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Immunology and Infection

विवो में इडियोपैथिक पल्मोनरी फाइब्रोसिस पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए ब्लीमाइसिन-प्रेरित माउस मॉडल में आईएल -33-उत्तेजित मैक्रोफेज का दत्तक हस्तांतरण

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64742
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Basic Medicine, Wuxi School of Medicine, Jiangnan University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल फुफ्फुसीय अंतरालीय मैक्रोफेज (आईएम) के अलगाव और माउस मॉडल में फेफड़ों के एल्वियोली के आईएल -33 उत्तेजना के बाद उनके दत्तक हस्तांतरण का वर्णन करता है, जो इडियोपैथिक फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस (आईपीएफ) के विवो अध्ययन की सुविधा प्रदान कर सकता है।

Abstract

शुरुआती फेफड़ों की चोट के कारण भड़काऊ प्रतिक्रिया इडियोपैथिक पल्मोनरी फाइब्रोसिस (आईपीएफ) के विकास के महत्वपूर्ण कारणों में से एक है, जो मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल जैसे भड़काऊ कोशिकाओं के सक्रियण के साथ-साथ टीएनएफ-α, आईएल -1 और आईएल -6 सहित भड़काऊ कारकों की रिहाई के साथ है। आईएल -33 उत्तेजना के जवाब में सक्रिय फुफ्फुसीय अंतरालीय मैक्रोफेज (आईएम) के कारण होने वाली प्रारंभिक सूजन आईपीएफ की रोग प्रक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जानी जाती है। यह प्रोटोकॉल आईपीएफ विकास का अध्ययन करने के लिए चूहों के फेफड़ों में आईएल -33 द्वारा उत्तेजित आईएम के दत्तक हस्तांतरण का वर्णन करता है। इसमें मेजबान माउस फेफड़ों से प्राथमिक आईएम का अलगाव और संस्कृति शामिल है, इसके बाद ब्लीमाइसिन (बीएलएम) -प्रेरित आईपीएफ प्राप्तकर्ता चूहों के एल्वियोली में उत्तेजित आईएम का दत्तक हस्तांतरण (जो पहले क्लोड्रोनेट लिपोसोम के साथ उपचार द्वारा वायुकोशीय मैक्रोफेज से समाप्त हो गए हैं), और उन चूहों का पैथोलॉजिकल मूल्यांकन। प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं कि आईएल -33-उत्तेजित मैक्रोफेज का दत्तक हस्तांतरण चूहों में फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस को बढ़ाता है, यह सुझाव देते हुए कि मैक्रोफेज दत्तक हस्तांतरण प्रयोग की स्थापना आईपीएफ पैथोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा तकनीकी साधन है।

