Summary
Bu protokol, pulmoner interstisyel makrofajların (IM) izolasyonunu ve bir fare modelinde akciğer alveollerinin IL-33 stimülasyonundan sonra evlat edinilen transferlerini tanımlar ve bu da idiyopatik pulmoner fibrozun (İPF) in vivo çalışmasını kolaylaştırabilir.
Abstract
Erken akciğer hasarının neden olduğu enflamatuar yanıt, makrofajlar ve nötrofiller gibi enflamatuar hücrelerin aktivasyonunun yanı sıra TNF-α, IL-1β ve IL-6 gibi enflamatuar faktörlerin salınımının eşlik ettiği idiyopatik pulmoner fibroz (İPF) gelişiminin önemli nedenlerinden biridir. IL-33 stimülasyonuna yanıt olarak aktive pulmoner interstisyel makrofajların (IM) neden olduğu erken inflamasyonun İPF'nin patolojik sürecinde hayati bir rol oynadığı bilinmektedir. Bu protokol, IL-33 tarafından uyarılan IM'lerin İPF gelişimini incelemek için farelerin akciğerlerine evlat edinilmesini açıklamaktadır. Birincil IM'lerin konakçı fare akciğerlerinden izolasyonunu ve kültürünü, ardından uyarılmış IM'lerin bleomisin (BLM) ile indüklenen IPF alıcı farelerin (daha önce klodronat lipozomlarla tedavi edilerek alveoler makrofajların tükenmiş olan) alveollerine evlat edinilmesini ve bu farelerin patolojik değerlendirmesini içerir. Temsili sonuçlar, IL-33 ile uyarılmış makrofajların evlat edinilerek transferinin farelerde pulmoner fibrozisi şiddetlendirdiğini ve makrofaj evlat edinme transfer deneyinin kurulmasının İPF patolojisini incelemek için iyi bir teknik araç olduğunu göstermektedir.
Introduction
İdiyopatik pulmoner fibrozis (İPF), birçok faktörün neden olduğu yaygın pulmoner inflamatuar bir hastalıktır1. Th1 ve Th2 immün yanıtının sitokin mikroortamında, makrofajlar klasik olarak aktive edilmiş makrofajlara (M1) ve alternatif olarak aktive edilmiş makrofajlara (M2) polarize edilebilir. Lipopolisakkaritler (LPS) veya sitokin IFN-γ, M1 makrofajlarını polarize etmeye ve iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α ve IL-12 dahil olmak üzere pro-inflamatuar sitokinler üretmeye indükler. Buna karşılık, tip II sitokinler IL-4 ve IL-13, pulmoner fibroz2'yi destekleyen TGF-β ve PDGF gibi farklı fibroblast büyümesini teşvik eden faktörler üretebilen M2 makrofajlarının polarizasyonunu yönlendirir. İPF'nin patolojik sürecine makrofaj aktivasyonu ve infiltrasyonu eşlik eder. İPF, sitokinlerin salınımı yoluyla yaralanma onarımı, inflamasyon ve fibrozise aracılık eder3. Sadece sınırlı tedavi seçenekleri mevcut olduğundan, İPF'nin moleküler patolojik mekanizmalarının araştırılması, İPF'nin önlenmesi ve tedavisi için yeni stratejilerin geliştirilmesinde büyük önem taşımaktadır. Grubumuz ve diğer araştırmacılar tarafından yapılan önceki çalışmalar 4,5, İPF hastalarında ve bleomisin (BLM) ile indüklenen İPF'li fare modellerinde IL-33'ün salınımının arttığını doğrulamıştır. IL-33, fibroz sırasında epitel ve endotel hücreleri tarafından salınır ve makrofaj aktivasyonunda rol oynar, bu da fibroblastların anormal proliferasyonu, lökosit infiltrasyonu ve nihayetinde akciğer fonksiyon kaybına neden olur5. Mevcut protokol, IL-33 ile uyarılmış interstisyel makrofajların (IM'ler) fare modellerinde İPF gelişimini incelemek için bir araç olarak alveollere evlat edinilmesini tanımlamaktadır. Burada, IM'ler konakçı farelerin akciğer dokusundan izole edildi, in vitro kültüre alındı, 24 saat boyunca IL-33 ile uyarıldı ve daha sonra trakeal enjeksiyon yoluyla alıcı farelerin alveollerine evlat edinildi. Uyarılmış fare makrofajlarının doğrudan toplanması ve alıcı alveollere evlat edinilerek aktarılmasının pulmoner fibrozis derecesini ağırlaştırdığı ve uyarıcı faktörlerin fibroz üzerindeki etkisini önceki çalışmalara kıyasla daha net bir şekilde gösterebildiği bulunmuştur6. Bu makalede açıklanan teknik, araştırmacıların İPF'nin gelişiminde potansiyel sitokinler tarafından uyarılan makrofajların işlevini keşfetmelerini sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvan deneyleri Jiangnan Üniversitesi Deneysel Hayvan Refahı Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (JN No. 20211130m1720615[501]).
