Summary
Denne protokol beskriver isoleringen af pulmonale interstitielle makrofager (IM'er) og deres adoptive overførsel efter IL-33-stimulering af lungealveolerne i en musemodel, hvilket kan lette in vivo-undersøgelsen af idiopatisk lungefibrose (IPF).
Abstract
Det inflammatoriske respons forårsaget af tidlig lungeskade er en af de vigtige årsager til udviklingen af idiopatisk lungefibrose (IPF), som ledsages af aktivering af inflammatoriske celler såsom makrofager og neutrofiler samt frigivelse af inflammatoriske faktorer, herunder TNF-α, IL-1β og IL-6. Tidlig inflammation forårsaget af aktiverede pulmonale interstitielle makrofager (IM'er) som reaktion på IL-33-stimulering er kendt for at spille en afgørende rolle i den patologiske proces af IPF. Denne protokol beskriver den adoptive overførsel af IM'er stimuleret af IL-33 til lungerne hos mus for at studere IPF-udvikling. Det involverer isolering og dyrkning af primære IM'er fra værtsmuselunger, efterfulgt af adoptiv overførsel af stimulerede IM'er til alveolerne hos bleomycin (BLM)-inducerede IPF-modtagermus (som tidligere er blevet udtømt for alveolære makrofager ved behandling med clodronatliposomer) og patologisk evaluering af disse mus. De repræsentative resultater viser, at adoptiv overførsel af IL-33-stimulerede makrofager forværrer lungefibrose hos mus, hvilket tyder på, at etableringen af makrofagadoptivoverførselseksperimentet er et godt teknisk middel til at studere IPF-patologi.
Introduction
Idiopatisk lungefibrose (IPF) er en diffus lungeinflammatorisk sygdom forårsaget af mange faktorer1. I cytokinmikromiljøet af Th1- og Th2-immunresponset kan makrofager polariseres til klassisk aktiverede makrofager (M1) og alternativt aktiverede makrofager (M2). Lipopolysaccharider (LPS) eller cytokinet IFN- γ inducerer M1-makrofager til at polarisere og producere proinflammatoriske cytokiner, herunder iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α og IL-12. I modsætning hertil driver type II-cytokinerne IL-4 og IL-13 polariseringen af M2-makrofager, som kan producere forskellige fibroblastvækstfremmende faktorer, såsom TGF-β og PDGF, der fremmer lungefibrose2. Den patologiske proces af IPF ledsages af makrofagaktivering og infiltration. IPF formidler skadereparation, inflammation og fibrose gennem frigivelse af cytokiner3. Da der kun er begrænsede behandlingsmuligheder til rådighed, har udforskning af IPF's molekylærpatologiske mekanismer stor betydning for udviklingen af nye strategier for IPF-forebyggelse og -behandling. Tidligere undersøgelser foretaget af vores gruppe og andre forskere 4,5 har bekræftet den øgede frigivelse af IL-33 hos IPF-patienter og i musemodeller med bleomycin (BLM)-induceret IPF. IL-33 frigives af epitel- og endotelcellerne under fibrose og er involveret i makrofagaktivering, hvilket resulterer i unormal proliferation af fibroblaster, leukocytinfiltration og eventuelt tab af lungefunktion5. Den nuværende protokol beskriver den adoptive overførsel af IL-33-stimulerede interstitielle makrofager (IM'er) til alveolerne som et middel til at studere IPF-udvikling i musemodeller. Her blev IM'er isoleret fra lungevævet hos værtsmus, dyrket in vitro, stimuleret med IL-33 i 24 timer og derefter adoptivt overført til alveolerne hos modtagermus ved trakealinjektion. Den direkte indsamling af stimulerede musemakrofager og deres adoptive overførsel til modtageralveolerne viste sig at forværre graden af lungefibrose og kan tydeligere illustrere stimulerende faktorers indflydelse på fibrose sammenlignet med de tidligere undersøgelser6. Teknikken beskrevet i denne artikel kan gøre det muligt for forskere at udforske funktionen af makrofager stimuleret af potentielle cytokiner i udviklingen af IPF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med vejledningen for pasning og brug af forsøgsdyr. Alle dyreforsøg blev godkendt af den eksperimentelle etiske komité for dyrevelfærd ved Jiangnan University (JN nr. 20211130m1720615[501]).
