Summary
Detta protokoll beskriver isoleringen av pulmonella interstitiella makrofager (IM) och deras adoptiva överföring efter IL-33-stimulering av lungalveolerna i en musmodell, vilket kan underlätta in vivo-studien av idiopatisk lungfibros (IPF).
Abstract
Det inflammatoriska svaret som orsakas av tidig lungskada är en av de viktiga orsakerna till utvecklingen av idiopatisk lungfibros (IPF), som åtföljs av aktivering av inflammatoriska celler såsom makrofager och neutrofiler, liksom frisättning av inflammatoriska faktorer inklusive TNF-α, IL-1β och IL-6. Tidig inflammation orsakad av aktiverade pulmonella interstitiella makrofager (IM) som svar på IL-33-stimulering är känd för att spela en viktig roll i den patologiska processen för IPF. Detta protokoll beskriver adoptiv överföring av IM stimulerad av IL-33 till lungorna hos möss för att studera IPF-utveckling. Det innefattar isolering och odling av primära IM från värdmuslungor, följt av adoptiv överföring av stimulerade IM till alveolerna hos bleomycin (BLM)-inducerade IPF-mottagarmöss (som tidigare har utarmats av alveolära makrofager genom behandling med klodronatliposomer) och den patologiska utvärderingen av dessa möss. De representativa resultaten visar att adoptiv överföring av IL-33-stimulerade makrofager förvärrar lungfibros hos möss, vilket tyder på att etableringen av makrofagöverföringsexperimentet är ett bra tekniskt sätt att studera IPF-patologi.
Introduction
Idiopatisk lungfibros (IPF) är en diffus lunginflammatorisk sjukdom som orsakas av många faktorer1. I cytokinmikromiljön i Th1- och Th2-immunsvaret kan makrofager polariseras till klassiskt aktiverade makrofager (M1) och alternativt aktiverade makrofager (M2). Lipopolysackarider (LPS) eller cytokinet IFN-γ inducerar M1-makrofager att polarisera och producera proinflammatoriska cytokiner, inklusive iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α och IL-12. Däremot driver typ II-cytokinerna IL-4 och IL-13 polariseringen av M2-makrofager, som kan producera olika fibroblasttillväxtfrämjande faktorer, såsom TGF-β och PDGF, som främjar lungfibros2. Den patologiska processen med IPF åtföljs av makrofagaktivering och infiltration. IPF förmedlar skadereparation, inflammation och fibros genom frisättning av cytokiner3. Eftersom endast begränsade terapeutiska alternativ finns tillgängliga, har utforskandet av de molekylärpatologiska mekanismerna för IPF stor betydelse för att utveckla nya strategier för förebyggande och behandling av IPF. Tidigare studier av vår grupp och andra forskare 4,5 har bekräftat den ökade frisättningen av IL-33 hos IPF-patienter och i musmodeller med bleomycin (BLM)-inducerad IPF. IL-33 frigörs av epitel- och endotelcellerna under fibros och är involverad i makrofagaktivering, vilket resulterar i onormal spridning av fibroblaster, leukocytinfiltration och eventuell förlust av lungfunktion5. Det nuvarande protokollet beskriver adoptiv överföring av IL-33-stimulerade interstitiella makrofager (IM) till alveolerna som ett sätt att studera IPF-utveckling i musmodeller. Här isolerades IM från lungvävnaden hos värdmöss, odlades in vitro, stimulerades med IL-33 i 24 timmar och överfördes sedan adoptivt till alveolerna hos mottagarmöss genom trakealinjektion. Den direkta insamlingen av stimulerade musmakrofager och deras adoptiva överföring till mottagaralveolerna visade sig förvärra graden av lungfibros och kan tydligare illustrera påverkan av stimulerande faktorer på fibros jämfört med tidigare studier6. Tekniken som beskrivs i denna artikel kan göra det möjligt för forskare att utforska funktionen av makrofager stimulerade av potentiella cytokiner i utvecklingen av IPF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök utfördes i enlighet med Vägledning för vård och användning av försöksdjur. Alla djurförsök godkändes av den experimentella djurskyddsetiska kommittén vid Jiangnan University (JN nr 20211130m1720615 [501]).
