Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

העברה מאומצת של מקרופאגים מעוררי IL-33 למודלים של עכברים הנגרמים על ידי בלומיצין כדי לחקור את השפעתם על פיברוזיס ריאתי אידיופתי in vivo

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64742
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Basic Medicine, Wuxi School of Medicine, Jiangnan University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של מקרופאגים אינטרסטיציאליים ריאתיים (IMs) ואת העברתם המאומצת לאחר גירוי IL-33 של נאדיות הריאה במודל עכבר, אשר יכול להקל על מחקר in vivo של פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF).

Abstract

התגובה הדלקתית הנגרמת על ידי פגיעה ריאתית מוקדמת היא אחד הגורמים החשובים להתפתחות פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF), המלווה בהפעלת תאים דלקתיים כגון מקרופאגים ונויטרופילים, כמו גם שחרור של גורמים דלקתיים כולל TNF-α, IL-1β ו- IL-6. דלקת מוקדמת הנגרמת על ידי מקרופאגים אינטרסטיציאליים ריאתיים פעילים (IMs) בתגובה לגירוי IL-33 ידועה כממלאת תפקיד חיוני בתהליך הפתולוגי של IPF. פרוטוקול זה מתאר העברה מאומצת של IMs שעוררו IL-33 לריאות של עכברים כדי לחקור את התפתחות IPF. היא כוללת בידוד ותרבית של IMs ראשוניים מריאות עכבר מארח, ולאחר מכן העברה מאומצת של IMs מעוררים לתוך alveoli של עכברים מושתלי IPF המושרה על ידי בלומיצין (BLM) (אשר כבר רוקנו בעבר מקרופאגים alveolar על ידי טיפול עם ליפוזומים clodronate), ואת ההערכה הפתולוגית של עכברים אלה. התוצאות המייצגות מראות כי העברה מאומצת של מקרופאגים מעוררי IL-33 מחמירה פיברוזיס ריאתי בעכברים, דבר המצביע על כך שהקמת ניסוי העברת המקרופאגים המאמצת היא אמצעי טכני טוב לחקר פתולוגיה של IPF.

Introduction

פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF) היא מחלה דלקתית ריאתית מפושטת הנגרמת על ידי גורמים רבים1. במיקרו-סביבה הציטוקינים של התגובה החיסונית Th1 ו-Th2, מקרופאגים יכולים להיות מקוטבים למקרופאגים המופעלים באופן קלאסי (M1) ולמקרופאגים מופעלים לחלופין (M2). ליפופוליסכרידים (LPS) או הציטוקין IFN- γ גורמים למקרופאגים M1 לקטב ולייצר ציטוקינים מעודדי דלקת, כולל iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α ו-IL-12. לעומת זאת, ציטוקינים מסוג II IL-4 ו-IL-13 מניעים את הקיטוב של מקרופאגים M2, אשר יכולים לייצר גורמים שונים המעודדים גדילה של פיברובלסטים, כגון TGF-β ו-PDGF, המקדמים פיברוזיס ריאתי2. התהליך הפתולוגי של IPF מלווה בהפעלת מקרופאגים וחדירה. IPF מתווך תיקון פציעות, דלקת ופיברוזיס באמצעות שחרור ציטוקינים3. מכיוון שרק אפשרויות טיפוליות מוגבלות זמינות, חקירת המנגנונים הפתולוגיים המולקולריים של IPF היא בעלת משמעות רבה לפיתוח אסטרטגיות חדשות למניעה וטיפול ב- IPF. מחקרים קודמים של הקבוצה שלנו וחוקרים אחרים 4,5 אישרו את השחרור המוגבר של IL-33 בחולי IPF ובמודלים של עכברים עם IPF המושרה על ידי בלומיצין (BLM). IL-33 משתחרר על-ידי תאי אפיתל ואנדותל במהלך פיברוזיס ומעורב בהפעלת מקרופאגים, מה שגורם להתרבות חריגה של פיברובלסטים, הסננת לויקוציטים, ובסופו של דבר אובדן תפקוד ריאות5. הפרוטוקול הנוכחי מתאר העברה מאומצת של מקרופאגים אינטרסטיציאליים (IMs) מעוררי IL-33 לתוך הנאדיות כאמצעי לחקר התפתחות IPF במודלים של עכברים. כאן, IMs בודדו מרקמת הריאה של עכברים מארחים, גודלו בתרבית במבחנה, עוררו עם IL-33 במשך 24 שעות, ולאחר מכן הועברו באופן מאומץ לנאדיות של עכברים מושתלים על ידי הזרקת קנה הנשימה. האיסוף הישיר של מקרופאגים עכבריים מעוררים והעברתם המאומצת לנאדיות המקבל נמצא כמחמיר את מידת הפיברוזיס הריאתי ויכול להמחיש בצורה ברורה יותר את ההשפעה של גורמים מעוררים על פיברוזיס בהשוואה למחקרים קודמים6. הטכניקה המתוארת במאמר זה יכולה לאפשר לחוקרים לחקור את תפקודם של מקרופאגים המעוררים על ידי ציטוקינים פוטנציאליים בהתפתחות IPF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה הניסויית לרווחת בעלי חיים באוניברסיטת ג'יאנגנאן (JN No. 20211130m1720615[501]).

