IL-33刺激マクロファージのブレオマイシン誘導マウスモデルへの養子導入によるin vivo特発性肺線維症への影響の研究(英語)

Summary

このプロトコルは、肺間質マクロファージ(IM)の単離と、特発性肺線維症(IPF)の in vivo 研究を容易にすることができるマウスモデルにおける肺胞のIL-33刺激後のそれらの養子移植について説明しています。

Abstract

早期肺損傷による炎症反応は、特発性肺線維症(IPF)の発症の重要な原因の1つであり、マクロファージや好中球などの炎症細胞の活性化、およびTNF-α、IL-1β、およびIL-6などの炎症因子の放出を伴う。IL-33刺激に応答して活性化された肺間質マクロファージ(IM)によって引き起こされる初期の炎症は、IPFの病理学的過程において重要な役割を果たすことが知られている。このプロトコルは、IPFの発生を研究するために、IL-33によって刺激されたIMのマウスの肺への養子移入について説明しています。これには、宿主マウスの肺からの一次IMの単離と培養、続いてブレオマイシン(BLM)誘発IPFレシピエントマウス(クロドロネートリポソームによる処理によって以前に肺胞マクロファージが枯渇した)の肺胞への刺激IMの養子移入、およびそれらのマウスの病理学的評価が含まれます。代表的な結果は、IL-33刺激マクロファージの養子導入がマウスの肺線維症を悪化させることを示しており、マクロファージ養子導入実験の確立はIPF病理を研究するための優れた技術的手段であることを示唆しています。

Introduction

特発性肺線維症(IPF)は、多くの要因によって引き起こされるびまん性肺炎症性疾患です¹。Th1およびTh2免疫応答のサイトカイン微小環境では、マクロファージは古典的に活性化されたマクロファージ(M1)および代替的に活性化されたマクロファージ(M2)に分極され得る。リポ多糖(LPS)またはサイトカインIFN-γは、M1マクロファージを分極させ、iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α、およびIL-12を含む炎症誘発性サイトカインを産生するように誘導します。対照的に、II型サイトカインIL-4およびIL-13はM2マクロファージの分極を促進し、肺線維症を促進するTGF-βやPDGFなどのさまざまな線維芽細胞増殖促進因子を産生する可能性があります²。IPFの病理学的過程はマクロファージの活性化および浸潤を伴う。IPFは、サイトカインの放出を通じて損傷修復、炎症、および線維症を媒介します³。治療の選択肢は限られているため、IPFの分子病理学的メカニズムを探求することは、IPFの予防と治療のための新しい戦略を開発する上で大きな意味を持ちます。私たちのグループと他の研究者による以前の研究^4,5は、IPF患者およびブレオマイシン(BLM)誘発IPFのマウスモデルにおけるIL-33の放出の増加を確認しています。IL-33は、線維症の際に上皮細胞および内皮細胞から放出され、マクロファージの活性化に関与し、線維芽細胞の異常増殖、白血球浸潤、および最終的には肺機能の喪失をもたらします⁵。現在のプロトコルでは、マウスモデルでのIPF発生を研究する手段として、IL-33刺激間質マクロファージ(IM)の肺胞への養子移入について説明しています。ここでは、IMを宿主マウスの肺組織から単離し、in vitroで培養し、IL-33で24時間刺激した後、気管注射によってレシピエントマウスの肺胞に養子的に移植した。刺激されたマウスマクロファージの直接収集とレシピエント肺胞へのそれらの養子移動は、肺線維症の程度を悪化させることがわかり、以前の研究と比較して線維症に対する刺激因子の影響をより明確に説明することができます⁶。この論文に記載されている技術により、研究者はIPFの発生における潜在的なサイトカインによって刺激されるマクロファージの機能を探索することができます。

Protocol

全ての実験は実験動物の世話と使用のための手引きに従って行った。すべての動物実験は、江南大学の実験動物福祉倫理委員会によって承認されました(JN No. 20211¹³⁰m1720615[501])。

