Summary
Ce protocole décrit l’isolement des macrophages interstitiels pulmonaires (IM) et leur transfert adoptif après stimulation IL-33 des alvéoles pulmonaires dans un modèle murin, ce qui peut faciliter l’étude in vivo de la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI).
Abstract
La réponse inflammatoire causée par une lésion pulmonaire précoce est l’une des causes importantes du développement de la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI), qui s’accompagne de l’activation de cellules inflammatoires telles que les macrophages et les neutrophiles, ainsi que de la libération de facteurs inflammatoires, notamment le TNF-α, l’IL-1β et l’IL-6. L’inflammation précoce causée par des macrophages interstitiels pulmonaires (IM) activés en réponse à la stimulation de l’IL-33 est connue pour jouer un rôle essentiel dans le processus pathologique de la FPI. Ce protocole décrit le transfert adoptif des IM stimulées par l’IL-33 dans les poumons de souris pour étudier le développement de la FPI. Il implique l’isolement et la culture de MI primaires à partir des poumons de souris hôtes, suivis du transfert adoptif de MI stimulés dans les alvéoles de souris receveuses de FPI induites par la bléomycine (BLM) (qui ont été précédemment appauvries en macrophages alvéolaires par un traitement avec des liposomes clodronates), et l’évaluation pathologique de ces souris. Les résultats représentatifs montrent que le transfert adoptif de macrophages stimulés par l’IL-33 aggrave la fibrose pulmonaire chez la souris, suggérant que la mise en place de l’expérience de transfert adoptif de macrophages est un bon moyen technique d’étudier la pathologie de la FPI.
Introduction
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie inflammatoire pulmonaire diffuse causée par de nombreux facteurs1. Dans le microenvironnement des cytokines de la réponse immunitaire Th1 et Th2, les macrophages peuvent être polarisés en macrophages classiquement activés (M1) et en macrophages activés (M2). Les lipopolysaccharides (LPS) ou la cytokine IFN-γ induisent les macrophages M1 à polariser et à produire des cytokines pro-inflammatoires, notamment iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α et IL-12. En revanche, les cytokines de type II IL-4 et IL-13 entraînent la polarisation des macrophages M2, qui peuvent produire différents facteurs favorisant la croissance des fibroblastes, tels que le TGF-β et le PDGF, qui favorisent la fibrose pulmonaire2. Le processus pathologique de la FPI s’accompagne d’une activation et d’une infiltration des macrophages. La FPI intervient dans la réparation des blessures, l’inflammation et la fibrose par la libération de cytokines3. Comme seules des options thérapeutiques limitées sont disponibles, l’exploration des mécanismes pathologiques moléculaires de la FPI revêt une grande importance pour le développement de nouvelles stratégies de prévention et de traitement de la FPI. Des études antérieures menées par notre groupe et d’autres chercheurs 4,5 ont confirmé la libération accrue d’IL-33 chez les patients atteints de FPI et dans des modèles murins atteints de FPI induite par la bléomycine (BLM). L’IL-33 est libérée par les cellules épithéliales et endothéliales lors de la fibrose et est impliquée dans l’activation des macrophages, entraînant la prolifération anormale des fibroblastes, l’infiltration des leucocytes et la perte éventuelle de la fonction pulmonaire5. Le protocole actuel décrit le transfert adoptif de macrophages interstitiels (IM) stimulés par l’IL-33 dans les alvéoles comme moyen d’étudier le développement de la FPI dans des modèles murins. Ici, les IM ont été isolés du tissu pulmonaire de souris hôtes, cultivés in vitro, stimulés avec de l’IL-33 pendant 24 h, puis transférés adoptivement dans les alvéoles de souris receveuses par injection trachéale. La collecte directe de macrophages de souris stimulés et leur transfert adoptif dans les alvéoles receveuses se sont avérés aggraver le degré de fibrose pulmonaire et peuvent illustrer plus clairement l’influence des facteurs stimulants sur la fibrose par rapport aux études précédentes6. La technique décrite dans cet article peut permettre aux chercheurs d’explorer la fonction des macrophages stimulés par des cytokines potentielles dans le développement de la FPI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les expériences ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité d’éthique du bien-être animal expérimental de l’Université de Jiangnan (JN n n ° 20211130m1720615 [501]).
NOTE: Au total, 10 souris mâles C57BL / 6 âgées de 6 à 8 semaines et pesant 20 à 25 g ont été utilisées dans cette étude. Les trois groupes expérimentaux de l’étude comprenaient trois souris receveuses chacun, et une souris hôte a été utilisée pour l’isolement IM.