הערה: במחקר זה נעשה שימוש בסך הכל ב-10 עכברים זכרים מסוג C57BL/6 בגילאי 6-8 שבועות ובמשקל 20-25 גרם. שלוש קבוצות הניסוי במחקר כללו שלושה עכברים מושתלים כל אחד, ועכבר מארח אחד שימש לבידוד הודעות מיידיות.

1. דלדול מקרופאגים ריאתיים של עכברים

  1. הוציאו את בקבוקון הליפוזומים של קלודרונט (ראו טבלת חומרים) מהמקרר 30 דקות מראש, חממו אותו לטמפרטורת החדר והפכו אותו מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב אחיד.
    הערה: Clodronate liposomes לעטוף את מולקולות הידרופילי dichloromethylene bisphosphonate. כאשר ליפוזומים אלה נצרכים על ידי המקרופאגים, הקלודרונאט משתחרר בהדרגה על ידי פעולת הפוספטאז הליזוזום, והצטברותו גורמת כתוצאה מכך לאפופטוזיס של התא ולדלדול המקרופאגים7.
  2. מרדימים עכברים עם 3% איזופלורן. בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטת רגל אחת כדי לבדוק את ההכרה. יש למרוח משחה וטרינרית על שתי העיניים למניעת יובש בהרדמה.
  3. שאפו 60 μL של ליפוזומים קלודרונט באמצעות פיפטה עם קצה יניקה סטרילי. לתת את התרופה טיפה לתוך חלל האף של העכבר מורדם, כך שכאשר העכבר שואף, התרופה נשאפת לתוך קנה הנשימה. לאחר כל טיפה, ודא שהעכבר שואף את התרופה לחלוטין ונושם באופן שווה. מתן ליפוזומים המכילים PBS בלבד כבקרה8 (איור 2).
  4. הניחו את העכברים על טבלת טמפרטורה קבועה של 38 מעלות צלזיוס להתחממות מחדש כדי להאיץ את התאוששותם. עקוב אחר העכברים עד שהם מתעוררים. לאחר שהעכברים מתאוששים היטב ומשיגים שכיבה עצם החזה, העבירו אותם לכלוב.
  5. השתמש בעכברים עם מקרופאגים מכתשית מדולדלים יומיים לאחר הטיפול בליפוזומים קלודרונט כעכברים המקבלים לניסוי ההעברה.
    הערה: במחקר זה, הידלדלות המקרופאגים בנאדיות אושרה על-ידי בדיקת הביטוי של סמני מקרופאגים כפי שתואר קודם לכן 8,9 לאחר מתן ליפוזומים קלודרונאטים בשאיפה (ראו איור משלים 1).

