Summary
Denne undersøgelse viser en meget reproducerbar dyremodel for akut regional myokardieiskæmi og reperfusionsskade hos kaniner ved hjælp af en venstre mini-thoracotomi til overlevelsestilfælde eller en midterlinjesternotomi til ikke-overlevelsestilfælde.
Abstract
Protokollen her giver en enkel, meget replikerbar metode til at inducere in situ akut regional myokardieiskæmi hos kaninen til ikke-overlevelses- og overlevelseseksperimenter. New Zealand White voksen kanin er bedøvet med atropin, acepromazin, butorphanol og isofluran. Dyret intuberes og anbringes på mekanisk ventilation. Et intravenøst kateter indsættes i den marginale ørevene til infusion af medicin. Dyret er præmedicineret med heparin, lidokain og lakteret Ringers opløsning. En carotis cut-down udføres for at opnå arteriel linjeadgang til blodtryksovervågning. Udvalgte fysiologiske og mekaniske parametre overvåges og registreres ved kontinuerlig realtidsanalyse.
Med dyret bedøvet og fuldt bedøvet udføres enten et fjerde interkostalt rum lille venstre thoracotomi (overlevelse) eller midterlinie sternotomi (ikke-overlevelse). Perikardiet åbnes, og den venstre forreste nedadgående (LAD) arterie er placeret.
En polypropylensutur føres rundt om den anden eller tredje diagonale gren af LAD-arterien, og polypropylenfilamentet trækkes gennem et lille vinylrør, der danner en snare. Dyret udsættes for 30 minutters regional iskæmi, opnået ved at lukke LAD ved at stramme snaren. Myokardieiskæmi bekræftes visuelt af epikardiets regionale cyanose. Efter regional iskæmi løsnes ligaturen, og hjertet får lov til at perfusere igen.
For både overlevelses- og ikke-overlevelsesforsøg kan myokardiefunktionen vurderes via en ekkokardiografi (ECHO) måling af den fraktionelle forkortelse. For ikke-overlevelsesundersøgelser kan data fra sonomikrometri indsamlet ved hjælp af tre digitale piezoelektriske ultralydssonder implanteret i det iskæmiske område og venstre ventrikel udviklet tryk (LVDP) ved hjælp af et apikalt indsat venstre ventrikel (LV) kateter kontinuerligt erhverves til evaluering af henholdsvis den regionale og globale myokardiefunktion.
Til overlevelsesundersøgelser lukkes snittet, en thoracentese med venstre nål udføres til pleural luftevakuering, og postoperativ smertekontrol opnås.
Introduction
Hjerte-kar-sygdomme er den største dødsårsag i verden og bidrager til over 18 millioner dødsfald hvert år 1,2,3. Akut myokardieinfarkt (MI) er en almindelig medicinsk nødsituation, der udvikler sig, når en blodprop eller et stykke atheromatøs plak blokerer blodgennemstrømningen i en koronararterie. Dette forårsager regional myokardieiskæmi i det område, som arterien perfuserer.
Denne undersøgelse beskriver en protokol, der anvender en enkel og pålidelig metode til at skabe in situ akut regional myokardieiskæmi i en kaninmodel til ikke-overlevelses- og overlevelsesforsøg. Det oprindelige mål med denne metode var at evaluere virkningerne af mitokondrietransplantation på modulerende myokardienekrose og øge den post-iskæmiske hjertefunktion efter en iskæmisk begivenhed. Tidligere forskning har vist forekomsten af mitokondrieændringer og et hurtigt fald i fosfatniveauer med høj energi efter iskæmi og en reduktion i iltforsyningen, hvilket resulterer i et drastisk fald i hjerteenergilagrene4. Forskere har forsøgt at forbedre post-iskæmisk funktion og mindske myokardievævsnekrose ved hjælp af farmakologiske indgreb og / eller procedureteknikker, men disse teknikker giver begrænset kardiobeskyttelse og har minimal indvirkning på mitokondrieskader og dysfunktion 5,6,7. Vores team og andre har tidligere vist, at mitokondrieskader primært opstår under iskæmi, og at kontraktil genopretning kan forbedres, og myokardieinfarktstørrelsen faldt med bevarelsen af mitokondriel åndedrætsfunktion under reperfusion 8,9,10. Således antog vi, at mitokondrietransplantation fra væv, der ikke er påvirket af iskæmi til området med iskæmi før reperfusion, ville give en alternativ tilgang til at reducere myokardienekrose og forbedre myokardiefunktionen. Heri beskriver vi protokollen, der bruges til at teste denne teori og de repræsentative resultater opnået fra vores indledende undersøgelsesanalyse.
Desuden har flere forskere fokuseret på andre emner, der er integreret i at definere virkningen af myokardieiskæmi-reperfusionsskade og etablere passende terapeutiske interventioner. Et sådant forskningsområde er prækonditionering. Myokardial iskæmisk prækonditionering er en kardiobeskyttende mekanisme aktiveret af kort iskæmisk stress, der resulterer i en reduktion i hastigheden af hjertecellenekrose under efterfølgende episoder af langvarig iskæmi. Disse mekanismer kan aktiveres ved enten hypoxi eller koronar okklusion. Mandel et al. demonstrerede, at hypoxisk-hyperoxisk prækonditionering hjalp med at opretholde balancen mellem nitrogenoxidmetabolitter, reducerede endothelin-1 hyperproduktion og understøttede organbeskyttelse11. Desuden er begrebet fjerniskæmisk prækonditionering, et fænomen, hvor enkeltorganprækonditionering giver systemisk beskyttelse, blevet undersøgt. Ali et al. fandt, at hos patienter, der gennemgik elektiv åben abdominal aortaaneurismereparation, fjernkonditionering, udført ved intermitterende krydsklemme af den fælles iliacarterie for at tjene som stimulus, reducerede forekomsten af postoperativ myokardieskade, myokardieinfarkt og nedsat nyrefunktion12.
