Summary
يصف هذا البروتوكول عزل الضامة الخلالية الرئوية (IMs) ونقلها بالتبني بعد تحفيز IL-33 للحويصلات الهوائية الرئوية في نموذج الفأر ، والذي يمكن أن يسهل الدراسة في الجسم الحي للتليف الرئوي مجهول السبب (IPF).
Abstract
تعد الاستجابة الالتهابية الناجمة عن إصابة الرئة المبكرة أحد الأسباب المهمة لتطور التليف الرئوي مجهول السبب (IPF) ، والذي يصاحبه تنشيط الخلايا الالتهابية مثل الضامة والعدلات ، بالإضافة إلى إطلاق العوامل الالتهابية بما في ذلك TNF-α و IL-1β و IL-6. من المعروف أن الالتهاب المبكر الناجم عن الضامة الخلالية الرئوية المنشطة (IMs) استجابة لتحفيز IL-33 يلعب دورا حيويا في العملية المرضية ل IPF. يصف هذا البروتوكول النقل بالتبني للرسائل العضلية التي يحفزها IL-33 إلى رئتي الفئران لدراسة تطور IPF. وهو ينطوي على عزل وزراعة الحقن العضلي الأولي من رئتي الفأر المضيف ، يليه النقل بالتبني للرسائل العضلية المحفزة إلى الحويصلات الهوائية للفئران المتلقية IPF التي يسببها بليوميسين (BLM) (والتي تم استنفادها سابقا من البلاعم السنخية عن طريق العلاج بالليبوزومات الشحمية كلودرونات) ، والتقييم المرضي لتلك الفئران. تظهر النتائج التمثيلية أن النقل بالتبني للبلاعم المحفزة IL-33 يؤدي إلى تفاقم التليف الرئوي في الفئران ، مما يشير إلى أن إنشاء تجربة نقل البلاعم بالتبني هو وسيلة تقنية جيدة لدراسة أمراض IPF.
Introduction
التليف الرئوي مجهول السبب (IPF) هو مرض التهابي رئوي منتشر تسببه العديد من العوامل1. في البيئة المكروية السيتوكينية للاستجابة المناعية Th1 و Th2 ، يمكن استقطاب البلاعم إلى بلاعم منشطة بشكل كلاسيكي (M1) وبلاعم نشطة بدلا من ذلك (M2). تحفز عديدات السكاريد الدهنية (LPS) أو السيتوكين IFN- γ الضامة M1 على استقطاب وإنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، بما في ذلك iNOS و IL-1 و IL-6 و TNF-α و IL-12. في المقابل ، فإن السيتوكينات من النوع الثاني IL-4 و IL-13 تقود استقطاب الضامة M2 ، والتي يمكن أن تنتج عوامل مختلفة لتعزيز نمو الخلايا الليفية ، مثل TGF-β و PDGF ، التي تعزز التليف الرئوي2. ويرافق العملية المرضية ل IPF تنشيط البلاعم والتسلل. يتوسط IPF إصلاح الإصابة والالتهاب والتليف من خلال إطلاق السيتوكينات3. نظرا لتوفر خيارات علاجية محدودة فقط ، فإن استكشاف الآليات المرضية الجزيئية ل IPF يحمل أهمية كبيرة لتطوير استراتيجيات جديدة للوقاية من IPF وعلاجه. أكدت الدراسات السابقة التي أجرتها مجموعتنا وباحثون آخرون 4,5 زيادة إطلاق IL-33 في مرضى IPF وفي نماذج الفئران مع بليوميسين (BLM) الناجم عن IPF. يتم إطلاق IL-33 بواسطة الخلايا الظهارية والبطانية أثناء التليف ويشارك في تنشيط البلاعم ، مما يؤدي إلى تكاثر غير طبيعي للخلايا الليفية ، وتسلل الكريات البيض ، وفقدان وظائف الرئة في نهاية المطاف5. يصف البروتوكول الحالي النقل بالتبني للبلاعم الخلالية المحفزة IL-33 (IMs) إلى الحويصلات الهوائية كوسيلة لدراسة تطور IPF في نماذج الفئران. هنا ، تم عزل IMs من أنسجة الرئة للفئران المضيفة ، وزرعت في المختبر ، وحفزت مع IL-33 لمدة 24 ساعة ، ثم نقلها بالتبني إلى الحويصلات الهوائية للفئران المتلقية عن طريق حقن القصبة الهوائية. تم العثور على المجموعة المباشرة من البلاعم الفأر المحفزة ونقلها بالتبني إلى الحويصلات الهوائية المتلقية لتفاقم درجة التليف الرئوي ويمكن أن توضح بشكل أوضح تأثير العوامل المحفزة على التليف مقارنة بالدراسات السابقة6. يمكن للتقنية الموصوفة في هذه الورقة أن تمكن الباحثين من استكشاف وظيفة الضامة التي تحفزها السيتوكينات المحتملة في تطوير IPF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع التجارب وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات رعاية الحيوان التجريبي بجامعة جيانغنان (JN No. 20211130m1720615 [501]).
