Summary
该协议描述了肺间质巨噬细胞（IMs）的分离及其在小鼠模型中IL-33刺激肺泡后的过继转移，这可以促进特发性肺纤维化（IPF）的 体内 研究。
Abstract
早期肺损伤引起的炎症反应是特发性肺纤维化（IPF）发展的重要原因之一，其伴有巨噬细胞和中性粒细胞等炎症细胞的活化，以及包括TNF-α，IL-1β和IL-6在内的炎症因子的释放。已知由活化的肺间质巨噬细胞（IM）响应IL-33刺激引起的早期炎症在IPF的病理过程中起着至关重要的作用。该协议描述了由IL-33刺激的IM的过继转移到小鼠肺部以研究IPF发育。它涉及从宿主小鼠肺部分离和培养原代IM，然后将受刺激的IM过继转移到博来霉素（BLM）诱导的IPF受体小鼠的肺泡中（这些小鼠先前已通过氯膦酸盐脂质体处理耗尽了肺泡巨噬细胞），以及这些小鼠的病理评估。代表性结果表明，IL-33刺激巨噬细胞的过继转移加重了小鼠肺纤维化，表明巨噬细胞过继转移实验的建立是研究IPF病理学的良好技术手段。
Introduction
特发性肺纤维化（IPF）是一种由多种因素引起的弥漫性肺部炎症性疾病1。在Th1和Th2免疫反应的细胞因子微环境中，巨噬细胞可以极化为经典活化的巨噬细胞（M1）和替代活化的巨噬细胞（M2）。脂多糖（LPS）或细胞因子IFN-γ诱导M1巨噬细胞极化并产生促炎细胞因子，包括iNOS，IL-1，IL-6，TNF-α和IL-12。相比之下，II型细胞因子IL-4和IL-13驱动M2巨噬细胞的极化，M2巨噬细胞可以产生不同的成纤维细胞生长促进因子，如TGF-β和PDGF，促进肺纤维化2。IPF的病理过程伴随着巨噬细胞活化和浸润。IPF通过释放细胞因子介导损伤修复、炎症和纤维化3。由于治疗选择有限，探索IPF的分子病理机制对于制定IPF预防和治疗的新策略具有重要意义。我们小组和其他研究人员4，5 先前的研究已经证实IPF患者和博来霉素（BLM）诱导的IPF小鼠模型中IL-33的释放增加。IL-33在纤维化过程中由上皮和内皮细胞释放并参与巨噬细胞活化，导致成纤维细胞异常增殖，白细胞浸润，最终丧失肺功能5。目前的协议描述了IL-33刺激的间质巨噬细胞（IMs）向肺泡的过继转移，作为研究小鼠模型中IPF发育的一种手段。在这里，从宿主小鼠的肺组织中分离IMs， 体外培养，用IL-33刺激24小时，然后通过气管注射过继转移到受体小鼠的肺泡中。与以前的研究相比，直接收集受刺激的小鼠巨噬细胞并将其过继转移到受体肺泡中会加重肺纤维化的程度，并且可以更清楚地说明刺激因子对纤维化的影响6。本文中描述的技术可以使研究人员探索由潜在细胞因子刺激的巨噬细胞在IPF发展中的功能。
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Protocol
所有实验均按照《实验动物护理和使用指南》进行。所有动物实验均经江南大学实验动物福利伦理委员会批准（JN No. 20211130m1720615[501]）。
注意：本研究总共使用了10只年龄在6-8周大，体重20-25g的雄性C57BL / 6小鼠。研究中的三个实验组各包括三只受体小鼠，一只宿主小鼠用于IM分离。
1.小鼠肺巨噬细胞耗竭
- 提前30分钟从冰箱中取出氯膦酸脂质体小瓶（见 材料表），加热至室温，倒置数次，保证混合均匀。
注意：氯膦酸盐脂质体封装亲水性二氯亚甲基双膦酸盐分子。当这些脂质体被巨噬细胞消耗时，氯膦酸盐在溶酶体磷酸酶的作用下逐渐释放，其积累因此触发细胞凋亡和巨噬细胞的消耗7。 - 用3%异氟醚麻醉小鼠。通过捏一只脚检查意识来检查麻醉深度。在双眼上涂抹兽药膏，以防止麻醉下干燥。
- 使用带有无菌吸头的移液器吸出 60 μL 氯膦酸盐脂质体。将药物滴加到麻醉小鼠的鼻腔中，使得当小鼠吸入时，药物被吸入气管。每次滴后，确保小鼠完全吸入药物并均匀呼吸。单独施用含有PBS的脂质体作为对照8 （图2）。
- 将小鼠放在38°C恒温台上进行复温以加速其恢复。监视小鼠直到它们醒来。在小鼠恢复良好并达到胸骨卧位后，将它们转移到笼子中。