注:この研究では、合計10匹のオスのC57BL / 6マウスが6〜8週齢で体重20〜25 gを使用しました。研究の3つの実験グループには、それぞれ3匹のレシピエントマウスが含まれ、1匹の宿主マウスがIM分離に使用されました。

1. マウス肺マクロファージの枯渇

1. 30分前に冷蔵庫からクロドロネートリポソームのバイアル( 材料の表を参照)を取り出し、室温に温め、数回反転させて均一な混合を確保します。
   注:クロドロネートリポソームは、親水性ジクロロメチレンビスホスホネート分子をカプセル化します。これらのリポソームがマクロファージによって消費されると、クロドロネートはリソソームホスファターゼの作用によって徐々に放出され、その結果、その蓄積は細胞のアポトーシスとマクロファージの枯渇を引き起こします⁷。
2. マウスを3%イソフルランで麻酔する。片足をつまんで麻酔の深さを確認し、意識を確認します。麻酔下での乾燥を防ぐために、両目に獣医用軟膏を塗ります。
3. 60 μLのクロドロネートリポソームを、滅菌吸引チップを備えたピペットを使用して吸引します。麻酔をかけたマウスの鼻腔に薬物を滴下し、マウスが吸入すると薬物が気管に吸入されるようにする。各滴の後、マウスが薬を完全に吸い込み、均等に呼吸していることを確認してください。対照としてPBSのみを含むリポソームを投与^する 8(図2)。
4. マウスを38°Cの恒温テーブルに置いて再加温し、回復を早めます。マウスが目を覚ますまで監視します。マウスがよく回復し、胸骨横臥を達成したら、それらをケージに移します。
5. クロドロネートリポソームによる処理の2日後に肺胞マクロファージが枯渇したマウスを移植実験のレシピエントマウスとして使用した。
   注:本研究では、吸入によるクロドロネートリポソーム投与後の^マクロファージマーカーの発現を確認することにより、肺胞マクロファージの枯渇を確認しました^8,9(補足図1を参照)。

2. IMの分離と文化

1. ケタミン(120 mg / kg)とキシラジン(16 mg / kg)の腹腔内注射で宿主マウスを麻酔します。.足指のピンチ反射の喪失による麻酔の深さを確認します。麻酔下での乾燥を防ぐために、両目に獣医用軟膏を塗ります。その後、麻酔をかけたマウスの皮膚を75%アルコールとヨウ素で消毒します。はさみを使用して皮膚を切り裂き、心肺組織を露出させます
2. 20 Gの針を備えたシリンジに10 mLの1x PBSを吸引し、針の先端をマウスの右心房に挿入します(図3A)。マウスの下大静脈を外科用ハサミで切断し、肺組織が白くなるまで一定速度(10〜20 mL / min)でマウスにPBSを手動で灌流します。肺組織を切除し、培養皿内の氷冷PBSに移します(図3B)。
3. 肺組織を約2 mm x 2 mm x 2 mmの断片に切断します。次に、1%コラゲナーゼAを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)15 mLを肺組織に加え、マクロファージを単離します。37°Cの振とう台で100rpmで30分間インキュベートします。
4. 肺組織懸濁液を10 mLシリンジを通して少なくとも20倍吸引し、できるだけ細かくします。この懸濁液を40 μmの細胞ストレーナーでろ過します。ろ液を400 x g で10分間遠心分離し、上清を廃棄します。
5. 3 mLのRBC溶解バッファー( 材料表を参照)を氷上で2〜3分間添加して、ペレット内の赤血球を溶解します。
6. 150 x g で5分間遠心分離した後、細胞ペレットを10 mLのDMEM(100 U / mLペニシリンと100 μg / mLストレプトマイシンを含む)で再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
7. 細胞を10 cm接着細胞培養ディッシュに2 x 10⁷ 細胞/皿で播種し、37°Cおよび5%_CO2で1時間インキュベートします。これにより、肺IMが皿⁵に付着することができる。1時間後、上清と浮遊細胞を吸引し、10 mLの新鮮な完全培養培地(10%FBS、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを含むDMEM)を加えます。8時間以上または一晩インキュベートします。
8. 前述のように、F4/80およびCD11cマーカーの染色を伴うフローサイトメトリーを使用して、得られたIMの純度を測定します⁵ ( 補足図1を参照)。