1. Déplétion des macrophages pulmonaires de souris
- Sortez le flacon de liposomes de clodronate (voir le tableau des matières) du réfrigérateur 30 minutes à l’avance, réchauffez-le à température ambiante et retournez-le plusieurs fois pour assurer un mélange uniforme.
REMARQUE: Les liposomes de clodronate encapsulent les molécules hydrophiles de bisphosphonate de dichlorométhylène. Lorsque ces liposomes sont consommés par les macrophages, le clodronate est progressivement libéré par l’action de la phosphatase lysosome, et son accumulation déclenche par conséquent l’apoptose cellulaire et l’épuisement des macrophages7. - Anesthésier les souris avec 3% d’isoflurane. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant un pied pour vérifier la conscience. Appliquez une pommade vétérinaire sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Aspirer 60 μL de liposomes de clodronate à l’aide d’une pipette munie d’un embout d’aspiration stérile. Administrer le médicament goutte à goutte dans la cavité nasale de la souris anesthésiée, de sorte que lorsque la souris inhale, le médicament est inhalé dans la trachée. Après chaque goutte, assurez-vous que la souris inhale complètement le médicament et respire uniformément. Administrer des liposomes contenant uniquement du PBS comme témoin8 (Figure 2).
- Placez les souris sur une table de température constante de 38 °C pour les réchauffer afin d’accélérer leur récupération. Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles se réveillent. Une fois que les souris se sont bien rétablies et ont atteint la position couchée sternale, transférez-les dans la cage.
- Utilisez des souris avec des macrophages alvéolaires appauvris 2 jours après le traitement avec des liposomes clodronate comme souris receveuses pour l’expérience de transfert.
NOTE: Dans cette étude, la déplétion des macrophages alvéolaires a été confirmée en vérifiant l’expression des marqueurs macrophages comme décrit précédemment 8,9 après l’administration de liposomes clodronate par inhalation (voir Figure supplémentaire 1).
2. Isolement et culture des GI
- Anesthésiez la souris hôte avec une injection intrapéritonéale de kétamine (120 mg / kg) et de xylazine (16 mg / kg). Confirmer la profondeur de l’anesthésie par la perte du réflexe de pincement des orteils. Appliquez une pommade vétérinaire sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Ensuite, désinfectez la peau de la souris anesthésiée avec 75% d’alcool et d’iode. Utilisez des ciseaux pour couper à travers la peau et exposer le tissu cardiopulmonaire
- Aspirer 10 mL de 1x PBS dans une seringue à l’aide d’une aiguille de 20 G et insérer l’extrémité de l’aiguille dans l’oreillette droite de la souris (Figure 3A). Coupez la veine cave inférieure de la souris avec des ciseaux chirurgicaux, puis perfuser manuellement la souris avec du PBS à une vitesse constante (10-20 ml / min) jusqu’à ce que le tissu pulmonaire devienne blanc. Extrayez le tissu pulmonaire et transférez-le dans du PBS glacé dans une boîte de culture (figure 3B).
- Couper le tissu pulmonaire en fragments d’environ 2 mm x 2 mm x 2 mm. Ensuite, ajoutez 15 mL de milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 1 % de collagénase A au tissu pulmonaire pour isoler les macrophages. Incuber à 100 tr/min pendant 30 min sur une table vibrante à 37 °C.
- Aspirer la suspension de tissu pulmonaire à l’aide d’une seringue de 10 ml au moins 20x pour la rendre aussi fine que possible. Filtrer cette suspension à travers une crépine cellulaire de 40 μm. Centrifuger le filtrat à 400 x g pendant 10 min et jeter le surnageant.
- Lyser les globules rouges contenus dans la pastille en ajoutant 3 mL de tampon de lyse des globules rouges (voir le tableau des matières) sur de la glace pendant 2 à 3 minutes.
- Après centrifugation à 150 x g pendant 5 min, remettre en suspension la pastille cellulaire avec 10 mL de DMEM (contenant 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine). Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Ensemencer les cellules dans des boîtes de culture cellulaire adhérentes de 10 cm à 2 x 107 cellules/plat, et incuber pendant 1 h à 37 °C et 5% de CO2. Cela permet aux IM pulmonaires d’adhérer au plat5. Après 1 h, aspirer les cellules surnageantes et flottantes et ajouter 10 mL de milieu de culture complet frais (DMEM contenant 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine). Incuber pendant plus de 8 h ou toute la nuit.