BEMÆRK: I alt blev 10 C57BL/6-hanmus i alderen 6-8 uger gamle og med en vægt på 20-25 g anvendt i dette studie. De tre eksperimentelle grupper i undersøgelsen omfattede tre modtagermus hver, og en værtsmus blev brugt til IM-isolering.
1. Udtømning af musens lungemakrofager
- Tag hætteglasset med clodronatliposomer (se materialetabellen) ud af køleskabet 30 minutter i forvejen, varm det op til stuetemperatur, og vend det på hovedet flere gange for at sikre ensartet blanding.
BEMÆRK: Clodronat liposomer indkapsler de hydrofile dichlormethylenbisfosfonatmolekyler. Når disse liposomer forbruges af makrofagerne, frigives clodronatet gradvist ved virkningen af lysosomphosphatasen, og dets ophobning udløser følgelig celleapoptose og udtømning af makrofager7. - Bedøv mus med 3% isofluran. Kontroller dybden af anæstesi ved at klemme den ene fod for at kontrollere bevidstheden. Påfør veterinærsalve på begge øjne for at forhindre tørhed under anæstesi.
- Opsug 60 μL clodronat liposomer ved hjælp af en pipette med en steril sugespids. Administrer lægemidlet dråbevis i næsehulen i den bedøvede mus, således at når musen inhalerer, inhaleres lægemidlet i luftrøret. Efter hver dråbe skal du sørge for, at musen inhalerer stoffet fuldstændigt og trækker vejret jævnt. Administrer liposomer indeholdende PBS alene som kontrol8 (figur 2).
- Placer musene på et 38 °C konstant temperaturbord til genopvarmning for at fremskynde deres restitution. Overvåg musene, indtil de vågner op. Når musene er kommet sig godt og opnår brystliggende, skal du overføre dem til buret.
- Brug mus med udtømte alveolære makrofager 2 dage efter behandlingen med clodronatliposomer som modtagermus til overførselseksperimentet.
BEMÆRK: I dette studie blev udtømningen af alveolære makrofager bekræftet ved at kontrollere ekspressionen af makrofagmarkører som beskrevet tidligere 8,9 efter administration af clodronatliposomer ved inhalation (se supplerende figur 1).
2. Isolation og kultur af chattjenester
- Bedøv værtsmusen med en intraperitoneal injektion af Ketamin (120 mg / kg) og Xylazin (16 mg / kg). Bekræft dybden af anæstesi via tab af tåklemmerefleksen. Påfør veterinærsalve på begge øjne for at forhindre tørhed under anæstesi. Desinficer derefter huden på den bedøvede mus med 75% alkohol og jod. Brug en saks til at skære gennem huden og udsætte hjerte-lungevævet
- Der suges 10 ml 1x PBS i en sprøjte med en 20 G kanyle og stikkeren kanylespidsen ind i musens højre atrium (figur 3A). Klip musens ringere vena cava med en kirurgisk saks, og perfuser derefter musen manuelt med PBS med en konstant hastighed (10-20 ml / min), indtil lungevævet bliver hvidt. Punktafgifter lungevævet og overfør det til iskold PBS i en kulturskål (figur 3B).
- Skær lungevævet i fragmenter på ca. 2 mm x 2 mm x 2 mm. Derefter tilsættes 15 ml af Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) indeholdende 1% collagenase A til lungevævet for at isolere makrofagerne. Der inkuberes ved 100 o/min i 30 minutter på et rystebord på 37 °C.
- Opsug lungevævssuspensionen gennem en 10 ml sprøjte mindst 20x for at gøre den så fin som muligt. Denne suspension filtreres gennem en 40 μm cellesi. Filtratet centrifugeres ved 400 x g i 10 minutter og supernatanten kasseres.
- Lyser de røde blodlegemer i pillen ved at tilsætte 3 ml RBC-lysisbuffer (se materialetabel) på is i 2-3 min.
- Efter centrifugering ved 150 x g i 5 minutter resuspenderes cellepelleten med 10 ml DMEM (indeholdende 100 E/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin). Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer.
