференцируются в гепатоциты, проходящие три различные стадии. Первая стадия представляет собой дифференцировку в энтодермальные клетки L4, вторая - дифференцировку в клетки-предшественники печени (гепатобласт) L8, демонстрирующие типичную полигональную морфологию, а третья - созревание в гепатоциты L15-L24.
Иммунофлюоресцентный анализ был проведен для подтверждения дифференцировки BD-PSC в печени, как показано на рисунке 2. Сильная экспрессия маркера-предшественника энтодермы/печени человека, такого как альфа-фетопротеин (АФП), основной белок плазмы в сыворотке крови плода, концентрация которого очень низка у взрослых организмов и поэтому рассматривается как маркер предшественника15 гепатоцитов и транстиретина (TTR), основного белка, связывающего гормон щитовидной железы, участвующего в транспортировке тироксина из кровотока в мозг16 обнаруживаются в клетках на первой стадии процесса дифференцировки печени от L4 до L8. Однако их экспрессия снижается при L15, в то время как экспрессия альбумина (ALB), наиболее распространенного белка плазмы, продуцируемого в основном печенью и крайне важного для дифференцировки печени, а также ядерного фактора гепатоцитов 4 альфа (HNF-4α), фактора транскрипции гепатоцитов, который участвует в экспрессии специфических для печени генов17 появляется сначала в L4, повышается на протяжении всего времени дифференцировки L4-L15, достигая сильной и стабильной экспрессии во время созревания L15-L24.
Цитокератин 18 (CK18) представляет собой цитоскелетный белок, один из основных компонентов промежуточной нити, экспрессируемой в печени18. Результаты показывают, что, как и ожидалось, экспрессия CK18 коррелирует со зрелыми гепатоцитами (L15-L24) и не экспрессируется в клетках-предшественниках гепатоцитов.
Четко определенный протокол дифференцировки гепатоцитов в 2D-культурах позволяет создавать печеночные 3D-культуры, начиная с BD-PSC.
Здесь мы демонстрируем, что спонтанная агрегация этих клеток в пластинах с низким прикреплением, содержащих среду для индукции/созревания гепатоцитов, инициирует образование сфероидов. За траекторией роста следовала визуализация клеток на L2, L4 и L7. (Рисунок 3А) Существует постоянная корреляция между объемом сфероида и переменным числом клеток, как показано на рисунке 3B.
Печень является органом, в котором метаболизируется большинство лекарств в организме человека. Цитохром Р450 представляет собой суперсемейство ферментов (монооксигеназ), которые имеют ключевое значение в процессах лекарственного и клеточного метаболизма, детоксикации ксенобиотиков и гомеостаза. Чтобы оценить потенциальную функциональную активность печеночных сфероидов, полученных из BD-PSCs, мы проанализировали экспрессию ферментов, метаболизирующих лекарственные средства, таких как CYP3A4 и CYP2E1, членов семейств CYP3 и CYP219.
Большинство препаратов, которые используются сегодня, включая кодеин, циклоспорин А, эритромицин, ацетаминофен и диазепам, а также многие стероиды и канцерогены, метаболизируются из-за активности фермента CY3A420. CYP2E1 участвует в метаболизме эндогенных субстратов, таких как этиленгликоль, бензол, четыреххлористый углерод и, в частности, наиболее важного высокомутагенного соединения, такого как нитрозамин21.
Сфероиды, которые формируются и дифференцируются в соответствии с протоколом на D14, живые, окрашенные антителами к этим двум ферментам, показывают потенциальную функциональную активность печени сфероидов, полученных из BD-PSC (рис. 4).
