Summary
이 프로토콜은 특발성 폐 섬유증(IPF)의 생체 내 연구를 용이하게 할 수 있는 마우스 모델에서 폐포의 IL-33 자극 후 폐 간질 대식세포(IM)의 분리 및 입양 전달을 설명합니다.
Abstract
조기 폐 손상으로 인한 염증 반응은 특발성 폐 섬유증 (IPF) 발병의 중요한 원인 중 하나이며, 이는 대 식세포 및 호중구와 같은 염증 세포의 활성화뿐만 아니라 TNF-α, IL-1β 및 IL-6을 포함한 염증 인자의 방출을 동반합니다. IL-33 자극에 반응하여 활성화된 폐 간질성 대식세포(IM)에 의해 유발되는 초기 염증은 IPF의 병리학적 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이 프로토콜은 IPF 발달을 연구하기 위해 IL-33에 의해 자극된 IM을 마우스의 폐로 입양 전달하는 것을 설명합니다. 여기에는 숙주 마우스 폐에서 1차 IM을 분리 및 배양한 다음, 자극된 IM을 블레오마이신(BLM) 유도 IPF 수용자 마우스(이전에 클로드로네이트 리포솜으로 처리하여 폐포 대식세포가 고갈됨)의 폐포로 이식하는 것과 해당 마우스의 병리학적 평가가 포함됩니다. 대표적인 결과는 IL-33 자극 대식세포의 입양 전이가 마우스에서 폐 섬유증을 악화시킨다는 것을 보여주며, 이는 대식세포 입양 전이 실험의 확립이 IPF 병리를 연구하기 위한 좋은 기술적 수단임을 시사한다.
Introduction
특발성 폐섬유증(IPF)은 여러 요인에 의해 유발되는 미만성 폐염증성 질환이다1. Th1 및 Th2 면역 반응의 사이토카인 미세환경에서, 대식세포는 고전적으로 활성화된 대식세포(M1) 및 대안적으로 활성화된 대식세포(M2)로 분극화될 수 있다. 지질다당류(LPS) 또는 사이토카인 IFN-γ M1 대식세포가 분극화되도록 유도하고 iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α 및 IL-12를 포함하는 전염증성 사이토카인을 생성합니다. 대조적으로, II형 사이토카인 IL-4 및 IL-13은 폐 섬유증2를 촉진하는 TGF-β 및 PDGF와 같은 다양한 섬유아세포 성장 촉진 인자를 생성할 수 있는 M2 대식세포의 분극을 유도합니다. IPF의 병리학적 과정은 대식세포 활성화 및 침윤을 동반한다. IPF는 사이토카인의 방출을 통해 손상 복구, 염증 및 섬유증을 매개한다3. 제한된 치료 옵션만 사용할 수 있기 때문에 IPF의 분자 병리학적 메커니즘을 탐색하는 것은 IPF 예방 및 치료를 위한 새로운 전략을 개발하는 데 큰 의미가 있습니다. 우리 그룹과 다른 연구자들에 의한이전 연구4,5는 IPF 환자와 블레오마이신(BLM) 유도 IPF가 있는 마우스 모델에서 IL-33의 증가된 방출을 확인했습니다. IL-33은 섬유화 과정에서 상피세포와 내피세포에서 분비되어 대식세포 활성화에 관여하여 섬유아세포의 비정상적인 증식, 백혈구 침윤 및 궁극적인 폐 기능 상실을 초래한다5. 현재 프로토콜은 마우스 모델에서 IPF 발달을 연구하기 위한 수단으로서 IL-33 자극 간질 대식세포(IM)를 폐포로 입양 전달하는 것을 설명합니다. 여기서, 숙주 마우스의 폐 조직으로부터 IM을 분리하고, 시험관 내에서 배양하고, 24시간 동안 IL-33으로 자극한 다음, 기관 주사에 의해 수용자 마우스의 폐포로 입양적으로 옮겼다. 자극된 마우스 대식세포의 직접 수집과 수용자 폐포로의 입양 전달은 폐 섬유증의 정도를 악화시키는 것으로 밝혀졌으며 이전 연구에 비해 자극 인자의 섬유증 영향을 보다 명확하게 설명할 수 있다6. 이 논문에 기술된 기술은 연구자들이 IPF의 발달에서 잠재적인 사이토카인에 의해 자극된 대식세포의 기능을 탐구할 수 있게 한다.
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Protocol
모든 실험은 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 따라 수행하였다. 모든 동물 실험은 Jiangnan University의 실험 동물 복지 윤리위원회의 승인을 받았습니다(JN No. 20211,130m1720615[501]).