- Frø cellerne til 10 cm vedhængende cellekulturskåle ved 2 x 107 celler / skål, og inkuber i 1 time ved 37 ° C og 5% CO2. Dette gør det muligt for lunge-IM'erne at klæbe til skålen5. Efter 1 time aspireres supernatanten og de flydende celler, og der tilsættes 10 ml frisk fuldkulturmedium (DMEM indeholdende 10% FBS, 100 E/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin). Inkuber i mere end 8 timer eller natten over.
- Renheden af de opnåede IM'er bestemmes ved hjælp af flowcytometri med farvning for F4/80- og CD11c-markører som beskrevet tidligere5 (se supplerende figur 1).
3. Adoptiv overførsel af IM'er til lungealveolerne
- Substratet fra pladen, der indeholder de isolerede lunge-IM'er (trin 2.7), erstattes med et komplet dyrkningsmedium indeholdende 10 ng/ml IL-33 til stimulering af IM'erne. Der inkuberes i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2. Brug 1x PBS i stedet for IL-33 som kontrol.
- Dissocier pulmonale IM'er ved at behandle dem med 1 ml 0,25% trypsin i 5 minutter. Sluk derefter fordøjelsen ved at tilsætte 3 ml frisk kultur komplet medium, og høst lungemakrofagerne ved at centrifugere cellesuspensionen ved 150 x g og 4 °C i 5 minutter. Cellerne tælles med et hæmocytometer, og cellerne resuspenderes i PBS til en slutkoncentration på 5 x 105 celler/50 μL.
- Bedøv modtagermusene med 3% isoflurangas. Vent på, at musen bliver bevidstløs (som i trin 1.2), og fastgør derefter lemmerne på den bedøvede mus på en lodret plade med medicinsk tape. Træk forsigtigt musens tunge til den ene side ved hjælp af en vatpind.
- Tænd intubationslampen og skinne den på musens hals, så luftrøret kan ses. Kontroller, at luftrøret er tæt på bunden af tungen, spiserøret er nær bagsiden af nakken, men spiserørets åbning er ikke synlig under operationen.
- Brug intubationslampen (22 G) til at hjælpe med at intubere musen. Den indbyggede nålekanyle føres ind i luftrøret med en styretråd (0,4 mm diameter). Fjern styretråden og skub kanylen ind i muserøret for at fuldføre intubationen.
- Når kanylen er observeret at trænge ind i luftrøret, injiceres 50 μL af cellesuspensionen (indeholdende 5 x 105 IM'er) i modtagermusen gennem luftrøret.
- Placer musene på en 38 ° C konstant opvarmningspude til genopvarmning for at fremskynde restitutionen. Overvåg musene, indtil de vågner op. Når de har genoprettet sig godt og opnået bryst liggende, skal du overføre dem til buret.
- Efter 24 timer administreres bleomycin (BLM) via luftrøret (ved hjælp af proceduren i trin 3.3-3.5) i en dosis på 1,4 E/kg legemsvægt for at inducere IPF. Administrer en lige så stor mængde saltvand til kontrolgruppen.
- Efter 21 dage bestemmes sværhedsgraden af lungefibrose for de forskellige grupper af mus, der blev adoptivt overført med PBS eller den IL-33-stimulerede IM-suspension ved at evaluere ekspressionen af markører for fibrose og Ashcroft-scorerne10.
- Uddrag det samlede RNA fra lungevævet ved hjælp af et RNA-ekstraktionsreagens (se materialetabel).
BEMÆRK: Kvantitativ analyse blev udført med en mikropladelæser. Hvis OD260/OD280-forholdet er 1,8-2,0, er RNA-renheden høj. Alle prøverne blev opbevaret ved -80 ° C. - Udfør fluorescens kvantitativ PCR for at evaluere ekspressionen af α-glat muskelactin (SMA) og fibronectin ved hjælp af specifikke primere.
BEMÆRK: De primere, der blev brugt til α-SMA, var fremad 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' og omvendt 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3', og primerne, der blev brugt til fibronectin, var fremad 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' og omvendt 5'-CACTGAAGCAGGTTTTTCCTCGGTT-3'.
- Uddrag det samlede RNA fra lungevævet ved hjælp af et RNA-ekstraktionsreagens (se materialetabel).
- Udfør immunhistokemi som beskrevet nedenfor.