3.肺胞へのIMの養子移入

1. 単離された肺IMを含むプレートの培養培地(ステップ2.7)を、IMを刺激するための10 ng/mL IL-33を含む完全培養培地と交換します。37°C、5%_CO2で24時間インキュベートします。コントロールとしてIL-33の代わりに1x PBSを使用してください。
2. 肺IMを1 mLの0.25%トリプシンで5分間処理することにより、肺IMを解離します。その後、3 mLの新鮮な培養完全培地を加えて消化を消光し、細胞懸濁液を150 x g および4°Cで5分間遠心分離して肺マクロファージを回収した。血球計算盤を使用して細胞をカウントし、PBS中の細胞を最終濃度5 x 10⁵ 細胞/50 μLまで再懸濁します。
3. レシピエントマウスを3%イソフルランガスで麻酔する。マウスが意識を失うのを待ってから(手順1.2のように)、麻酔をかけたマウスの手足を医療用テープで垂直プレートに固定します。綿棒を使用してマウスの舌をゆっくりと片側に引っ張ります。
4. 挿管ランプをオンにして、気管が見えるようにマウスの喉に当てます。気管が舌の付け根に近く、食道が首の後ろ近くにあることを確認しますが、手術中に食道の開口部は見えません。
5. 挿管ランプ(22 G)を使用して、マウスの挿管を支援します。留置針カニューレをガイドワイヤー(直径0.4mm)で気管に導きます。ガイドワイヤーを取り外し、カニューレをマウス気管に押し込んで挿管を完了します。
6. カニューレが気管に入るのが観察された後、50 μLの細胞懸濁液(5 x 10⁵ IMを含む)を気管を通してレシピエントマウスに注入します。
7. 回復を早めるために、マウスを38°Cの一定の加温パッドに置き、再加温します。マウスが目を覚ますまで監視します。彼らがよく回復して胸骨横臥を達成したら、それらをケージに移します。
8. 24時間後、気管 を介して ブレオマイシン(BLM)を(ステップ3.3〜3.5の手順を使用して)1.4 U / kg体重の用量で投与し、IPFを誘発します。等量の生理食塩水を対照群に投与する。
9. 21日後、線維症のマーカーの発現を評価することによって、PBSまたはIL-33刺激IM懸濁液を養子に移したマウスの異なる群の肺線維症の重症度を決定し、アシュクロフトスコア¹⁰。
   1. RNA抽出試薬を使用して肺組織から全RNAを抽出します( 材料の表を参照)。
      注:定量分析はマイクロプレートリーダーで行った。OD260 / OD280比が1.8〜2.0の場合、RNA純度は高くなります。全ての試料を−80°Cで保存した。
   2. 蛍光定量PCRを行い、特異的プライマーを用いてα平滑筋アクチン(SMA)およびフィブロネクチンの発現を評価した。
      注:α-SMAに用いたプライマーは順方向5'-GACGCTGAAGTATCCGATAGAACG-3'と逆5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCAAT-3'であり、フィブロネクチンに用いたプライマーは順方向5'-TCTGGGAAATGGAAAGGGGAATGG-3'と逆5'-CACTGAAGCAAGGTTTCCTCGGTTGT-3'であった。
10. 下記のように免疫組織化学を行う。
    1. 左肺を脱水し、埋め込み、パラフィンスライサーで4μmの厚さにスライスします。
    2. 組織切片をスライドの上に置き、スライドを65〜70°Cのオーブンで30分から1時間焼きます。アルコールの割合が減少しているスライド(つまり、100%、95%、90%、80%、および70%アルコール)で5分間脱ろうします。
    3. スライドをヘマトキシリン色素溶液(分析的に純粋)で5分間染色します。次に、スライドを水道水で洗います。スライドを1%塩酸アルコールに3秒間浸し、浮き色を洗い流し、流水に5分間浸します。セクションが青色に変わります。
    4. エオジン溶液に10秒から1分間浸漬し(色によって染色時間を決め)、水道水で洗い、アルコール70%、80%、95%、100%、100%アルコールにそれぞれ5分間入れます。次に、スライドをキシレンI溶液とキシレンII溶液に3分間入れます。乾燥後、中性接着剤シールフィルムを用いて垂直顕微鏡下で観察し、写真を撮影する。
    5. 肺線維症の重症度を示すために、セクションでアシュクロフトスコアリングを実行します¹⁰。2つの独立したサンプルのt検定を使用してデータの統計分析を実行します。

