Summary
Настоящее исследование демонстрирует высоковоспроизводимую животную модель острой регионарной ишемии миокарда и реперфузионного повреждения у кроликов, использующих левую мини-торакотомию для случаев выживания или срединную стернотомию для случаев невыживаемости.
Abstract
Протокол предоставляет простую, легко воспроизводимую методологию индуцирования острой регионарной ишемии миокарда in situ у кролика для экспериментов без выживания и выживания. Новозеландского белого взрослого кролика усыпляют атропином, ацепромазином, буторфанолом и изофлураном. Животное интубируют и помещают на искусственную вентиляцию легких. Внутривенный катетер вводится в краевую ушную вену для инфузии лекарственных препаратов. Животное предварительно лечат гепарином, лидокаином, лактационным раствором Рингера. Срез сонной артерии проводится для получения доступа к артериальному катетеру для мониторинга артериального давления. Выбранные физиологические и механические параметры контролируются и регистрируются с помощью непрерывного анализа в режиме реального времени.
После того, как животное находится под седативным препаратом и под полным наркозом, выполняется либо торакотомия в четвертом межреберье (выживаемость), либо стернотомия по средней линии (невыживаемость). Вскрывается перикард и располагается левая передняя нисходящая артерия.
Полипропиленовый шов пропускается вокруг второй или третьей диагональной ветви артерии LAD, и полипропиленовая нить продевается через небольшую виниловую трубку, образуя петлю. Животное подвергается 30-минутной регионарной ишемии, достигаемой окклюзией LAD путем затягивания силка. Ишемия миокарда подтверждается визуально регионарным цианозом эпикарда. После регионарной ишемии лигатуру ослабляют, и сердцу дают возможность повторной перфузии.
Как в экспериментах с выживаемостью, так и без выживания функция миокарда может быть оценена с помощью эхокардиографии (ЭХО) для измерения фракционного укорочения. Для исследований, не связанных с выживаемостью, данные сономикрометрии, собранные с помощью трех цифровых пьезоэлектрических ультразвуковых зондов, имплантированных в область ишемии, и давление развития левого желудочка (LVDP) с помощью апикально введенного катетера левого желудочка (ЛЖ) могут быть непрерывно получены для оценки региональной и глобальной функции миокарда соответственно.
Для исследований выживаемости разрез закрывают, выполняют торакоцентез левой иглой для эвакуации воздуха из плевры и достигают послеоперационного контроля боли.
Introduction
Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной смерти в мире и ежегодно приводят к более чем 18 миллионам случаев смерти 1,2,3. Острый инфаркт миокарда (ИМ) является распространенным неотложным состоянием, которое развивается, когда тромб или кусочек атероматозной бляшки блокирует кровоток коронарной артерии. Это вызывает регионарную ишемию миокарда на территории, которую перфузирует артерия.
В настоящем исследовании описывается протокол, который использует простую и надежную методологию для создания острой регионарной ишемии миокарда in situ на кроличьей модели для экспериментов без выживания и выживания. Первоначальная цель этого метода состояла в том, чтобы оценить влияние митохондриальной трансплантации на модуляцию некроза миокарда и повышение постишемической функции сердца после ишемического события. Предыдущие исследования продемонстрировали возникновение митохондриальных изменений и быстрое снижение уровня высокоэнергетических фосфатов после начала ишемии и снижение подачи кислорода, что приводит к резкому уменьшениюзапасов сердечной энергии. Исследователи пытались улучшить постишемическую функцию и уменьшить некроз ткани миокарда с помощью фармакологических вмешательств и/или процедурных методов, но эти методы обеспечивают ограниченную кардиозащиту и оказывают минимальное влияние на повреждение и дисфункцию митохондрий 5,6,7. Наша команда и другие ранее показали, что повреждение митохондрий в основном происходит во время ишемии и что сократительное восстановление может быть усилено, а размер инфаркта миокарда уменьшен с сохранением дыхательной функции митохондрий во время реперфузии 8,9,10. Таким образом, мы предположили, что митохондриальная трансплантация из тканей, не затронутых ишемией, в область ишемии до реперфузии обеспечит альтернативный подход к уменьшению некроза миокарда и усилению функции миокарда. В этой статье мы подробно опишем протокол, используемый для проверки этой теории, и репрезентативные результаты, полученные в результате нашего первоначального анализа исследования.
Кроме того, несколько исследователей сосредоточились на других темах, имеющих важное значение для определения влияния ишемически-реперфузионного повреждения миокарда и разработки соответствующих терапевтических вмешательств. Одной из таких областей исследований является предобусловливание. Прекондиционирование ишемии миокарда является кардиопротекторным механизмом, активируемым кратковременным ишемическим стрессом, который приводит к снижению скорости некроза клеток сердца во время последующих эпизодов длительной ишемии. Эти механизмы могут быть активированы либо гипоксией, либо окклюзией коронарных артерий. Mandel et al. продемонстрировали, что гипоксически-гипероксическое прекондиционирование помогает поддерживать баланс метаболитов оксида азота, снижает гиперпродукцию эндотелина-1 и поддерживает защиту органов11. Кроме того, была исследована концепция дистанционного ишемического прекондиционирования, феномена, при котором прекондиционирование одного органа обеспечивает системную защиту. Ali et al. обнаружили, что у пациентов, перенесших плановую открытую операцию по поводу аневризмы брюшной аорты, дистанционное прекондиционирование, выполняемое путем периодического перекрестного пережатия общей подвздошной артерии в качестве стимула, снижало частоту послеоперационного повреждения миокарда, инфаркта миокарда и почечной недостаточности12.
Кроличьи модели обладают потенциальными преимуществами по сравнению с моделями с другими видами и десятилетиями использовались в различных сценариях, включая индукцию аритмий, глобальные и региональные модели ишемии, а также исследования сердечных сокращений, среди прочих13,14,15. Хотя сердце кролика меньше, чем у собаки или свиньи, оно достаточно большое, чтобы легко выполнять хирургические процедуры с гораздо меньшимизатратами. Часто используется кроличье сердце, так как оно очень похоже на человеческое сердце; Действительно, он имеет аналогичную скорость метаболизма, экспрессирует тяжелую цепь β-миозина и не имеет значительной ксантиноксидазы16 миокарда. Описанный здесь метод индуцирования регионарной ишемии миокарда прост, воспроизводим и экономически эффективен. Этот метод допускает как случаи невыживаемости, так и случаи выживания, поскольку индуцируется только регионарная ишемия, а не глобальная, а необходимые материалы не являются специализированными. Могут быть использованы два различных хирургических подхода (например, стернотомия и мини-торакотомия), что обеспечивает оператору и экспериментальным протоколам большую свободу с точки зрения дизайна исследования. Кроме того, процедура не требует использования искусственного кровообращения. В этом контексте минимально инвазивные подходы к аортокоронарному шунтированию стали ценной альтернативой для пациентов, нуждающихся в многососудистой реваскуляризации17,18. Эта модель может быть использована для изучения различий между этими подходами и предоставления инструмента обучения на животных для стажеров-хирургов. Кроме того, катетеризация сердца с использованием этой модели может быть полезна для физиологических исследований и/или хирургической подготовки.
Наша модель предоставляет методологию для приложений, в которых важно индуцировать регионарную ишемию миокарда и впоследствии измерять размер инфаркта, функцию миокарда и клеточные изменения. С помощью этого протокола мы смогли оценить несколько маркеров клеточной функции и адаптации к ишемии и предлагаемому терапевтическому вмешательству (т.е. митохондриальной трансплантации), изучив интернализацию органелл, потребление кислорода, синтез высокоэнергетических фосфатов и индукцию цитокиновых медиаторов и протеомных путей. Эти результаты важны для сохранения энергетики миокарда, жизнеспособности клеток и функции сердца и позволяют объективно оценить кардиопротекторные методы после ишемически-реперфузионного повреждения. Эта модель может быть использована для изучения аналогичных биологических путей и альтернатив в области постишемической патологии миокарда и восстановления.
Целью данного протокола является предоставление высоковоспроизводимой методологии индуцирования острой регионарной ишемии миокарда in situ у кроликов для экспериментов по невыживанию и выживанию. Эта модель обеспечивает методологию с высокой выживаемостью, низкой интраоперационной летальностью и минимальной заболеваемостью19. Другие модели острой регионарной ишемии миокарда были описаны с использованием радиомеченных материалов, контрастных веществ, магнитно-резонансной томографии или компьютерного моделирования20,21,22. Наш протокол обеспечивает надежную и простую методологию, которая является экономически эффективной, стабильно воспроизводимой и имеет низкие технические требования и, таким образом, может быть выполнена исследователями без хирургического опыта. Этот протокол включает в себя либо проект выживания с использованием левой мини-торакотомии, либо модель без выживания с использованием срединной стернотомии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения по уходу за животными и их использованию и было одобрено Комитетом по уходу за животными и их использованию Бостонской детской больницы (протокол 20-08-4247R). Все животные получали гуманный уход в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию.
1. Виды животных, анестетики и анальгетики
- Виды животных: Для экспериментальных исследований используют новозеландских белых кроликов (штамм дикого типа; женский пол; половозрелый возраст 15-20 недель; масса тела 3-4 кг).
- Обезболивающие и обезболивающие средства:
- Применяют атропин в дозе 0,01 мг/кг внутримышечно (в/м)
- Применяют ацепромазин в дозе 0,5 мг/кг в/м для начальной седации и 0,5 мг/кг внутривенно (в/в) для полной анестезии.
- Применяют буторфанол в дозе 0,5 мг/кг в/м.
- Используйте изофлуран через маску для лица с прецизионным испарением в концентрации 3% для индукции, с последующей интубацией в дозе 1%-2%, кислородом (O2) при 100% при 2 л/мин и общей анестезией в дозе 1% для поддерживающей терапии.
- Применяют медетомидин в дозе 0,25 мг/кг в/м.
- Применяют кетамин в дозе 10 мг/кг в/в.
- Применяют межреберную блокаду бупивакаина в месте торакотомии в дозе не более 3 мг/кг в/м.
- Применяют 1% лидокаин в дозе 1-1,5 мл/кг в/в.
- Используйте трансдермальный пластырь фентанила в дозе 1-4 мкг/кг в течение 72 ч.
2. Процедурные этапы (рисунок 1)
- Усыпляйте новозеландских белых взрослых кроликов однократной комбинированной внутримышечной инъекцией атропина, ацепромазина и буторфанола. Индуцируйте животное 3%-ным изофлураном через маску для лица с прецизионной системой испарения.
- Подготовка перед слепой эндотрахеальной интубацией (т.е. без визуализации голосовой щели)
- Опрыскайте гортань 1% лидокаином для профилактики ларингоспазма.
- Предварительно измерьте длину эндотрахеальной трубки (ЭТТ) на внешней стороне кролика от зубов до прогнозируемого киля и поместите кролика в грудное лежачее положение с вытянутой шеей.
- Интубировать животное с помощью манжеты педиатрического размера (внутренний диаметр 3-0 или 3-5) ETT под непрерывным ингаляционным анестетиком в дозе 1%-2% иO2 на 100% при 2 л/мин.
- Вставьте ЭТТ в рот и направьте его мимо тора в глотку.
- Продвигайте ETT до тех пор, пока кончик трубки не соприкоснется с голосовой щелью или звуки дыхания не исчезнут, указывая на то, что кончик трубки прошел через отверстие глотки.
- Слегка оттяните трубку до тех пор, пока звуки дыхания не восстановятся, а затем снова продвиньтесь вперед и закрепите трубку на месте.
- Искусственная вентиляция легких (дыхательный объем: 10 мл/кг, фракция вдохаО2: 40%, частота дыхания: 30-40 вдохов/мин, положительное давление в конце выдоха: 5-10 смН2О).
- Отрегулируйте FiO2 в соответствии с переносимостью для достижения сатурации O2 более92 %, измеренной с помощью пульсоксиметрии, чтобы предотвратить гипероксию, которая может спровоцировать системную воспалительную реакцию.
- Проверьте правильность установки ЭТТ с помощью физикального осмотра (т.е. аускультации), клинических признаков (т.е. наблюдения конденсации на конце эндотрахеальной трубки) и объективных измерений (например, углекислого газа в конце выдоха).
- Примерно через 10 мин введите кролику внутримышечную инъекцию медетомидина для обеспечения одновременного обезболивающего и обезболивающего эффектов.
- Поддерживайте общую анестезию 1% изофлураном на протяжении всей хирургической процедуры.
- Вставьте внутривенный катетер 22 G в краевую ушную вену и закрепите его лентой, чтобы получить периферический внутривенный доступ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бедренная вена может быть использована в качестве альтернативного места венозного доступа.- Полностью обезболивайте животное ацепромазином в/в и кетамином внутривенно.
- Перед разрезом вводят 1000 ЕД/мл гепарина в дозе 3 мг/кг внутривенно.
- Вводят 1000 ЕД/мл гепарина в дозе 3 мг/кг первоначально и повторяют дозу каждый час до конца эксперимента, чтобы поддерживать время активированного свертывания крови >400 с, в соответствии с текущим хирургическим протоколом.
- При необходимости вводят 1% лидокаин в/или эпикардиальную асинхронную дефибрилляцию, если во время операции возникает фибрилляция желудочков. Фибрилляция желудочков обычно прекращается одной или двумя дозами лидокаина.
- Перфузируйте раствор Рингера непрерывно в дозе 10 мл/кг/ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая небольшой объем вводимых жидкостей и короткое время операции, животные в исследованиях выживаемости в этой работе не нуждались в диурезе до экстубации или в период восстановления. Если у животного развивается ухудшение состояния легких (т.е. увеличение настроек аппарата искусственной вентиляции легких, признаки отека легких при аускультации и т.д.), рекомендуется диурез.
- Выполните разрез сонной артерии и установите 4 или 5 французских артериальных катетер, чтобы облегчить интраоперационный мониторинг артериального давления (АД).
ПРИМЕЧАНИЕ: Бедренная артерия может быть использована в качестве альтернативного места артериального доступа. - Контролируйте и записывайте все физиологические и механические переменные с помощью непрерывного анализа в режиме реального времени.
- Контролируйте артериальное АД с помощью сонной артерии и регистрируйте сатурациюО2 с помощью пульсоксиметрии через датчик, размещенный на бритой лапе.
- Монитор с электрокардиограммой (ЭКГ) с тремя отведениями конечностей: I, II и III, и тремя вычисленными расширенными отведениями: aVL, aVR и aVF.
- Записывайте трассировку ЭКГ на исходном уровне до ишемии, во время ишемии, во время реперфузии и последовательно в течение 7-28 дней восстановления (при проведении исследования выживаемости).
- Контролируйте уровень седации путем непрерывного мониторинга АД и частоты сердечных сокращений (ЧСС).
- Контролируйте температуру ректальным зондом.
- Используйте 2D ЭХО с левой парастернальной и апикальной проекций для оценки функции миокарда в желаемые моменты времени как в случаях выживаемости, так и в случаях невыживаемости.
- Оцените функцию миокарда с помощью фракционного укорочения (FS), измерив конечное диастолическое расстояние левого желудочка (LVEDD) и конечное систолическое расстояние левого желудочка (LVESD) и используя следующую формулу:
FS = (LVEDD − LVESD)/LVEDD × 100
- Оцените функцию миокарда с помощью фракционного укорочения (FS), измерив конечное диастолическое расстояние левого желудочка (LVEDD) и конечное систолическое расстояние левого желудочка (LVESD) и используя следующую формулу:
- Во время операции поместите животное на одеяло с циркулирующей горячей водой, чтобы поддерживать стабильную температуру тела.
- Подготовьте и задрапируйте животное стерильным способом:
- Побрейте место операции и подготовьте бетадином и 70% изопропиловым спиртом, каждый из которых наносится в трех экземплярах. Промокните участок насухо стерильными марлевыми салфетками и накройте все животное стерильными полотенцами.
- Левосторонняя миниторакотомия (исследования выживаемости)
- Выполнить межреберную блокаду в заданном месте торакотомии бупивакаином внутримышечно.
- Вводят 1% лидокаин в/в через ушную вену перед разрезом.
- Выполните левую мини-торакотомию через четвертое межреберье вдоль верхней части пятого ребра, чтобы избежать нервно-мышечного пучка, который расположен параллельно нижней поверхности каждого ребра.
- Выполните переднебоковую торакотомию для наилучшей визуализации переднебоковой поверхности сердца (т.е. анатомического расположения диагональных ветвей LAD).
- Расположите кролика левым боком, приподнятым примерно на 30°, используя подушку или мешок с фасолью.
- Закрепите ипсилатеральную ногу кролика над головой, чтобы освободить место как для операционного поля, так и между реберными пространствами.
- Пальпируйте и обведите костные ориентиры, включая ребра, грудину и лопатку, фломастером. Надрежьте кожу над пятым ребром лезвием #10. Следите за тем, чтобы разрез оставался параллельным ребру.
- Используйте электрокоагуляцию, чтобы разделить большую грудную мышцу и переднюю зубчатую мышцу. Разделите межприбрежные мышцы прямо над пятым ребром с помощью электрокоагуляции, чтобы сохранить сосудисто-нервный пучок.
- Осторожно входите в плевральную полость через четвертое межреберье с резким или тупым рассечением. Расширьте начальный разрез плевры параллельно ребру в обоих направлениях с острым или тупым рассечением до тех пор, пока не будет введен расширитель ребер или стернальный ретрактор.
- Поместите расширитель ребер или стернальный ретрактор в реберное пространство и расширьте, чтобы обеспечить адекватную визуализацию сердца и перикардиального мешка. Приподнимите перикард щипцами Дебейки, а перикард раскройте ножницами Метценбаума.
- Изоляция артерий LAD
- Вторую или третью диагональную ветвь артерии LAD обвести полипропиленовым швом (3-0) на конической игле. Извлеките иглу и проденьте оба конца полипропиленовой нити через небольшую виниловую трубку, чтобы образовалась петля.
- Поместите пластырь между петлей и коронарной артерией, чтобы не повредить коронарные артерии и/или не вызвать спазм сосудов при перевязке.
- С помощью щипцов Дебейки возьмите прямоугольный войлок из ПТФЭ (примерно 7 мм x 3 мм). Поместите залог между двумя полипропиленовыми нитями так, чтобы он был зажат между изолированной артерией LAD и виниловой трубкой при затягивании малого барабана.
- Срединная стернотомия (исследования без выживаемости)
ПРИМЕЧАНИЕ: Подход к срединной стернотомии идеально подходит для случаев, не связанных с выживанием, для которых может быть использован более инвазивный мониторинг с помощью LVDP и сономикрометрии.- Выполните срединную стернотомию изогнутыми ножницами Майо. Установите стернальный ретрактор и расширьте его, чтобы обеспечить адекватную визуализацию сердца и перикардиального мешка.
- Приподнимите перикард щипцами Дебейки, а перикард раскройте ножницами Метценбаума.
- Разместим три пьезоэлектрических кристалла сономикрометрии:
- Сделайте три небольших надреза по 1 мм на эпикарде ЛЖ, образуя углы треугольника. Поместите пьезоэлектрические кристаллы сономикрометрии внутрь надрезов эпикарда.
- Закрепите провода на поверхности сердца полипропиленовым U-образным швом 5-0. При записи с помощью сономикрометрии приостановите искусственную вентиляцию легких, чтобы обеспечить точную запись в течение двух-трех сердечных сокращений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если сердце фибриллирует, 1% лидокаин не эффективен, и необходима эпикардиальная дефибрилляция, выключите сономикрометр и отсоедините его от системы сбора данных, чтобы защитить оба от электрического ввода.
- Изоляция артерий LAD:
- Вторую или третью диагональную ветвь артерии LAD обвести полипропиленовым швом (3-0) на конической игле.
- Извлеките иглу и проденьте оба конца полипропиленовой нити через небольшую виниловую трубку, чтобы образовалась петля.
- Поместите пластырь между петлей и коронарной артерией, чтобы не повредить коронарную артерию и/или не вызвать спазм сосудов при перевязке.
- С помощью щипцов Дебейки возьмите прямоугольный войлок из ПТФЭ (примерно 7 мм x 3 мм). Поместите залог между двумя полипропиленовыми нитями так, чтобы он был зажат между изолированной артерией LAD и виниловой трубкой при затягивании малого барабана.
- Измерение LVDP:
- Поместите полипропиленовый U-образный стежок 5-0 в вершину LV. Сделайте небольшой надрез 1 мм лезвием 11 в вершине LV.
- Введите 3-х французский баллонный катетер в просвет LV. Закрепите катетер на ЛЖ, завязав его на полипропиленовый U-образный шовный шов 5-0.
- Подключите катетер к датчику, подключенному к монитору, для записи LVDP. Запишите LVDP с помощью системы сбора данных (описанной ниже). Обнулите катетер для регистрации гемодинамических параметров, открыв трехходовой запорный кран в воздух и прицелив монитор.
- Система сбора данных
- Запустите систему сбора данных (см. Таблицу материалов) на используемом компьютере/ноутбуке. Подключите провод от монитора к компьютеру/ноутбуку.
- Выберите канал 1 в системе сбора данных и назовите его LVDP. Обнулите датчик с помощью монитора.
ПРИМЕЧАНИЕ: При подключении БП и ЧСС к системе сбора данных выполните тот же процесс: подключите провод к ноутбуку, выберите Канал и ноль при измерении АД.
- Окклюзируйте коронарную артерию, затянув петлю, надавливая на виниловую трубку, одновременно натягивая полипропиленовые нити шовного материала. Поддерживайте желаемую герметичность с помощью зажима от комаров, непосредственно зажимая трубку и фиксируя ее на месте.
- Подтверждают ишемию миокарда визуально регионарным цианозом эпикарда. Регионарная ишемия также может быть подтверждена на ЭКГ при наличии сегмента ST и изменениях зубца Т.
- После визуального подтверждения индуцируют регионарную ишемию в течение 30 мин под наркозом.
- Через 0 мин, 10 мин, 20 мин и 30 мин во время регионарной ишемии оценивают ФС с помощью 2D ЭХО как для случаев выживаемости, так и для случаев невыживаемости.
- Непрерывно оценивайте LVDP и сономикрометрию в предишемическом времени, времени ишемии миокарда и постишемическом времени для случаев невыживаемости.
- При необходимости разграничьте зону риска, снова перевязав артерию полипропиленовым швом, оставленным на месте. Пережмите аорту и введите пигмент Monastral Blue 98% (разбавленный 1:5 в PBS) через аорту с помощью кардиоплегической иглы. Перфузионные участки миокарда окрашиваются в синий цвет, а область, подверженная риску, остается неокрашенной.
- Постоянно контролируйте и регистрируйте ЧСС, АД и насыщениеO2 .
- Дайте животному восстановиться в течение 2 ч (невыживаемость) или 28 дней (выживаемость).
ПРИМЕЧАНИЕ: ЭКГ может быть использована для подтверждения реперфузии. Хотя гипокалиемия не наблюдалась в эксперименте, проведенном в этом исследовании, она часто может возникать во время реперфузии и может быть скорректирована с помощью контроля калия или соответствующей инфузии.
- Заключение процедуры
- Случаи выживания
- В случае выживания обрежьте полипропиленовую нить 3-0, используемую для силка, неплотно свяжите концы вместе и оставьте на месте. Определите зону риска и зону инфаркта полипропиленовой нитью 3-0.
- После завершения процедуры закройте разрез в три слоя.
- Закройте первый слой, завязав два стежка 2-0 полиглактин 910 в форме восьмерки вокруг ребер.
- Закройте мышечный и подкожный слои полидиоксаноновым швом 3-0 на ходу.
- Закройте кожу подкожно, используя монофиламентный шов 5-0. Используйте скрытый ходовой шов, чтобы свести к минимуму раздражение, которое чувствует животное.
- Откачайте плевральный воздух, выполнив торакоцентез иглой.
- Наложите трансдермальный пластырь с фентанилом на 72 часа, чтобы облегчить послеоперационное обезболивание.
- Выполните трансторакальную эхокардиографию через 1 неделю и 2 недели после операции, чтобы оценить тенденции в ФС.
- После заданного периода восстановления успокоите, интубируйте и обезболивайте животное, как указано выше. Выполнить срединную стернотомию. Обнажают и вскрывают перикардиальный мешок. Усыпите кролика под глубоким наркозом, удалив сердце целиком, позволив животному умереть путем обескровливания.
- Случаи, не связанные с выживанием
- После эксперимента и убедившись в глубоком обезболивании, полностью обнажите сердце, и удалите его единым блоком для биохимического и тканевого анализа. Животное умирает путем обескровливания.
- Случаи выживания
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В соответствии с протоколом (рис. 1) ишемия миокарда была подтверждена сразу при прямой визуализации цианоза эпикарда.
Стандартные ЭКГ (три отведения: I, II и III и три компьютерных аугментированных отведения: aVL, aVR и aVF) регистрировались непрерывно в преишемию, во время ишемии и при реперфузии (рис. 2). На ЭКГ выявлены тахикардия, аритмии (фибрилляция желудочков), дефекты проводящей системы (блокада ножек пучка Гиса), развитие индфаркт-ассоциированных зубцов Q и отклонение сегмента ST23.
При регионарной ишемии регионарная гипокинезия наблюдалась непосредственно невооруженным глазом в средней полости передней стенки во всех сердцах, что соответствовало области перфузии артерии LAD, которая была ишемизирована из-за ограничения кровотока с временным захватом LAD. Как в выживаемых, так и в невыживаемых случаях показания 2D ЭХО были получены во время предишемии, непосредственно перед индуцированием регионарной ишемии, и в разные моменты времени во время эксперимента: 5 мин, 10 мин, 15 мин, 30 мин, 60 мин и 120 мин. Конечные диастолические размеры левого желудочка (LVEDD) и конечного систолического размера левого желудочка (LVESD) измеряли с помощью ЭХО M-режима под 2D-контролем на максимальной и минимальной окружности ЛЖ соответственно. Регионарную сократительную способность стенки ЛЖ в зоне ишемии миокарда оценивали по короткоосевым изображениям ЛЖ с использованием М-режима, при этом линия курсора перекрывала зону риска. Дробное укорачивание (ФС) рассчитывали по следующей формуле: ФС = (ЛВЭДД − ЛВЭД)/ЛВЕДД × 10024. Результаты показали, что фракционное укорочение уменьшилось в течение ишемического и постишемического времени по сравнению с доишемическим временем (рис. 3)
Чтобы количественно оценить степень повреждения миокарда, размер инфаркта можно измерить биохимически с помощью окрашивания трифенилтетразолием хлорида (TTC) (Sigma Chemical Co., Сент-Луис, Миссури). В этой работе область, подверженная риску, была очерчена путем перевязки пораженной артерии путем перевязывания оставшегося на месте шва Prolene. Аорта была пережата, и пигмент Monastral Blue (разбавленный 1:5 в PBS) был доставлен через аорту с помощью кардиоплегической иглы. Участки перфузионного миокарда были окрашены в синий цвет, а область риска оставалась неокрашенной из-за перевязки артерии.
Сердце разрезали поперек длинной оси левого желудочка, от вершины до основания, на поперечные срезы толщиной 1 см, помещали между стеклянными пластинами и сжимали бульдожьими зажимами. Область риска для каждой стороны каждого участка была прослежена на прозрачном ацетатном листе. Срезы сердца инкубировали в темном контейнере с 1% ТТС в фосфатном буфере (рН 7,4) при 38 °C в течение 20 мин. Затем срезы сердца хранили в 10% растворе формальдегида в течение 24 ч перед окончательными измерениями для улучшения визуализации зоны инфаркта. Секции помещались между стеклянными пластинами и сжимались бульдожьими зажимами. О некрозе миокарда свидетельствовал белый участок на ткани миокарда, а на кирпично-красных участках видна жизнеспособная ткань. (Рисунок 4) Инфарктные участки (белые) в пределах областей риска с каждой стороны каждого участка были прослежены на прозрачном ацетатном листе. Планиметрия использовалась для измерения зоны риска и зоны инфаркта. Объемы зоны риска и зоны инфаркта рассчитывались путем умножения планиметрических площадей на толщину среза. Объем инфаркта выражали в процентах от общего объема ЛЖ для каждого сердца25. Рассчитывали отношение площади риска к весу ЛЖ, а размер инфаркта выражали в процентах от площади риска. Наша предыдущая работа показала, что после 2 ч и 28 дней выздоровления зоны риска (т.е. в процентах от массы ЛЖ) составляли примерно 29% и 27% соответственно как для митохондриальной, так и для контрольной групп Однако через 2 ч и 28 дней после выздоровления размер инфаркта (т.е. размер/площадь инфаркта риска) в митохондриальных сердцах составлял 9,8% и 7,9%. соответственно по сравнению с 37% и 34% в контрольных сердцах26. Кроме того, в наших предыдущих экспериментах фракционное укорочение и LVDP были снижены в контрольной группе до 50%-60% и 70%-80% соответственно по сравнению с исходным уровнем.
Рисунок 1: Диаграмма протокола. Протокол может быть скорректирован в зависимости от потребностей эксперимента как для случаев выживания, так и для случаев, не связанных с выживанием. Случаи, не связанные с выживаемостью, могут быть выполнены с помощью более инвазивного хирургического подхода с использованием срединной стернотомии, что позволяет использовать кристаллы сономикрометрии, эпикардиальную эхокардиографию (ЭХО) и катетер ЛЖ для измерения фракционного укорочения и LVDP. В случаях выживаемости, при которых необходимо рассмотреть возможность заживления разреза и обезболивания, может быть выполнена левая миниторакотомия, а функция миокарда может быть оценена в разные моменты времени в течение более длительного периода исследования с помощью 2D ECHO. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативная электрокардиограмма (лимб II и вычисленный аЛЛ с аугментированным отведением) до индукции регионарной ишемии, во время ишемического времени и во время реперфузии. Милливольтная и миллисекундная шкалы показаны слева. Точки времени и момент защемления левой передней нисходящей артерии показаны внизу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Эхокардиографическая оценка сердца путем измерения фракционного укорочения (ФС). Фракционное укорочение измеряли путем получения конечного диастолического расстояния левого желудочка и конечного систолического расстояния левого желудочка с 2D-управляемым М-режимом на максимальной и минимальной окружностях ЛЖ соответственно. Фракционное укорочение оценивали на (А) исходном/предишемическом уровне, (В) во время временного захвата левой передней нисходящей артерии (LAD) с линией курсора, перекрывающей область риска, и (C) во время реперфузии после отпускания петли на LAD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные изображения размера инфаркта для сердца, окрашенного 1% трифенилтетразолием хлоридом после 30 мин индуцированной регионарной ишемии миокарда. Жизнеспособная ткань видна красным цветом, в то время как инфаркт виден как белая область. Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наш протокол демонстрирует надежную методику выполнения острой регионарной ишемии миокарда у кролика. Левосторонняя миниторакотомия идеально подходит для случаев выживания, в которых разрез и связанная с ним боль должны быть сведены к минимуму. Важно отметить, что диуретическая терапия не была необходима до экстубации, и не было смертности интраоперационно в группе без выживания или через 4 недели после операции в группе выживаемости. Когда разработка протокола требует случая, не связанного с выживанием, или когда необходим более детальный мониторинг глобальной и регионарной функции миокарда, может быть использована срединная стернотомия (рис. 1).
Наиболее важными этапами протокола являются осторожное обхватывание LAD конической иглой, не повреждая артерию и не создавая венозного кровотечения, а также окклюзия LAD для создания постоянной зоны риска.
Некоторые осложнения, которые могут возникнуть при выполнении описанной операции, - это перерастяжение легких во время искусственной вентиляции легких из-за большого дыхательного объема, кровотечение из-за повреждения LAD, кровотечение на фоне повреждения межреберного сосуда, которое обычно возникает при входе или в результате манипуляций с ретрактором, и/или сердечная аритмия (интраоперационная фибрилляция желудочков) с перевязкой LAD. Также могут возникнуть другие послеоперационные осложнения, такие как инфекция в области хирургического вмешательства, плохая мобилизация животного из-за боли и/или остаточная регионарная гипокинезия миокарда. Несмотря на то, что частота этих осложнений очень низкая, исследователь должен быть в состоянии быстро и эффективно их устранить.
Кролики представляют собой отличную животную модель для исследования миокарда. Их частота сердечных сокращений аналогична частоте сердечных сокращений человека, а их размер достаточно мал, но позволяет проводить гистологический анализ под оптическим микроскопом.
Следует признать ограниченность данного исследования; В частности, сердце кролика меньше и клинически менее значимо для сравнения с человеческим сердцем, чем сердце других крупных животных, таких как свинья.
В связи с частотой и распространенностью сердечно-сосудистых заболеваний наличие животной модели, моделирующей регионарную ишемию миокарда, имеет первостепенное значение. Эта методология может иметь множество применений и доказала свою полезность в моделях повреждения сосудов, хронической ишемии миокарда и коротких периодов оглушения миокарда 27,28,29,30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конфликтах интересов, финансовых или иных.
Acknowledgments
Оригинальное исследование, в котором использовался этот протокол, было поддержано грантами Национального института сердца, легких и крови HL-103642 и HL-088206
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 blade | Bard Parker | 371210 | |
| #11 blade | Fisher Scientific | B3L | |
| 22 G PIV needle | BD Insyte | 381423 | |
| Acepromazine | VETONE | NDC 13985-587-50 | 0.5 mg/kg IM and IV |
| Aline pressure bag | Infu-Stat | 2139 | |
| Angiocath | Becton Dickinson | 382512 | |
| Arterial Catheter | Teleflex | MC-004912 | |
| Atropine | Hikma Pharmaceuticals | NDC 0641-6006-01 | 0.01 mg/kg IM |
| Betadine and 70% isopropyl alcohol | McKesson | NDC 68599-2302-6 | |
| Blood gas machine | Siemens | MRK0025 | |
| Bovie | Valleylab | E6008 | |
| Bulldog clamps | World Precision Instruments | 14119 | |
| Bupivacaine | Auromedics | NDC 55150-249-50 | 3 mg/kg IM |
| Butorphanol | Roxane | NDC 2054-3090-36 | 0.5 mg/kg IM |
| Clear acetate sheet | Oxford Instruments | ID 51-1625-0213 | |
| Clipers | Andis | AGC2 | |
| DeBakey forceps | Integra | P6280 | |
| Echocardiography machine | Philips | IE33 F1 | |
| Electrocardiography machine | Meditech | MD908B | |
| Endotracheal tube | Medline | #922774 | |
| Fentanyl | West-Ward | NDC 0641-6030-01 | 1–4 µg/kg transdermal patch |
| Formaldehyde solution 10% | Epredia | 94001 | |
| Glass plates | United Scientific | B01MUHX6MR | |
| Heparin Sodium | Sagent | NDC 69-0058-02 | 1000U in 1 mL 3 mg/kg |
| Hot water blanket | 3M | 55577 | |
| Isoflurane | Penn Veterinary Supply, INC | NDC 50989-606-15 | 1%–3% |
| Ketamine | Dechra | NDC 42023-138-10 | 10 mg/kg IV |
| Lab Chart 7 Acquisition Software | Adinstruments | ||
| Lactated Ringer's solution | ICUmedical | NDC 0990-7953-09 | 10 mL/kg/h |
| Laryngoscope | Welch Allyn | 68044 | |
| Left ventricule lumen catheter 3Fr | McKesson | 385764-EA | |
| Lidocaine (1%) | Pfizer | 4276-01 | 1–1.5 mL/kg IV |
| LVDP transducer | Edward | PDP-ED | |
| Marking pen | Viscot | 1451SR-100 Unsterile | |
| Mayo scissors | Mayo | S7-1098 | |
| Medetomidine | Entireoly Pets Pharmacy | NDC 015914-005-01 | 0.25 mg/kg IM |
| Metzenbaum scissors | Cole-Parmer | UX-10821-05 | |
| Monastra. Blue pigment 98% | Chemsavers | MBTR1100G | |
| Monocryl 5-0 | Ethicon | Y463G | |
| Mosquito clamp | Shioda | 802N | |
| PDS 3-0 | Ethicon | 42312201 | |
| Piezoelectric sonomicrometry crystals | Sonometrics | Small 2mm round | |
| Plegets | DeRoyal | 32-363 | |
| Povuine Iodine Prep Solutions | Medline | MDS093940 | |
| Precision vaporized system face mask | Yuwell | B07PNH69BF | |
| Prolene 3-0 | Ethicon | 8665G | |
| Proline 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Pulse oximetry probe | Masimo | 9216-U | |
| Rib spreader | Medline | MDS5621025 | |
| S12 Pediatric Sector Probe | Phillips | 21380A | |
| Sonomicrometer | Sonometrics | BZ10123724 | |
| Sterile gauze | Medline | 3.00802E+13 | |
| Sterile towels | McKesson | MON 277860EA | |
| Sternal retractor | Medline | MDS5610321 | |
| Sutures for closure | J&J Dental | 8698G | |
| Telemetriy monitor | Meditech | MD908B | |
| Temperature probe | Omega | KHSS-116G-RSC-12 | |
| Triphenyl tetrazolium chloride (1%) | Millipore | MFCD00011963 | |
| Ventilator | MedGroup | MSLGA 11 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | V635H | |
| Vinyl tubing | ABE | DISW 3001 |
References
- Selvin, E., Erlinger, T. P. Prevalence of and risk factors for peripheral arterial disease in the United States: Results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2000. Circulation. 110 (6), 738-743 (2004).