참고: 총 10마리의 수컷 C57BL/6 마우스가 6-8주령이고 체중이 20-25g인 이 연구에 사용되었습니다. 연구의 3개 실험 그룹에는 각각 3마리의 수용 마우스가 포함되었고, 1마리의 숙주 마우스가 IM 분리에 사용되었습니다.
1. 마우스 폐 대 식세포의 고갈
- 30분 전에 냉장고에서 클로드로네이트 리포좀 바이알( 재료 표 참조)을 꺼내 실온으로 데우고 여러 번 뒤집어 균일한 혼합을 보장합니다.
참고: 클로드로네이트 리포솜은 친수성 디클로로메틸렌 비스포스포네이트 분자를 캡슐화합니다. 이러한 리포좀이 대식세포에 의해 소비될 때, 클로드로네이트는 리소좀 포스파타제의 작용에 의해 서서히 방출되며, 그 축적은 결과적으로 세포 사멸과 대식세포의 고갈을 유발한다7. - 3 % isoflurane으로 마우스를 마취하십시오. 의식을 확인하기 위해 한쪽 발을 꼬집어 마취 깊이를 확인합니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 수의학 연고를 바르십시오.
- 멸균 흡입 팁이 있는 피펫을 사용하여 클로드로네이트 리포솜 60μL을 흡인합니다. 마취된 마우스의 비강 내로 약물을 적하하여 마우스가 흡입할 때 약물이 기관으로 흡입되도록 합니다. 한 방울 떨어 뜨린 후 마우스가 약물을 완전히 흡입하고 고르게 호흡하는지 확인하십시오. PBS 를 단독으로 포함하는 리포솜을 대조군으로 투여한다 8(그림 2).
- 마우스의 회복 속도를 높이기 위해 재가열을 위해 마우스를 38°C 항온 테이블에 놓습니다. 생쥐가 깨어날 때까지 모니터링하십시오. 생쥐가 잘 회복되고 흉골 기댄스를 달성 한 후 새장으로 옮깁니다.
- 클로드로네이트 리포좀으로 처리한 지 2일 후에 폐포 대식세포가 고갈된 마우스를 이식 실험을 위한 수용자 마우스로 사용하였다.
참고: 본 연구에서는 클로드로네이트 리포좀을 흡입하여 투여한 후 앞서 설명한 8,9와 같이 대식세포 마커의 발현을 확인하여 폐포 대식세포의 고갈을 확인했습니다(보충 그림 1 참조).
2. IM의 격리와 문화
- 케타민(120mg/kg)과 자일라진(16mg/kg)을 복강내 주사하여 숙주 마우스를 마취합니다. 발가락 핀치 반사의 상실을 통해 마취의 깊이를 확인하십시오. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 수의학 연고를 바르십시오. 그런 다음 마취 된 마우스의 피부를 75 % 알코올과 요오드로 소독합니다. 가위를 사용하여 피부를 자르고 심폐 조직을 노출시킵니다
- 20G 바늘로 주사기에서 1x PBS 10mL를 흡인하고 바늘 끝을 마우스의 우심방에 삽입합니다(그림 3A). 수술용 가위로 마우스의 하대정맥을 절단한 다음 폐 조직이 하얗게 변할 때까지 일정한 속도(10-20mL/분)로 PBS로 마우스를 수동으로 관류합니다. 폐 조직을 절제하고 배양 접시에 담긴 얼음처럼 차가운 PBS로 옮깁니다(그림 3B).
- 폐 조직을 약 2 mm x 2 mm x 2 mm의 조각으로 자릅니다. 그런 다음 1% 콜라게나제 A를 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 15mL를 폐 조직에 추가하여 대식세포를 분리합니다. 37°C 진탕 테이블에서 30분 동안 100rpm으로 배양합니다.
- 폐 조직 현탁액을 10mL 주사기를 통해 최소 20배 흡인하여 가능한 한 미세하게 만듭니다. 이 현탁액을 40μm 세포 여과기를 통해 여과합니다. 여과액을 400 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 얼음 위에 3mL의 RBC 용해 완충액( 재료 표 참조)을 2-3분 동안 첨가하여 펠릿의 적혈구를 용해합니다.