Totalt användes 10 manliga C57BL/6-möss i åldern 6-8 veckor gamla och vägande 20-25 g i denna studie. De tre experimentella grupperna i studien inkluderade tre mottagarmöss vardera, och en värdmus användes för IM-isoleringen.
1. Utarmning av muslungmakrofager
- Ta ut injektionsflaskan med klodronatliposomer (se Materialförteckning) från kylskåpet 30 minuter i förväg, värm den till rumstemperatur och vänd den upp och ner flera gånger för att säkerställa jämn blandning.
OBS: Klodronatliposomer kapslar in de hydrofila diklormetylenbisfosfonatmolekylerna. När dessa liposomer konsumeras av makrofagerna frigörs klodronatet gradvis genom verkan av lysosomfosfatas, och dess ackumulering utlöser följaktligen cellapoptos och utarmning av makrofager7. - Bedövar möss med 3% isofluran. Kontrollera djupet av anestesi genom att klämma en fot för att kontrollera medvetandet. Applicera veterinärsalva på båda ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
- Aspirera 60 μL klodronatliposomer med en pipett med en steril sugspets. Administrera läkemedlet droppvis i näshålan hos den bedövade musen, så att när musen andas in, inhaleras läkemedlet i luftstrupen. Efter varje droppe, se till att musen inhalerar läkemedlet helt och andas jämnt. Administrera liposomer som innehåller enbart PBS som kontroll8 (figur 2).
- Placera mössen på ett 38 °C konstant temperaturbord för uppvärmning för att påskynda återhämtningen. Övervaka mössen tills de vaknar. När mössen har återhämtat sig väl och uppnått sternal liggande, överför dem till buret.
- Använd möss med utarmade alveolära makrofager 2 dagar efter behandlingen med klodronatliposomer som mottagarmöss för överföringsexperimentet.
OBS: I denna studie bekräftades utarmningen av alveolära makrofager genom att kontrollera uttrycket av makrofagmarkörer som beskrivits tidigare 8,9 efter administrering av klodronatliposomer genom inandning (se kompletterande figur 1).
2. IM:s isolering och kultur
- Bedöva värdmusen med en intraperitoneal injektion av ketamin (120 mg/kg) och xylazin (16 mg/kg). Bekräfta anestesidjupet via förlust av tåklämreflexen. Applicera veterinärsalva på båda ögonen för att förhindra torrhet under anestesi. Desinficera sedan huden på den bedövade musen med 75% alkohol och jod. Använd sax för att skära igenom huden och exponera hjärt-lungvävnaden
- Aspirera 10 ml 1x PBS i en spruta med en 20 G nål och för in nålspetsen i musens högra förmak (figur 3A). Klipp musens nedre vena cava med kirurgisk sax och perfusera sedan musen manuellt med PBS med konstant hastighet (10-20 ml / min) tills lungvävnaden blir vit. Punktmarkera lungvävnaden och överför den till iskall PBS i en odlingsskål (figur 3B).
- Skär lungvävnaden i fragment av ca 2 mm x 2 mm x 2 mm. Tillsätt sedan 15 ml Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) innehållande 1% kollagenas A till lungvävnaden för att isolera makrofagerna. Inkubera vid 100 rpm i 30 min på ett 37 °C skakbord.
- Aspirera lungvävnadssuspensionen genom en 10 ml spruta minst 20x för att göra den så fin som möjligt. Filtrera denna suspension genom en 40 μm cellsil. Centrifugera filtratet vid 400 x g i 10 minuter och kassera supernatanten.
- Lysera de röda blodkropparna i pelleten genom att tillsätta 3 ml RBC-lysbuffert (se materialtabell) på is i 2-3 minuter.
- Efter centrifugering vid 150 x g i 5 minuter, suspendera cellpelleten igen med 10 ml DMEM (innehållande 100 E/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin). Räkna cellerna med en hemocytometer.