ملاحظة: في المجموع ، تم استخدام 10 ذكور من الفئران C57BL / 6 الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع ويزن 20-25 جم في هذه الدراسة. تضمنت المجموعات التجريبية الثلاث في الدراسة ثلاثة فئران متلقية لكل منها ، وتم استخدام فأر مضيف واحد لعزل IM.
1. استنزاف الضامة الرئوية للفأر
- أخرج قارورة كلودرونات ليبوزومات (انظر جدول المواد) من الثلاجة قبل 30 دقيقة ، وقم بتسخينها إلى درجة حرارة الغرفة ، ثم اقلبها عدة مرات لضمان خلط موحد.
ملاحظة: تغلف الجسيمات الشحمية كلودرونات جزيئات ثنائي كلوروميثيلين ثنائي كلوروميثيلين ثنائي فوسفونات الماء. عندما تستهلك البلاعم هذه الجسيمات الشحمية ، يتم إطلاق الكلودرونات تدريجيا عن طريق عمل الفوسفاتيز الليزوزوم ، وبالتالي يؤدي تراكمه إلى موت الخلايا المبرمج ونضوب الضامة7. - تخدير الفئران مع 3 ٪ إيزوفلوران. تحقق من عمق التخدير عن طريق الضغط على قدم واحدة للتحقق من الوعي. ضع مرهما بيطريا على كلتا العينين لمنع الجفاف تحت التخدير.
- نضح 60 ميكرولتر من الجسيمات الشحمية كلودرونات باستخدام ماصة مع طرف شفط معقم. إعطاء الدواء بالتنقيط في تجويف الأنف للفأر المخدر ، بحيث عندما يستنشق الفأر ، يتم استنشاق الدواء في القصبة الهوائية. بعد كل قطرة ، تأكد من أن الفأر يستنشق الدواء تماما ويتنفس بالتساوي. إدارة الجسيمات الشحمية التي تحتوي على برنامج تلفزيوني وحده كعنصر تحكم8 (الشكل 2).
- ضع الفئران على جدول درجة حرارة ثابتة 38 درجة مئوية لإعادة التدفئة لتسريع شفائها. راقب الفئران حتى تستيقظ. بعد أن تتعافى الفئران جيدا وتحقق راقد القص ، قم بنقلها إلى القفص.
- استخدام الفئران مع الضامة السنخية المستنفدة 2 أيام بعد العلاج مع الجسيمات الشحمية كلودرونات كفئران متلقية لتجربة النقل.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم تأكيد استنفاد البلاعم السنخية عن طريق التحقق من التعبير عن علامات البلاعم كما هو موضح سابقا 8,9 بعد إعطاء الجسيمات الشحمية كلودرونات عن طريق الاستنشاق (انظر الشكل التكميلي 1).