NOT: Bu çalışmada 6-8 haftalık ve 20-25 g ağırlığında toplam 10 erkek C57BL/6 fare kullanılmıştır. Çalışmadaki üç deney grubu, her biri üç alıcı fareyi içeriyordu ve IM izolasyonu için bir konakçı fare kullanıldı.
1. Fare pulmoner makrofajlarının tükenmesi
- Klodronat lipozomların şişesini ( Malzeme Tablosuna bakınız) buzdolabından 30 dakika önceden çıkarın, oda sıcaklığına ısıtın ve düzgün bir karıştırma sağlamak için birkaç kez ters çevirin.
NOT: Klodronat lipozomlar hidrofilik diklorometilen bifosfonat moleküllerini kapsüller. Bu lipozomlar makrofajlar tarafından tüketildiğinde, klodronat lizozom fosfatazın etkisiyle yavaş yavaş salınır ve bunun sonucunda birikimi hücre apoptozunu ve makrofajların tükenmesini tetikler7. - Fareleri % 3 izofluran ile uyuşturun. Bilinci kontrol etmek için bir ayağınızı sıkıştırarak anestezinin derinliğini kontrol edin. Anestezi altında kuruluğu önlemek için her iki göze veteriner merhem uygulayın.
- Steril emme ucuna sahip bir pipet kullanarak 60 μL klodronatlı lipozomları aspire edin. İlacı, anestezi uygulanan farenin burun boşluğuna damla damla uygulayın, böylece fare nefes aldığında, ilaç trakeaya solunur. Her damladan sonra, farenin ilacı tamamen soluduğundan ve eşit şekilde nefes aldığından emin olun. PBS içeren lipozomları tek başına kontrol8 olarak uygulayın (Şekil 2).
- İyileşmelerini hızlandırmak için fareleri yeniden ısınmak üzere 38 ° C sabit sıcaklık tablosuna yerleştirin. Uyanana kadar fareleri izleyin. Fareler iyi iyileştikten ve sternal yatışmayı başardıktan sonra, onları kafese aktarın.
- Transfer deneyi için alıcı fareler olarak klodronat lipozomlarla tedaviden 2 gün sonra tükenmiş alveoler makrofajlı fareleri kullanın.
NOT: Bu çalışmada, alveoler makrofajların tükenmesi, klodronatlı lipozomların inhalasyon yoluyla uygulanmasınıtakiben daha önce tarif edildiği gibi makrofaj belirteçlerinin ekspresyonu kontrol edilerek doğrulanmıştır (bakınız Ek Şekil 1).
2. IM'lerin izolasyonu ve kültürü
- Konakçı fareyi intraperitoneal Ketamin (120 mg / kg) ve Xylazine (16 mg / kg) enjeksiyonu ile uyuşturun. Ayak parmağı sıkışma refleksinin kaybıyla anestezinin derinliğini onaylayın. Anestezi altında kuruluğu önlemek için her iki göze veteriner merhem uygulayın. Ardından, anestezi uygulanan farenin cildini% 75 alkol ve iyotla dezenfekte edin. Cildi kesmek ve kardiyopulmoner dokuyu açığa çıkarmak için makas kullanın
- 20 G iğne ile bir şırıngada 10 mL 1x PBS aspire edin ve iğnenin ucunu farenin sağ atriyumuna yerleştirin (Şekil 3A). Farenin inferior vena kavasını cerrahi makasla kesin ve ardından akciğer dokusu beyaza dönene kadar fareyi PBS ile sabit bir hızda (10-20 mL / dak) manuel olarak perfüze edin. Akciğer dokusunu eksize edin ve bir kültür kabında buz gibi soğuk PBS'ye aktarın (Şekil 3B).