- Ympa cellerna i 10 cm vidhäftande cellodlingsskålar vid 2 x 107 celler/skål och inkubera i 1 timme vid 37 °C och 5 %CO2. Detta gör att lungmeddelandena kan fästa vid skålen5. Efter 1 timme, aspirera supernatanten och flytande celler och tillsätt 10 ml färskt komplett odlingsmedium (DMEM innehållande 10% FBS, 100 U / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin). Inkubera i mer än 8 timmar eller över natten.
- Bestäm renheten hos de erhållna IM med hjälp av flödescytometri med färgning för F4/80- och CD11c-markörer, enligt beskrivningen tidigare5 (se kompletterande figur 1).
3. Adoptiv överföring av IM till lungalveolerna
- Ersätt odlingsmediet från plattan som innehåller de isolerade pulmonella IM-modulerna (steg 2.7) med ett komplett odlingsmedium som innehåller 10 ng/ml IL-33 för stimulering av IM. Inkubera i 24 timmar vid 37 °C och 5 %CO2. Använd 1x PBS istället för IL-33 som kontroll.
- Dissociera lung IM genom att behandla dem med 1 ml 0,25% trypsin i 5 min. Släck sedan matsmältningen genom att tillsätta 3 ml färskt odlingsmedium och skörda lungmakrofagerna genom att centrifugera cellsuspensionen vid 150 x g och 4 °C i 5 minuter. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och suspendera cellerna i PBS till en slutlig koncentration av 5 x 105 celler/50 μl.
- Bedöva mottagarmössen med 3% isoflurangas. Vänta tills musen blir medvetslös (som i steg 1.2) och fixera sedan lemmarna på den bedövade musen på en vertikal platta med medicinsk tejp. Dra försiktigt musens tunga åt sidan med en bomullspinne.
- Slå på intubationslampan och lysa den på musens hals så att luftstrupen kan ses. Kontrollera att luftstrupen ligger nära tungans botten, matstrupen ligger nära nacken, men matstrupen är inte synlig under operationen.
- Använd intubationslampan (22 G) för att intubera musen. För den kvarliggande nålkanylen in i luftstrupen med en styrtråd (0,4 mm diameter). Ta bort guidekabeln och tryck in kanylen i musluftstrupen för att slutföra intubationen.
- När kanylen har observerats komma in i luftstrupen, injicera 50 μL av cellsuspensionen (innehållande 5 x 105 IM) i mottagarmusen genom luftstrupen.
- Placera mössen på en 38 ° C konstant värmedyna för uppvärmning för att påskynda återhämtningen. Övervaka mössen tills de vaknar. När de har återhämtat sig väl och uppnått sternal liggande, överför dem till buret.
- Efter 24 timmar, administrera bleomycin (BLM) via luftstrupen (enligt proceduren i steg 3.3-3.5) i en dos på 1,4 E/kg kroppsvikt för att inducera IPF. Administrera en lika stor volym saltlösning till kontrollgruppen.
- Efter 21 dagar bestämmer du graden av svårighetsgrad av lungfibros för de olika grupperna av möss som adoptivt överfördes med PBS eller IL-33-stimulerad IM-suspension genom att utvärdera uttrycket av markörer för fibros och Ashcroft-poängen10.
- Extrahera det totala RNA från lungvävnaden med hjälp av ett RNA-extraktionsreagens (se materialtabell).
OBS: Kvantitativ analys utfördes med en mikroplattläsare. Om OD260 / OD280-förhållandet är 1,8-2,0 är RNA-renheten hög. Alla prover lagrades vid -80 ° C. - Utför fluorescens kvantitativ PCR för att utvärdera uttrycket av α-glatt muskelaktin (SMA) och fibronektin med hjälp av specifika primers.
OBS: De primrar som användes för α-SMA var framåt 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACCG-3' och omvänd 5'-CACCATCCAGAGTCCAGCAAT-3', och primrarna som användes för fibronektin var framåt 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' och omvänd 5'-CACTGAAGCAGGTTTTTCCTCGGTTGT-3'.
- Extrahera det totala RNA från lungvävnaden med hjälp av ett RNA-extraktionsreagens (se materialtabell).
- Utför immunhistokemi enligt beskrivningen nedan.
- Dehydrera den vänstra lungan, bädda in den och skiva den med en paraffinskivare till en tjocklek av 4 μm.