- Déterminer la pureté des IM obtenues en utilisant la cytométrie en flux avec coloration pour les marqueurs F4/80 et CD11c, comme décrit précédemment5 (voir la figure supplémentaire 1).
3. Transfert adoptif des IM dans les alvéoles pulmonaires
- Remplacer le milieu de culture de la plaque contenant les IM pulmonaires isolés (étape 2.7) par un milieu de culture complet contenant 10 ng/mL d’IL-33 pour stimuler les IM. Incuber pendant 24 h à 37 °C et 5% CO2. Utilisez 1x PBS à la place de l’IL-33 comme témoin.
- Dissocier les IM pulmonaires en les traitant avec 1 mL de trypsine à 0,25% pendant 5 min. Ensuite, éteignez la digestion en ajoutant 3 mL de milieu complet de culture fraîche, et récoltez les macrophages pulmonaires en centrifugeant la suspension cellulaire à 150 x g et 4 °C pendant 5 min. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et remettre les cellules en suspension dans le PBS jusqu’à une concentration finale de 5 x 105 cellules/50 μL.
- Anesthésier les souris receveuses avec du gaz isoflurane à 3%. Attendez que la souris devienne inconsciente (comme à l’étape 1.2), puis fixez les membres de la souris anesthésiée sur une plaque verticale avec du ruban médical. Tirez doucement la langue de la souris d’un côté à l’aide d’un coton-tige.
- Allumez la lampe d’intubation et faites-la briller sur la gorge de la souris pour que la trachée puisse être vue. Vérifiez que la trachée est proche de la base de la langue, que l’œsophage est près de l’arrière du cou, mais que l’ouverture de l’œsophage n’est pas visible pendant l’opération.
- Utilisez la lampe d’intubation (22 G) pour aider à intuber la souris. Guidez la canule à aiguille à demeure dans la trachée à l’aide d’un fil guide (0,4 mm de diamètre). Retirez le fil guide et poussez la canule dans la trachée de souris pour terminer l’intubation.
- Une fois que la canule est observée pour entrer dans la trachée, injecter 50 μL de la suspension cellulaire (contenant 5 x 105 IM) dans la souris receveuse à travers la trachée.
- Placez les souris sur un coussin chauffant constant à 38 °C pour le réchauffer afin d’accélérer la récupération. Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles se réveillent. Une fois qu’ils se sont bien rétablis et qu’ils ont atteint la position couchée sternale, transférez-les dans la cage.
- Après 24 heures, administrer de la bléomycine (BLM) par la trachée (en utilisant la procédure décrite aux étapes 3.3-3.5) à une dose de 1,4 U/kg de poids corporel pour induire la FPI. Administrer un volume égal de solution saline au groupe témoin.
- Après 21 jours, déterminer le degré de gravité de la fibrose pulmonaire pour les différents groupes de souris qui ont été transférés adoptivement avec PBS ou la suspension IM stimulée par l’IL-33 en évaluant l’expression des marqueurs de la fibrose et les scores d’Ashcroft10.
- Extraire l’ARN total du tissu pulmonaire à l’aide d’un réactif d’extraction d’ARN (voir le tableau des matériaux).
NOTE: L’analyse quantitative a été effectuée avec un lecteur de microplaques. Si le rapport OD260/OD280 est de 1,8-2,0, la pureté de l’ARN est élevée. Tous les échantillons ont été stockés à -80 ° C. - Effectuer une PCR quantitative en fluorescence pour évaluer l’expression de l’actine α-lisse, de l’actine musculaire lisse (SMA) et de la fibronectine à l’aide d’amorces spécifiques.
NOTA : Les amorces utilisées pour la α-SMA étaient avant 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACG-3' et inversée 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3', et les amorces utilisées pour la fibronectine étaient avant 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' et 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3'.
- Extraire l’ARN total du tissu pulmonaire à l’aide d’un réactif d’extraction d’ARN (voir le tableau des matériaux).
- Effectuer l’immunohistochimie comme décrit ci-dessous.
- Déshydratez le poumon gauche, encastrez-le et tranchez-le avec une trancheuse à paraffine jusqu’à une épaisseur de 4 μm.
- Placer les coupes de tissu sur des lames et cuire les lames dans une étuve à 65-70 ° C pendant 30 min à 1 h. Décirer les lames avec un pourcentage décroissant d’alcool (c.-à-d. 100 %, 95 %, 90 %, 80 % et 70 % d’alcool) pendant 5 min.