Kaninmodeller tilbyder potentielle fordele i forhold til modeller med andre arter og er blevet brugt i flere forskellige scenarier i årtier, herunder induktion af arytmier, globale og regionale iskæmiske modeller og hjertekontraktionsforskning, blandt andet13,14,15. Selvom kaninhjertet er mindre end en hund eller gris, er det stort nok til nemt at udføre kirurgiske procedurer til en meget lavere pris13. Kaninhjertet bruges ofte, da det er tæt parallelt med det menneskelige hjerte; Faktisk har den en lignende metabolisk hastighed, udtrykker β-myosin tung kæde og mangler signifikant myokardial xanthinoxidase16. Teknikken heri beskrevet til at fremkalde regional myokardieiskæmi er enkel, gentagelig og omkostningseffektiv. Denne metode giver mulighed for både ikke-overlevelses- og overlevelsestilfælde, da kun regional iskæmi induceres snarere end global iskæmi, og de nødvendige materialer er ikke-specialiserede. To forskellige kirurgiske tilgange (dvs. sternotomi og mini-thoracotomi) kan anvendes, hvilket giver operatøren og eksperimentelle protokoller mere frihed med hensyn til undersøgelsesdesignet. Derudover kræver proceduren ikke brug af en kardiopulmonal bypass. I denne sammenhæng er minimalt invasive tilgange til koronararterie bypass podning blevet værdifulde alternativer for patienter med behov for multi-kar revaskularizaiton,17,18. Denne model kan bruges til at studere forskellene mellem disse tilgange og give et dyrebaseret læringsværktøj til kirurgiske praktikanter. Derudover kan udførelse af hjertekateterisering ved hjælp af denne model være nyttig til fysiologisk forskning og / eller kirurgisk træning.
Vores model giver en metode til applikationer, hvor inducering af regional myokardieiskæmi og efterfølgende måling af infarktstørrelse, myokardiefunktion og cellulære ændringer er af betydning. Med denne protokol har vi været i stand til at evaluere flere markører for cellulær funktion og tilpasning til iskæmi og det foreslåede terapeutiske indgreb (dvs. mitokondrietransplantation) ved at undersøge internaliseringen af organeller, iltforbrug, fosfatsyntese med høj energi og induktion af cytokinmediatorer og proteomiske veje. Disse resultater er vigtige for at bevare myokardieenergi, cellelevedygtighed og hjertefunktion og giver mulighed for objektiv evaluering af kardioprotektive teknikker efter iskæmi-reperfusionsskade. Denne model kan bruges til at studere lignende biologiske veje og alternativer inden for post-iskæmisk myokardiepatologi og genopretning.
Målet med denne protokol er at tilvejebringe en meget reproducerbar metode til at inducere in situ akut regional myokardieiskæmi hos kaninen til ikke-overlevelses- og overlevelsesforsøg. Denne model giver en metode med høj overlevelse, lav intraoperativ dødelighed og minimal sygelighed19. Andre modeller for akut regional myokardieiskæmi er blevet beskrevet ved hjælp af radioaktivt mærkede materialer, kontrastmidler, magnetisk resonansbilleddannelse eller computersimuleringer20,21,22. Vores protokol giver en pålidelig og enkel metode, der er omkostningseffektiv, konsekvent reproducerbar og har en lav teknisk efterspørgsel og dermed kan udføres af efterforskere uden kirurgisk ekspertise. Denne protokol rummer enten et overlevelsesprojekt ved hjælp af en venstre mini-thoracotomi eller en ikke-overlevelsesmodel ved hjælp af en midterlinjesternotomi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført i henhold til National Institutes of Health's retningslinjer for dyrepleje og brug og blev godkendt af Boston Children's Hospitals Animal Care and Use Committee (protokol 20-08-4247R). Alle dyrene modtog human pleje i overensstemmelse med vejledningen om pleje og brug af forsøgsdyr.
1. Dyrearter, bedøvelsesmidler og smertestillende midler
- Dyrearter: Brug New Zealand hvide kaniner (vildtype stamme; kvindelig køn; seksuelt moden 15-20 uger gammel; 3-4 kg kropsvægt) til eksperimentelle undersøgelser.
- Anæstetiske og smertestillende midler:
- Brug atropin i en dosis på 0,01 mg/kg intramuskulær (IM)
- Brug acepromazin i en dosis på 0,5 mg / kg IM til indledende sedation og 0,5 mg / kg intravenøs (IV) til fuld bedøvelse.
- Brug butorphanol i en dosis på 0,5 mg/kg i.m.
- Brug isofluran via en præcisionsfordampet systemansigtsmaske ved 3% til induktion, efterfulgt af intubation ved 1% -2%, ilt (O2) ved 100% ved 2 l / min og generel anæstesi ved 1% til vedligeholdelse.
- Brug medetomidin i en dosis på 0,25 mg/kg i.m.
- Brug ketamin i en dosis på 10 mg/kg IV.
- Brug en interkostal bupivacainblok på thoracotomistedet i en dosis, der ikke overstiger 3 mg/kg i.m.
- Brug 1% lidokain i en dosis på 1-1,5 ml / kg IV.
- Brug et depotplaster på 1-4 μg/kg fentanyl i 72 timer.
2. Proceduremæssige skridt (figur 1)
- Rolige New Zealand hvide voksne kaniner med en enkelt kombineret IM-injektion af atropin, acepromazin og butorphanol. Inducer dyret med 3% isofluran via en præcisionsfordampet system ansigtsmaske.