- Lägg vävnadssektionerna på objektglas och grädda glasen i en ugn vid 65-70 ° C i 30 min till 1 h. Avvaxa objektglasen med en minskande alkoholhalt (dvs. 100%, 95%, 90%, 80% och 70% alkohol) i 5 minuter.
- Färga objektglasen i hematoxylinfärglösning (analytiskt ren) i 5 min. Tvätta sedan bilderna med kranvatten. Blötlägg glasen i 1% saltsyraalkohol i 3 s, tvätta av den flytande färgen och blötlägg i rinnande vatten i 5 minuter. Sektionerna blir blå.
- Fördjupa i eosinlösning i 10 s till 1 min (bestäm färgningstiden enligt färgen), tvätta med kranvatten och placera i 70%, 80%, 95%, 100% respektive 100% alkohol i 5 minuter vardera. Lägg sedan glasen i xylen I- och xylen II-lösningar i 3 minuter. Efter torkning, observera och ta bilder under det vertikala mikroskopet med neutral självhäftande tätningsfilm.
- Utför Ashcroft-poäng på sektionerna för att indikera svårighetsgraden av lungfibros10. Utför statistisk analys av data med hjälp av ett t-test av två oberoende prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som används här sammanfattas i flödesschemat i figur 1. Inandning av klodronatliposomer genom näsan (figur 2) användes för att tömma lungmakrofagerna hos vuxna C57BL / 6-möss, och detta gav en bra mottagarmusmodell. Pulmonella IM isolerades från en annan obehandlad (värd) mus (figur 3A,B) och odlades in vitro. De isolerade makrofagerna stimulerades med IL-33 i 24 timmar och infördes sedan intratrakealt i mottagarmössen (figur 3C), med ostimulerade makrofager som kontroll. Efter 24 timmar administrerades BLM till mottagarmössen för att inducera en lungfibrosmodell. Omfattningen av lungfibros efter adoptiv överföring av IM med eller utan IL-33-stimulering jämfördes 21 dagar efter administrering av BLM. Hematoxylin och eosin (H&E) färgning av de patologiska vävnadssektionerna visade att de typiska patologiska förändringarna av fibros observerades efter BLM-administrering: mössens lungvävnadsstruktur förstördes, aggregeringen av fibroblaster observerades och de normala alveolerna försvann eller minskade. Den adoptiva överföringen av IL-33-stimulerade makrofager förvärrade graden av lungvävnadsförstörelse och ökad fibroblastaggregering hos de BLM-stimulerade mössen (figur 4A). Ökningen av Ashcroft-poängen illustrerade ytterligare graden av lungfibros (figur 4B). Den patologiska processen för lungfibros är associerad med den ökade aggregeringen av myofibroblaster, som utsöndrar α-glattmuskelaktin (α-SMA) och fibronektin. Bestämningen av expressionsnivåerna för dessa markörer visade att mRNA-nivåerna av α-SMA (figur 5B) och fibronektin (figur 5A) i lungvävnaderna hos mottagarmössen innehållande adoptivt överförda IL-33-stimulerade IM och behandlade med BLM ökade ytterligare jämfört med de hos BLM-behandlade vildtypmöss.