- Dehydrer venstre lunge, indlejr den og skær den i skiver med en paraffinskærer til en tykkelse på 4 μm.
- Placer vævssektionerne på dias og bag diasene i en ovn ved 65-70 ° C i 30 min til 1 time. Afvoks diasene med en faldende procentdel alkohol (dvs. 100%, 95%, 90%, 80% og 70% alkohol) i 5 min.
- Plet diasene i hæmatopylinfarveopløsning (analytisk ren) i 5 min. Vask derefter diasene med ledningsvand. Sug diasene i blød i 1% saltsyrealkohol i 3 sekunder, vask den flydende farve af og blød i rindende vand i 5 minutter. Sektionerne bliver blå.
- Dyp i eosinopløsning i 10 s til 1 min (bestem farvningstiden i henhold til farven), vask med ledningsvand og læg i henholdsvis 70%, 80%, 95%, 100% og 100% alkohol i 5 minutter hver. Placer derefter diasene i xylen I- og xylen II-opløsninger i 3 min. Efter tørring skal du observere og tage fotos under det lodrette mikroskop med neutral klæbende tætningsfilm.
- Udfør Ashcroft-scoring på sektionerne for at indikere sværhedsgraden af lungefibrose10. Udfør statistisk analyse af dataene ved hjælp af en t-test af to uafhængige prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den protokol, der anvendes her, er opsummeret i rutediagrammet i figur 1. Indånding af clodronatliposomer gennem næsen (figur 2) blev brugt til at nedbryde lungemakrofagerne hos voksne C57BL/6-mus, og dette gav en god modtagermusemodel. Pulmonale IM'er blev isoleret fra en anden ubehandlet (værts)mus (figur 3A,B) og dyrket in vitro. De isolerede makrofager blev stimuleret med IL-33 i 24 timer og derefter intratrachealt indpodet i modtagermusene (figur 3C) med ustimulerede makrofager anvendt som kontrol. Efter 24 timer blev BLM administreret til modtagermusene for at inducere en lungefibrosemodel. Omfanget af lungefibrose efter adoptiv overførsel af IM'er med eller uden IL-33-stimulering blev sammenlignet 21 dage efter administration af BLM. Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning af de patologiske vævssektioner viste, at de typiske patologiske ændringer af fibrose blev observeret efter BLM-administration: musenes lungevævsstruktur blev ødelagt, aggregeringen af fibroblaster blev observeret, og de normale alveoler forsvandt eller faldt. Den adoptive overførsel af IL-33-stimulerede makrofager forværrede graden af lungevævsødelæggelse og øget fibroblastaggregering i de BLM-stimulerede mus (figur 4A). Stigningen i Ashcroft-scoren illustrerede yderligere graden af lungefibrose (figur 4B). Den patologiske proces af lungefibrose er forbundet med den øgede aggregering af myofibroblaster, som udskiller α-glat muskelactin (α-SMA) og fibronectin. Bestemmelsen af ekspressionsniveauerne for disse markører viste, at mRNA-niveauerne af α-SMA (figur 5B) og fibronectin (figur 5A) i lungevævet hos modtagermusene indeholdende adoptivt overførte IL-33-stimulerede IM'er og behandlet med BLM blev yderligere øget sammenlignet med dem hos de BLM-behandlede vildtypemus.