- Forberedelse før blindet endotracheal intubation (dvs. uden visualisering af glottis)
- Sprøjt strubehovedet med 1% lidokain for at forhindre laryngospasme.
- Formål længden af endotrachealrøret (ETT) på ydersiden af kaninen fra tænderne til den forudsagte carina, og placer kaninen i en siddestilling med nakken strakt ud.
- Intubere dyret med en manchet pædiatrisk størrelse (3-0 eller 3-5 indre diameter) ETT under kontinuerlig inhaleret bedøvelse ved 1% -2% ogO2 ved 100% ved 2 l / min.
- Indsæt ETT i munden, og ret det forbi torus ind i svælget.
- Fremfør ETT, indtil enten spidsen af røret kommer i kontakt med glottis eller åndedrættet går tabt, hvilket indikerer, at rørspidsen har passeret gennem den glottiske åbning.
- Træk røret lidt ud, indtil åndedrættet er genvundet, og gå derefter frem igen, og fastgør røret på plads.
- Ventilér dyret med mekanisk støtte (tidevandsvolumen: 10 ml/kg, fraktion af inspireret O 2: 40%, respirationsfrekvens: 30-40 vejrtrækninger/min, positivt slutekspiratorisk tryk: 5-10 cmH2O).
- Juster FiO2 som tolereret for at opnå en O2-mætning større end92 % målt ved pulsoximetri for at forhindre hyperoxia, hvilket kan fremkalde et systemisk inflammatorisk respons.
- Kontroller den korrekte placering af ETT ved en fysisk eksamen (dvs. auskultation), kliniske tegn (dvs. observation af kondens i slutningen af endotrachealrøret) og med objektive foranstaltninger (dvs. slutvandskuldioxid).
- Efter ca. 10 minutter skal du levere en IM-injektion af medetomidin til kaninen for at give samtidig bedøvelses- og smertestillende virkning.
- Oprethold den generelle anæstesi med 1% isofluran i løbet af den kirurgiske procedure.
- Indsæt et 22 G IV-kateter i den marginale ørevene, og fastgør det med tape for at opnå perifer IV-adgang.
BEMÆRK: Lårbensvenen kan bruges som et alternativt sted for venøs adgang.- Bedøm dyret fuldt ud med acepromazin IV og ketamin IV.
- Før snittet injiceres 1.000 E/ml heparin i en dosis på 3 mg/kg i.v.
- Administrer 1.000 E / ml heparin i en dosis på 3 mg / kg indledningsvis, og gendosis hver time indtil eksperimentets afslutning for at opretholde en aktiveret koagulationstid på >400 s i overensstemmelse med den nuværende kirurgiske protokol.
- Administrer 1% lidokain IV og / eller epikardial asynkroniseret defibrillering efter behov, hvis ventrikelflimmer opstår under operationen. Ventrikelflimmer stopper normalt med en eller to doser lidokain.
- Perfuse lactat Ringers opløsning kontinuerligt ved 10 ml/kg/time.
BEMÆRK: På grund af den lille mængde indgivne væsker og de korte operationstider krævede dyrene i overlevelsesstudier i dette arbejde ikke diurese før ekstubation eller i restitutionsperioden. Hvis dyret udvikler en forværret lungestatus (dvs. forøgelse af ventilatorindstillingerne, tegn på lungeødem ved auskultation osv.), Anbefales diurese.
- Udfør en carotisskæring, og placer en 4 eller 5 fransk arteriel linje for at lette den intraoperative overvågning af arterielt blodtryk (BP).
BEMÆRK: Lårbensarterien kan bruges som et alternativt sted for arteriel adgang. - Overvåg og registrer alle de fysiologiske og mekaniske variabler ved kontinuerlig realtidsanalyse.
- Overvåg arteriel BP med halspulsarterielinjen, og registrerO2-mætningen ved hjælp af pulsoximetri via en sensor placeret på en barberet pote.
- Overvåg med et elektrokardiogram (EKG) med tre lemledninger: I, II og III og tre beregnede forstærkede ledninger: aVL, aVR og aVF.
- Registrer EKG-sporingerne ved den præiskæmiske baseline, under iskæmi, under reperfusion og serielt i løbet af dag 7-28 af genopretning (hvis der udføres en overlevelsesundersøgelse).
- Overvåg sedationsniveauet ved kontinuerlig overvågning af BP og puls (HR).
- Overvåg temperaturen med en rektal sonde.
- Brug 2D ECHO fra venstre parasternale og apikale visninger til at vurdere myokardiefunktionen på ønskede tidspunkter i både overlevelses- og ikke-overlevelsestilfælde.
- Vurder myokardiefunktionen ved hjælp af fraktioneret forkortelse (FS) ved at måle venstre ventrikel end-diastolisk afstand (LVEDD) og venstre ventrikel ende-systolisk afstand (LVESD) og ved hjælp af følgende formel:
FS = (LVEDD − LVESD)/LVEDD × 100
- Vurder myokardiefunktionen ved hjælp af fraktioneret forkortelse (FS) ved at måle venstre ventrikel end-diastolisk afstand (LVEDD) og venstre ventrikel ende-systolisk afstand (LVESD) og ved hjælp af følgende formel:
- Under operationen skal du placere dyret på et cirkulerende varmtvandstæppe for at opretholde en stabil kropstemperatur.
- Forbered og draperer dyret på en steril måde:
- Barber det kirurgiske sted, og forbered med betadin og 70% isopropylalkohol, hver påført i tre eksemplarer. Dup området tørt med sterile gasbind, og draperer hele dyret med sterile håndklæder.