- Akciğer dokusunu yaklaşık 2 mm x 2 mm x 2 mm parçalara ayırın. Daha sonra, makrofajları izole etmek için akciğer dokusuna% 1 kollajenaz A içeren 15 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) ekleyin. 100 rpm'de 37 °C sallama masasında 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Akciğer dokusu süspansiyonunu mümkün olduğunca ince hale getirmek için 10 mL'lik bir şırıngadan en az 20 kat aspire edin. Bu süspansiyonu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Filtreyi 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı atın.
- Peletteki kırmızı kan hücrelerini, 2-3 dakika boyunca buz üzerine 3 mL RBC lizis tamponu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek lize edin.
- 5 dakika boyunca 150 x g'de santrifüjlemeden sonra, hücre peletini 10 mL DMEM (100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin içerir) ile yeniden askıya alın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
- Hücreleri 2 x 10 7 hücre/tabakta 10 cmyapışkan hücre kültürü kaplarına tohumlayın ve 37 °C'de ve %5 CO2'de 1 saat inkübe edin. Bu, akciğer IM'lerinin çanak 5'e yapışmasınısağlar. 1 saat sonra, süpernatant ve yüzen hücreleri aspire edin ve 10 mL taze tam kültür ortamı ekleyin (% 10 FBS, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin içeren DMEM). 8 saatten fazla veya bir gecede inkübe edin.
- Daha önceaçıklandığı gibi F4/80 ve CD11c belirteçleri için boyama ile akış sitometrisi kullanarak elde edilen IM'lerin saflığını belirleyin (bkz. Ek Şekil 1).
3. IM'lerin akciğer alveollerine evlat edinilerek aktarılması
- İzole pulmoner IM'leri içeren plakadaki kültür ortamını (adım 2.7), IM'leri uyarmak için 10 ng / mL IL-33 içeren tam bir kültür ortamı ile değiştirin. 37 ° C'de 24 saat ve % 5 CO2'de inkübe edin. Kontrol olarak IL-33 yerine 1x PBS kullanın.
- Pulmoner IM'leri 5 dakika boyunca 1 mL% 0.25 tripsin ile tedavi ederek ayırın. Daha sonra, 3 mL taze kültür tam ortamı ekleyerek sindirimi söndürün ve hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 150 x g ve 4 ° C'de santrifüj ederek pulmoner makrofajları toplayın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve PBS'deki hücreleri 5 x 105 hücre / 50 μL'lik son bir konsantrasyona kadar yeniden askıya alın.
- Alıcı fareleri% 3 izofluran gazı ile uyuşturun. Farenin bilinçsiz hale gelmesini bekleyin (adım 1.2'de olduğu gibi) ve ardından anestezi uygulanan farenin uzuvlarını tıbbi bantla dikey bir plakaya sabitleyin. Pamuklu çubukla farenin dilini yavaşça bir tarafa doğru çekin.
- Entübasyon lambasını açın ve trakeanın görülebilmesi için farenin boğazına parlatın. Trakeanın dilin tabanına yakın olduğunu, yemek borusunun boynun arkasına yakın olduğunu, ancak yemek borusunun açılmasının operasyon sırasında görünmediğini kontrol edin.
- Fareyi entübe etmeye yardımcı olması için entübasyon lambasını (22 G) kullanın. Yerleşik iğne kanülünü trakeaya bir kılavuz tel (0,4 mm çapında) ile yönlendirin. Entübasyonu tamamlamak için kılavuz teli çıkarın ve kanülü fare trakeasına itin.
- Kanülün trakeaya girdiği gözlendikten sonra, trakea yoluyla alıcı fareye 50 μL hücre süspansiyonu (5 x 105 IM içeren) enjekte edin.
- İyileşmeyi hızlandırmak için fareleri yeniden ısınmak üzere 38 ° C sabit bir ısıtma yastığına yerleştirin. Uyanana kadar fareleri izleyin. İyileştikten ve sternal yatışmayı başardıktan sonra, onları kafese aktarın.
- 24 saat sonra, İPF'yi indüklemek için trakea yoluyla (3.3-3.5. adımlardaki prosedürü kullanarak) 1.4 U / kg vücut ağırlığı dozunda bleomisin (BLM) uygulayın. Kontrol grubuna eşit miktarda salin uygulayın.
- 21 gün sonra, fibroz için belirteçlerin ekspresyonunu ve Ashcroft skorları10'u değerlendirerek, PBS veya IL-33 ile uyarılmış IM süspansiyonu ile evlat edinilen farklı fare grupları için pulmoner fibrozun ciddiyet derecesini belirleyin.
- Bir RNA ekstraksiyon reaktifi kullanarak akciğer dokusundan toplam RNA'yı çıkarın (bakınız Malzeme Tablosu).
NOT: Kantitatif analiz mikroplaka okuyucu ile gerçekleştirilmiştir. OD260/OD280 oranı 1.8-2.0 ise RNA saflığı yüksektir. Tüm örnekler −80 ° C'de saklandı. - Spesifik primerler kullanarak α-düz kas aktini (SMA) ve fibronektinin ekspresyonunu değerlendirmek için floresan kantitatif PCR uygulayın.
NOT: α-SMA için kullanılan primerler ileri 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' ve ters 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3' idi ve fibronektin için kullanılan primerler ileri 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' ve ters 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3' idi.
- Bir RNA ekstraksiyon reaktifi kullanarak akciğer dokusundan toplam RNA'yı çıkarın (bakınız Malzeme Tablosu).
- İmmünohistokimyayı aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
- Sol akciğeri dehidrate edin, gömün ve bir parafin dilimleyici ile 4 μm kalınlığa kadar dilimleyin.
- Doku bölümlerini slaytların üzerine yerleştirin ve slaytları 65-70 ° C'de bir fırında 30 dakika ila 1 saat pişirin. Slaytları 5 dakika boyunca azalan alkol yüzdesiyle (yani% 100,% 95,% 90,% 80 ve% 70 alkol) balmumundan arındırın.
- Slaytları hematoksilin boya çözeltisinde (analitik olarak saf) 5 dakika boyunca lekeleyin. Ardından, slaytları musluk suyuyla yıkayın. Slaytları 3 sn boyunca% 1 hidroklorik asit alkolüne batırın, yüzen rengi yıkayın ve 5 dakika boyunca akan suya batırın. Bölümler maviye döner.
- Eosin çözeltisine 10 s ila 1 dakika daldırın (renge göre boyama süresini belirleyin), musluk suyuyla yıkayın ve her biri 5 dakika boyunca sırasıyla% 70,% 80,% 95,% 100 ve% 100 alkol koyun. Ardından, slaytları 3 dakika boyunca ksilen I ve ksilen II çözeltilerine yerleştirin. Kuruduktan sonra, nötr yapışkan sızdırmazlık filmi ile dikey mikroskop altında gözlemleyin ve fotoğraf çekin.