Introduction

इडियोपैथिक पल्मोनरी फाइब्रोसिस (आईपीएफ)कई कारकों के कारण होने वाली एक डिफ्यूज पल्मोनरी सूजन की बीमारी है। टीएच 1 और टीएच 2 प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साइटोकिन माइक्रोएन्वायरमेंट में, मैक्रोफेज को शास्त्रीय रूप से सक्रिय मैक्रोफेज (एम 1) और वैकल्पिक रूप से सक्रिय मैक्रोफेज (एम 2) में ध्रुवीकृत किया जा सकता है। लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) या साइटोकिन आईएफएन- γ एम 1 मैक्रोफेज को प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स का ध्रुवीकरण और उत्पादन करने के लिए प्रेरित करते हैं, जिसमें आईएनओएस, आईएल -1, आईएल -6, टीएनएफ -α और आईएल -12 शामिल हैं। इसके विपरीत, टाइप II साइटोकिन्स आईएल -4 और आईएल -13 एम 2 मैक्रोफेज के ध्रुवीकरण को चलाते हैं, जो विभिन्न फाइब्रोब्लास्ट विकास को बढ़ावा देने वाले कारकों का उत्पादन कर सकते हैं, जैसे कि टीजीएफ -β और पीडीजीएफ, जो फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस2 को बढ़ावा देते हैं। आईपीएफ की पैथोलॉजिकल प्रक्रिया मैक्रोफेज सक्रियण और घुसपैठ के साथ होती है। आईपीएफ साइटोकिन्स3 की रिहाई के माध्यम से चोट की मरम्मत, सूजन और फाइब्रोसिस की मध्यस्थता करता है। चूंकि केवल सीमित चिकित्सीय विकल्प उपलब्ध हैं, आईपीएफ के आणविक रोग तंत्र की खोज आईपीएफ रोकथाम और उपचार के लिए नई रणनीतियों को विकसित करने के लिए बहुत महत्व रखती है। हमारे समूह और अन्य शोधकर्ताओं 4,5 द्वारा पिछले अध्ययनों ने आईपीएफ रोगियों में और ब्लेमाइसिन (बीएलएम) -प्रेरित आईपीएफ के साथ माउस मॉडल में आईएल -33 की बढ़ती रिहाई की पुष्टि की है। आईएल -33 फाइब्रोसिस के दौरान उपकला और एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा जारी किया जाता है और मैक्रोफेज सक्रियण में शामिल होता है, जिसके परिणामस्वरूप फाइब्रोब्लास्ट का असामान्य प्रसार, ल्यूकोसाइट घुसपैठ और फेफड़ों के कार्य का अंतिम नुकसानहोता है। वर्तमान प्रोटोकॉल माउस मॉडल में आईपीएफ विकास का अध्ययन करने के साधन के रूप में एल्वियोली में आईएल -33-उत्तेजित अंतरालीय मैक्रोफेज (आईएम) के दत्तक हस्तांतरण का वर्णन करता है। यहां, आईएम को मेजबान चूहों के फेफड़ों के ऊतकों से अलग किया गया था, विट्रो में सुसंस्कृत किया गया था, 24 घंटे के लिए आईएल -33 के साथ उत्तेजित किया गया था, और फिर श्वासनली इंजेक्शन द्वारा प्राप्तकर्ता चूहों के एल्वियोली में दत्तक रूप से स्थानांतरित किया गया था। उत्तेजित माउस मैक्रोफेज का प्रत्यक्ष संग्रह और प्राप्तकर्ता एल्वियोली में उनके दत्तक हस्तांतरण को फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस की डिग्री को बढ़ाने के लिए पाया गया था और पिछले अध्ययनों की तुलना में फाइब्रोसिस पर उत्तेजक कारकों के प्रभाव को अधिक स्पष्ट रूप से चित्रित करसकता है। इस पेपर में वर्णित तकनीक शोधकर्ताओं को आईपीएफ के विकास में संभावित साइटोकिन्स द्वारा प्रेरित मैक्रोफेज के कार्य का पता लगाने में सक्षम कर सकती है।

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Protocol

सभी प्रयोग प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार किए गए थे। सभी पशु प्रयोगों को जियांगनान विश्वविद्यालय की प्रायोगिक पशु कल्याण नैतिकता समिति (जेएन नंबर 20211130 एम 1720615[501]) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

नोट: कुल मिलाकर, 6-8 सप्ताह की आयु के 10 पुरुष सी 57बीएल / 6 चूहों और 20-25 ग्राम वजन का उपयोग इस अध्ययन में किया गया था। अध्ययन में तीन प्रयोगात्मक समूहों में प्रत्येक में तीन प्राप्तकर्ता चूहे शामिल थे, और आईएम अलगाव के लिए एक मेजबान माउस का उपयोग किया गया था।

1. माउस फुफ्फुसीय मैक्रोफेज की कमी

  1. 30 मिनट पहले रेफ्रिजरेटर से क्लोड्रोनेट लिपोसोम्स ( सामग्री की तालिका देखें) की शीशी निकालें, इसे कमरे के तापमान पर गर्म करें, और समान मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए इसे कई बार उलट दें।
    नोट: क्लोड्रोनेट लिपोसोम हाइड्रोफिलिक डाइक्लोरोमेथिलीन बिसफ़ॉस्फ़ोनेट अणुओं को समाहित करते हैं। जब मैक्रोफेज द्वारा इन लिपोसोम का सेवन किया जाता है, तो क्लोड्रोनेट धीरे-धीरे लाइसोसोम फॉस्फेट की कार्रवाई से जारी होता है, और इसके संचय के परिणामस्वरूप सेल एपोप्टोसिस और मैक्रोफेज7 की कमी होती है।
  2. 3% आइसोफ्लुरेन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें। चेतना की जांच के लिए एक पैर को चुटकी मारकर संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें। संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए दोनों आंखों पर पशु चिकित्सा मरहम लागू करें।
  3. एक बाँझ सक्शन टिप के साथ पिपेट का उपयोग करके क्लोड्रोनेट लिपोसोम के 60 μL एस्पिरेट। एनेस्थेटाइज्ड माउस की नाक गुहा में दवा ड्रॉपवाइज का प्रशासन करें, जैसे कि जब माउस श्वास लेता है, तो दवा श्वासनली में साँस लेती है। प्रत्येक बूंद के बाद, सुनिश्चित करें कि माउस दवा को पूरी तरह से साँस लेता है और समान रूप से सांस ले रहा है। नियंत्रण 8 (चित्रा 2) के रूप में अकेले पीबीएस युक्त लिपोसोमका प्रबंधन करें।
  4. चूहों को उनकी वसूली में तेजी लाने के लिए फिर से गर्म करने के लिए 38 डिग्री सेल्सियस निरंतर तापमान तालिका पर रखें। चूहों की निगरानी करें जब तक कि वे जाग न जाएं। चूहों के अच्छी तरह से ठीक होने और उरोस्थि पुनरावृत्ति प्राप्त करने के बाद, उन्हें पिंजरे में स्थानांतरित करें।
  5. स्थानांतरण प्रयोग के लिए प्राप्तकर्ता चूहों के रूप में क्लोड्रोनेट लिपोसोम के साथ उपचार के 2 दिन बाद क्षीण वायुकोशीय मैक्रोफेज वाले चूहों का उपयोग करें।
    नोट: इस अध्ययन में, वायुकोशीय मैक्रोफेज की कमी की पुष्टि मैक्रोफेज मार्करों की अभिव्यक्ति की जांच करके की गई थी जैसा कि इनहेलेशन द्वारा क्लोड्रोनेट लिपोसोम के प्रशासन के बाद पहले वर्णित 8,9 है (पूरक चित्र 1 देखें)।

2. आईएम का अलगाव और संस्कृति

  1. केटामाइन (120 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलज़िन (16 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के साथ मेजबान माउस को एनेस्थेटाइज करें। पैर की अंगुली पिंच रिफ्लेक्स के नुकसान के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए दोनों आंखों पर पशु चिकित्सा मरहम लागू करें। फिर, 75% अल्कोहल और आयोडीन के साथ एनेस्थेटाइज्ड माउस की त्वचा को कीटाणुरहित करें। त्वचा को काटने और कार्डियोपल्मोनरी ऊतक को उजागर करने के लिए कैंची का उपयोग करें
  2. 20 ग्राम सुई के साथ एक सिरिंज में 10 एमएल 1x पीबीएस को एस्पिरिएट करें और सुई की नोक को माउस के दाहिने आलिंद में डालें (चित्रा 3 ए)। सर्जिकल कैंची के साथ माउस के अवर वेना कावा को काटें, और फिर मैन्युअल रूप से माउस को पीबीएस के साथ स्थिर गति (10-20 एमएल / मिनट) पर तब तक घुमाएं जब तक कि फेफड़े के ऊतक सफेद न हो जाएं। फेफड़ों के ऊतकों का उत्पादन करें और इसे एक संस्कृति डिश (चित्रा 3 बी) में बर्फ-ठंडे पीबीएस में स्थानांतरित करें।
  3. फेफड़ों के ऊतकों को लगभग 2 मिमी x 2 मिमी x 2 मिमी के टुकड़ों में काटें। फिर, मैक्रोफेज को अलग करने के लिए फेफड़ों के ऊतकों में 1% कोलेजनेज ए युक्त डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के 15 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस हिलाने वाली मेज पर 30 मिनट के लिए 100 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें।
  4. इसे जितना संभव हो उतना ठीक बनाने के लिए कम से कम 20 गुना 10 एमएल सिरिंज के माध्यम से फेफड़ों के ऊतक निलंबन को एस्पिरेट करें। इस निलंबन को 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें। 10 मिनट के लिए 400 x g पर छानने वाले को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
  5. 2-3 मिनट के लिए बर्फ पर 3 एमएल आरबीसी लाइसिस बफर ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़कर गोली में लाल रक्त कोशिकाओं को लाइस करें।
  6. 5 मिनट के लिए 150 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सेल पेलेट को 10 एमएल डीएमईएम (जिसमें 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त) के साथ पुन: निलंबित किया जाता है। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  7. कोशिकाओं को 2 x 10 7 कोशिकाओं / डिश पर 10 सेमी अनुयायी सेल कल्चरव्यंजनों में बीज दें, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। यह फेफड़ों के आईएम को डिश 5 का पालन करने की अनुमति देताहै। 1 घंटे के बाद, सतह पर तैरने वाली और तैरने वाली कोशिकाओं को एस्पिरेट करें, और 10 एमएल ताजा पूर्ण संस्कृति माध्यम (डीएमईएम जिसमें 10% एफबीएस, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन होता है) जोड़ें। 8 घंटे से अधिक या रात भर के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. एफ 4/80 और सीडी 11 सी मार्करों के लिए धुंधला होने के साथ फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके प्राप्त आईएम की शुद्धता निर्धारित करें, जैसा कि पहले वर्णितहै (पूरक चित्र 1 देखें)।