2. בידוד ותרבות של הודעות מיידיות

  1. מרדימים את העכבר המארח בהזרקה תוך צפקית של קטמין (120 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (16 מ"ג/ק"ג). אשר את עומק ההרדמה באמצעות אובדן רפלקס צביטת הבוהן. יש למרוח משחה וטרינרית על שתי העיניים למניעת יובש בהרדמה. לאחר מכן, לחטא את העור של העכבר מורדם עם 75% אלכוהול ויוד. השתמש מספריים לחתוך דרך העור ולחשוף את רקמת הלב ריאה
  2. שאפו 10 מ"ל של 1x PBS במזרק עם מחט 20 G והכניסו את קצה המחט לאטריום הימני של העכבר (איור 3A). חותכים את הווריד הנבוב התחתון של העכבר עם מספריים כירורגיים, ולאחר מכן ידנית לחורר את העכבר עם PBS במהירות קבועה (10-20 מ"ל / דקה) עד שרקמת הריאה הופכת לבנה. מוציאים את רקמת הריאה ומעבירים אותה ל-PBS קר כקרח בצלחת תרבית (איור 3B).
  3. חותכים את רקמת הריאה לשברים של כ 2 מ"מ x 2 מ"מ x 2 מ"מ. לאחר מכן, הוסף 15 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל 1% collagenase A לרקמת הריאה כדי לבודד את המקרופאגים. יש לדגור ב-100 סל"ד למשך 30 דקות על שולחן ניעור בטמפרטורה של 37°C.
  4. שאפו את מתלה רקמת הריאה דרך מזרק 10 מ"ל לפחות פי 20 כדי שיהיה עדין ככל האפשר. סנן את המתלה דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר. צנטריפוגו את התסנין ב 400 x גרם במשך 10 דקות ולזרוק את supernatant.
  5. לפרוס את תאי הדם האדומים בגלולה על ידי הוספת 3 מ"ל של חיץ ליזיס RBC (ראה טבלת חומרים) על קרח במשך 2-3 דקות.
  6. לאחר צנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 5 דקות, להשעות מחדש את גלולת התא עם 10 מ"ל של DMEM (המכיל 100 U/mL פניצילין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין). לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
  7. זרעו את התאים לתוך 10 ס"מ צלחת תרבית תאים דבק ב 2 x 107 תאים / צלחת, ולדגור במשך 1 שעה ב 37 ° C ו 5% CO2. זה מאפשר IMs הריאה לדבוק צלחת5. לאחר שעה אחת, שאפו את התאים הסופרנאטנטיים והצפים, והוסיפו 10 מ"ל של מדיום תרבית שלם טרי (DMEM המכיל 10% FBS, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין). יש לדגור במשך יותר מ-8 שעות או למשך הלילה.
  8. קבע את טוהר ההודעות המיידיות המתקבלות באמצעות ציטומטריית זרימה עם צביעה עבור סמני F4/80 ו- CD11c, כפי שתואר קודם לכן5 (ראה איור משלים 1).