Рисунок 1: Дифференцировка BD-PSC в печеночноподобные клетки. Репрезентативные микрофотографии морфологических изменений во время дифференцировки BD-PSC в печени, показывающие морфологию энтодермы L4 или L8 полигональной формы, наконец, достигающую состояния созревания от L15 до L24. Масштабные линейки: верхний ряд 50 мкм, нижний ряд 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Иммунофлуоресцентный анализ редифференцировки BD-PSC в сторону клеток печени. Маркеры-предшественники энтодермы/гепатоцитов и специфические маркеры гепатоцитов экспрессируются при дифференцировке BD-PSC в печени в 2D-культурах. В дни с L4 по L8 микрофотографии показывают снижение экспрессии энтодермы/печеночного предшественника AFP и TTR, в то время как их экспрессия исчезла из L8-L24. Экспрессия гепатоцитов маркеров ALB и HNFα возникает при L4 и увеличивается в процессе созревания, тогда как экспрессия CK18 появилась сначала на L15, достигнув максимума на L24. Масштабные линейки для графиков L4-L15: 50 мкм и для L24: 20 мкм. Управление представлено на дополнительном рисунке 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Формирование 3D-сфероидов при дифференцировке BD-PSC в печени. (A) Вариабельное количество клеток BD-PSCs, начиная с 1 x 10от 6 до 4000 клеток, было посеяно в пластины с низким прикреплением, и дифференцировка проводилась в соответствии с двухэтапной процедурой, как указано в Протоколе. Генерация 3D-сфероидов печени человека была изображена в разные моменты времени, показано, что они являются репрезентативными фазово-контрастными изображениями в каждый момент времени в течение периода времени культивирования. Масштабная линейка: 200 мкм. (B) Диаметры не менее 4 печеночных сфероидов для каждого размера измеряли на L4 с использованием программного обеспечения для визуализации микроскопа, и были рассчитаны объемы. Полосы погрешностей показывают стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Функциональные маркеры гепатоцитов экспрессируются в сфероидах печени, полученных из BD-PSCs. BD-PSC дифференцировали в гепатоциты. Прямой иммунофлуоресцентный анализ проводили на живых клетках L14 с использованием антител к ALB, AFP, CK18 и CYP2E1 и CYP3A4, членам семейства цитохрома P450. Масштабная линейка: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Отрицательный контроль для иммунофлуоресцентного анализа редифференцировки BD-PSC к клеткам печени. Маркеры-предшественники энтодермы/гепатоцитов и специфические маркеры гепатоцитов экспрессируются при дифференцировке BD-PSC в печени в 2D-культурах. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Печень является основным органом в организме человека со многими важными биологическими функциями, такими как детоксикация метаболитов. Из-за тяжелой печеночной недостаточности, такой как цирроз печени и/или вирусный гепатит, во всем мире ежегодно умирает около 2 миллионов человек. Трансплантация печени занимает второе место среди трансплантаций солидных органов во всем мире, но удовлетворяется только около 10% текущей потребности22.
Первичные гепатоциты человека (PHH) часто используются для изучения токсичности печени. Эти клетки могут поддерживаться в культуре в течение короткого времени, сохраняя свои специфические функции. Кроме того, количество клеток, доступных от одного донора, ограничено, кроме того, эти клетки не могут быть расширены в культуре, поэтому нехватка донорского PHH остается основным препятствием для исследований гепатотоксичности. ПСК представляют собой источник обновления тканей человека и могут быть использованы для создания 3D-печеночных культур11.
Системы 3D-культивирования печени демонстрируют множество преимуществ по сравнению с 2D. Более короткое время дифференциации и точная имитация процессов in vivo позволяют проводить более точные исследования лекарственно-индуцированной токсичности, лучше прогнозировать ответственность печени и являются более экономически эффективными23. Культуры сфероидов печени из-за их аутологичной особенности могут быть большим преимуществом по сравнению с первичными гепатоцитами человека (PHH), обходя недостатки, связанные с их использованием, и могут стать золотым стандартом для применения при тестировании токсичности лекарств и имеют потенциальное будущее применение в регенеративной медицине.
Мы продемонстрировали, что BD-PSCs, полученные из стационарной периферической крови, могут быть успешно дифференцированы в энтодермальные / гепатоцитарные предшественники / зрелые гепатоциты с устойчивой секрецией альбумина и фенотипической стабильностью, экспрессирующей маркеры гепатоцитов. Кроме того, сконструированные 3D-культуры сфероидов гепатоцитов человека демонстрируют потенциальную функциональную активность путем экспрессии ферментов, принадлежащих цитохрому P450, таких как CYP3A4 и CYP2E1.
Наиболее важным шагом в протоколе является получение хорошего качества и количества свежих человеческих ТНК для процесса перепрограммирования. Использование замороженных ТНК приводит к уменьшению количества перепрограммированных клеток.
Мы сконструировали сфероиды печени человека с использованием активированных культур PBMNC с применением иммуномагнитной сортировки и без нее, которая отделяет перепрограммированные клетки от зрелых клеток крови. Небольшая разница в использовании этих двух методов основана на более высокой плотности 3D-структуры при использовании очищенных перепрограммированных ячеек. Экспрессия маркеров гепатоцитов остается стабильной в обоих препаратах клеточных культур.
Из-за ограниченной доступности PHH метод потенциально представляет собой биологически значимую ближайшую альтернативу аутологичным свежим гепатоцитам для изучения функции печени in vitro , такой как метаболизм ксенобиотиков и токсичность печени, вмешательство хозяина-патогена и клеточная биология в целом. Возможность использования BD-PSC в регенеративной медицине, будучи аутологичными и нетератогенными, является предметом дальнейших исследований в нашей лаборатории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Соответствующий автор заявляет, что она является патентообладателем, связанным с новым человеческим GPI-сцепленным белком. Она является соучредителем и работает с ACA CELL Biotech GmbH. Другие авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы особенно благодарны за техническую помощь, оказанную Оксаной и Джоном Гринакр. Эта работа была поддержана ACA CELL Biotech GmbH Гейдельберг, Германия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
- Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
- Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
- Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
- Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
- Crandall, B. F.
- Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
- Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
- Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
- Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
- Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
- Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S.
- Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).