- Pulmoner fibrozis10'un şiddetini göstermek için kesitlerde Ashcroft skorlaması yapın. İki bağımsız numunenin t-testini kullanarak verilerin istatistiksel analizini yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada kullanılan protokol Şekil 1'deki akış şemasında özetlenmiştir. Klodronatlı lipozomların burun yoluyla solunması (Şekil 2), yetişkin C57BL / 6 farelerinin pulmoner makrofajlarını tüketmek için kullanıldı ve bu da iyi bir alıcı fare modeli üretti. Pulmoner IM'ler tedavi edilmemiş (konakçı) başka bir fareden izole edildi (Şekil 3A,B) ve in vitro olarak kültürlendi. İzole edilen makrofajlar 24 saat boyunca IL-33 ile uyarıldı ve daha sonra kontrol olarak uyarılmamış makrofajlar kullanılarak alıcı farelere intratrakeal olarak aşılandı (Şekil 3C). 24 saat sonra, pulmoner fibroz modelini indüklemek için alıcı farelere BLM uygulandı. IL-33 stimülasyonu olan veya olmayan IM'lerin evlat edinilmesinden sonra pulmoner fibrozisin kapsamı, BLM uygulamasından 21 gün sonra karşılaştırıldı. Patolojik doku kesitlerinin hematoksilin ve eozin (H &E) boyaması, BLM uygulamasından sonra fibrozun tipik patolojik değişikliklerinin gözlendiğini göstermiştir: farelerin akciğer dokusu yapısı tahrip olmuş, fibroblastların agregasyonu gözlenmiş ve normal alveoller kaybolmuş veya azalmıştır. IL-33 ile uyarılmış makrofajların evlat edinilen transferi, BLM ile uyarılmış farelerde akciğer dokusu yıkımının derecesini ve fibroblast agregasyonunu arttırdı (Şekil 4A). Ashcroft skorundaki artış, pulmoner fibrozis derecesini daha da göstermiştir (Şekil 4B). Pulmoner fibrozisin patolojik süreci, α-düz kas aktini (α-SMA) ve fibronektin salgılayan miyofibroblastların artan agregasyonu ile ilişkilidir. Bu belirteçlerin ekspresyon seviyelerinin belirlenmesi, evlat edinilerek aktarılan IL-33 ile uyarılmış IM'leri içeren ve BLM ile tedavi edilen alıcı farelerin akciğer dokularındaki α-SMA (Şekil 5B) ve fibronektin (Şekil 5A) mRNA seviyelerinin, BLM ile tedavi edilen vahşi tip farelere kıyasla daha da arttığını göstermiştir.
Şekil 1: Makrofaj evlat edinici transfer deneyinin kuruluşunun şematik diyagramı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Alıcı farelerde makrofajların tükenmesi. Klodronat lipozomlar farelerin burun boşluğuna bırakıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İnterstisyel makrofajların izolasyonu ve adoptif transferi . (A) Konakçı farenin inferior vena kavası perfüzyonu kolaylaştırmak için kesildi. (B) Konakçı farenin akciğer dokusu küçük parçalara ayrıldı. (C) İnterstisyel makrofajlar, F4/80 ve CD11c belirteçleri ile akış sitometrisi kullanılarak %94'e kadar saflaştırıldı. (D) IL-33 ile uyarılmış IM'ler, alıcı farelere trakea yoluyla uygulandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: BLM ile uyarılmış farelerde IL-33 ile uyarılmış makrofajların evlat edinilmesinin etkisi. (A) Alıcı farelerden akciğer dokusu kesitlerinin H&E boyaması. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Alıcı farelerin akciğer dokusu bölümlerinden belirlenen Ashcroft skorları. Veriler SEM ± ortalama olarak gösterilir (n=3). *p < 0,05, **p < 0,01. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Alıcı farelerde pulmoner fibroz belirteci genlerinin ekspresyon seviyeleri. (A) Fibronektinin mRNA seviyesi. (B) α-SMA'nın mRNA seviyesi. Veriler SEM ± ortalama olarak gösterilir (n=3). *p < 0,05, **p < 0,01. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Alveoler makrofajların tükenmesi ve IM'lerin saflığı. (A) Alveoler makrofajların tükenmesi, F4/80 ve CD11b belirteçlerinin ekspresyonu kontrol edilerek doğrulandı. (B) Elde edilen IM'lerin saflığı, F4/80 ve CD11c belirteçleri için boyama ile akış sitometrisi kullanılarak değerlendirildi ve izole IM'lerin saflığı, akış sitometrisi kullanılarak% 94.4 olarak belirlendi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, farelerde pulmoner fibroz mekanizmalarını incelemede yardımcı olabilecek makrofajları tüketmek, izole etmek, kültürlemek ve aktarmak için etkili bir yöntem sunmaktadır. Fare makrofaj tükenmesi için trakea