3. העברה מאמצת של IMs לתוך alveoli הריאה

  1. החלף את מדיום התרבית מהצלחת המכילה את IMs הריאתיים המבודדים (שלב 2.7) במדיום תרבית שלם המכיל 10 ng/mL IL-33 לגירוי IMs. יש לדגור במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. השתמש ב- PBS 1x במקום IL-33 כפקד.
  2. לנתק את IMs ריאתי על ידי טיפול בהם עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין במשך 5 דקות. לאחר מכן, להרוות את העיכול על ידי הוספת 3 מ"ל של תרבית טרייה מדיום מלא, ולקצור את המקרופאגים ריאתיים על ידי צנטריפוגה של תרחיף התא ב 150 x גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות. ספור את התאים באמצעות המוציטומטר, והשהה מחדש את התאים ב- PBS לריכוז סופי של 5 x 105 תאים / 50 μL.
  3. מרדימים את העכברים המקבלים עם גז איזופלורן 3%. המתן עד שהעכבר יאבד את הכרתו (כמו בשלב 1.2), ולאחר מכן תקן את הגפיים של העכבר המרדים על צלחת אנכית עם סרט רפואי. משוך בעדינות את לשון העכבר לצד אחד באמצעות צמר גפן.
  4. הפעל את מנורת האינטובציה והאיר אותה על גרונו של העכבר כך שניתן יהיה לראות את קנה הנשימה. בדוק כי קנה הנשימה קרוב לבסיס הלשון, הוושט קרוב לחלק האחורי של הצוואר, אך פתח הוושט אינו נראה במהלך הניתוח.
  5. השתמש במנורת האינטובציה (22 G) כדי לסייע באינטובציה של העכבר. יש להנחות את צינורית המחט לתוך קנה הנשימה בעזרת חוט מנחה (קוטר 0.4 מ"מ). הסר את חוט ההנחיה ודחוף את הצינורית לתוך קנה הנשימה של העכבר כדי להשלים את האינטובציה.
  6. לאחר הצינורית הוא ציין להיכנס קנה הנשימה, להזריק 50 μL של תרחיף התא (המכיל 5 x 105 IMs) לתוך העכבר המקבל דרך קנה הנשימה.
  7. הניחו את העכברים על משטח חימום קבוע בטמפרטורה של 38°C לחימום מחדש כדי לזרז את ההתאוששות. עקוב אחר העכברים עד שהם מתעוררים. לאחר שהם מתאוששים היטב ומשיגים שכיבה עצם החזה, מעבירים אותם לכלוב.
  8. לאחר 24 שעות, מתן בלומיצין (BLM) דרך קנה הנשימה (באמצעות ההליך בשלבים 3.3-3.5) במינון של 1.4 U/kg משקל גוף כדי לגרום IPF. לתת כמות שווה של מלוחים לקבוצת הביקורת.
  9. לאחר 21 יום, לקבוע את מידת החומרה של פיברוזיס ריאתי עבור קבוצות שונות של עכברים שהועברו באימוץ עם PBS או השעיית IM מגורה IL-33 על ידי הערכת ביטוי של סמנים עבור פיברוזיס ואת Ashcroft ציונים10.
    1. לחלץ את סך הרנ"א מרקמת הריאה באמצעות מגיב מיצוי RNA (ראה טבלת חומרים).
      הערה: ניתוח כמותי בוצע עם קורא microplate. אם יחס OD260/OD280 הוא 1.8-2.0, טוהר הרנ"א גבוה. כל הדגימות אוחסנו ב -80 מעלות צלזיוס.
    2. בצע PCR כמותי פלואורסצנטי כדי להעריך את הביטוי של אקטין שרירים α חלק (SMA) ופיברונקטין באמצעות פריימרים ספציפיים.
      הערה: הפריימרים ששימשו עבור α-SMA היו קדימה 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' והפוך 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3', והפריימרים ששימשו לפיברונקטין היו קדימה 5'-TCTGGGAAATGGAAGAGGGGAATGG-3' והפוך 5'-CACTGAAGCAGTTCCTCGGTTGT-3'.