Representative Results

ここで使用するプロトコルは、 図 1 のフローチャートにまとめられています。鼻からのクロドロネートリポソームの吸入(図2)は、成体C57BL/6マウスの肺マクロファージを枯渇させるために使用され、これは良好なレシピエントマウスモデルを作成しました。肺IMを別の未処理(宿主)マウスから単離し(図3A、B)、 インビトロで 培養した。単離したマクロファージをIL-33で24時間刺激した後、レシピエントマウスに気管内注入し(図3C)、刺激されていないマクロファージを対照として用いました。24時間後、BLMをレシピエントマウスに投与し、肺線維症モデルを誘導した。IL-33刺激の有無にかかわらずIMの養子移入後の肺線維症の程度をBLM投与の21日後に比較した。病理組織切片のヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色は、BLM投与後に線維症の典型的な病理学的変化が観察されることを示した:マウスの肺組織構造が破壊され、線維芽細胞の凝集が観察され、正常な肺胞が消失または減少した。IL-33刺激マクロファージの養子導入は、BLM刺激マウスにおける肺組織破壊の程度を悪化させ、線維芽細胞凝集を増加させた(図4A)。アシュクロフトスコアの増加は、肺線維症の程度をさらに示した(図4B)。肺線維症の病理学的過程は、α平滑筋アクチン(α-SMA)およびフィブロネクチンを分泌する筋線維芽細胞の凝集の増加と関連している。これらのマーカーの発現レベルの決定は、養子移入されたIL-33刺激IMを含み、BLMで処理されたレシピエントマウスの肺組織におけるα-SMA(図5B)およびフィブロネクチン(図5A)のmRNAレベルが、BLM処理された野生型マウスのmRNAレベルと比較してさらに増加したことを示しました。

図1:マクロファージ養子導入実験の確立の模式図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:レシピエントマウスにおけるマクロファージの枯渇。 クロドロネートリポソームをマウスの鼻腔内に滴下した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:間質性マクロファージの単離と養子移入 。 (A)宿主マウスの下大静脈を灌流を容易にするために切断した。(B)宿主マウスの肺組織を小片に切断した。(C)間質マクロファージを、F4/80およびCD11cマーカーを用いたフローサイトメトリーを用いて94%まで精製した。(d)IL-33刺激IMsを気管を通してレシピエントマウスに投与した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:BLM刺激マウスにおけるIL-33刺激マクロファージの養子導入の効果。 (A)レシピエントマウスの肺組織切片のH&E染色。スケールバー=100μm。 (B)レシピエントマウスの肺組織切片から決定したアシュクロフトスコア。データはSEM±平均値として示される(n=3)。*p < 0.05, **p < 0.01.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:レシピエントマウスにおける肺線維症マーカー遺伝子の発現レベル。 (a)フィブロネクチンのmRNAレベル。(B)α-SMAのmRNAレベル。データはSEM±平均値として示される(n=3)。*p < 0.05, **p < 0.01.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:肺胞マクロファージの枯渇とIMの純度。 (A)F4/80マーカーとCD11bマーカーの発現を確認することで肺胞マクロファージの枯渇を確認した。(B)得られたIMの純度をF4/80およびCD11cマーカーの染色を伴うフローサイトメトリーを用いて評価し、単離されたIMの純度はフローサイトメトリーを用いて94.4%と決定した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