2. عزلة وثقافة الرسائل الفورية
- تخدير الفأر المضيف بحقن الكيتامين داخل الصفاق (120 ملغم/كغم) والزيلازين (16 ملغم/كغم). تأكد من عمق التخدير عن طريق فقدان منعكس قرصة إصبع القدم. ضع مرهما بيطريا على كلتا العينين لمنع الجفاف تحت التخدير. ثم قم بتطهير جلد الفأر المخدر بنسبة 75٪ كحول ويود . استخدم المقص لقطع الجلد وكشف الأنسجة القلبية الرئوية
- نضح 10 مل من 1x PBS في حقنة بإبرة 20 G وأدخل طرف الإبرة في الأذين الأيمن للفأر (الشكل 3 أ). اقطع الوريد الأجوف السفلي للفأر بالمقص الجراحي ، ثم قم بتهوية الماوس يدويا باستخدام برنامج تلفزيوني بسرعة ثابتة (10-20 مل / دقيقة) حتى يتحول لون أنسجة الرئة إلى اللون الأبيض. قم باستئصال أنسجة الرئة ونقلها إلى برنامج تلفزيوني بارد في طبق استزراع (الشكل 3 ب).
- قطع أنسجة الرئة إلى شظايا حوالي 2 مم × 2 مم × 2 مم. ثم أضف 15 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 1٪ كولاجيناز أ إلى أنسجة الرئة لعزل البلاعم. احتضن عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة على طاولة اهتزاز 37 درجة مئوية.
- نضح تعليق أنسجة الرئة من خلال حقنة 10 مل على الأقل 20x لجعلها دقيقة قدر الإمكان. قم بتصفية هذا التعليق من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. أجهزة الطرد المركزي الترشيح في 400 × غرام لمدة 10 دقائق وتجاهل الطاف.
- تحلل خلايا الدم الحمراء في الحبيبات عن طريق إضافة 3 مل من محلول تحلل كرات الدم الحمراء (انظر جدول المواد) على الجليد لمدة 2-3 دقائق.
- بعد الطرد المركزي عند 150 × جم لمدة 5 دقائق ، أعد تعليق حبيبات الخلية ب 10 مل من DMEM (تحتوي على 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين). عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
- بذر الخلايا في أطباق زراعة الخلايا الملتصقة 10 سم في 2 × 107 خلايا / طبق ، واحتضانها لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. هذا يسمح للرسائل العضلية الرئوية بالالتزام بالطبق5. بعد 1 ساعة ، قم بشفط الخلايا الطافية والعائمة ، وأضف 10 مل من وسط الاستزراع الكامل الطازج (DMEM يحتوي على 10٪ FBS و 100 U / mL من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين). احتضان لأكثر من 8 ساعات أو بين عشية وضحاها.
- تحديد نقاء العضل الذي تم الحصول عليه باستخدام قياس التدفق الخلوي مع تلطيخ لعلامات F4 / 80 و CD11c ، كما هو موضح سابقا5 (انظر الشكل التكميلي 1).
3. النقل بالتبني للرسائل العضلية إلى الحويصلات الهوائية الرئوية
- استبدل وسط الاستزراع من اللوحة التي تحتوي على العضل الرئوي المعزول (الخطوة 2.7) بوسط استزراع كامل يحتوي على 10 نانوغرام/مل IL-33 لتحفيز العضل. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. استخدم 1x PBS بدلا من IL-33 كعنصر تحكم.
- فصل العضلات الرئوية عن طريق علاجها ب 1 مل من 0.25٪ تربسين لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، قم بإخماد عملية الهضم بإضافة 3 مل من وسط كامل للثقافة الطازجة ، وحصاد الضامة الرئوية عن طريق الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 150 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، وأعد تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني إلى تركيز نهائي قدره 5 × 105 خلايا / 50 ميكرولتر.
- تخدير الفئران المتلقية بغاز إيزوفلوران 3٪. انتظر حتى يصبح الماوس فاقدا للوعي (كما في الخطوة 1.2) ، ثم قم بإصلاح أطراف الماوس المخدر على لوحة عمودية بشريط طبي. اسحب لسان الماوس برفق إلى جانب واحد باستخدام قطعة قطن.
- قم بتشغيل مصباح التنبيب وتألقه على حلق الماوس حتى يمكن رؤية القصبة الهوائية. تأكد من أن القصبة الهوائية قريبة من قاعدة اللسان ، والمريء بالقرب من الجزء الخلفي من الرقبة ، ولكن فتحة المريء غير مرئية أثناء العملية.