Figur 1: Schematiskt diagram över upprättandet av makrofagöverföringsexperimentet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Utarmning av makrofager hos mottagarmössen. Klodronatliposomerna släpptes in i näshålan hos mössen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Isolering och adoptiv överföring av interstitiella makrofager . (A) Värdmusens underlägsna vena cava klipptes för att underlätta perfusion. (B) Lungvävnaden från värdmusen skars i små bitar. (C) De interstitiella makrofagerna renades till 94% med hjälp av flödescytometri med F4/80- och CD11c-markörer. (D) IL-33-stimulerade IMs administrerades till mottagarmössen genom luftstrupen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Effekten av adoptiv överföring av IL-33-stimulerade makrofager i de BLM-stimulerade mössen. (A) H&E-färgning av lungvävnadssnitt från mottagarmössen. Skalstapel = 100 μm. (B) Ashcroft-poäng bestäms utifrån lungvävnadssektionerna hos mottagarmössen. Data visas som medelvärde ± SEM (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Uttrycksnivåer av markörgener för lungfibros hos mottagarmössen. (A) mRNA-nivån av fibronektin. (B) mRNA-nivån av α-SMA. Data visas som medelvärde ± SEM (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Utarmning av alveolära makrofager och renhet hos IM. (A) Uttömningen av alveolära makrofager bekräftades genom kontroll av uttrycket av F4/80- och CD11b-markörer. (B) Renheten hos de erhållna IM bedömdes med hjälp av flödescytometri med färgning för F4/80- och CD11c-markörer, och renheten hos de isolerade IM bestämdes till 94,4% med användning av flödescytometri. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie ger en effektiv metod för att tömma, isolera, odla och överföra makrofager, vilket kan hjälpa till att studera mekanismerna för lungfibros hos möss. Det finns många metoder för utarmning av musmakrofag, såsom trakealadministrering, svansveninjektion och nasal inandning11. Denna studie optimerade den nasala inhalationsmetoden, som är enkel att använda och effektivt kan tömma lungmakrofager 8,9. Efter IL-33-stimulering av IM i odling i 24 timmar överfördes IM adoptivt till lungorna hos mottagarmössen med hjälp av en icke-invasiv trakealadministreringsväg, vilket orsakade minst trauma för mössen. Under intubationen användes en anestesivaraktighet på >20 minuter för att säkerställa en smidig framfart av intubationen, vilket avsevärt förbättrade överlevnaden hos mössen. Den initiala trakealadministreringen av en 50 μL IM-suspension kräver en mikropipett för att säkerställa noggrannheten i administreringen. Efter trakealadministrering ska 500 μL luft omedelbart tillsättas i lungorna med en 1 ml spruta för att säkerställa att cellsuspensionen i katetern helt kan komma in i lungvävnaden. Även om denna metod rensar de alveolära makrofagerna, kan makrofager från andra delar av musen också migrera till alveolerna under sjukdomsförloppet, vilket spädar andelen celler som överförs till alveolerna. Därför behöver experiment med strikta krav på andelen celler som överförs ytterligare utforska andra metoder.
Lungmakrofager spelar en viktig roll i lungornas defensiva funktion12,13. Av dessa uttrycker alveolära makrofager huvudsakligen F4/80- och CD11b-markörerna, medan interstitiella makrofager huvudsakligen uttrycker F4/80 och CD11c12. IM valdes för adoptiv överföring i denna studie, eftersom processen krävde 5 x 105 celler, och IM utgör en stor del av lungmakrofagerna, vilket gör dem lättare att få. Ett stort antal studier har visat att makrofager reglerar det inflammatoriska svaret genom att frigöra inflammatoriska faktorer och spelar en viktig roll i den patologiska processen för lungfibros14. Studier har visat att IL-33 reglerar TGF-β och andra cytokiner för att reglera makrofagernas funktion, vilket främjar BLM-inducerad lungfibros4. Därför spelar inducerade förändringar i makrofagfunktionen en viktig roll i patogenesen av lungfibros. Denna studie ger en metod för adoptiv överföring av IM som kan hjälpa forskare att ytterligare utforska makrofagernas roll i lungsjukdomar som astma och IPF. Det finns för närvarande inget effektivt terapeutiskt läkemedel för IPF, men denna studie indikerar att faktorn IL-33 kan vara relevant för forskning och behandling av idiopatisk lungfibros och ger därmed en riktning för vidare utforskning av lungfibros läkemedelsforskning. Till exempel kan en neutraliserande antikropp mot IL-33 förberedas för att undersöka dess effekt och genomförbarhet som ett experimentellt IPF-läkemedel och därigenom ge en viktig riktning för behandling av idiopatisk lungfibros.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna erkänner det särskilda ämnet laboratoriehantering vid Jiangnan University: Construction of Digital Slice Library Based on Pathological Specimens (JDSYS202223) och National Natural Science Foundation of China (81800065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
References
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
- Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897 (2021).
- Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
- Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
- Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
- Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
- He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846 (2017).
- Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
- Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
- Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
- Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
- Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
- Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170 (2018).