- Venstre mini-thoracotomi (overlevelsesstudier)
- Udfør en interkostal blok på det forudbestemte thoracotomisted med bupivacain IM.
- Administrer 1% lidokain IV via aurikulær vene før snit.
- Udfør en venstre mini-thoracotomi gennem det fjerde interkostale rum langs den øverste del af det femte ribben for at undgå det neuromuskulære bundt, som er placeret parallelt med undersiden af hvert ribben.
- Udfør en anterolateral thoracotomi for den bedste visualisering af hjertets anterolaterale overflade (dvs. den anatomiske placering af LAD diagonale grene).
- Placer kaninen med venstre side hævet ca. 30° ved hjælp af en pude eller sækkestol.
- Fastgør kaninens ipsilaterale ben over hovedet for at skabe plads til både operationsfeltet og mellem ribbenene.
- Palperer og skitserer de benede vartegn, herunder ribben, brystben og skulderblad, med en filtspids markeringspen. Skær huden over det femte ribben ved hjælp af et #10 blad. Sørg for, at snittet forbliver parallelt med ribben.
- Brug elektrokauteri til at opdele pectoralis major muskel og serratus anterior muskel. Opdel de intercoastal muskler lige over den femte ribben med elektrokauteri for at bevare det neurovaskulære bundt.
- Indtast forsigtigt pleurrummet gennem det fjerde interkostale rum med skarp eller stump dissektion. Forlæng det indledende pleurasnit parallelt med ribben i begge retninger med skarp eller stump dissektion, indtil en ribbenspreder eller brystretraktor kan indsættes.
- Placer en ribbenspreder eller brystretraktor inden for ribbensrummet, og udvid for at give tilstrækkelig visualisering af hjertet og hjertesækken. Løft hjertesækken med DeBakey-pincet, og åbn hjertesækken med Metzenbaum-saksen.
- LAD arterie isolering
- Omkreds den anden eller tredje diagonale gren af LAD-arterien med en polypropylensutur (3-0) på en konisk nål. Fjern nålen, og træk begge ender af polypropylenfilamentet gennem et lille vinylrør for at danne en snare.
- Placer en pledget mellem snare og koronararterien for at undgå at beskadige koronar og / eller forårsage vasospasme med ligering.
- Brug DeBakey-tang til at hente en rektangulær PTFE-filtplissé (ca. 7 mm x 3 mm). Placer plisséet mellem de to polypropylenfilamenter, så det er klemt mellem den isolerede LAD-arterie og vinylrøret, når snaren strammes.
- Midline sternotomi (ikke-overlevelsesstudier)
BEMÆRK: Midline sternotomi-tilgangen er ideel til ikke-overlevelsestilfælde, hvor mere invasiv overvågning med LVDP og sonomikrometri kan anvendes.- Udfør en midterlinjesternotomi ved hjælp af buet Mayo-saks. Placer en brystretraktor, og udvid den for at give tilstrækkelig visualisering af hjertet og hjertesækken.
- Løft hjertesækken med DeBakey-pincet, og åbn hjertesækken med Metzenbaum-saksen.
- Placering af de tre piezoelektriske sonomikrometrikrystaller:
- Lav tre små 1 mm snit på epikardiet af LV, der danner hjørnerne af en trekant. Placer de piezoelektriske sonomikrometrikrystaller inde i epikardiesnittene.
- Fastgør ledningerne til hjerteoverfladen med en 5-0 polypropylen U-søm. Når du optager ved hjælp af sonomicrometri, skal du sætte den mekaniske ventilation på pause for at muliggøre en nøjagtig optagelse over to til tre hjerteslag.
BEMÆRK: Hvis hjertet fibrillerer, er 1% lidokain ikke effektivt, og epikardiedefibrillering er nødvendig, sluk for sonomikrometeret og frakobl det fra dataindsamlingssystemet for at beskytte begge mod elektrisk indgang.
- LAD arterie isolering:
- Omkreds den anden eller tredje diagonale gren af LAD-arterien med en polypropylensutur (3-0) på en konisk nål.
- Fjern nålen, og træk begge ender af polypropylenfilamentet gennem et lille vinylrør for at danne en snare.
- Placer en pledget mellem snare og koronararterien for at undgå at beskadige koronararterien og / eller forårsage vasospasme med ligering.
- Brug DeBakey-tang til at hente en rektangulær PTFE-filtplissé (ca. 7 mm x 3 mm). Placer plisséet mellem de to polypropylenfilamenter, så det er klemt mellem den isolerede LAD-arterie og vinylrøret, når snaren strammes.
- Måling af LVDP:
- Placer en 5-0 polypropylen U-søm i toppen af LV. Lav et lille 1 mm snit med et 11 blad i LV-spidsen.
- Indsæt et 3 fransk ballonkateter i LV-lumen. Fastgør kateteret til LV ved at binde det til 5-0 polypropylen U-stitch sutur.
- Tilslut kateteret til transduceren, der er tilsluttet skærmen, for at registrere LVDP. Optag LVDP ved hjælp af dataindsamlingssystemet (beskrevet nedenfor). Nulstil kateteret for at registrere de hæmodynamiske variabler ved at åbne trevejs stophanen til luften og nulstille på skærmen.
- System til dataindsamling
- Start dataindsamlingssystemet (se materialefortegnelsen) på den computer/bærbare computer, der bruges. Tilslut ledningen fra skærmen til computeren / den bærbare computer.
- Vælg kanal 1 på dataindsamlingssystemet, og navngiv den LVDP. Nulstil transduceren ved hjælp af skærmen.