3. फेफड़ों के एल्वियोली में आईएम का दत्तक स्थानांतरण

  1. पृथक फुफ्फुसीय आईएम (चरण 2.7) वाली प्लेट से कल्चर माध्यम को आईएम को उत्तेजित करने के लिए 10 एनजी / एमएल आईएल -33 युक्त पूर्ण संस्कृति माध्यम से बदलें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। नियंत्रण के रूप में आईएल -33 के स्थान पर 1x PBS का उपयोग करें।
  2. फुफ्फुसीय आईएम को 5 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन के 1 एमएल के साथ इलाज करके अलग करें। फिर, 3 एमएल ताजा संस्कृति पूर्ण माध्यम जोड़कर पाचन को बुझाएं, और 5 मिनट के लिए 150 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करके फुफ्फुसीय मैक्रोफेज की कटाई करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें, और पीबीएस में कोशिकाओं को 5 x 10 5 कोशिकाओं /50 μL की अंतिम एकाग्रता में पुन: निलंबित करें।
  3. प्राप्तकर्ता चूहों को 3% आइसोफ्लुरेन गैस के साथ एनेस्थेटाइज करें। माउस के बेहोश होने की प्रतीक्षा करें (चरण 1.2 में), और फिर चिकित्सा टेप के साथ ऊर्ध्वाधर प्लेट पर एनेस्थेटाइज्ड माउस के अंगों को ठीक करें। धीरे से एक कपास के फाहे का उपयोग करके माउस की जीभ को एक तरफ खींचें।
  4. इंटुबैशन लैंप को चालू करें और इसे माउस के गले पर चमकाएं ताकि श्वासनली देखी जा सके। जांच ें कि श्वासनली जीभ के आधार के करीब है, अन्नप्रणाली गर्दन के पीछे के पास है, लेकिन ऑपरेशन के दौरान अन्नप्रणाली का उद्घाटन दिखाई नहीं देता है।
  5. माउस को इंटुबेट करने में मदद करने के लिए इंटुबैशन लैंप (22 G) का उपयोग करें। एक गाइड तार (0.4 मिमी व्यास) के साथ श्वासनली में रहने वाली सुई कैनुला का मार्गदर्शन करें। गाइड तार को हटा दें और इंटुबैशन को पूरा करने के लिए कैनुला को माउस श्वासनली में धक्का दें।
  6. श्वासनली में प्रवेश करने के लिए कैनुला देखे जाने के बाद, श्वासनली के माध्यम से प्राप्तकर्ता माउस में सेल सस्पेंशन (5 x 10 5 आईएम युक्त)के 50 μL इंजेक्ट करें।
  7. रिकवरी में तेजी लाने के लिए चूहों को फिर से गर्म करने के लिए 38 डिग्री सेल्सियस निरंतर वार्मिंग पैड पर रखें। चूहों की निगरानी करें जब तक कि वे जाग न जाएं। जब वे अच्छी तरह से ठीक हो जाते हैं और उरोस्थि पुनरावृत्ति प्राप्त करते हैं, तो उन्हें पिंजरे में स्थानांतरित करें।
  8. 24 घंटे के बाद, श्वासनली के माध्यम से ब्लीमाइसिन (बीएलएम) का उपयोग करें (चरण 3.3-3.5 में प्रक्रिया का उपयोग करके) आईपीएफ को प्रेरित करने के लिए 1.4 यू / किग्रा शरीर के वजन की खुराक पर। नियंत्रण समूह को खारा की एक समान मात्रा का प्रबंधन करें।
  9. 21 दिनों के बाद, चूहों के विभिन्न समूहों के लिए फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस की गंभीरता की डिग्री निर्धारित करें, जिन्हें फाइब्रोसिस और एशक्रॉफ्ट स्कोर10 के लिए मार्करों की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करके पीबीएस या आईएल -33-उत्तेजित आईएम निलंबन के साथ दत्तक रूप से स्थानांतरित किया गया था।