  10. בצע אימונוהיסטוכימיה כמתואר להלן.
    1. מייבשים את הריאה השמאלית, מטמיעים אותה ופורסים אותה בעזרת פרוסת פרפין לעובי של 4 מיקרומטר.
    2. מניחים את חלקי הרקמה על שקופיות ואופים את המגלשות בתנור ב 65-70 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד 1 שעה. הורידו את המגלשות עם אחוז הולך ופוחת של אלכוהול (כלומר, 100%, 95%, 90%, 80% ו-70% אלכוהול) למשך 5 דקות.
    3. מכתימים את המגלשות בתמיסת צבע המטוקסילין (טהורה אנליטית) למשך 5 דקות. לאחר מכן, שטפו את המגלשות במי ברז. השרו את המגלשות ב-1% חומצה הידרוכלורית למשך 3 שניות, שטפו את הצבע הצף והשרו במים זורמים למשך 5 דקות. המקטעים יהפכו כחולים.
    4. לטבול בתמיסת eosin במשך 10 שניות עד 1 דקות (לקבוע את זמן הצביעה בהתאם לצבע), לשטוף עם מי ברז, ומניחים 70%, 80%, 95%, 100%, ו 100% אלכוהול, בהתאמה, במשך 5 דקות כל אחד. לאחר מכן הניחו את המגלשות בתמיסות קסילן I וקסילן II למשך 3 דקות. לאחר הייבוש, התבוננו וצלמו מתחת למיקרוסקופ האנכי עם סרט איטום דביק ניטרלי.
    5. בצע ניקוד Ashcroft על הסעיפים כדי לציין את חומרת פיברוזיס ריאתי10. לבצע ניתוח סטטיסטי של הנתונים באמצעות מבחן t של שני מדגמים בלתי תלויים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המשמש כאן מסוכם בתרשים הזרימה באיור 1. שאיפת ליפוזומים קלודרונט דרך האף (איור 2) שימשה לדלדול המקרופאגים הריאתיים של עכברי C57BL/6 בוגרים, וזה יצר מודל טוב של עכבר מושתל. בדיקות מיידיות ריאתיות בודדו מעכבר אחר (מארח) שלא טופל (איור 3A,B) וגודלו בתרבית חוץ גופית. המקרופאגים שבודדו עוררו באמצעות IL-33 במשך 24 שעות, ולאחר מכן הוחדרו תוך קנה הנשימה לעכברים המקבלים (איור 3C), עם מקרופאגים לא מגורים ששימשו כביקורת. לאחר 24 שעות, BLM ניתן לעכברים המקבלים כדי לגרום למודל פיברוזיס ריאתי. היקף הפיברוזיס הריאתי לאחר העברה מאומצת של IMs עם או בלי גירוי IL-33 הושווה 21 יום לאחר מתן BLM. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) של חלקי הרקמה הפתולוגית הראתה כי השינויים הפתולוגיים האופייניים לפיברוזיס נצפו לאחר מתן BLM: מבנה רקמת הריאה של העכברים נהרס, נצפתה הצטברות של פיברובלסטים, והנאדיות הרגילות נעלמו או ירדו. ההעברה המאומצת של מקרופאגים מעוררי IL-33 החמירה את מידת הרס רקמת הריאה והגדילה את צבירת הפיברובלסטים בעכברים שעוררו BLM (איור 4A). העלייה בציון אשקרופט המחישה עוד יותר את מידת הפיברוזיס הריאתי (איור 4B). התהליך הפתולוגי של פיברוזיס ריאתי קשור לצבירה מוגברת של myofibroblasts, המפרישים אקטין שרירים α חלק (α-SMA) ופיברונקטין (fibronectin). קביעת רמות הביטוי של הסמנים האלה הראתה שרמות ה-mRNA של α-SMA (איור 5B) ופיברונקטין (איור 5A) ברקמות הריאה של העכברים המקבלים שהכילו IMs מעוררי IL-33 שהועברו באימוץ וטופלו ב-BLM היו גבוהות עוד יותר בהשוואה לאלה של עכברי הבר שטופלו ב-BLM.