この研究は、マクロファージを枯渇、分離、培養、および移植するための効果的な方法を提供し、マウスの肺線維症のメカニズムの研究に役立ちます。マウスマクロファージの枯渇には、気管投与、尾静脈注射、鼻吸入など、多くの方法があります¹¹。この研究は、操作が簡単で肺マクロファージを効果的に枯渇させることができる鼻吸入法を最適化しました^8,9。培養中のIMのIL-33刺激を24時間後、IMは非侵襲的気管投与経路を使用してレシピエントマウスの肺に養子的に移植され、マウスへの外傷が最も少なかった。挿管中は、挿管の円滑な進行を確実にするために>20分の麻酔時間を採用し、マウスの生存率を大幅に向上させました。50 μL IM懸濁液の最初の気管投与には、投与の精度を確保するためにマイクロピペットが必要です。気管投与後、カテーテル内の細胞懸濁液が肺組織に完全に入ることができるように、1mLシリンジで500μLの空気を直ちに肺に加える必要があります。この方法は肺胞マクロファージを除去しますが、マウスの他の部分からのマクロファージも病気の経過中に肺胞に移動する可能性があり、したがって肺胞に移された細胞の割合を希釈します。したがって、移植された細胞の割合について厳密な要件を持つ実験では、他の方法をさらに探求する必要があります。

肺マクロファージは、肺の防御機能において重要な役割を果たす^12,13。このうち、肺胞マクロファージは主にF4/80およびCD11bマーカーを発現し、間質マクロファージは主にF4/80および^CD11c12を発現する。このプロセスには5 x 10⁵細胞が必要であり、IMは肺マクロファージの大部分を構成しているため、IMは入手が容易であるため、この研究では養子縁組移植にIMが選択されました。多くの研究は、マクロファージが炎症因子を放出することによって炎症反応を調節し、肺線維症の病理学的過程において重要な役割を果たすことを示している¹⁴。研究によると、IL-33はTGF-βやその他のサイトカインを調節してマクロファージの機能を調節し、BLM誘発性肺線維症を促進します⁴。したがって、マクロファージ機能の誘導された変化は、肺線維症の病因において重要な役割を果たす。この研究は、研究者が喘息やIPFなどの肺疾患におけるマクロファージの役割をさらに調査するのに役立つIMの養子移入の方法を提供します。現在、IPFの有効な治療薬はありませんが、この研究は、因子IL-33が特発性肺線維症の研究と治療に関連している可能性があることを示しており、したがって、肺線維症の薬物研究のさらなる探求の方向性を提供します。例えば、IL-33に対する中和抗体を調製して、実験的なIPF薬としての効果と実現可能性を探ることができ、それによって特発性肺線維症の治療に重要な方向性を提供します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life technologies Biotechnology,USA	1508012
Arterial indwelling needle	B Braun Melsingen AG,Germany	21G15G8393
BD Accuri C6 Plus	Becton Dickinson,USA
Bleomycin	Biotang, USA	Ab9465
Carbon dioxide incubator	Thermo Forma, USA	Thermo Forma370
CD11b	R&D Systems,USA	1124F
CD11c	R&D Systems,USA	N418
Cell culture dish	Thermo Forma, USA	174926
Clodronate liposomes	Clodronate liposomes,Netherlands	CI-150-150
Collagenase A	Sigma-Aldrich, USA	10103578001
F4/80	R&D Systems,USA	521204
Falcon Cell Strainer	Becton,Dickinson and Company, USA	352340
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies,USA	1047571
Hematoxylin Eosin	Nanjing Jiancheng Technology,China	06-570
LightCycler 480 PCR detection system	Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33	Peprotech, USA	210-33
Nikon microscope	Nikon Corporation, Japan	941185
Penicillin, streptomycin	Life technologies,USA	877113
Phosphate buffer (PBS)	Guangdong Huankai Microbial Technology ,China	1535882
RBC lysis buffer	Beyotime Biotechnology Company,China	C3702
RNA Isolater	Vazyme company,China	R401-01-AA	Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine	Shenzhen Rayward Life Technology ,China	R500
Semi-automatic paraffin slicer	Leica, Germany	LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq	Takara, Japan	410800
Trypsin 0.25%	Life Technologies, USA	1627172