    1. आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक का उपयोग करके फेफड़ों के ऊतकों से कुल आरएनए निकालें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: मात्रात्मक विश्लेषण एक माइक्रोप्लेट रीडर के साथ किया गया था। यदि OD260/OD280 अनुपात 1.8-2.0 है, तो RNA शुद्धता अधिक है। सभी नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए थे।
    2. विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके α-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए) और फाइब्रोनेक्टिन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर करें।
      नोट: α-एसएमए के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर फॉरवर्ड 5'- जीएसीजीसीटीजीएजीटीएजीटीसीसीजीएएसीजीजी -3' और रिवर्स 5'-सीएसीसीसीटीसीसीएजीटीसीसीएजीसीएएटी-3' थे, और फाइब्रोनेक्टिन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर फॉरवर्ड 5'-टीसीटीजीजीएएटीजीजीएएटीजीटीजीजी-3' और रिवर्स 5'-सीएसीटीजीएजीटीटीजीएक्सएटीजीएजीएटीजीएटीजीएजीएटी-3' और फाइब्रोनेक्टिन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर फॉरवर्ड 5'-टीसीटीजीजीएएटीजीजीएएटीजीटीजीएटी-3' थे और फाइब्रोनेक्टिन के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले प्राइमर फॉरवर्ड 5'-टीसीटीजीजीएजीए
  10. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का प्रदर्शन करें जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. बाएं फेफड़े को निर्जलित करें, इसे एम्बेड करें, और इसे पैराफिन स्लाइसर के साथ 4 μm की मोटाई तक स्लाइस करें।
    2. ऊतक वर्गों को स्लाइड पर रखें और स्लाइड्स को 30 मिनट से 1 घंटे के लिए 65-70 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में बेक करें। 5 मिनट के लिए अल्कोहल (यानी, 100%, 95%, 90%, 80%, और 70% अल्कोहल) के घटते प्रतिशत के साथ स्लाइड्स को डीवैक्स करें।
    3. 5 मिनट के लिए हेमेटॉक्सिलिन डाई समाधान (विश्लेषणात्मक रूप से शुद्ध) में स्लाइड को दाग दें। फिर, नल के पानी से स्लाइड्स को धो लें। स्लाइड्स को 1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड अल्कोहल में 3 सेकंड के लिए भिगोदें, फ्लोटिंग रंग को धो लें, और 5 मिनट के लिए बहते पानी में भिगो दें। अनुभाग नीले हो जाएंगे।
    4. 10 सेकंड से 1 मिनट के लिए ईओसिन घोल में डुबोएं (रंग के अनुसार रंगाई का समय निर्धारित करें), नल के पानी से धोएं, और क्रमशः 70%, 80%, 95%, 100%, और 100% अल्कोहल में 5 मिनट के लिए रखें। फिर, 3 मिनट के लिए जाइलीन I और xylene II समाधानों में स्लाइड रखें। सूखने के बाद, तटस्थ चिपकने वाली सीलिंग फिल्म के साथ ऊर्ध्वाधर माइक्रोस्कोप के नीचे निरीक्षण करें और तस्वीरें लें।
    5. फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस10 की गंभीरता को इंगित करने के लिए अनुभागों पर एशक्रॉफ्ट स्कोरिंग करें। दो स्वतंत्र नमूनों के टी-परीक्षण का उपयोग करके डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण करें।