uygulaması, kuyruk damarı enjeksiyonu ve burun inhalasyonu gibi birçok yöntem vardır11. Bu çalışma, kullanımı kolay olan ve pulmoner makrofajları etkili bir şekilde tüketebilen nazal inhalasyon yöntemini optimize etmiştir 8,9. IL-33'ün kültürdeki IM'lerin 24 saat boyunca uyarılmasından sonra, IM'ler, farelerde en az travmaya neden olan non-invaziv bir trakeal uygulama yolu kullanılarak alıcı farelerin akciğerlerine evlat edinilerek aktarıldı. Entübasyon sırasında, entübasyonun düzgün ilerlemesini sağlamak için >20 dakikalık bir anestezi süresi kullanıldı ve bu da farelerin hayatta kalma oranını büyük ölçüde artırdı. 50 μL IM süspansiyonunun ilk trakeal uygulaması, uygulamanın doğruluğunu sağlamak için bir mikropipet gerektirir. Trakea uygulamasından sonra, kateterdeki hücre süspansiyonunun akciğer dokusuna tamamen girebilmesini sağlamak için derhal 1 mL'lik bir şırınga ile akciğerlere 500 μL hava eklenmelidir. Bu yöntem alveoler makrofajları temizlemesine rağmen, farenin diğer kısımlarından gelen makrofajlar da hastalık boyunca alveollere göç edebilir, böylece alveollere aktarılan hücrelerin oranını seyreltebilir. Bu nedenle, transfer edilen hücrelerin oranı için katı gerekliliklere sahip deneylerin diğer yöntemleri daha fazla araştırması gerekir.
Pulmoner makrofajlar akciğerlerin defansif fonksiyonunda önemli rol oynar12,13. Bunlardan alveoler makrofajlar esas olarak F4/80 ve CD11b belirteçlerini eksprese ederken, interstisyel makrofajlar esas olarak F4/80 ve CD11c12'yi eksprese eder. Bu çalışmada evlat edinme transferi için IM'ler seçildi, çünkü süreç 5 x 105 hücre gerektiriyordu ve IM'ler pulmoner makrofajların önemli bir bölümünü oluşturuyor ve bu da onları elde etmeyi kolaylaştırıyor. Çok sayıda çalışma, makrofajların enflamatuar faktörleri serbest bırakarak inflamatuar yanıtı düzenlediğini ve pulmoner fibrozis14'ün patolojik sürecinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Çalışmalar, IL-33'ün BLM'ye bağlı pulmoner fibroz4'ü destekleyen makrofajların işlevini düzenlemek için TGF-β ve diğer sitokinleri düzenlediğini göstermiştir. Bu nedenle makrofaj fonksiyonlarında indüklenen değişiklikler pulmoner fibrozisin patogenezinde önemli rol oynamaktadır. Bu çalışma, araştırmacıların astım ve İPF gibi akciğer hastalıklarında makrofajların rolünü daha fazla keşfetmelerine yardımcı olabilecek IM'lerin evlat edinilmesi için bir yöntem sunmaktadır. Şu anda İPF için etkili bir terapötik ilaç yoktur, ancak bu çalışma IL-33 faktörünün idiyopatik pulmoner fibrozun araştırılması ve tedavisi ile ilgili olabileceğini ve bu nedenle pulmoner fibroz ilaç araştırmalarının daha fazla araştırılması için bir yön sağladığını göstermektedir. Örneğin, IL-33'e karşı nötralize edici bir antikor, deneysel bir İPF ilacı olarak etkisini ve fizibilitesini araştırmak için hazırlanabilir, böylece idiyopatik pulmoner fibrozun tedavisi için önemli bir yön sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların birbiriyle çelişen finansal çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Jiangnan Üniversitesi Laboratuvar Yönetimi Özel Konusunu kabul etmektedir: Patolojik Örneklere Dayalı Dijital Dilim Kütüphanesinin Yapımı (JDSYS202223) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81800065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
References
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
- Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897 (2021).
- Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
- Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
- Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
- Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
- He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846 (2017).
- Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
- Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
- Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
- Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
- Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
- Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170 (2018).