- Bolli, R., et al. Myocardial protection at a crossroads: The need for translation into clinical therapy. Circulation Research. 95 (2), 125-134 (2004).
- Cohn, J. N., et al. Report of the National Heart, Lung, and Blood Institute Special Emphasis Panel on Heart Failure Research. Circulation. 95 (4), 766-770 (1997).
- Rousou, A. J., Ericsson, M., Federman, M., Levitsky, S., McCully, J. D. Opening of mitochondrial KATP channels enhances cardioprotection through the modulation of mitochondrial matrix volume, calcium accumulation, and respiration. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (5), H1967-H1976 (2004).
- Rao, V., et al. Insulin cardioplegia for elective coronary bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 119 (6), 1176-1184 (2000).
- Vinten-Johansen, J., Zhao, Z. Q., Jiang, R., Zatta, A. J. Myocardial protection in reperfusion with postconditioning. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 3 (6), 1035-1045 (2005).
- Wakiyama, H., et al. Selective opening of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels during surgically induced myocardial ischemia decreases necrosis and apoptosis. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 21 (3), 424-433 (2002).
- Chen, Q., Moghaddas, S., Hoppel, C. L., Lesnefsky, E. J. Reversible blockade of electron transport during ischemia protects mitochondria and decreases myocardial injury following reperfusion. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 319 (3), 1405-1412 (2006).
- Lesnefsky, E. J., et al. rather than reperfusion, inhibits respiration through cytochrome oxidase in the isolated, perfused rabbit heart: Role of cardiolipin. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), H258-H267 (2004).
- McCully, J. D., Rousou, A. J., Parker, R. A., Levitsky, S. Age- and gender-related differences in mitochondrial oxygen consumption and calcium with cardioplegia and diazoxide. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (3), 1102-1109 (2007).
- Mandel, I. A., et al. Influence of hypoxic and hyperoxic preconditioning on endothelial function in a model of myocardial is-chemia-reperfusion injury with cardiopulmonary bypass (Experimental study). International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5336 (2020).
- Ali, Z. A., et al. Remote ischemic preconditioning reduces myocardial and renal injury after elective abdominal aortic aneurysm repair: A randomized controlled trial. Circulation. 116, 98-105 (2007).
- Pogwizd, S. M., Bers, D. M.
- Tanaka, K., Hearse, D. J. Reperfusion-induced arrhythmias in the isolated rabbit heart: characterization of the influence of the duration of regional ischemia and the extracellular potassium concentration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 20 (3), 201-211 (1988).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Gupta, M. P. Factors controlling cardiac myosin-isoform shift during hypertrophy and heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43 (4), 388-403 (2007).
- Lapierre, H., Chan, V., Sohmer, B., Mesana, T. G., Ruel, M. Minimally invasive coronary artery bypass grafting via a small thoracotomy versus off-pump: A case-matched study. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 40 (4), 804-810 (2011).
- Aubin, H., Akhyari, P., Lichtenberg, A., Albert, A. Additional right-sided upper "half-mini-thoracotomy" for aortocoronary bypass grafting during minimally invasive multivessel revascularization. Journal of Cardiothoracic Surgery. 10, 130 (2015).
- Hu, N., et al. Ligation of the left circumflex coronary artery with subsequent MRI and histopathology in rabbits. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (6), 838-844 (2010).
- Sievers, R. E., et al. A model of acute regional myocardial ischemia and reperfusion in the rat. Magnetic Resonance in Medicine. 10 (2), 172-181 (1989).
- Rodríguez, B., Trayanova, N., Noble, D.
- Sinusas, A. J., et al. Quantification of area at risk during coronary occlusion and degree of myocardial salvage after reperfusion with technetium-99m methoxyisobutyl isonitrile. Circulation. 82 (4), 1424-1437 (1990).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Pombo, J. F., Troy, B. L., Russell, R. O. J. Left ventricular volumes and ejection fraction by echocardiography. Circulation. 43 (4), 480-490 (1971).
- McCully, J. D., Wakiyama, H., Hsieh, Y. J., Jones, M., Levitsky, S. Differential contribution of necrosis and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), H1923-H1935 (2004).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 304 (7), 966-982 (2013).
- Abarbanell, A. M., et al. Animal models of myocardial and vascular injury. Journal of Surgical Research. 162 (2), 239-249 (2010).
- Pirat, B., et al. A novel feature-tracking echocardiographic method for the quantitation of regional myocardial function: Validation in an animal model of ischemia-reperfusion. Journal of the American College of Cardiology. 51 (6), 651-659 (2008).
- Verdouw, P. D., vanden Doel, M. A., de Zeeuw, S., Duncker, D. J. Animal models in the study of myocardial ischaemia and ischaemic syndromes. Cardiovascular Research. 39 (1), 121-135 (1998).
- Bolukoglu, H., et al. An animal model of chronic coronary stenosis resulting in hibernating myocardium. The American Journal of Physiology. 263, H20-H29 (1992).
- Heyndrickx, G. R., Millard, R. W., McRitchie, R. J., Maroko, P. R., Vatner, S. F. Regional myocardial functional and electrophysiological alterations after brief coronary artery occlusion in conscious dogs. Journal of Clinical Investigation. 56 (4), 978-985 (1975).