Figure 1
איור 1: תרשים סכמטי של הקמת ניסוי ההעברה המאמצת מקרופאגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דלדול המקרופאגים בעכברים המקבלים. הליפוזומים של הקלדרונט הוטלו לתוך חלל האף של העכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: בידוד והעברה מאמצת של מקרופאגים אינטרסטיציאליים . (A) הווריד הנבוב התחתון של העכבר המארח נחתך כדי להקל על הזלוף. (B) רקמת הריאה של העכבר המארח נחתכה לחתיכות קטנות. (C) המקרופאגים הבין-תאיים טוהרו ל-94% באמצעות ציטומטריית זרימה עם סמני F4/80 ו-CD11c. (D) IMs מעוררי IL-33 ניתנו לעכברים המקבלים דרך קנה הנשימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: השפעת ההעברה המאומצת של מקרופאגים מעוררי IL-33 בעכברים שעברו גירוי BLM. (A) צביעת H&E של חלקי רקמת ריאה מהעכברים המקבלים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) ציוני אשקרופט נקבעים מחלקי רקמת הריאה של העכברים המקבלים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 3). *p < 0.05, **p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: רמות ביטוי של גנים של סמן פיברוזיס ריאתי בעכברים מושתלים. (A) רמת mRNA של פיברונקטין (fibronectin). (B) רמת mRNA של α-SMA. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 3). *p < 0.05, **p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: דלדול המקרופאגים בנאדיות וטוהר ה-IMs. (A) דלדול המקרופאגים בנאדיות אושר על ידי בדיקת הביטוי של סמני F4/80 ו-CD11b. (B) טוהר ה-IMs שהתקבלו הוערך באמצעות ציטומטריית זרימה עם צביעה לסמני F4/80 ו-CD11c, וטוהר ה-IMs המבודדים נקבע כ-94.4% באמצעות ציטומטריית זרימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקר זה מספק שיטה יעילה לדלדול, בידוד, תרבית והעברת מקרופאגים, אשר יכולה לסייע בחקר המנגנונים של פיברוזיס ריאתי בעכברים. ישנן שיטות רבות לדלדול מקרופאגים בעכברים, כגון ניהול קנה הנשימה, הזרקת ורידים בזנב ושאיפת אף11. מחקר זה ייעל את שיטת שאיפת האף, שהיא פשוטה לתפעול ויכולה לרוקן ביעילות מקרופאגים ריאתיים 8,9. לאחר גירוי IL-33 של IMs בתרבית במשך 24 שעות, IMs הועברו באופן מאומץ לריאות של העכברים המקבלים באמצעות נתיב ניהול קנה נשימה לא פולשני, אשר גרם הכי פחות טראומה לעכברים. במהלך האינטובציה, נעשה שימוש במשך הרדמה של >20 דקות כדי להבטיח התקדמות חלקה של האינטובציה, מה ששיפר מאוד את שיעור ההישרדות של העכברים. ניהול קנה הנשימה הראשוני של השעיית IM של 50 μL דורש מיקרופיפטה כדי להבטיח את דיוק הממשל. לאחר ניהול קנה הנשימה, 500 μL של אוויר יש להוסיף מיד לתוך הריאות עם מזרק 1 מ"ל כדי להבטיח כי השעיית התא בקטטר יכול להיכנס לחלוטין לרקמת הריאה. למרות ששיטה זו מנקה את המקרופאגים הנאדיות, מקרופאגים מחלקים אחרים של העכבר עשויים גם לנדוד לנאדיות במהלך המחלה, ובכך לדלל את חלקם של התאים המועברים לנאדיות. לכן, ניסויים עם דרישות מחמירות עבור שיעור התאים המועברים צריכים להמשיך לחקור שיטות אחרות.