BEMÆRK: Hvis du tilslutter BP og HR til dataindsamlingssystemet, skal du følge den samme proces: Tilslut ledningen til den bærbare computer, vælg Kanal og nul, hvis du måler BP.
- Okkluder koronararterien ved at stramme snare ved at trykke ned på vinylrøret, mens du trækker op på polypropylensuturfilamenterne. Oprethold den ønskede tæthed med en mygklemme ved direkte at klemme røret og fastgøre det på plads.
- Bekræft myokardieiskæmi visuelt ved epikardiets regionale cyanose. Regional iskæmi kan også bekræftes på EKG med tilstedeværelsen af et ST-segment og T-bølgeændringer.
- Efter visuel bekræftelse induceres regional iskæmi i 30 minutter under anæstesi.
- Ved 0 min, 10 min, 20 min og 30 min under den regionale iskæmi vurderes FS ved 2D ECHO for både overlevelses- og ikke-overlevelsestilfælde.
- Vurder LVDP og sonomikrometri kontinuerligt i løbet af præ-iskæmi tid, myokardial iskæmi tid, og post-iskæmi tid for ikke-overlevelse tilfælde.
- Hvis det er nødvendigt, afgrænse risikoområdet ved at ligere arterien igen med polypropylensutursømmen tilbage på plads. Krydsklem aorta, og injicer Monastral Blue pigment 98% (fortyndet 1:5 i PBS) gennem aorta ved hjælp af en kardiopleginål. De perfunderede områder af myokardiet vil plette blåt, og risikoområdet forbliver ufarvet.
- Overvåg og registrer kontinuerligt HR-, BP- ogO2-mætningen .
- Lad dyret komme sig i 2 timer (ikke-overlevelse) eller 28 dage (overlevelse).
BEMÆRK: EKG kan bruges til at bekræfte reperfusion. Selvom det ikke ses i eksperimentet udført i denne undersøgelse, kan hypokaliæmi ofte forekomme under reperfusion og kan korrigeres med kaliumkontrol eller en passende infusion.
- Afslutning af proceduren
- Overlevelse tilfælde
- I overlevelsestilfælde skal du trimme 3-0 polypropylentråden, der bruges til snaren, binde enderne løst sammen og lade den være på plads. Identificer risikoområdet og infarktzonen ved hjælp af 3-0 polypropylentråden.
- Når proceduren er afsluttet, skal du lukke snittet i tre lag.
- Luk det første lag ved at binde to 2-0 polyglactin 910 figur-af-otte sting rundt om ribbenene.
- Luk de muskulære og subkutane lag med en 3-0 polydioxanon sutur på en løbende måde.
- Luk huden på en subkutikulær måde ved hjælp af en 5-0 monofilamentsutur. Brug en begravet løbende sutur for at minimere irritationen, som dyret føler.
- Evakuer pleurluften ved at udføre en nål thoracentese.
- Påfør et fentanyl depotplaster i 72 timer for at lette den postoperative smertebehandling.
- Udfør transthorax ekkokardiografi på tidspunkterne 1 uge og 2 uger postoperativt for at vurdere tendenserne i FS.
- Efter den forudbestemte restitutionsperiode skal du berolige, intubere og bedøve dyret som ovenfor. Udfør en median sternotomi. Udsæt og åbn perikardiesækken. Aflive kaninen under dyb anæstesi ved at fjerne hjertet en bloc, så dyret udløber ved ekssanguination.
- Tilfælde af manglende overlevelse
- Efter eksperimentet og efter at have sikret dyb anæstesi, udsæt hjertet fuldstændigt og fjern det en bloc til biokemisk og vævsanalyse. Dyret udløber ved ekssanguination.
- Overlevelse tilfælde
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter protokollen (figur 1) blev myokardieiskæmi bekræftet straks ved den direkte visualisering af cyanose af epikardiet.
Standard EKG'er (tre lemmer: I, II og III og tre beregnede forstærkede ledninger: aVL, aVR og aVF) blev registreret kontinuerligt præiskæmi, under iskæmi og ved reperfusion (figur 2). EKG'erne demonstrerer takykardi, arytmier (dvs. ventrikelflimmer), ledningssystemdefekter (dvs. bundtgrenblok), udvikling af infarktrelaterede Q-bølger og ST-segmentafvigelse23.
Under regional iskæmi blev regional hypokinesi direkte observeret med det blotte øje i midten af hulrummet i den forreste væg i alle hjerter, i overensstemmelse med LAD-arteriens perfusionsområde, der blev gjort iskæmisk ved begrænsning af strømning med midlertidig snaring af LAD. I både overlevelses- og ikke-overlevelsestilfælde blev 2D ECHO-aflæsninger opnået under præiskæmi, lige før inducering af regional iskæmi, og på forskellige tidspunkter under eksperimentet: 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min og 120 min. De venstre ventrikulære endediastoliske (LVEDD) og venstre ventrikulære endesystoliske dimensioner (LVESD) blev målt med en 2D-styret M-mode ECHO ved henholdsvis de maksimale og minimale LV-omkredse. Den regionale LV-vægkontraktilitet i den myokardiale iskæmiske zone blev vurderet ud fra kortaksevisninger af LV ved hjælp af M-tilstand, hvor markørlinjen ligger over risikoområdet. Den fraktionelle forkortelse (FS) blev beregnet med følgende formel: FS = (LVEDD - LVESD)/LVEDD × 10024. Resultaterne viste, at den fraktionelle forkortelse faldt i løbet af den iskæmiske tid og post-iskæmiske tid sammenlignet med den præ-iskæmiske tid (figur 3)
For at kvantificere omfanget af myokardieskade kan infarktstørrelsen måles biokemisk med triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) farvning. I dette arbejde blev risikoområdet afgrænset ved re-ligering af den involverede arterie ved at binde Prolene-sømmen, der var tilbage på plads. Aorta blev krydsfastspændt, og Monastral Blue pigment (fortyndet 1:5 i PBS) blev leveret gennem aorta ved hjælp af en kardiopleginål. Områderne med perfuseret myokardium blev farvet blå, og risikoområdet forblev ufarvet på grund af ligering af arterien.
Hjertet blev skåret over den lange akse af venstre ventrikel, fra spids til base, i 1 cm tykke tværgående sektioner, placeret mellem glasplader og komprimeret med bulldogklemmer. Risikoområdet for hver side af hver sektion blev sporet på et klart acetatark. Hjerteafsnittene blev inkuberet i en mørk beholder med 1% TTC i fosfatbuffer (pH 7,4) ved 38 °C i 20 minutter. Hjertesektionerne blev derefter opbevaret i en 10% formaldehydopløsning i 24 timer før de endelige målinger for at forbedre visualiseringen af infarktzonen. Sektionerne blev placeret mellem glasplader og komprimeret med bulldogklemmer. Myokardienekrose blev påvist af et hvidt område på myokardievævet, og de murstenrøde områder viste det levedygtige væv. (Figur 4) De infarkterede områder (hvide) inden for risikoområderne for hver side af hver sektion blev sporet på det klare acetatark. Planimetry blev brugt til at måle risikoområdet og infarktzonen. Volumenerne af risikoområdet og infarktzonen blev beregnet ved at gange de planmålte områder med skivetykkelsen. Infarktvolumenet blev udtrykt som en procentdel af det totale LV-volumen for hvert hjerte25. Forholdet mellem risikoområdet og LV-vægten blev beregnet, og infarktstørrelsen blev udtrykt som en procentdel af risikoområdet. Vores tidligere arbejde viste, at efter 2 timer og 28 dages restitution var risikoområderne (dvs. som en procentdel af LV-massen) henholdsvis ca. 29% og 27% for både mitokondrie- og kontrolgrupperne Efter 2 timer og 28 dages restitution var infarktstørrelsen (dvs. infarktstørrelse/risikoområde) i mitokondriehjerterne 9,8% og 7,9%, henholdsvis sammenlignet med 37% og 34% i kontrolhjerterne26. Derudover blev fraktioneret forkortelse og LVDP i vores tidligere eksperimenter reduceret i kontrolgruppen til henholdsvis 50% -60% og 70% -80% sammenlignet med baseline.
Figur 1: Protokoldiagram. Protokollen kan justeres baseret på eksperimentets behov enten for overlevelses- eller ikke-overlevelsestilfælde. Ikke-overlevelsestilfælde kan udføres med en mere invasiv kirurgisk tilgang ved hjælp af en midterlinjesternotomi, hvilket muliggør anvendelse af sonomikrometrikrystaller, epikardial ekkokardiografi (ECHO) og et LV-kateter til måling af fraktioneret forkortelse og LVDP. For overlevelsestilfælde, hvor snitheling og smertebehandling skal overvejes, kan en venstre mini-thoracotomi udføres, og myokardiefunktionen kan vurderes på forskellige tidspunkter i en længere undersøgelsesperiode ved hjælp af 2D ECHO. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentativt elektrokardiogram (lem II og beregnet forstærket bly aVL) før den regionale iskæmiinduktion, under den iskæmiske tid og under reperfusionen. Millivolt og millisekund skalaer vises til venstre. Tidspunkterne og øjeblikket for den venstre forreste nedadgående arterie snaring er vist nederst. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Ekkokardiografisk vurdering af hjertet ved måling af fraktioneret forkortelse (FS). Den fraktionelle forkortelse blev målt ved at opnå venstre ventrikulær endediastolisk afstand og venstre ventrikulær endesystolisk afstand med 2D-guidet M-tilstand ved henholdsvis de maksimale og minimale LV-omkredse. Den fraktionelle afkortning blev vurderet ved (A) baseline/præiskæmi, (B) under den midlertidige snaring af venstre forreste nedadgående (LAD) arterie med markørlinjen over risikoområdet og (C) under reperfusion efter frigivelse af snare på LAD. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative billeder af infarktstørrelsen for et hjerte farvet med 1% triphenyltetrazoliumchlorid efter 30 minutters induceret myokardieregional iskæmi. Det levedygtige væv ses som rødt, mens infarkt ses som hvide områder. Vægtstang = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores protokol demonstrerer en pålidelig metode til udførelse af akut regional myokardieiskæmi hos kaninen. Den venstre mini-thoracotomi-tilgang er ideel til overlevelsestilfælde, hvor snittet og tilhørende smerte skal minimeres. Det er vigtigt, at diuretisk behandling ikke var nødvendig før ekstubation, og der var ingen dødelighed intraoperativt i ikke-overlevelsesgruppen eller efter 4 uger postoperativt i overlevelsesgruppen. Når udformningen af protokollen kræver et ikke-overlevelsestilfælde, eller når der er behov for mere detaljeret overvågning af den globale og regionale myokardiefunktion, kan en midterlinjesternotomi anvendes (figur 1).
De mest kritiske trin i protokollen er omhyggeligt at omslutte LAD med en konisk nål uden at beskadige arterien eller skabe venøs blødning og at blokere LAD for at skabe et ensartet risikoområde.
Nogle komplikationer, der kan opleves ved udførelse af den beskrevne operation, er lungeoverdistension under mekanisk ventilation på grund af et højt tidevandsvolumen, blødning fra skade på LAD, blødning sekundært til interkostal karskade, som normalt opstår ved indrejse eller fra retraktormanipulation og / eller hjertearytmi (intraoperativ ventrikelflimmer) med LAD ligering. Andre postoperative komplikationer kan også forekomme, såsom infektion på operationsstedet, dårlig dyremobilisering på grund af smerte og / eller resterende myokardial regional hypokinese. På trods af at forekomsten af disse komplikationer er meget lav, bør investigator være i stand til let og effektivt at løse dem.
Kaniner præsenterer som en fremragende dyremodel til myokardieundersøgelser. Deres hjertefrekvens svarer til den menneskelige hjertefrekvens, og deres størrelse er tilstrækkelig lille, men giver mulighed for histologisk analyse under et optisk mikroskop.
En begrænsning i denne undersøgelse bør anerkendes; Specifikt er kaninhjertet mindre og klinisk mindre relevant til sammenligninger med det menneskelige hjerte end hjerterne i andre store dyremodeller som grisen.
På grund af forekomsten og forekomsten af hjerte-kar-sygdomme er det af afgørende betydning at have en dyremodel, der simulerer regional myokardieiskæmi. Denne metode kan have flere anvendelser og har vist sig at være nyttig i modeller af vaskulær skade, kronisk myokardieiskæmi og korte perioder med myokardiebedøvelse 27,28,29,30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter, økonomiske eller på anden måde, erklæres af forfatterne.
Acknowledgments
Den oprindelige undersøgelse, hvor denne protokol blev brugt, blev støttet af National Heart, Lung, and Blood Institute Grants HL-103642 og HL-088206
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 blade | Bard Parker | 371210 | |
| #11 blade | Fisher Scientific | B3L | |
| 22 G PIV needle | BD Insyte | 381423 | |
| Acepromazine | VETONE | NDC 13985-587-50 | 0.5 mg/kg IM and IV |
| Aline pressure bag | Infu-Stat | 2139 | |
| Angiocath | Becton Dickinson | 382512 | |
| Arterial Catheter | Teleflex | MC-004912 | |
| Atropine | Hikma Pharmaceuticals | NDC 0641-6006-01 | 0.01 mg/kg IM |
| Betadine and 70% isopropyl alcohol | McKesson | NDC 68599-2302-6 | |
| Blood gas machine | Siemens | MRK0025 | |
| Bovie | Valleylab | E6008 | |
| Bulldog clamps | World Precision Instruments | 14119 | |
| Bupivacaine | Auromedics | NDC 55150-249-50 | 3 mg/kg IM |
| Butorphanol | Roxane | NDC 2054-3090-36 | 0.5 mg/kg IM |
| Clear acetate sheet | Oxford Instruments | ID 51-1625-0213 | |
| Clipers | Andis | AGC2 | |
| DeBakey forceps | Integra | P6280 | |
| Echocardiography machine | Philips | IE33 F1 | |
| Electrocardiography machine | Meditech | MD908B | |
| Endotracheal tube | Medline | #922774 | |
| Fentanyl | West-Ward | NDC 0641-6030-01 | 1–4 µg/kg transdermal patch |
| Formaldehyde solution 10% | Epredia | 94001 | |
| Glass plates | United Scientific | B01MUHX6MR | |
| Heparin Sodium | Sagent | NDC 69-0058-02 | 1000U in 1 mL 3 mg/kg |
| Hot water blanket | 3M | 55577 | |
| Isoflurane | Penn Veterinary Supply, INC | NDC 50989-606-15 | 1%–3% |
| Ketamine | Dechra | NDC 42023-138-10 | 10 mg/kg IV |
| Lab Chart 7 Acquisition Software | Adinstruments | ||
| Lactated Ringer's solution | ICUmedical | NDC 0990-7953-09 | 10 mL/kg/h |
| Laryngoscope | Welch Allyn | 68044 | |
| Left ventricule lumen catheter 3Fr | McKesson | 385764-EA | |
| Lidocaine (1%) | Pfizer | 4276-01 | 1–1.5 mL/kg IV |
| LVDP transducer | Edward | PDP-ED | |
| Marking pen | Viscot | 1451SR-100 Unsterile | |
| Mayo scissors | Mayo | S7-1098 | |
| Medetomidine | Entireoly Pets Pharmacy | NDC 015914-005-01 | 0.25 mg/kg IM |
| Metzenbaum scissors | Cole-Parmer | UX-10821-05 | |
| Monastra. Blue pigment 98% | Chemsavers | MBTR1100G | |
| Monocryl 5-0 | Ethicon | Y463G | |
| Mosquito clamp | Shioda | 802N | |
| PDS 3-0 | Ethicon | 42312201 | |
| Piezoelectric sonomicrometry crystals | Sonometrics | Small 2mm round | |
| Plegets | DeRoyal | 32-363 | |
| Povuine Iodine Prep Solutions | Medline | MDS093940 | |
| Precision vaporized system face mask | Yuwell | B07PNH69BF | |
| Prolene 3-0 | Ethicon | 8665G | |
| Proline 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Pulse oximetry probe | Masimo | 9216-U | |
| Rib spreader | Medline | MDS5621025 | |
| S12 Pediatric Sector Probe | Phillips | 21380A | |
| Sonomicrometer | Sonometrics | BZ10123724 | |
| Sterile gauze | Medline | 3.00802E+13 | |
| Sterile towels | McKesson | MON 277860EA | |
| Sternal retractor | Medline | MDS5610321 | |
| Sutures for closure | J&J Dental | 8698G | |
| Telemetriy monitor | Meditech | MD908B | |
| Temperature probe | Omega | KHSS-116G-RSC-12 | |
| Triphenyl tetrazolium chloride (1%) | Millipore | MFCD00011963 | |
| Ventilator | MedGroup | MSLGA 11 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | V635H | |
| Vinyl tubing | ABE | DISW 3001 |
References
- Selvin, E., Erlinger, T. P. Prevalence of and risk factors for peripheral arterial disease in the United States: Results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2000. Circulation. 110 (6), 738-743 (2004).