- 150 x g 에서 5분 동안 원심분리한 후 10mL의 DMEM(100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신 함유)으로 세포 펠릿을 다시 현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
- 세포를 2 x 107 세포/접시에서 10cm 부착 세포 배양 접시에 시드하고 37°C 및 5%CO2에서 1시간 동안 배양합니다. 이렇게 하면 폐 IM이 접시에 부착될 수 있습니다(5). 1시간 후, 상청액과 부유 세포를 흡인하고 10mL의 신선한 완전 배양 배지(10% FBS, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신을 함유한 DMEM)를 추가합니다. 8시간 이상 또는 하룻밤 동안 배양합니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 F4/80 및 CD11c 마커에 대한 염색과 함께 유세포 분석을 사용하여 얻은 IM의 순도를 결정합니다5 ( 보충 그림 1 참조).
3. IM을 폐포로의 입양 이식
- 분리된 폐 IM이 포함된 플레이트(단계 2.7)의 배양 배지를 IM을 자극하기 위한 10ng/mL IL-33이 포함된 완전한 배양 배지로 교체합니다. 37°C 및 5%CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 대조군으로 IL-33 대신 PBS 1개를 사용합니다.
- 폐 IM을 1mL의 0.25% 트립신으로 5분 동안 처리하여 해리합니다. 이어서, 3 mL의 신선한 배양 완전 배지를 첨가하여 소화를 켄칭하고, 세포 현탁액을 150 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 폐 대식세포를 수확한다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 세고 PBS에서 세포를 5 x 105 cells/50 μL의 최종 농도로 재현탁합니다.
- 수용자 마우스를 3% 이소플루란 가스로 마취합니다. 마우스가 의식을 잃을 때까지 기다린 다음 (1.2 단계에서와 같이) 마취 된 마우스의 팔다리를 의료용 테이프로 수직 플레이트에 고정합니다. 면봉을 사용하여 마우스의 혀를 한쪽으로 부드럽게 당깁니다.
- 삽관 램프를 켜고 기관을 볼 수 있도록 마우스의 목구멍에 비추십시오. 기관이 혀 밑 부분에 가깝고 식도가 목 뒤쪽에 있지만 수술 중에 식도 입구가 보이지 않는지 확인하십시오.
- 삽관 사용 lamp (22 G) 마우스의 삽관을 돕습니다. 유치 바늘 캐뉼라를 가이드 와이어(직경 0.4mm)로 기관으로 안내합니다. 가이드 와이어를 제거하고 캐뉼라를 마우스 기관에 밀어 넣어 삽관을 완료합니다.
- 캐뉼라가 기관으로 들어가는 것을 관찰한 후 50μL의 세포 현탁액(5 x 105 IM 포함)을 기관을 통해 수용자 마우스에 주입합니다.
- 회복 속도를 높이기 위해 재가열을 위해 마우스를 38°C 일정한 온난화 패드에 놓습니다. 생쥐가 깨어날 때까지 모니터링하십시오. 그들이 잘 회복하고 흉골 기댄스를 달성 한 후, 새장으로 옮깁니다.
- 24시간 후, IPF를 유도하기 위해 1.4U/kg 체중의 용량으로 기관을 통해 블레오마이신(BLM)을 투여합니다(3.3-3.5단계의 절차 사용). 대조군에 동일한 양의 식염수를 투여하십시오.
- 21일 후, PBS 또는 IL-33 자극 IM 현탁액으로 입양된 여러 그룹의 마우스에 대한 폐섬유증의 중증도 정도를 확인하여 섬유증에 대한 마커의 발현을 평가하여 Ashcroft 점수를10으로 확인하였다.
- RNA 추출 시약을 사용하여 폐 조직에서 전체 RNA를 추출합니다( 재료 표 참조).
참고: 정량 분석은 마이크로플레이트 리더로 수행되었습니다. OD260/OD280 비율이 1.8-2.0이면 RNA 순도가 높습니다. 모든 샘플을 -80 °C에서 저장하였다. - 형광 정량 PCR을 수행하여 특정 프라이머를 사용하여 α-평활근 액틴(SMA) 및 피브로넥틴의 발현을 평가합니다.
참고: α-SMA에 사용된 프라이머는 정방향 5'-GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' 및 역방향 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3'이었고, 피브로넥틴에 사용된 프라이머는 정방향 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' 및 역방향 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3'이었다.
- RNA 추출 시약을 사용하여 폐 조직에서 전체 RNA를 추출합니다( 재료 표 참조).
- 아래에 설명된 대로 면역조직화학을 수행합니다.
- 왼쪽 폐를 탈수하고 내장한 후 파라핀 슬라이서로 4μm 두께로 자릅니다.
- 조직 섹션을 슬라이드에 놓고 슬라이드를 65-70 ° C의 오븐에서 30 분에서 1 시간 동안 굽습니다. 알코올 함량이 감소하는 비율(즉, 알코올 100%, 95%, 90%, 80% 및 70% 알코올)로 슬라이드를 5분 동안 탈랍합니다.