Figur 1: Skematisk diagram over etableringen af makrofag adoptiv overførsel eksperiment. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Udtømning af makrofager i modtagermusene. Clodronate liposomerne blev droppet ind i musenes næsehule. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Isolering og adoptiv overførsel af interstitielle makrofager . (A) Værtsmusens ringere vena cava blev skåret for at lette perfusion. (B) Lungevævet fra værtsmusen blev skåret i små stykker. (C) De interstitielle makrofager blev renset til 94% ved anvendelse af flowcytometri med F4/80 og CD11c markører. (D) IL-33-stimulerede IM'er blev administreret til modtagermusene gennem luftrøret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Effekten af adoptivoverførsel af IL-33-stimulerede makrofager i de BLM-stimulerede mus. (A) H&E-farvning af lungevævssektioner fra modtagermusene. Skalabjælke = 100 μm. (B) Ashcroft-score bestemt ud fra lungevævssektionerne hos modtagermusene. Data vises som gennemsnit ± SEM (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Ekspressionsniveauer af lungefibrose markørgener i modtagermusene. (A) MRNA-niveauet af fibronectin. (B) mRNA-niveauet af α-SMA. Data vises som gennemsnit ± SEM (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Udtømning af alveolære makrofager og renhed af IM'er. (A) Udtømningen af alveolære makrofager blev bekræftet ved at kontrollere ekspressionen af F4/80- og CD11b-markører. (B) Renheden af de opnåede IM'er blev vurderet ved anvendelse af flowcytometri med farvning for F4/80- og CD11c-markører, og renheden af de isolerede IM'er blev bestemt til at være 94,4% ved anvendelse af flowcytometri. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse giver en effektiv metode til at nedbryde, isolere, dyrke og overføre makrofager, hvilket kan hjælpe med at studere mekanismerne for lungefibrose hos mus. Der er mange metoder til udtømning af musemakrofager, såsom trakeal administration, haleveneinjektion og nasal indånding11. Denne undersøgelse optimerede den nasale inhalationsmetode, som er enkel at betjene og effektivt kan nedbryde lungemakrofager 8,9. Efter IL-33-stimulering af IM'er i kultur i 24 timer blev IM'erne adoptivt overført til lungerne hos modtagermusene ved hjælp af en ikke-invasiv trakealadministrationsvej, hvilket forårsagede mindst traume for musene. Under intubation blev der anvendt en anæstesivarighed på >20 minutter for at sikre en jævn udvikling af intubationen, hvilket i høj grad forbedrede musenes overlevelsesrate. Den indledende trakealadministration af en 50 μL IM-suspension kræver en mikropipette for at sikre nøjagtigheden af administrationen. Efter trakealadministration skal 500 μL luft straks tilsættes lungerne med en 1 ml sprøjte for at sikre, at cellesuspensionen i kateteret kan trænge helt ind i lungevævet. Selvom denne metode rydder de alveolære makrofager, kan makrofager fra andre dele af musen også migrere til alveolerne i løbet af sygdommen og dermed fortynde andelen af celler, der overføres til alveolerne. Derfor skal eksperimenter med strenge krav til andelen af overførte celler yderligere udforske andre metoder.
Lungemakrofager spiller en vigtig rolle i lungernes defensive funktion12,13. Af disse udtrykker alveolære makrofager hovedsageligt F4/80- og CD11b-markørerne, mens interstitielle makrofager hovedsageligt udtrykker F4/80 og CD11c12. IM'er blev valgt til adoptivoverførsel i denne undersøgelse, da processen krævede 5 x 105 celler, og IM'er udgør en stor del af lungemakrofagerne, hvilket gør dem lettere at opnå. Et stort antal undersøgelser har vist, at makrofager regulerer det inflammatoriske respons ved at frigive inflammatoriske faktorer og spiller en vigtig rolle i den patologiske proces af lungefibrose14. Undersøgelser har vist, at IL-33 regulerer TGF-β og andre cytokiner for at regulere funktionen af makrofager, hvilket fremmer BLM-induceret lungefibrose4. Derfor spiller inducerede ændringer i makrofagfunktionen en vigtig rolle i patogenesen af lungefibrose. Denne undersøgelse giver en metode til adoptiv overførsel af IM'er, der kan hjælpe forskere med yderligere at udforske makrofagers rolle i lungesygdomme som astma og IPF. Der findes i øjeblikket ikke noget effektivt terapeutisk lægemiddel til IPF, men denne undersøgelse indikerer, at faktoren IL-33 kan være relevant for forskning og behandling af idiopatisk lungefibrose og dermed giver en retning for den videre udforskning af lungefibrose-lægemiddelforskning. For eksempel kan et neutraliserende antistof mod IL-33 fremstilles for at undersøge dets virkning og gennemførlighed som et eksperimentelt IPF-lægemiddel og derved give en vigtig retning til behandling af idiopatisk lungefibrose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender det særlige emne for laboratoriestyring af Jiangnan University: Konstruktion af digitalt skivebibliotek baseret på patologiske prøver (JDSYS202223) og National Natural Science Foundation of China (81800065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
References
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
- Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897 (2021).
- Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
- Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
- Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
- Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
- He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846 (2017).
- Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
- Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
- Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
- Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
- Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
- Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170 (2018).