- Bolli, R., et al. Myocardial protection at a crossroads: The need for translation into clinical therapy. Circulation Research. 95 (2), 125-134 (2004).
- Cohn, J. N., et al. Report of the National Heart, Lung, and Blood Institute Special Emphasis Panel on Heart Failure Research. Circulation. 95 (4), 766-770 (1997).
- Rousou, A. J., Ericsson, M., Federman, M., Levitsky, S., McCully, J. D. Opening of mitochondrial KATP channels enhances cardioprotection through the modulation of mitochondrial matrix volume, calcium accumulation, and respiration. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (5), H1967-H1976 (2004).
- Rao, V., et al. Insulin cardioplegia for elective coronary bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 119 (6), 1176-1184 (2000).
- Vinten-Johansen, J., Zhao, Z. Q., Jiang, R., Zatta, A. J. Myocardial protection in reperfusion with postconditioning. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 3 (6), 1035-1045 (2005).
- Wakiyama, H., et al. Selective opening of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels during surgically induced myocardial ischemia decreases necrosis and apoptosis. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 21 (3), 424-433 (2002).
- Chen, Q., Moghaddas, S., Hoppel, C. L., Lesnefsky, E. J. Reversible blockade of electron transport during ischemia protects mitochondria and decreases myocardial injury following reperfusion. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 319 (3), 1405-1412 (2006).
- Lesnefsky, E. J., et al. rather than reperfusion, inhibits respiration through cytochrome oxidase in the isolated, perfused rabbit heart: Role of cardiolipin. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), H258-H267 (2004).
- McCully, J. D., Rousou, A. J., Parker, R. A., Levitsky, S. Age- and gender-related differences in mitochondrial oxygen consumption and calcium with cardioplegia and diazoxide. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (3), 1102-1109 (2007).
- Mandel, I. A., et al. Influence of hypoxic and hyperoxic preconditioning on endothelial function in a model of myocardial is-chemia-reperfusion injury with cardiopulmonary bypass (Experimental study). International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5336 (2020).
- Ali, Z. A., et al. Remote ischemic preconditioning reduces myocardial and renal injury after elective abdominal aortic aneurysm repair: A randomized controlled trial. Circulation. 116, 98-105 (2007).
- Pogwizd, S. M., Bers, D. M.
- Tanaka, K., Hearse, D. J. Reperfusion-induced arrhythmias in the isolated rabbit heart: characterization of the influence of the duration of regional ischemia and the extracellular potassium concentration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 20 (3), 201-211 (1988).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Gupta, M. P. Factors controlling cardiac myosin-isoform shift during hypertrophy and heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43 (4), 388-403 (2007).
- Lapierre, H., Chan, V., Sohmer, B., Mesana, T. G., Ruel, M. Minimally invasive coronary artery bypass grafting via a small thoracotomy versus off-pump: A case-matched study. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 40 (4), 804-810 (2011).
- Aubin, H., Akhyari, P., Lichtenberg, A., Albert, A. Additional right-sided upper "half-mini-thoracotomy" for aortocoronary bypass grafting during minimally invasive multivessel revascularization. Journal of Cardiothoracic Surgery. 10, 130 (2015).
- Hu, N., et al. Ligation of the left circumflex coronary artery with subsequent MRI and histopathology in rabbits. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (6), 838-844 (2010).
- Sievers, R. E., et al. A model of acute regional myocardial ischemia and reperfusion in the rat. Magnetic Resonance in Medicine. 10 (2), 172-181 (1989).
- Rodríguez, B., Trayanova, N., Noble, D.
- Sinusas, A. J., et al. Quantification of area at risk during coronary occlusion and degree of myocardial salvage after reperfusion with technetium-99m methoxyisobutyl isonitrile. Circulation. 82 (4), 1424-1437 (1990).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Pombo, J. F., Troy, B. L., Russell, R. O. J. Left ventricular volumes and ejection fraction by echocardiography. Circulation. 43 (4), 480-490 (1971).
- McCully, J. D., Wakiyama, H., Hsieh, Y. J., Jones, M., Levitsky, S. Differential contribution of necrosis and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), H1923-H1935 (2004).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 304 (7), 966-982 (2013).
- Abarbanell, A. M., et al. Animal models of myocardial and vascular injury. Journal of Surgical Research. 162 (2), 239-249 (2010).
- Pirat, B., et al. A novel feature-tracking echocardiographic method for the quantitation of regional myocardial function: Validation in an animal model of ischemia-reperfusion. Journal of the American College of Cardiology. 51 (6), 651-659 (2008).
- Verdouw, P. D., vanden Doel, M. A., de Zeeuw, S., Duncker, D. J. Animal models in the study of myocardial ischaemia and ischaemic syndromes. Cardiovascular Research. 39 (1), 121-135 (1998).
- Bolukoglu, H., et al. An animal model of chronic coronary stenosis resulting in hibernating myocardium. The American Journal of Physiology. 263, H20-H29 (1992).
- Heyndrickx, G. R., Millard, R. W., McRitchie, R. J., Maroko, P. R., Vatner, S. F. Regional myocardial functional and electrophysiological alterations after brief coronary artery occlusion in conscious dogs. Journal of Clinical Investigation. 56 (4), 978-985 (1975).