- Colorer les lames dans une solution de colorant à l’hématoxyline (analytiquement pure) pendant 5 min. Ensuite, lavez les lames à l’eau du robinet. Trempez les lames dans de l’alcool d’acide chlorhydrique à 1% pendant 3 s, lavez la couleur flottante et trempez dans l’eau courante pendant 5 min. Les sections deviendront bleues.
- Tremper dans la solution d’éosine pendant 10 s à 1 min (déterminer le temps de teinture en fonction de la couleur), laver à l’eau du robinet et placer dans 70%, 80%, 95%, 100% et 100% d’alcool, respectivement, pendant 5 min chacun. Placez ensuite les lames dans des solutions de xylène I et de xylène II pendant 3 min. Après séchage, observez et prenez des photos au microscope vertical avec un film d’étanchéité adhésif neutre.
- Effectuer un score d’Ashcroft sur les sections pour indiquer la gravité de la fibrose pulmonaire10. Effectuer une analyse statistique des données à l’aide d’un test t de deux échantillons indépendants.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le protocole utilisé ici est résumé dans l’organigramme de la figure 1. L’inhalation de liposomes de clodronate par le nez (Figure 2) a été utilisée pour épuiser les macrophages pulmonaires de souris adultes C57BL/6, ce qui a produit un bon modèle de souris receveuse. Les MI pulmonaires ont été isolées chez une autre souris (hôte) non traitée (figure 3A,B) et cultivées in vitro. Les macrophages isolés ont été stimulés avec de l’IL-33 pendant 24 heures, puis instillés par voie intratrachéale dans les souris receveuses (Figure 3C), avec des macrophages non stimulés utilisés comme témoin. Après 24 heures, BLM a été administré aux souris receveuses pour induire un modèle de fibrose pulmonaire. L’étendue de la fibrose pulmonaire après le transfert adoptif d’IM avec ou sans stimulation de l’IL-33 a été comparée 21 jours après l’administration de BLM. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) des coupes de tissus pathologiques a montré que les changements pathologiques typiques de la fibrose ont été observés après l’administration de BLM: la structure du tissu pulmonaire des souris a été détruite, l’agrégation des fibroblastes a été observée et les alvéoles normales ont disparu ou diminué. Le transfert adoptif de macrophages stimulés par l’IL-33 a exacerbé le degré de destruction des tissus pulmonaires et augmenté l’agrégation des fibroblastes chez les souris stimulées par BLM (Figure 4A). L’augmentation du score d’Ashcroft a également illustré le degré de fibrose pulmonaire (Figure 4B). Le processus pathologique de la fibrose pulmonaire est associé à l’agrégation accrue des myofibroblastes, qui sécrètent de l’actine α-lisse-muscle (α-SMA) et de la fibronectine. La détermination des niveaux d’expression de ces marqueurs a montré que les niveaux d’ARNm de α-SMA (Figure 5B) et de fibronectine (Figure 5A) dans les tissus pulmonaires des souris receveuses contenant des MI stimulées par l’IL-33 transférées adoptivement et traitées avec BLM étaient encore augmentés par rapport à ceux des souris de type sauvage traitées par BLM.