- 슬라이드를 헤마톡실린 염료 용액(분석적으로 순수함)에 5분 동안 염색합니다. 그런 다음 슬라이드를 수돗물로 씻으십시오. 슬라이드를 1% 염산 알코올에 3초 동안 담그고 떠 있는 색을 씻어낸 다음 흐르는 물에 5분 동안 담급니다. 섹션이 파란색으로 바뀝니다.
- 에오신 용액에 10초에서 1분 동안 담그고(색상에 따라 염색 시간 결정) 수돗물로 씻고 70%, 80%, 95%, 100%, 100% 알코올에 각각 5분씩 넣습니다. 그런 다음 슬라이드를 크실렌 I 및 자일렌 II 용액에 3분 동안 놓습니다. 건조 후 중성 접착 밀봉 필름으로 수직 현미경으로 관찰하고 사진을 찍습니다.
- 폐 섬유증의 중증도를 나타내기 위해 섹션에서 Ashcroft 점수를 매기십시오10. 두 개의 독립 표본에 대한 t-검정을 사용하여 데이터의 통계 분석을 수행합니다.
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Representative Results
여기에 사용된 프로토콜은 그림 1의 순서도에 요약되어 있습니다. 코를 통한 클로드로네이트 리포솜의 흡입(그림 2)은 성인 C57BL/6 마우스의 폐 대식세포를 고갈시키는 데 사용되었으며, 이는 좋은 수용자 마우스 모델을 생성했습니다. 폐 IM은 처리되지 않은 다른 (숙주) 마우스(그림 3A, B)에서 분리되어 시험관 내에서 배양되었습니다. 분리된 대식세포를 IL-33으로 24시간 동안 자극한 다음, 자극되지 않은 대식세포를 대조군으로 사용하여 수용자 마우스에 기관 내 주입했습니다(그림 3C). 24시간 후, BLM을 수용자 마우스에 투여하여 폐 섬유증 모델을 유도하였다. IL-33 자극 유무에 관계없이 IM의 입양 전달 후 폐 섬유증의 정도를 BLM 투여 후 21일에 비교했습니다. 병리학적 조직 절편의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 BLM 투여 후 섬유증의 전형적인 병리학적 변화가 관찰되었음을 보여주었다: 마우스의 폐 조직 구조가 파괴되고, 섬유아세포의 응집이 관찰되었으며, 정상 폐포가 사라지거나 감소했다. IL-33 자극 대식세포의 입양 전달은 BLM 자극 마우스에서 폐 조직 파괴 정도를 악화시키고 섬유아세포 응집을 증가시켰습니다(그림 4A). Ashcroft 점수의 증가는 폐 섬유증의 정도를 추가로 설명했습니다 (그림 4B). 폐 섬유증의 병리학 적 과정은 α 평활근 액틴 (α-SMA)과 피브로넥틴을 분비하는 근 섬유 아세포의 응집 증가와 관련이 있습니다. 이들 마커의 발현 수준을 측정한 결과, 입양적으로 전사된 IL-33 자극 IM을 함유하고 BLM으로 처리된 수용 마우스의 폐 조직에서 α-SMA(도 5B) 및 피브로넥틴(도 5A)의 mRNA 수준이 BLM 처리된 야생형 마우스에 비해 더 증가한 것으로 나타났습니다.