- استخدم مصباح التنبيب (22 جم) للمساعدة في تنبيب الماوس. قم بتوجيه قنية إبرة المسكن في القصبة الهوائية بسلك توجيه (قطره 0.4 مم). قم بإزالة سلك التوجيه وادفع القنية في القصبة الهوائية للفأر لإكمال التنبيب.
- بعد ملاحظة دخول القنية إلى القصبة الهوائية ، قم بحقن 50 ميكرولتر من معلق الخلية (يحتوي على 5 × 105 IMs) في الماوس المتلقي من خلال القصبة الهوائية.
- ضع الفئران على وسادة تسخين ثابتة تبلغ 38 درجة مئوية لإعادة التسخين لتسريع التعافي. راقب الفئران حتى تستيقظ. بعد أن يتعافوا جيدا ويحققوا راقد القصي ، قم بنقلهم إلى القفص.
- بعد 24 ساعة، يتم تطبيق بليوميسين (BLM) عبر القصبة الهوائية (باستخدام الإجراء في الخطوات 3.3-3.5) بجرعة 1.4 وحدة / كغ من وزن الجسم للحث على IPF. تطبيق كمية متساوية من المحلول الملحي على المجموعة الضابطة.
- بعد 21 يوما ، حدد درجة شدة التليف الرئوي لمجموعات مختلفة من الفئران التي تم نقلها بالتبني باستخدام PBS أو تعليق IM المحفز IL-33 من خلال تقييم التعبير عن علامات التليف ودرجات Ashcroft10.
- استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من أنسجة الرئة باستخدام كاشف استخراج الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
ملاحظة: تم إجراء التحليل الكمي باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة. إذا كانت نسبة OD260 / OD280 هي 1.8-2.0 ، فإن نقاء الحمض النووي الريبي مرتفع. تم تخزين جميع العينات في -80 درجة مئوية. - إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري لتقييم التعبير عن أكتين العضلات الملساء α (SMA) والفبرونيكتين باستخدام بادئات محددة.
ملاحظة: كانت البادئات المستخدمة في α-SMA أمامية 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' وعكسية 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3 '، وكانت البادئات المستخدمة في الفبرونيكتين أمامية 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' وعكسية 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGTGT-3'.
- استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من أنسجة الرئة باستخدام كاشف استخراج الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
- إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية كما هو موضح أدناه.
- قم بتجفيف الرئة اليسرى ، وقم بتضمينها ، وقم بتقطيعها باستخدام قطاعة البارافين بسمك 4 ميكرومتر.
- ضع أقسام الأنسجة على شرائح واخبز الشرائح في فرن على حرارة 65-70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة. قم بإزالة الشمع من الشرائح بنسبة متناقصة من الكحول (أي 100٪ و 95٪ و 90٪ و 80٪ و 70٪ كحول) لمدة 5 دقائق.
- تلطيخ الشرائح في محلول صبغة الهيماتوكسيلين (نقي تحليليا) لمدة 5 دقائق. ثم اغسل الشرائح بماء الصنبور. انقع الشرائح في كحول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 1٪ لمدة 3 ثوان ، واغسل اللون العائم ، وانقع في الماء المتدفق لمدة 5 دقائق. ستتحول الأقسام إلى اللون الأزرق.
- اغمر في محلول eosin لمدة 10 إلى 1 دقيقة (حدد وقت الصباغة وفقا للون) ، واغسله بماء الصنبور ، وضعه في 70٪ و 80٪ و 95٪ و 100٪ كحول ، على التوالي ، لمدة 5 دقائق لكل منهما. ثم ضع الشرائح في محاليل الزيلين I و xylene II لمدة 3 دقائق. بعد التجفيف ، راقب والتقط الصور تحت المجهر الرأسي باستخدام فيلم مانع للتسرب لاصق محايد.