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Representative Results

यहां उपयोग किए गए प्रोटोकॉल को चित्र 1 में फ्लोचार्ट में संक्षेपित किया गया है। नाक के माध्यम से क्लोड्रोनेट लिपोसोम्स की साँस लेना (चित्रा 2) का उपयोग वयस्क सी 57बीएल / 6 चूहों के फुफ्फुसीय मैक्रोफेज को कम करने के लिए किया गया था, और इसने एक अच्छा प्राप्तकर्ता माउस मॉडल तैयार किया। फुफ्फुसीय आईएम को एक अन्य अनुपचारित (मेजबान) माउस (चित्रा 3 ए, बी) से अलग किया गया और विट्रो में सुसंस्कृत किया गया। पृथक मैक्रोफेज को 24 घंटे के लिए आईएल -33 के साथ उत्तेजित किया गया था और फिर प्राप्तकर्ता चूहों (चित्रा 3 सी) में इंट्राट्रैकल रूप से डाला गया था, जिसमें नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने वाले अनियंत्रित मैक्रोफेज थे। 24 घंटे के बाद, बीएलएम को फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस मॉडल को प्रेरित करने के लिए प्राप्तकर्ता चूहों को प्रशासित किया गया था। आईएल -33 उत्तेजना के साथ या बिना आईएम के दत्तक हस्तांतरण के बाद फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस की सीमा की तुलना बीएलएम प्रशासन के 21 दिन बाद की गई थी। पैथोलॉजिकल ऊतक वर्गों के हेमटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला होने से पता चला कि बीएलएम प्रशासन के बाद फाइब्रोसिस के विशिष्ट रोग संबंधी परिवर्तन देखे गए थे: चूहों की फेफड़ों की ऊतक संरचना नष्ट हो गई थी, फाइब्रोब्लास्ट का एकत्रीकरण देखा गया था, और सामान्य एल्वियोली गायब या कम हो गया था। आईएल -33-उत्तेजित मैक्रोफेज के दत्तक हस्तांतरण ने फेफड़ों के ऊतकों के विनाश की डिग्री को बढ़ा दिया और बीएलएम-उत्तेजित चूहों में फाइब्रोब्लास्ट एकत्रीकरण में वृद्धि की (चित्रा 4 ए)। एशक्रॉफ्ट स्कोर में वृद्धि ने फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस (चित्रा 4 बी) की डिग्री को और चित्रित किया। फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस की पैथोलॉजिकल प्रक्रिया मायोफाइब्रोब्लास्ट्स के बढ़ते एकत्रीकरण से जुड़ी है, जो α-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (α-एसएमए) और फाइब्रोनेक्टिन का स्राव करती है। इन मार्करों के अभिव्यक्ति स्तरों के निर्धारण से पता चला है कि प्राप्तकर्ता चूहों के फेफड़ों के ऊतकों में α-एसएमए (चित्रा 5 बी) और फाइब्रोनेक्टिन (चित्रा 5 ए) के एमआरएनए स्तर में दत्तक रूप से स्थानांतरित आईएल -33-उत्तेजित आईएम और बीएलएम के साथ इलाज किया गया था, जो बीएलएम-उपचारित जंगली प्रकार के चूहों की तुलना में और बढ़ गए थे।

Figure 1
चित्रा 1: मैक्रोफेज दत्तक हस्तांतरण प्रयोग की स्थापना का योजनाबद्ध आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्राप्तकर्ता चूहों में मैक्रोफेज की कमी। क्लोड्रोनेट लिपोसोम को चूहों की नाक गुहा में गिरा दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: अंतरालीय मैक्रोफेज का अलगाव और दत्तक हस्तांतरण। (ए) छिड़काव की सुविधा के लिए मेजबान माउस के अवर वेना कावा को काट दिया गया था। (बी) मेजबान माउस से फेफड़ों के ऊतकों को छोटे टुकड़ों में काट दिया गया था। (सी) अंतरालीय मैक्रोफेज को एफ 4/80 और सीडी 11 सी मार्करों के साथ फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके 94% तक शुद्ध किया गया था। (डी) आईएल -33-उत्तेजित आईएम को श्वासनली के माध्यम से प्राप्तकर्ता चूहों को प्रशासित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: बीएलएम-उत्तेजित चूहों में आईएल -33-उत्तेजित मैक्रोफेज के दत्तक हस्तांतरण का प्रभाव। (ए) प्राप्तकर्ता चूहों से फेफड़ों के ऊतकों का एच एंड ई धुंधला होना। स्केल बार = 100 μm. (B) प्राप्तकर्ता चूहों के फेफड़ों के ऊतक वर्गों से निर्धारित एशक्रॉफ्ट स्कोर। डेटा को एसईएम (एन = 3) ± माध्य के रूप में दिखाया गया है। * पी < 0.05, ** पी < 0.01। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: प्राप्तकर्ता चूहों में फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस मार्कर जीन के अभिव्यक्ति स्तर। (बी) α-एसएमए का एमआरएनए स्तर। डेटा को एसईएम (एन = 3) ± माध्य के रूप में दिखाया गया है। * पी < 0.05, ** पी < 0.01। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: वायुकोशीय मैक्रोफेज की कमी और आईएम की शुद्धता। (ए) वायुकोशीय मैक्रोफेज की कमी की पुष्टि एफ 4/80 और सीडी 11 बी मार्करों की अभिव्यक्ति की जांच करके की गई थी। (बी) प्राप्त आईएम की शुद्धता का मूल्यांकन एफ 4/80 और सीडी 11 सी मार्करों के लिए धुंधला होने के साथ फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके किया गया था, और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके पृथक आईएम की शुद्धता 94.4% निर्धारित की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह अध्ययन मैक्रोफेज को कम करने, अलग करने, संस्कृति करने और स्थानांतरित करने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है, जो चूहों में फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस के तंत्र का अध्ययन करने में मदद कर सकता है। माउस मैक्रोफेज की कमी के लिए कई तरीके हैं, जैसे कि श्वासनली प्रशासन, पूंछ नस इंजेक्शन, और नाक साँस लेना11। इस अध्ययन ने नाक इनहेलेशन विधि को अनुकूलित किया, जो संचालित करने के लिए सरल है और फुफ्फुसीय मैक्रोफेज 8,9 को प्रभावी ढंग से कम कर सकता है। 24 घंटे के लिए संस्कृति में आईएम के आईएल -33 उत्तेजना के बाद, आईएम को गैर-इनवेसिव श्वासनली प्रशासन मार्ग का उपयोग करके प्राप्तकर्ता चूहों के फेफड़ों में दत्तक रूप से स्थानांतरित कर दिया गया, जिससे चूहों को कम से कम आघात हुआ। इंटुबैशन के दौरान, इंटुबैशन की सुचारू प्रगति सुनिश्चित करने के लिए >20 मिनट की संज्ञाहरण अवधि को नियोजित किया गया था, जिसने चूहों की जीवित रहने की दर में काफी सुधार किया। 50 μL IM निलंबन के प्रारंभिक श्वासनली प्रशासन को प्रशासन की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए एक माइक्रोपिपेट की आवश्यकता होती है। श्वासनली के प्रशासन के बाद, 500 μL हवा को तुरंत 1 एमएल सिरिंज के साथ फेफड़ों में जोड़ा जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कैथेटर में सेल निलंबन पूरी तरह से फेफड़ों के ऊतकों में प्रवेश कर सकता है। यद्यपि यह विधि वायुकोशीय मैक्रोफेज को साफ करती है, माउस के अन्य हिस्सों से मैक्रोफेज भी रोग के दौरान एल्वियोली में स्थानांतरित हो सकते हैं, इस प्रकार एल्वियोली में स्थानांतरित कोशिकाओं के अनुपात को कम कर सकते हैं। इसलिए, स्थानांतरित कोशिकाओं के अनुपात के लिए सख्त आवश्यकताओं वाले प्रयोगों को अन्य तरीकों का पता लगाने की आवश्यकता है।

फुफ्फुसीय मैक्रोफेज फेफड़ों के रक्षात्मक कार्य में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं 12,13. इनमें से, वायुकोशीय मैक्रोफेज मुख्य रूप से एफ 4/80 और सीडी 11 बी मार्करों को व्यक्त करते हैं, जबकि अंतरालीय मैक्रोफेज मुख्य रूप से एफ 4/80 और सीडी 11 सी12 को व्यक्त करते हैं। इस अध्ययन में दत्तक हस्तांतरण के लिए आईएम को चुना गया था, क्योंकि प्रक्रिया में 5 x 105 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, और आईएम फुफ्फुसीय मैक्रोफेज का एक प्रमुख अंश बनाते हैं, जिससे उन्हें प्राप्त करना आसान हो जाता है। बड़ी संख्या में अध्ययनों से पता चला है कि मैक्रोफेज भड़काऊ कारकों को जारी करके भड़काऊ प्रतिक्रिया को नियंत्रित करते हैं और फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस14 की रोग प्रक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। अध्ययनों से पता चला है कि आईएल -33 मैक्रोफेज के कार्य को विनियमित करने के लिए टीजीएफ -β और अन्य साइटोकिन्स को नियंत्रित करता है, जो बीएलएम-प्रेरित फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस4 को बढ़ावा देता है। इसलिए, मैक्रोफेज फ़ंक्शन में प्रेरित परिवर्तन फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यह अध्ययन आईएम के दत्तक हस्तांतरण के लिए एक विधि प्रदान करता है जो शोधकर्ताओं को अस्थमा और आईपीएफ जैसे फेफड़ों के रोगों में मैक्रोफेज की भूमिका का पता लगाने में मदद कर सकता है। वर्तमान में आईपीएफ के लिए कोई प्रभावी चिकित्सीय दवा नहीं है, लेकिन यह अध्ययन इंगित करता है कि कारक आईएल -33 इडियोपैथिक फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस के अनुसंधान और उपचार के लिए प्रासंगिक हो सकता है और इस प्रकार, फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस दवा अनुसंधान की आगे की खोज के लिए एक दिशा प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, आईएल -33 के खिलाफ एक न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी को एक प्रयोगात्मक आईपीएफ दवा के रूप में इसके प्रभाव और व्यवहार्यता का पता लगाने के लिए तैयार किया जा सकता है, जिससे इडियोपैथिक पल्मोनरी फाइब्रोसिस के उपचार के लिए एक महत्वपूर्ण दिशा प्रदान की जा सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

लेखक जियांगनान विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला प्रबंधन के विशेष विषय को स्वीकार करते हैं: पैथोलॉजिकल नमूनों (जेडीएसवाईएस 202223) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81800065) के आधार पर डिजिटल स्लाइस लाइब्रेरी का निर्माण।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 DMEM Life technologies Biotechnology,USA 1508012
Arterial indwelling needle B Braun Melsingen AG,Germany 21G15G8393
BD Accuri C6 Plus Becton Dickinson,USA
Bleomycin Biotang, USA Ab9465
Carbon dioxide incubator Thermo Forma, USA Thermo Forma370
CD11b R&D Systems,USA 1124F
CD11c R&D Systems,USA N418
Cell culture dish Thermo Forma, USA 174926
Clodronate liposomes  Clodronate liposomes,Netherlands CI-150-150
Collagenase A Sigma-Aldrich, USA 10103578001
F4/80 R&D Systems,USA 521204
Falcon Cell Strainer Becton,Dickinson and Company, USA 352340
Fetal bovine serum (FBS) Life technologies,USA 1047571
Hematoxylin Eosin  Nanjing Jiancheng Technology,China 06-570
LightCycler 480 PCR detection system Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33 Peprotech, USA 210-33
Nikon microscope Nikon Corporation, Japan 941185
Penicillin, streptomycin Life technologies,USA 877113
Phosphate buffer (PBS) Guangdong Huankai Microbial Technology ,China 1535882
RBC lysis buffer Beyotime Biotechnology Company,China C3702
RNA Isolater Vazyme company,China R401-01-AA Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine Shenzhen Rayward Life Technology ,China R500
Semi-automatic paraffin slicer Leica, Germany LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq Takara, Japan 410800
Trypsin 0.25% Life Technologies, USA 1627172

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 195
विवो में इडियोपैथिक पल्मोनरी फाइब्रोसिस पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए ब्लीमाइसिन-प्रेरित माउस मॉडल <em>में</em> आईएल -33-उत्तेजित मैक्रोफेज का दत्तक हस्तांतरण
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Zhai, X., Li, J., Nie, Y. Adoptive… More

Zhai, X., Li, J., Nie, Y. Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. J. Vis. Exp. (195), e64742, doi:10.3791/64742 (2023).

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