- 用氯膦酸盐脂质体处理2天后使用具有耗尽肺泡巨噬细胞的小鼠作为受体小鼠进行转移实验。
注意：在本研究中，通过吸入施用氯膦酸脂质体后检查巨噬细胞标志物的表达来确认肺泡巨噬细胞的消耗，如前所述8，9（见补充图1）。
2. IM的隔离和培养
- 用腹膜内注射氯胺酮（120mg / kg）和甲苯噻嗪（16mg / kg）麻醉宿主小鼠。通过失去脚趾夹反射来确认麻醉深度。在双眼上涂抹兽药膏，以防止麻醉下干燥。然后，用75%的酒精和碘对麻醉小鼠的皮肤进行消毒。用剪刀切开皮肤，露出心肺组织
- 用20G针头在注射器中吸出10mL的1x PBS，并将针尖插入小鼠的右心房（图3A）。用手术剪刀切割小鼠的下腔静脉，然后以恒定速度（10-20mL / min）手动用PBS灌注小鼠，直到肺组织变白。切除肺组织并将其转移到培养皿中的冰冷PBS中（图3B）。
- 将肺组织切成大约 2 毫米 x 2 毫米 x 2 毫米的碎片。然后，将 15 mL 含有 1% 胶原酶 A 的 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 添加到肺组织中以分离巨噬细胞。在37°C振荡台上以100rpm孵育30分钟。
- 通过 10 mL 注射器吸出肺组织悬浮液至少 20 倍，使其尽可能细。通过40μm细胞过滤器过滤该悬浮液。将滤液以400× g 离心10分钟，弃去上清液。
- 通过在冰上加入3mL红细胞裂解缓冲液（参见 材料表）2-3分钟来裂解沉淀中的红细胞。
- 以 150 x g 离心 5 分钟后，用 10 mL DMEM（含有 100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素）重悬细胞沉淀。使用血细胞计数器计数细胞。
- 将细胞接种到10cm贴壁细胞培养皿中，2 x 107 个细胞/培养皿，并在37°C和5%CO2下孵育1小时。这允许肺IM粘附在培养皿上5。1小时后，吸出上清液和浮动细胞，并加入10mL新鲜完全培养基（DMEM含有10%FBS，100U / mL青霉素和100μg/ mL链霉素）。孵育8小时以上或过夜。
- 如前所述 ，使用流式细胞术对F4 / 80和CD11c标记物进行染色，确定获得的IM的纯度（参见 补充图1）。
3. IM过继转移到肺泡
- 用含有 10 ng/mL IL-33 的完整培养基替换含有分离肺 IM（步骤 2.7）的培养基（步骤 2.7），以刺激 IM。在37°C和5%CO2下孵育24小时。使用 1x PBS 代替 IL-33 作为对照。
- 通过用 1 mL 的 0.25% 胰蛋白酶处理肺部 IM 5 分钟来解离肺部 IM。然后，通过加入3mL新鲜培养完全培养基来淬灭消化，并通过在150× g 和4°C下离心细胞悬液5分钟来收获肺巨噬细胞。使用血细胞计数器计数细胞，并将细胞重悬于PBS中至终浓度为5 x 105 个细胞/ 50μL。
- 用3%异氟醚气体麻醉受体小鼠。等待小鼠失去知觉（如步骤1.2所示），然后用医用胶带将麻醉小鼠的四肢固定在垂直板上。用棉签轻轻地将鼠标的舌头拉到一侧。
- 打开插管灯并将其照在小鼠的喉咙上，以便可以看到气管。检查气管是否靠近舌根，食道靠近颈部后部，但在手术过程中食道开口不可见。
- 使用插管灯（22 G）帮助插管小鼠。用导丝（直径0.4毫米）将留置针套管引导到气管中。取下导丝并将套管推入小鼠气管以完成插管。
- 观察到套管进入气管后，通过气管将 50 μL 细胞悬液（包含 5 x 105 IM）注入受体小鼠。
- 将小鼠放在38°C恒定加热垫上进行复温以加速恢复。监视小鼠直到它们醒来。在它们恢复良好并达到胸骨卧位后，将它们转移到笼子里。
- 24小时后，通过气管（使用步骤3.3-3.5中的程序） 以 1.4U / kg体重的剂量施用博来霉素（BLM）以诱导IPF。向对照组施用等体积的盐水。