- أداء تسجيل Ashcroft على الأقسام للإشارة إلى شدة التليف الرئوي10. إجراء تحليل إحصائي للبيانات باستخدام اختبار t لعينتين مستقلتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تلخيص البروتوكول المستخدم هنا في المخطط الانسيابي في الشكل 1. تم استخدام استنشاق الجسيمات الشحمية كلودرونات من خلال الأنف (الشكل 2) لاستنفاد الضامة الرئوية للفئران البالغة C57BL / 6 ، وهذا أنتج نموذجا جيدا للفأر المتلقي. تم عزل العضل الرئوي من فأر آخر (مضيف) غير معالج (الشكل 3 أ ، ب) واستزراعه في المختبر. تم تحفيز البلاعم المعزولة باستخدام IL-33 لمدة 24 ساعة ثم غرست داخل القصبة الهوائية في الفئران المتلقية (الشكل 3C) ، مع استخدام الضامة غير المحفزة كعنصر تحكم. بعد 24 ساعة ، تم إعطاء BLM للفئران المتلقية للحث على نموذج التليف الرئوي. تمت مقارنة مدى التليف الرئوي بعد النقل بالتبني للعضل مع أو بدون تحفيز IL-33 بعد 21 يوما من إعطاء BLM. أظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E & E) لأقسام الأنسجة المرضية أن التغيرات المرضية النموذجية للتليف لوحظت بعد إعطاء BLM: تم تدمير بنية أنسجة الرئة للفئران ، ولوحظ تجميع الخلايا الليفية ، واختفت الحويصلات الهوائية الطبيعية أو انخفضت. أدى النقل بالتبني للبلاعم المحفزة ب IL-33 إلى تفاقم درجة تدمير أنسجة الرئة وزيادة تراكم الخلايا الليفية في الفئران المحفزة ب BLM (الشكل 4 أ). أوضحت الزيادة في درجة Ashcroft درجة التليف الرئوي (الشكل 4B). ترتبط العملية المرضية للتليف الرئوي بزيادة تجميع الخلايا الليفية العضلية ، التي تفرز أكتين العضلات الملساء α (α-SMA) والفبرونيكتين. أظهر تحديد مستويات التعبير لهذه العلامات أن مستويات mRNA ل α-SMA (الشكل 5B) والفبرونيكتين (الشكل 5A) في أنسجة الرئة للفئران المتلقية التي تحتوي على IMs المحفزة بالتبني IL-33 والمعالجة ب BLM قد زادت مقارنة بتلك الموجودة في الفئران البرية المعالجة ب BLM.
الشكل 1: رسم تخطيطي لإنشاء تجربة النقل بالتبني للبلاعم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: استنفاد البلاعم في الفئران المتلقية. تم إسقاط الجسيمات الشحمية كلودرونات في تجويف الأنف للفئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: عزل البلاعم الخلالية ونقلها بالتبني . (أ) قطع الوريد الأجوف السفلي للفأر المضيف لتسهيل التروية. (ب) قطعت أنسجة الرئة من الفأر المضيف إلى قطع صغيرة. (ج) تم تنقية البلاعم الخلالية إلى 94٪ باستخدام قياس التدفق الخلوي مع علامات F4 / 80 و CD11c. (د) تم إعطاء IMs المحفزة ب IL-33 للفئران المتلقية من خلال القصبة الهوائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تأثير النقل بالتبني للبلاعم المحفزة ب IL-33 في الفئران المحفزة ب BLM. أ: تلطيخ H&E لأقسام أنسجة الرئة من الفئران المتلقية. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) درجات أشكروفت المحددة من أقسام أنسجة الرئة للفئران المتلقية. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM (n = 3). * p < 0.05 ، ** p < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مستويات التعبير عن الجينات الواسمة للتليف الرئوي في الفئران المتلقية. أ: مستوى الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) للفيبرونيكتين. ب: مستوى الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) ل α-SMA. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM (n = 3). * p < 0.05 ، ** p < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: استنفاد البلاعم السنخية ونقاء العضل. (أ) تم تأكيد استنفاد البلاعم السنخية عن طريق التحقق من تعبير علامات F4/80 و CD11b. (ب) تم تقييم نقاء العضل الذي تم الحصول عليه باستخدام قياس التدفق الخلوي مع تلطيخ لعلامات F4 / 80 و CD11c ، وتم تحديد نقاء IMs المعزولة بنسبة 94.4٪ باستخدام قياس التدفق الخلوي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توفر هذه الدراسة طريقة فعالة لاستنفاد البلاعم وعزلها واستزراعها ونقلها ، والتي يمكن أن تساعد في دراسة آليات التليف الرئوي في الفئران. هناك العديد من الطرق لاستنفاد بلاعم الفئران ، مثل إدارة القصبة الهوائية ، وحقن الوريد الذيل ، واستنشاق الأنف11. حسنت هذه الدراسة طريقة استنشاق الأنف ، وهي سهلة التشغيل ويمكن أن تستنفد الضامة الرئويةبشكل فعال 8,9. بعد تحفيز IL-33 للرسائل العضلية في الثقافة لمدة 24 ساعة ، تم نقل IMs بالتبني إلى رئتي الفئران المتلقية باستخدام مسار إدارة القصبة الهوائية غير الغازية ، مما تسبب في أقل صدمة للفئران. أثناء التنبيب ، تم استخدام مدة تخدير >20 دقيقة لضمان التقدم السلس للتنبيب ، مما أدى إلى تحسن كبير في معدل بقاء الفئران. تتطلب الإدارة الأولية للقصبة الهوائية لتعليق عضلي سعة 50 ميكرولتر ماصة دقيقة لضمان دقة الإدارة. بعد إعطاء القصبة الهوائية ، يجب إضافة 500 ميكرولتر من الهواء على الفور إلى الرئتين باستخدام حقنة سعة 1 مل لضمان أن تعليق الخلية في القسطرة يمكن أن يدخل أنسجة الرئة تماما. على الرغم من أن هذه الطريقة تزيل البلاعم السنخية ، إلا أن البلاعم من أجزاء أخرى من الفأر قد تهاجر أيضا إلى الحويصلات الهوائية على مدار المرض ، مما يخفف من نسبة الخلايا المنقولة إلى الحويصلات الهوائية. لذلك ، تحتاج التجارب ذات المتطلبات الصارمة لنسبة الخلايا المنقولة إلى مزيد من استكشاف طرق أخرى.
تلعب الضامة الرئوية دورا مهما في الوظيفة الدفاعية للرئتين12,13. من بين هذه ، تعبر البلاعم السنخية بشكل أساسي عن علامات F4 / 80 و CD11b ، بينما تعبر البلاعم الخلالية بشكل أساسي عن F4 / 80 و CD11c12. تم اختيار الحقن العضلي للنقل بالتبني في هذه الدراسة ، حيث تطلبت العملية 5 × 105 خلايا ، وتشكل الحقن العضلي جزءا كبيرا من الضامة الرئوية ، مما يسهل الحصول عليها. أظهر عدد كبير من الدراسات أن البلاعم تنظم الاستجابة الالتهابية عن طريق إطلاق العوامل الالتهابية وتلعب دورا مهما في العملية المرضية للتليف الرئوي14. أظهرت الدراسات أن IL-33 ينظم TGF-β والسيتوكينات الأخرى لتنظيم وظيفة الضامة ، مما يعزز التليف الرئوي الناجم عن BLM4. لذلك ، تلعب التغيرات المستحثة في وظيفة البلاعم دورا مهما في التسبب في التليف الرئوي. توفر هذه الدراسة طريقة للنقل بالتبني للرسائل العضلية التي يمكن أن تساعد الباحثين على استكشاف دور الضامة في أمراض الرئة مثل الربو و IPF. لا يوجد حاليا دواء علاجي فعال ل IPF ، لكن هذه الدراسة تشير إلى أن العامل IL-33 قد يكون ذا صلة بالبحث والعلاج من التليف الرئوي مجهول السبب ، وبالتالي ، يوفر اتجاها لمزيد من الاستكشاف لأبحاث أدوية التليف الرئوي. على سبيل المثال ، يمكن إعداد جسم مضاد معادل ضد IL-33 لاستكشاف تأثيره وجدواه كدواء تجريبي IPF ، وبالتالي توفير اتجاه مهم لعلاج التليف الرئوي مجهول السبب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
يقر المؤلفون بالموضوع الخاص لإدارة المختبرات بجامعة جيانغنان: بناء مكتبة شرائح رقمية تعتمد على العينات المرضية (JDSYS202223) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81800065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
References
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
- Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897 (2021).
- Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
- Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
- Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
- Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
- He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846 (2017).
- Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
- Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
- Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
- Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
- Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
- Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170 (2018).