Figure 1 : Schéma de principe de l’établissement de l’expérience de transfert adoptif de macrophages. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Déplétion des macrophages chez les souris receveuses. Les liposomes clodronate ont été déposés dans la cavité nasale des souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Isolement et transfert adoptif des macrophages interstitiels. (A) La veine cave inférieure de la souris hôte a été coupée pour faciliter la perfusion. (B) Le tissu pulmonaire de la souris hôte a été coupé en petits morceaux. (C) Les macrophages interstitiels ont été purifiés à 94% par cytométrie de flux avec des marqueurs F4/80 et CD11c. (D) Des MI stimulées par l’IL-33 ont été administrées aux souris receveuses par la trachée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : L’effet du transfert adoptif de macrophages stimulés par l’IL-33 chez les souris stimulées par le BLM. (A) Coloration H&E des sections de tissu pulmonaire des souris receveuses. Barre d’échelle = 100 μm. (B) Scores d’Ashcroft déterminés à partir des sections de tissu pulmonaire des souris receveuses. Les données sont présentées sous forme de MEB moyenne ± (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Niveaux d’expression des gènes marqueurs de la fibrose pulmonaire chez les souris receveuses. (A) Le niveau d’ARNm de la fibronectine. (B) Le niveau d’ARNm de α-SMA. Les données sont présentées sous forme de MEB moyenne ± (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Déplétion des macrophages alvéolaires et pureté des IM. (A) La déplétion des macrophages alvéolaires a été confirmée par la vérification de l’expression des marqueurs F4/80 et CD11b. (B) La pureté des MI obtenues a été évaluée par cytométrie en flux avec coloration pour les marqueurs F4/80 et CD11c, et la pureté des MI isolées a été déterminée à 94,4% par cytométrie en flux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cette étude fournit une méthode efficace pour épuiser, isoler, cultiver et transférer les macrophages, ce qui peut aider à étudier les mécanismes de la fibrose pulmonaire chez la souris. Il existe de nombreuses méthodes pour la déplétion des macrophages de souris, telles que l’administration trachéale, l’injection de veines de la queue et l’inhalation nasale11. Cette étude a optimisé la méthode d’inhalation nasale, simple à utiliser et capable d’épuiser efficacement les macrophages pulmonaires 8,9. Après la stimulation IL-33 des MI en culture pendant 24 heures, les IM ont été transférés adoptivement dans les poumons des souris receveuses en utilisant une voie d’administration trachéale non invasive, ce qui a causé le moins de traumatismes aux souris. Pendant l’intubation, une anesthésie d’une durée de >20 min a été utilisée pour assurer le bon déroulement de l’intubation, ce qui a grandement amélioré le taux de survie des souris. L’administration trachéale initiale d’une suspension IM de 50 μL nécessite une micropipette pour assurer la précision de l’administration. Après l’administration trachéale, 500 μL d’air doivent être immédiatement ajoutés dans les poumons avec une seringue de 1 mL pour s’assurer que la suspension cellulaire dans le cathéter peut pénétrer complètement dans le tissu pulmonaire. Bien que cette méthode élimine les macrophages alvéolaires, les macrophages d’autres parties de la souris peuvent également migrer vers les alvéoles au cours de la maladie, diluant ainsi la proportion de cellules transférées dans les alvéoles. Par conséquent, les expériences avec des exigences strictes pour la proportion de cellules transférées doivent explorer davantage d’autres méthodes.
Les macrophages pulmonaires jouent un rôle important dans la fonction défensive des poumons12,13. Parmi ceux-ci, les macrophages alvéolaires expriment principalement les marqueurs F4/80 et CD11b, tandis que les macrophages interstitiels expriment principalement F4/80 et CD11c12. Les IM ont été choisis pour le transfert adoptif dans cette étude, car le processus nécessitait 5 x 105 cellules, et les IM constituent une fraction majeure des macrophages pulmonaires, ce qui les rend plus faciles à obtenir. Un grand nombre d’études ont montré que les macrophages régulent la réponse inflammatoire en libérant des facteurs inflammatoires et jouent un rôle important dans le processus pathologique de la fibrose pulmonaire14. Des études ont montré que l’IL-33 régule le TGF-β et d’autres cytokines pour réguler la fonction des macrophages, ce qui favorise la fibrose pulmonaire induite par le BLM4. Par conséquent, les changements induits dans la fonction des macrophages jouent un rôle important dans la pathogenèse de la fibrose pulmonaire. Cette étude fournit une méthode pour le transfert adoptif des IM qui peut aider les chercheurs à explorer davantage le rôle des macrophages dans les maladies pulmonaires telles que l’asthme et la FPI. Il n’existe actuellement aucun médicament thérapeutique efficace pour la FPI, mais cette étude indique que le facteur IL-33 peut être pertinent pour la recherche et le traitement de la fibrose pulmonaire idiopathique et, par conséquent, fournit une orientation pour l’exploration plus approfondie de la recherche sur les médicaments contre la fibrose pulmonaire. Par exemple, un anticorps neutralisant contre l’IL-33 peut être préparé pour explorer son effet et sa faisabilité en tant que médicament expérimental contre la FPI, fournissant ainsi une orientation importante pour le traitement de la fibrose pulmonaire idiopathique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent le sujet spécial de la gestion de laboratoire de l’Université de Jiangnan: construction d’une bibliothèque de tranches numériques basée sur des spécimens pathologiques (JDSYS202223) et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81800065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
References
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
- Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897 (2021).
- Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
- Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
- Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
- Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
- He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846 (2017).
- Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
- Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
- Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
- Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
- Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
- Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170 (2018).