- 21天后，通过评估纤维化标志物的表达和Ashcroft评分10，确定用PBS或IL-33刺激的IM悬浮液过继转移的不同组小鼠的肺纤维化的严重程度。
- 使用RNA提取试剂从肺组织中提取总RNA（参见 材料表）。
注意：使用酶标仪进行定量分析。如果OD260/OD280比率为1.8-2.0，则RNA纯度高。所有样品均储存在-80°C。 - 使用特异性引物进行荧光定量PCR以评估α平滑肌肌动蛋白（SMA）和纤连蛋白的表达。
注意：用于α-SMA的引物是正向5'-GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3'和反向5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3'，用于纤连蛋白的引物是正向5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3'和反向5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTT-3'。
- 使用RNA提取试剂从肺组织中提取总RNA（参见 材料表）。
- 如下所述进行免疫组化。
- 使左肺脱水，嵌入其中，然后用石蜡切片机将其切片至4μm的厚度。
- 将组织切片放在载玻片上，并在65-70°C的烤箱中烘烤载玻片30分钟至1小时。用降低酒精百分比（即100%，95%，90%，80%和70%酒精）对载玻片脱蜡5分钟。
- 将载玻片在苏木精染料溶液（分析纯）中染色5分钟。然后，用自来水清洗载玻片。将载玻片在1%盐酸醇中浸泡3秒，洗去浮色，在流水中浸泡5分钟。这些部分将变为蓝色。
- 浸入伊红溶液中10秒至1分钟（根据颜色确定染色时间），用自来水洗涤，分别放入70%，80%，95%，100%和100%酒精中，每次5分钟。然后将载玻片置于二甲苯I和二甲苯II溶液中3分钟。干燥后，用中性胶密封膜在垂直显微镜下观察并拍照。
- 对切片进行阿什克罗夫特评分，以指示肺纤维化的严重程度10.使用两个独立样本的 t 检验对数据进行统计分析。
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Representative Results
图 1 的流程 图总结了此处使用的协议。通过鼻子吸入氯膦酸盐脂质体（图2）用于消耗成年C57BL / 6小鼠的肺巨噬细胞，这产生了良好的受体小鼠模型。从另一只未经治疗的（宿主）小鼠中分离肺IM（图3A，B）并在 体外培养。 用IL-33刺激分离的巨噬细胞24小时，然后气管内滴注到受体小鼠中（图3C），使用未刺激的巨噬细胞作为对照。24小时后，向受体小鼠施用BLM以诱导肺纤维化模型。比较BLM给药后21天过继转移有或没有IL-33刺激的IM后的肺纤维化程度。病理组织切片的苏木精和伊红（H&E）染色显示，BLM给药后观察到纤维化的典型病理变化：小鼠肺组织结构被破坏，观察到成纤维细胞聚集，正常肺泡消失或减少。IL-33刺激的巨噬细胞的过继转移加剧了BLM刺激小鼠的肺组织破坏程度并增加了成纤维细胞聚集（图4A）。阿什克罗夫特评分的增加进一步说明了肺纤维化的程度（图4B）。肺纤维化的病理过程与肌成纤维细胞聚集增加有关，肌成纤维细胞分泌α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和纤连蛋白。这些标记物表达水平的测定表明，与BLM处理的野生型小鼠相比，含有过继转移IL-33刺激IM并用BLM处理的受体小鼠肺组织中α-SMA（图5B）和纤连蛋白（图5A）的mRNA水平进一步增加。
图1：建立巨噬细胞过继转移实验示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图2：受体小鼠巨噬细胞的耗竭。 将氯膦酸盐脂质体放入小鼠的鼻腔中。 请点击此处查看此图的大图。
图3：间质巨噬细胞的分离和过继转移 。 （A）切开宿主小鼠下腔静脉以利灌注。（B）将宿主小鼠的肺组织切成小块。（C）使用带有F4 / 80和CD11c标记物的流式细胞术将间质巨噬细胞纯化至94%。（D）通过气管向受体小鼠施用IL-33刺激的IM。 请点击此处查看此图的大图。
图4：IL-33刺激的巨噬细胞在BLM刺激的小鼠中过继转移的影响。 （A）受体小鼠肺组织切片的H&E染色。比例尺= 100μm。 （B）从受体小鼠的肺组织切片确定的阿什克罗夫特评分。数据显示为平均± SEM （n = 3）。*p < 0.05，**p < 0.01。请点击此处查看此图的大图。
图5：受体小鼠肺纤维化标志基因的表达水平。 （A）纤连蛋白的mRNA水平。（B）α-SMA的mRNA水平。数据显示为平均± SEM （n = 3）。*p < 0.05，**p < 0.01。请点击此处查看此图的大图。
补充图1：肺泡巨噬细胞的消耗和IM的纯度。 （A）通过检查F4 / 80和CD11b标志物的表达来确认肺泡巨噬细胞的耗竭。（B）使用流式细胞术评估获得的IM的纯度，并对F4 / 80和CD11c标记物进行染色，并使用流式细胞术确定分离的IM的纯度为94.4%。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
本研究为去除、分离、培养和转移巨噬细胞提供了一种有效的方法，有助于研究小鼠肺纤维化的机制。小鼠巨噬细胞耗竭的方法很多，如气管给药、尾静脉注射和鼻吸11。本研究优化了鼻吸法，操作简单，可有效耗竭肺巨噬细胞8，9。在IL-33刺激培养中的IMs24小时后，使用非侵入性气管给药途径将IM过继转移到受体小鼠的肺部，这对小鼠造成的创伤最小。插管时采用>20 min的麻醉时间，保证插管顺利进行，大大提高了小鼠的存活率。50 μL IM 悬浮液的初始气管给药需要微量移液器以确保给药的准确性。气管给药后，应立即用1mL注射器将500μL空气加入肺部，以确保导管中的细胞悬液可以完全进入肺组织。虽然这种方法清除了肺泡巨噬细胞，但来自小鼠其他部位的巨噬细胞也可能在疾病过程中迁移到肺泡，从而稀释转移到肺泡中的细胞比例。因此，对转移细胞比例有严格要求的实验需要进一步探索其他方法。
肺巨噬细胞在肺的防御功能中起重要作用12，13。其中，肺泡巨噬细胞主要表达F4/80和CD11b标志物，而间质巨噬细胞主要表达F4/80和CD11c12。本研究选择IM进行过继转移，因为该过程需要5 x 105 个细胞，并且IM构成肺巨噬细胞的主要部分，这使得它们更容易获得。大量研究表明，巨噬细胞通过释放炎症因子来调节炎症反应，在肺纤维化的病理过程中起重要作用14。研究表明，IL-33调节TGF-β等细胞因子调节巨噬细胞的功能，促进BLM诱导的肺纤维化4。因此，诱导的巨噬细胞功能变化在肺纤维化的发病机制中起重要作用。这项研究提供了一种IM过继转移的方法，可以帮助研究人员进一步探索巨噬细胞在哮喘和IPF等肺部疾病中的作用。目前尚无有效的IPF治疗药物，但研究表明因子IL-33可能与特发性肺纤维化的研究和治疗相关，为进一步探索肺纤维化药物研究提供了方向。例如，可以制备针对IL-33的中和抗体，探索其作为实验性IPF药物的效果和可行性，从而为特发性肺纤维化的治疗提供重要方向。
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Disclosures
作者没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者认可江南大学实验室管理专题：基于病理标本的数字切片库构建（JDSYS202223）和国家自然科学基金（81800065）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
References
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