그림 1: 대식세포 입양 전달 실험의 확립 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 수용자 마우스의 대식세포 고갈. 클로드로네이트 리포솜을 마우스의 비강 내로 떨어뜨렸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 간질성 대식세포의 분리 및 입양 전달 . (A) 관류를 용이하게 하기 위해 숙주 마우스의 하대정맥을 절단하였다. (B) 숙주 마우스로부터의 폐 조직을 작은 조각으로 절단하였다. (C) 간질성 대식세포는 F4/80 및 CD11c 마커를 사용한 유세포 분석을 사용하여 94%로 정제되었습니다. (D) IL-33-자극된 IM을 기관을 통해 수용자 마우스에게 투여하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: BLM 자극 마우스에서 IL-33 자극 대식세포의 입양 전달 효과. (a) 수용자 마우스로부터의 폐 조직 절편의 H&E 염색. 스케일 바 = 100 μm. (B) 수용자 마우스의 폐 조직 절편으로부터 결정된 Ashcroft 점수. 데이터는 평균 ± SEM(n=3)으로 나타내었다. *p < 0.05, **p < 0.01입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 수용자 마우스에서 폐 섬유증 마커 유전자의 발현 수준. (A) 피브로넥틴의 mRNA 수준. (B) α-SMA의 mRNA 수준. 데이터는 평균 ± SEM(n=3)으로 나타내었다. *p < 0.05, **p < 0.01입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 폐포 대식세포의 고갈 및 IM의 순도. (A) F4/80 및 CD11b 마커의 발현을 확인하여 폐포 대식세포의 고갈을 확인하였다. (B) F4/80 및 CD11c 마커에 대한 염색과 함께 유세포 분석을 사용하여 얻은 IM의 순도를 평가하고, 분리된 IM의 순도를 유세포 분석을 사용하여 94.4%로 측정했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구는 생쥐의 폐 섬유증 메커니즘을 연구하는 데 도움이 될 수 있는 대식세포를 고갈, 분리, 배양 및 전달하는 효과적인 방법을 제공합니다. 마우스 대식세포 고갈을 위한 많은 방법들이 있는데, 기관투여(tracheal administration), 꼬리 정맥 주사(tail vein injection), 비강 흡입(nasal inhalation)과 같다11. 이 연구는 작동이 간단하고 폐 대식세포를 효과적으로 고갈시킬 수 있는 비강 흡입 방법을 최적화했습니다 8,9. 24시간 동안 배양에서 IM의 IL-33 자극 후, IM을 비침습적 기관 투여 경로를 사용하여 수용자 마우스의 폐로 입양 이식하여 마우스에 대한 외상을 최소화했습니다. 삽관 중 삽관의 원활한 진행을 보장하기 위해 >20분의 마취 기간을 사용하여 생쥐의 생존율을 크게 향상시켰습니다. 50 μL IM 현탁액의 초기 기관 투여는 투여의 정확성을 보장하기 위해 마이크로피펫이 필요합니다. 기관 투여 후 500μL의 공기를 1mL 주사기로 즉시 폐에 첨가하여 카테터의 세포 현탁액이 폐 조직에 완전히 들어갈 수 있도록 해야 합니다. 이 방법은 폐포 대식세포를 제거하지만 마우스의 다른 부분의 대식세포도 질병이 진행되는 동안 폐포로 이동하여 폐포로 전달되는 세포의 비율을 희석시킬 수 있습니다. 따라서 전달된 세포의 비율에 대한 엄격한 요구 사항이 있는 실험은 다른 방법을 더 탐색해야 합니다.
폐 대 식세포는 폐의 방어 기능에 중요한 역할을합니다12,13. 이 중 폐포 대식세포는 주로 F4/80 및 CD11b 마커를 발현하는 반면, 간질성 대식세포는 주로 F4/80 및 CD11c12를 발현합니다. 이 과정에는 5 x 105 세포가 필요하고 IM은 폐 대식세포의 주요 부분을 구성하므로 더 쉽게 얻을 수 있기 때문에 이 연구에서 입양 이식을 위해 IM을 선택했습니다. 많은 연구에서 대식세포가 염증 인자를 방출하여 염증 반응을 조절하고 폐 섬유증의 병리학적 과정에서 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀졌습니다14. 연구에 따르면 IL-33은 TGF-β 및 기타 사이토카인을 조절하여 BLM 유발 폐 섬유증을 촉진하는 대식세포의 기능을 조절하는 것으로 나타났습니다4. 따라서 대식세포 기능의 유도된 변화는 폐섬유증의 발병기전에 중요한 역할을 한다. 이 연구는 연구자들이 천식 및 IPF와 같은 폐 질환에서 대식세포의 역할을 추가로 탐색하는 데 도움이 될 수 있는 IM의 입양 전달 방법을 제공합니다. 현재 IPF에 대한 효과적인 치료 약물은 없지만, 이 연구는 인자 IL-33이 특발성 폐 섬유증의 연구 및 치료와 관련이 있을 수 있음을 나타내며, 따라서 폐 섬유증 약물 연구의 추가 탐구를 위한 방향을 제공합니다. 예를 들어, IL-33에 대한 중화 항체는 실험적 IPF 약물로서의 그의 효과 및 실현 가능성을 탐색하기 위해 제조될 수 있으며, 이에 의해 특발성 폐 섬유증의 치료에 중요한 방향을 제공한다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
저자는 Jiangnan University의 실험실 관리 특별 주제: 병리학적 표본을 기반으로 한 디지털 슬라이스 라이브러리 구축(JDSYS202223)과 중국 국립 자연 과학 재단(81800065)을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
References
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