מקרופאגים ריאתיים ממלאים תפקיד חשוב בתפקוד ההגנתי של הריאות12,13. מתוכם, מקרופאגים בנאדיות מבטאים בעיקר את הסמנים F4/80 ו-CD11b, בעוד שמקרופאגים אינטרסטיציאליים מבטאים בעיקר F4/80 ו-CD11c12. IMs נבחרו להעברה מאומצת במחקר זה, מכיוון שהתהליך דרש 5 x 105 תאים, ו- IMs מהווים חלק גדול מהמקרופאגים הריאתיים, מה שמקל על השגתם. מספר רב של מחקרים הראו כי מקרופאגים מווסתים את התגובה הדלקתית על ידי שחרור גורמים דלקתיים וממלאים תפקיד חשוב בתהליך הפתולוגי של פיברוזיס ריאתי14. מחקרים הראו כי IL-33 מווסת TGF-β וציטוקינים אחרים כדי לווסת את תפקוד המקרופאגים, אשר מקדם פיברוזיס ריאתי המושרה על ידי BLM4. לכן, שינויים מושרים בתפקוד המקרופאגים ממלאים תפקיד חשוב בפתוגנזה של פיברוזיס ריאתי. מחקר זה מספק שיטה להעברה מאומצת של IMs שיכולה לסייע לחוקרים להמשיך לחקור את תפקידם של מקרופאגים במחלות ריאה כגון אסטמה ו- IPF. כיום אין תרופה טיפולית יעילה עבור IPF, אך מחקר זה מצביע על כך שהגורם IL-33 עשוי להיות רלוונטי למחקר וטיפול בפיברוזיס ריאתי אידיופתי, ובכך מספק כיוון לחקירה נוספת של מחקר תרופתי לפיברוזיס ריאתי. לדוגמה, נוגדן מנטרל נגד IL-33 יכול להיות מוכן כדי לבחון את השפעתו ואת היתכנותו כתרופה ניסיונית IPF, ובכך לספק כיוון חשוב לטיפול בפיברוזיס ריאתי אידיופתי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מכירים בנושא המיוחד של ניהול מעבדה באוניברסיטת ג'יאנגנאן: בניית ספריית פרוסה דיגיטלית המבוססת על דגימות פתולוגיות (JDSYS202223) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81800065).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 DMEM Life technologies Biotechnology,USA 1508012
Arterial indwelling needle B Braun Melsingen AG,Germany 21G15G8393
BD Accuri C6 Plus Becton Dickinson,USA
Bleomycin Biotang, USA Ab9465
Carbon dioxide incubator Thermo Forma, USA Thermo Forma370
CD11b R&D Systems,USA 1124F
CD11c R&D Systems,USA N418
Cell culture dish Thermo Forma, USA 174926
Clodronate liposomes  Clodronate liposomes,Netherlands CI-150-150
Collagenase A Sigma-Aldrich, USA 10103578001
F4/80 R&D Systems,USA 521204
Falcon Cell Strainer Becton,Dickinson and Company, USA 352340
Fetal bovine serum (FBS) Life technologies,USA 1047571
Hematoxylin Eosin  Nanjing Jiancheng Technology,China 06-570
LightCycler 480 PCR detection system Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33 Peprotech, USA 210-33
Nikon microscope Nikon Corporation, Japan 941185
Penicillin, streptomycin Life technologies,USA 877113
Phosphate buffer (PBS) Guangdong Huankai Microbial Technology ,China 1535882
RBC lysis buffer Beyotime Biotechnology Company,China C3702
RNA Isolater Vazyme company,China R401-01-AA Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine Shenzhen Rayward Life Technology ,China R500
Semi-automatic paraffin slicer Leica, Germany LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq Takara, Japan 410800
Trypsin 0.25% Life Technologies, USA 1627172

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
  2. Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
  3. Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897 (2021).
  4. Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
  5. Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
  6. Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
  7. Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
  8. He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846 (2017).
  9. Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
  10. Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
  11. Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
  12. Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
  13. Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
  14. Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170 (2018).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 195
העברה מאומצת של מקרופאגים מעוררי IL-33 למודלים של עכברים הנגרמים על ידי בלומיצין כדי לחקור את השפעתם על פיברוזיס ריאתי אידיופתי <em>in vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhai, X., Li, J., Nie, Y. Adoptive… More

Zhai, X., Li, J., Nie, Y. Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. J. Vis. Exp. (195), e64742, doi:10.3791/64742 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter