Summary
O presente estudo demonstra um modelo animal altamente reprodutível de lesão aguda de isquemia e reperfusão miocárdica regional em coelhos, utilizando uma minitoracotomia esquerda para casos de sobrevida ou uma esternotomia mediana para casos de não sobrevida.
Abstract
O protocolo aqui fornece uma metodologia simples e altamente replicável para induzir isquemia miocárdica regional aguda in situ em coelhos para experimentos de não sobrevida e sobrevida. O coelho adulto branco da Nova Zelândia é sedado com atropina, acepromazina, butorfanol e isoflurano. O animal é intubado e colocado em ventilação mecânica. Um cateter intravenoso é inserido na veia marginal da orelha para a infusão de medicamentos. O animal é pré-medicado com heparina, lidocaína e solução de Ringer com lactato. Um corte carotídeo é realizado para obter acesso à linha arterial para monitorização da pressão arterial. Parâmetros fisiológicos e mecânicos selecionados são monitorados e registrados por análise contínua em tempo real.
Com o animal sedado e totalmente anestesiado, realiza-se uma quarta toracotomia no espaço intercostal, pequena toracotomia esquerda (sobrevida) ou esternotomia mediana (não sobrevida). O pericárdio é aberto e a artéria descendente anterior (DAE) é localizada.
Uma sutura de polipropileno é passada ao redor do segundo ou terceiro ramo diagonal da artéria DAD, e o filamento de polipropileno é rosqueado através de um pequeno tubo de vinil, formando uma alça. O animal é submetido a 30 min de isquemia regional, conseguida pela oclusão da DA pelo aperto da alça. A isquemia miocárdica é confirmada visualmente pela cianose regional do epicárdio. Após a isquemia regional, a ligadura é solta e o coração é reperfundido.
Tanto para experimentos de sobrevida quanto para não sobrevida, a função miocárdica pode ser avaliada por meio de uma medida ecocardiográfica (ECO) da fração de encurtamento. Para estudos de não sobrevida, os dados da ultrassonometria coletada com três sondas ultrassônicas piezelétricas digitais implantadas na área isquêmica e a pressão desenvolvida do ventrículo esquerdo (PDVE) com cateter de inserção apicamente no ventrículo esquerdo (VE) podem ser continuamente adquiridos para avaliação da função miocárdica regional e global, respectivamente.
Para estudos de sobrevida, a incisão é fechada, uma toracocentese com agulha esquerda é realizada para evacuação com ar pleural e o controle da dor pós-operatória é alcançado.
Introduction
As doenças cardiovasculares são a principal causa de morte no mundo e contribuem para mais de 18 milhões de mortes a cada ano 1,2,3. O infarto agudo do miocárdio (IM) é uma emergência médica comum que se desenvolve quando um coágulo sanguíneo ou um pedaço de placa ateromatosa bloqueia o fluxo sanguíneo de uma artéria coronária. Isso causa isquemia miocárdica regional no território que a artéria perfunde.
O presente estudo descreve um protocolo que utiliza uma metodologia simples e confiável para criar isquemia miocárdica regional aguda in situ em um modelo de coelho para experimentos de não sobrevida e sobrevida. O objetivo inicial desse método era avaliar os efeitos do transplante mitocondrial na modulação da necrose miocárdica e no aumento da função cardíaca pós-isquêmica após um evento isquêmico. Pesquisas anteriores demonstraram a ocorrência de alterações mitocondriais e um rápido declínio nos níveis de fosfato de alta energia após o início da isquemia e redução da oferta de oxigênio, resultando em uma drástica diminuição dos estoques de energia cardíaca4. Investigadores têm tentado melhorar a função pós-isquêmica e diminuir a necrose do tecido miocárdico por meio de intervenções farmacológicas e/ou técnicas de procedimentos, mas essas técnicas fornecem cardioproteção limitada e têm impacto mínimo no dano e disfunção mitocondrial 5,6,7. Nossa equipe e outros demonstraram anteriormente que o dano mitocondrial ocorre primariamente durante a isquemia e que a recuperação contrátil pode ser aumentada e o tamanho do infarto do miocárdio diminuído com a preservação da função respiratória mitocondrial durante a reperfusão 8,9,10. Assim, levantamos a hipótese de que o transplante mitocondrial de tecidos não afetados pela isquemia para a área de isquemia prévia à reperfusão forneceria uma abordagem alternativa para reduzir a necrose miocárdica e melhorar a função miocárdica. Neste artigo, detalhamos o protocolo utilizado para testar essa teoria e os resultados representativos obtidos em nossa análise inicial do estudo.
Além disso, vários pesquisadores têm se concentrado em outros tópicos essenciais para definir o impacto da lesão de isquemia-reperfusão miocárdica e estabelecer intervenções terapêuticas apropriadas. Uma dessas áreas de pesquisa é a do pré-condicionamento. O pré-condicionamento isquêmico miocárdico é um mecanismo cardioprotetor ativado por estresse isquêmico breve que resulta em redução da taxa de necrose das células cardíacas durante episódios subsequentes de isquemia prolongada. Esses mecanismos podem ser ativados por hipóxia ou oclusão coronariana. demonstraram que o pré-condicionamento hipóxico-hiperóxico ajudou a manter o equilíbrio dos metabólitos do óxido nítrico, reduziu a hiperprodução de endotelina-1 e apoiou a proteção de órgãos11. Além disso, o conceito de pré-condicionamento isquêmico remoto, um fenômeno pelo qual o pré-condicionamento de órgão único fornece proteção sistêmica, tem sido explorado. Ali e col. verificaram que, em pacientes submetidos à correção eletiva de aneurisma aberto de aorta abdominal, o pré-condicionamento remoto, realizado pelo pinçamento intermitente da artéria ilíaca comum para servir de estímulo, reduziu a incidência de lesão miocárdica pós-operatória, infarto do miocárdio e comprometimento renal12.
Modelos em coelhos oferecem vantagens potenciais sobre modelos com outras espécies e têm sido utilizados em múltiplos cenários diferentes há décadas, incluindo indução de arritmias, modelos isquêmicos globais e regionais, pesquisa de contração cardíaca, entre outros13,14,15. Embora o coração de coelho seja menor que o de um cão ou porco, ele é grande o suficiente para realizar procedimentos cirúrgicos com facilidade e custo muito menor13. O coração de coelho é frequentemente usado, pois se assemelha ao coração humano; De fato, tem taxa metabólica semelhante, expressa cadeia pesada de β-miosina e carece de significativa xantina oxidase miocárdica16. A técnica aqui descrita para induzir isquemia miocárdica regional é simples, repetível e custo-efetiva. Esse método permite tanto casos de não sobrevida quanto de sobrevida, pois apenas isquemia regional é induzida e não isquemia global, e os materiais necessários não são especializados. Duas abordagens cirúrgicas diferentes (esternotomia e minitoracotomia) podem ser utilizadas, proporcionando maior liberdade ao operador e aos protocolos experimentais quanto ao desenho do estudo. Além disso, o procedimento dispensa o uso de circulação extracorpórea. Nesse contexto, abordagens minimamente invasivas de revascularização miocárdica têm se tornado alternativas valiosas para pacientes que necessitam de revascularizaçãomultiarterial17,18. Esse modelo poderia ser usado para estudar as diferenças entre essas abordagens e fornecer uma ferramenta de aprendizado baseada em animais para estagiários de cirurgia. Além disso, a realização de cateterismo cardíaco utilizando esse modelo pode ser útil para pesquisa fisiológica e/ou treinamento cirúrgico.
Nosso modelo fornece uma metodologia para aplicações em que a indução de isquemia miocárdica regional e, posteriormente, a mensuração do tamanho do infarto, da função miocárdica e das alterações celulares são importantes. Com esse protocolo, pudemos avaliar vários marcadores de função celular e adaptação à isquemia e a intervenção terapêutica proposta (i.e., transplante mitocondrial) examinando a internalização de organelas, o consumo de oxigênio, a síntese de fosfato de alta energia e a indução de mediadores de citocinas e vias proteômicas. Esses desfechos são importantes na preservação da energia miocárdica, da viabilidade celular e da função cardíaca e permitem a avaliação objetiva de técnicas cardioprotetoras após lesão de isquemia-reperfusão. Esse modelo poderia ser usado para estudar vias biológicas semelhantes e alternativas no campo da patologia e recuperação miocárdica pós-isquêmica.
O objetivo deste protocolo é fornecer uma metodologia altamente reprodutível para induzir isquemia miocárdica regional aguda in situ em coelhos para experimentos de não sobrevida e sobrevida. Esse modelo fornece uma metodologia com alta sobrevida, baixa mortalidade intraoperatória e morbidade mínima19. Outros modelos de isquemia miocárdica regional aguda têm sido descritos utilizando materiais radiomarcados, contrastes, ressonância magnética ou simulações computacionais20,21,22. Nosso protocolo fornece uma metodologia confiável e simples, que é custo-efetiva, consistentemente reprodutível, tem baixa demanda técnica e, portanto, pode ser realizada por investigadores sem experiência cirúrgica. Este protocolo acomoda um projeto de sobrevida usando uma minitoracotomia esquerda ou um modelo de não sobrevida usando uma esternotomia mediana.
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Protocol
Esta investigação foi conduzida de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health sobre cuidados e uso de animais e foi aprovada pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Boston Children's Hospital (Protocolo 20-08-4247R). Todos os animais receberam cuidados humanizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Espécie animal, agentes anestésicos e analgésicos
- Espécie animal: Use coelhos brancos da Nova Zelândia (cepa selvagem; sexo feminino; sexualmente maduro 15-20 semanas de idade; 3-4 kg de peso corporal) para estudos experimentais.
- Anestésicos e analgésicos:
- Usar atropina na dose de 0,01 mg/kg por via intramuscular (IM)
- Utilizar acepromazina na dose de 0,5 mg/kg IM para sedação inicial e 0,5 mg/kg intravenosa (IV) para anestesia total.
- Use butorfanol na dose de 0,5 mg/kg IM.
- Utilizar isoflurano através de máscara facial de sistema vaporizado de precisão a 3% para indução, seguida de intubação a 1%-2%, oxigênio (O2) a 100% a 2 L/min e anestesia geral a 1% para manutenção.
- Use medetomidina na dose de 0,25 mg/kg IM.
- Use cetamina na dose de 10 mg/kg EV.
- Utilizar bloqueio intercostal com bupivacaína no local da toracotomia na dose não superior a 3 mg/kg IM.
- Use lidocaína a 1% na dose de 1-1,5 mL/kg IV.
- Use um adesivo transdérmico de fentanil 1-4 μg/kg por 72 h.
2. Etapas processuais (Figura 1)
- Sedar coelhos adultos brancos da Nova Zelândia com uma única injeção IM combinada de atropina, acepromazina e butorfanol. Induzir o animal com isoflurano a 3% através de uma máscara facial de sistema vaporizado de precisão.
- Preparo antes da intubação endotraqueal cega (ou seja, sem visualização da glote)
- Borrifar a laringe com lidocaína a 1% para prevenir laringoespasmo.
- Pré-medir o comprimento do tubo endotraqueal (TET) na parte externa do coelho, desde os dentes até a carina prevista, e coloque o coelho em decúbito esternal com o pescoço estendido.
- Intubar o animal com um teto pediátrico com balonete (3-0 ou 3-5 de diâmetro interno) sob anestesia inalatória contínua a 1%-2% e O 2 a 100% a2 L/min.
- Insira o TET na boca e direcione-o além do toro para a faringe.
- Avançar o TET até que a ponta do tubo entre em contato com a glote ou os sons respiratórios sejam perdidos, indicando que a ponta do tubo passou pela abertura glótica.
- Retire ligeiramente o tubo até que os sons respiratórios sejam recuperados e, em seguida, volte a avançar novamente e prenda o tubo no lugar.
- Ventilar o animal com suporte mecânico (volume corrente: 10 mL/kg, fração inspirada de O 2: 40%, frequência respiratória: 30-40 ciclos/min, pressão positiva expiratória final: 5-10 cmH2O).
- Ajustar a FiO2 conforme tolerado para atingir uma saturação de O2 maior que 92% medida pela oximetria de pulso para prevenir a hiperóxia, que pode provocar uma resposta inflamatória sistêmica.
- Verificar o posicionamento adequado do TET por meio de exame físico (ausculta), sinais clínicos (observação de condensação no final do tubo endotraqueal) e medidas objetivas (dióxido de carbono expirado).
- Após aproximadamente 10 minutos, administrar uma injeção IM de medetomidina no coelho para proporcionar efeitos anestésicos e analgésicos simultâneos.
- Manter a anestesia geral com isoflurano a 1% durante todo o procedimento cirúrgico.
- Insira um cateter IV de 22 G na veia marginal da orelha e fixe-o com fita adesiva para obter acesso IV periférico.
OBS: A veia femoral pode ser utilizada como sítio alternativo de acesso venoso.- Anestesiar totalmente o animal com acepromazina IV e cetamina IV.
- Antes da incisão, injetar 1.000 U/mL de heparina na dose de 3 mg/kg EV.
- Administrar inicialmente 1.000 U/mL de heparina na dose de 3 mg/kg e redosar de hora em hora até o final do experimento para manter um tempo de coagulação ativado de >400 s, de acordo com o protocolo cirúrgico atual.
- Administrar lidocaína a 1% IV e/ou desfibrilação epicárdica assincronizada, conforme necessário, se ocorrer fibrilação ventricular durante a cirurgia. A fibrilação ventricular geralmente pára com uma ou duas doses de lidocaína.
- Perfundir solução de Ringer com lactato continuamente a 10 mL/kg/h.
OBS: Dado o pequeno volume de fluidos administrados e os curtos tempos operatórios, os animais em estudos de sobrevivência neste trabalho não necessitaram de diurese antes da extubação ou durante o período de recuperação. Se o animal desenvolver uma piora do estado pulmonar (ou seja, aumento das configurações do ventilador, evidência de edema pulmonar na ausculta, etc.), a diurese é aconselhada.
- Realizar um corte carotídeo e colocar uma linha arterial de 4 ou 5 French para facilitar a monitorização intraoperatória da pressão arterial (PA).
OBS: A artéria femoral pode ser utilizada como sítio alternativo de acesso arterial. - Monitorar e registrar todas as variáveis fisiológicas e mecânicas por meio de análise contínua em tempo real.
- Monitorar a PA arterial com a linha arterial carotídea e registrar a saturação de O2 usando oximetria de pulso através de um sensor colocado em uma pata raspada.
- Monitor com eletrocardiograma (ECG) com três derivações de membros: I, II e III, e três derivações aumentadas computadorizadas: aVL, aVR e aVF.
- Registrar os traçados de ECG na linha de base pré-isquêmica, durante a isquemia, durante a reperfusão e em série durante os dias 7-28 de recuperação (se estiver realizando um estudo de sobrevida).
- Monitorar o nível de sedação por meio da monitorização contínua da PA e da frequência cardíaca (FC).
- Monitore a temperatura com uma sonda retal.
- Utilizar ECO 2D nas incidências paraesternal e apical esquerda para avaliar a função miocárdica nos momentos desejados tanto nos casos de sobrevida quanto nos casos de não sobrevida.
- Avaliar a função miocárdica por meio da fração de encurtamento (EF) medindo-se a distância diastólica final do ventrículo esquerdo (DDVE) e a distância sistólica final do ventrículo esquerdo (DSVE) e utilizando a seguinte fórmula:
EF = (DDVE − DSVE)/DDVE × 100
- Avaliar a função miocárdica por meio da fração de encurtamento (EF) medindo-se a distância diastólica final do ventrículo esquerdo (DDVE) e a distância sistólica final do ventrículo esquerdo (DSVE) e utilizando a seguinte fórmula:
- Durante a cirurgia, coloque o animal em uma manta de água quente circulante para manter a temperatura corporal central estável.
- Prepare e esfregue o animal de forma estéril:
- Raspar o sítio cirúrgico e preparar com betadina e álcool isopropílico a 70%, cada um aplicado em triplicata. Seque a área com compressas de gaze estéreis e cubra todo o animal com toalhas estéreis.
- Minitoracotomia esquerda (estudos de sobrevida)
- Realizar bloqueio intercostal no local da toracotomia pré-determinado com bupivacaína IM.
- Administrar lidocaína a 1% IV através da veia auricular antes da incisão.
- Realizar uma minitoracotomia esquerda através do quarto espaço intercostal ao longo da porção superior da quinta costela para evitar o feixe neuromuscular, que está localizado paralelamente à superfície inferior de cada costela.
- Realizar uma toracotomia anterolateral para melhor visualização da superfície anterolateral do coração (ou seja, a localização anatômica dos ramos diagonais da DAD).
- Posicione o coelho com o lado esquerdo elevado aproximadamente 30° usando um travesseiro ou saco de feijão.
- Fixe a perna ipsilateral do coelho acima de sua cabeça para criar espaço tanto para o campo operatório quanto entre os espaços costais.
- Palpar e delinear os pontos de referência ósseos, incluindo as costelas, esterno e escápula, com uma caneta de marcação com ponta de feltro. Inciso a pele sobre a quinta costela usando uma lâmina #10. Certifique-se de que a incisão permaneça paralela à costela.
- Utilizar o eletrocautério para dividir o músculo peitoral maior e o músculo serrátil anterior. Divida os músculos intercosteiros logo acima da quinta costela com eletrocautério para preservar o feixe neurovascular.
- Entrar cautelosamente no espaço pleural através do quarto espaço intercostal com dissecção nítida ou romba. Estender a incisão pleural inicial paralela à costela em ambas as direções com dissecção nítida ou romba até que um espalhador de costelas ou afastador esternal possa ser inserido.
- Coloque um espalhador de costelas ou afastador esternal dentro do espaço costal e amplie para proporcionar visualização adequada do coração e do saco pericárdico. Levantar o pericárdio com pinça DeBakey e abrir o pericárdio com tesoura de Metzenbaum.
- Isolamento da artéria DA
- Circundar o segundo ou terceiro ramo diagonal da artéria LAD com uma sutura de polipropileno (3-0) sobre uma agulha de cone. Retire a agulha e rosqueie ambas as extremidades do filamento de polipropileno através de um pequeno tubo de vinil para formar uma armadilha.
- Coloque uma fenda entre a armadilha e a artéria coronária para evitar danificar a coronária e/ou causar vasoespasmo com a ligadura.
- Usando pinças DeBakey, pegue um plaço de feltro de PTFE retangular (aproximadamente 7 mm x 3 mm). Coloque a pelúcia entre os dois filamentos de polipropileno de modo que fique prensada entre a artéria LAD isolada e o tubo de vinil quando a armadilha for apertada.
- Esternotomia mediana (estudos de não sobrevida)
NOTA: A abordagem da esternotomia mediana é ideal para casos de não sobrevida, para os quais a monitorização mais invasiva com PDVE e ultrassonometria pode ser utilizada.- Realizar uma esternotomia mediana com tesoura Mayo curva. Colocar um afastador esternal e alargá-lo para proporcionar visualização adequada do coração e do saco pericárdico.
- Levantar o pericárdio com pinça DeBakey e abrir o pericárdio com tesoura de Metzenbaum.
- Colocação dos três cristais piezoelétricos de sonomicrometria:
- Faça três pequenos cortes de 1 mm no epicárdio do VE, formando os cantos de um triângulo. Coloque os cristais de sonomicrometria piezoelétrica dentro dos cortes epicárdicos.
- Fixe os fios à superfície cardíaca com um ponto em U de polipropileno 5-0. Ao gravar usando ultrassonomicrometria, pause a ventilação mecânica para permitir um registro preciso de dois a três batimentos cardíacos.
NOTA: Se os fibrilatos cardíacos, lidocaína a 1% não for eficaz, e a desfibrilação epicárdica for necessária, desligue o ultrassonomicrômetro e desconecte-o do sistema de aquisição de dados para proteger ambos da entrada elétrica.
- Isolamento da artéria DAD:
- Circundar o segundo ou terceiro ramo diagonal da artéria LAD com uma sutura de polipropileno (3-0) sobre uma agulha de cone.
- Retire a agulha e rosqueie ambas as extremidades do filamento de polipropileno através de um pequeno tubo de vinil para formar uma armadilha.
- Coloque uma fenda entre a armadilha e a artéria coronária para evitar danificar a artéria coronária e/ou causar vasoespasmo com a ligadura.
- Usando pinças DeBakey, pegue um plaço de feltro de PTFE retangular (aproximadamente 7 mm x 3 mm). Coloque a pelúcia entre os dois filamentos de polipropileno de modo que fique prensada entre a artéria LAD isolada e o tubo de vinil quando a armadilha for apertada.
- Mensuração da PDVE:
- Coloque um ponto em U de polipropileno 5-0 no ápice do VE. Faça uma pequena incisão de 1 mm com uma lâmina de 11 no ápice do VE.
- Insira um cateter-balão de 3 French na luz do VE. Fixar o cateter no VE amarrando-o ao ponto em U de polipropileno 5-0.
- Conecte o cateter ao transdutor conectado ao monitor para registrar a PDVE. Registre o LVDP usando o sistema de aquisição de dados (descrito abaixo). Zerar o cateter para registrar as variáveis hemodinâmicas abrindo a torneira de três vias para o ar e zerando no monitor.
- Sistema de aquisição de dados
- Inicie o sistema de aquisição de dados (consulte a Tabela de Materiais) no computador/laptop que está sendo usado. Conecte o fio do monitor ao computador/laptop.
- Selecione Canal 1 no sistema de aquisição de dados e nomeie-o LVDP. Zere o transdutor usando o monitor.
NOTA: Se conectar o BP e o HR ao sistema de aquisição de dados, siga o mesmo processo: conecte o fio ao laptop, selecione Canal e zero se medir o BP.
- Ocluir a artéria coronária apertando a armadilha pressionando o tubo de vinil enquanto puxa para cima os filamentos de sutura de polipropileno. Mantenha a estanqueidade desejada com uma braçadeira de mosquito, prendendo diretamente o tubo e fixando-o no lugar.
- Confirmar visualmente isquemia miocárdica pela cianose regional do epicárdio. A isquemia regional também pode ser confirmada no ECG com a presença de alterações do segmento ST e da onda T.
- Após confirmação visual, induzir isquemia regional por 30 min sob anestesia.
- Em 0 min, 10 min, 20 min e 30 min durante a isquemia regional, avaliar o FS por ECO 2D para os casos de sobrevida e não sobrevida.
- Avaliar a PDVE e a ultrassonometria continuamente durante o tempo pré-isquemia, tempo de isquemia miocárdica e tempo pós-isquêmico para os casos de não sobrevida.
- Se necessário, delinear a área de risco ligando a artéria novamente com o ponto de sutura de polipropileno deixado no lugar. Cruzar a aorta e injetar pigmento Azul Monastral 98% (diluído 1:5 em PBS) através da aorta usando uma agulha de cardioplegia. As áreas perfundidas do miocárdio ficarão azuis e a área de risco permanecerá sem manchas.
- Monitorar e registrar continuamente a FC, a PA e a saturação do Ø2 .
- Permitir que o animal se recupere por 2 h (não sobrevivência) ou 28 dias (sobrevivência).
NOTA: O ECG pode ser usado para confirmar a reperfusão. Embora não tenha sido observada no experimento realizado neste estudo, a hipocalemia pode ocorrer frequentemente durante a reperfusão e pode ser corrigida com controle de potássio ou infusão apropriada.
- Conclusão do procedimento
- Casos de sobrevida
- Em casos de sobrevivência, corte o fio de polipropileno 3-0 usado para a armadilha, amarre as extremidades e deixe-o no lugar. Identificar a área de risco e a zona de infarto pelo fio de polipropileno 3-0.
- Após o término do procedimento, fechar a incisão em três camadas.
- Feche a primeira camada amarrando dois pontos de poliglactina 910 2-0 ao redor das costelas.
- Fechar as camadas muscular e subcutânea com fio de polidioxanona 3-0 de forma corrida.
- Fechar a pele de forma subcuticular com sutura monofilamentar 5-0. Use uma sutura de corrida enterrada para minimizar a irritação sentida pelo animal.
- Evacuar o ar pleural realizando uma toracocentese com agulha.
- Aplicar um adesivo transdérmico de fentanil por 72 h para facilitar o controle da dor pós-operatória.
- Realizar ecocardiograma transtorácico nos períodos de 1 semana e 2 semanas de pós-operatório para avaliar as tendências do MCF.
- Após o período de recuperação pré-determinado, sedá, intuba e anestesia o animal como acima. Realizar esternotomia mediana. Expor e abrir o saco pericárdico. Eutanasiar o coelho sob anestesia profunda, removendo o coração em bloco, permitindo que o animal expire por exsanguinação.
- Casos de não sobrevida
- Após o experimento e tendo assegurada anestesia profunda, exponha completamente o coração e remova-o em bloco para análise bioquímica e tecidual. O animal expira por exsanguinação.
- Casos de sobrevida
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Representative Results
Seguindo o protocolo (Figura 1), a isquemia miocárdica foi confirmada imediatamente pela visualização direta da cianose do epicárdio.
ECGs padrão (três derivações de membros: I, II e III, e três derivações aumentadas computadorizadas: aVL, aVR e aVF) foram registrados continuamente pré-isquemia, durante isquemia e na reperfusão (Figura 2). Os ECGs demonstram taquicardia, arritmias (fibrilação ventricular), defeitos do sistema de condução (bloqueio de ramo), desenvolvimento de ondas Q relacionadas ao infarto e desvio do segmento ST23.
Durante a isquemia regional, observou-se hipocinesia regional diretamente a olho nu na cavidade média da parede anterior em todos os corações, compatível com a área de perfusão da artéria DA que se tornou isquêmica pela restrição de fluxo com o aprisionamento temporário da ADA. Tanto nos casos de sobrevida quanto nos casos de não sobrevida, as leituras de ECO 2D foram obtidas durante a pré-isquemia, imediatamente antes da indução da isquemia regional, e em diferentes momentos durante o experimento: 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min e 120 min. As dimensões diastólica final do ventrículo esquerdo (DDVE) e do ventrículo esquerdo (DSVE) foram medidas com ECO modo-M guiado por 2D nas circunferências máxima e mínima do VE, respectivamente. A contratilidade regional da parede do VE na zona isquêmica miocárdica foi avaliada a partir de cortes de eixo curto do VE utilizando o modo M, com a linha de curser sobrejacente à área de risco. A fração de encurtamento (EF) foi calculada com a seguinte fórmula: EF = (DDVE − DSVE)/DDVE × 10024. Os resultados mostraram que a fração de encurtamento diminuiu durante o tempo isquêmico e o tempo pós-isquêmico em relação ao tempo pré-isquêmico (Figura 3)
Para quantificar a extensão da lesão miocárdica, o tamanho do infarto pode ser medido bioquimicamente com a coloração de cloreto de trifenil tetrazólio (TTC) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Neste trabalho, a área de risco foi delimitada pela religadura da artéria envolvida, amarrando o ponto Prolene deixado no local. A aorta foi pinçada transversalmente, e o pigmento Azul Monastral (diluído 1:5 em PBS) foi liberado através da aorta com agulha de cardioplegia. As áreas de miocárdio perfundido foram coradas de azul, e a área de risco permaneceu sem coloração devido à ligadura da artéria.
O coração foi cortado através do longo eixo do ventrículo esquerdo, do ápice à base, em cortes transversais de 1 cm de espessura, colocados entre placas de vidro e comprimidos com pinças de buldogue. A área de risco para cada lado de cada seção foi traçada em uma folha de acetato transparente. Os cortes cardíacos foram incubados em recipiente escuro com TTC 1% em tampão fosfato (pH 7,4) a 38 °C por 20 min. Os cortes cardíacos foram então armazenados em solução de formaldeído a 10% por 24 h antes das medidas finais para melhorar a visualização da zona de infarto. Os cortes foram colocados entre placas de vidro e comprimidos com pinças de buldogue. A necrose miocárdica foi evidenciada por uma área branca no tecido miocárdico, e as áreas vermelho-tijolo mostraram o tecido viável. (Gráfico 4) As regiões infartadas (brancas) dentro das áreas de risco para cada lado de cada seção foram traçadas na folha de acetato transparente. A planimetria foi utilizada para medir a área de risco e a zona de infarto. Os volumes da área de risco e da zona de infarto foram calculados multiplicando-se as áreas planimetradas pela espessura de corte. O volume de infarto foi expresso em porcentagem do volume total do VE para cada coração25. A razão entre a área de risco e o peso do VE foi calculada, e o tamanho do infarto foi expresso em porcentagem da área de risco. Nosso trabalho anterior demonstrou que, após 2 h e 28 dias de recuperação, as áreas de risco (isto é, em porcentagem da massa do VE) eram de aproximadamente 29% e 27%, respectivamente, tanto para os grupos mitocondrial quanto para controle. No entanto, após 2 h e 28 dias de recuperação, o tamanho do infarto (ou seja, tamanho do infarto/área de risco) nos corações mitocondriais foi de 9,8% e 7,9%, respectivamente, comparados a 37% e 34% nos coraçõescontroles26. Além disso, em nossos experimentos anteriores, a fração de encurtamento e a PDVE foram reduzidas no grupo controle para 50%-60% e 70%-80%, respectivamente, em comparação com os valores basais.
Figura 1: Diagrama de protocolo. O protocolo pode ser ajustado com base nas necessidades do experimento, seja para casos de sobrevida ou não. Os casos de não sobrevida podem ser realizados com uma abordagem cirúrgica mais invasiva com esternotomia mediana, permitindo o uso de cristais de ultrassonomicrometria, ecocardiograma epicárdico (ECO) e cateter de VE para mensuração da fração de encurtamento e PDVE. Para casos de sobrevida, para os quais a cicatrização da incisão e o controle da dor devem ser considerados, uma minitoracotomia esquerda pode ser realizada, e a função miocárdica pode ser avaliada em diferentes momentos durante um período mais longo do estudo usando ECO 2D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Eletrocardiograma representativo (membro II e aVL de derivação aumentada computadorizada) antes da indução da isquemia regional, durante o tempo de isquemia e durante a reperfusão. As escalas de milivolts e milissegundos são mostradas à esquerda. Os pontos de tempo e o momento do aprisionamento da artéria descendente anterior são mostrados na parte inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação ecocardiográfica do coração pela medida da fração de encurtamento (EF). A fração de encurtamento foi medida obtendo-se a distância diastólica final do ventrículo esquerdo e a distância sistólica final do ventrículo esquerdo com modo-M guiado por 2D nas circunferências máxima e mínima do VE, respectivamente. A fração de encurtamento foi avaliada em (A) basal/pré-isquemia, (B) durante o aprisionamento temporário da artéria descendente anterior (DA) com a linha do cursor recobrindo a área de risco e (C) durante a reperfusão após a liberação da armadilha na ADA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens representativas do tamanho do infarto para um coração corado com cloreto de trifenil tetrazólio a 1% após 30 min de isquemia miocárdica regional induzida. O tecido viável é visto como vermelho, enquanto o infarto é visto como áreas brancas. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nosso protocolo demonstra uma metodologia confiável para a realização de isquemia miocárdica regional aguda no coelho. A abordagem da minitoracotomia esquerda é ideal para casos de sobrevida, para os quais a incisão e a dor associada devem ser minimizadas. É importante ressaltar que a terapia diurética não foi necessária antes da extubação, e não houve mortalidade intraoperatória no grupo sem sobrevida ou com 4 semanas de pós-operatório no grupo sobrevida. Quando o desenho do protocolo requer um caso de não sobrevida, ou quando é necessária uma monitorização mais detalhada da função miocárdica global e regional, uma esternotomia mediana pode ser utilizada (Figura 1).
Os passos mais críticos do protocolo são circundar cuidadosamente a DAE com uma agulha de conicidade sem danificar a artéria ou criar sangramento venoso e ocluir a DAE para criar uma área de risco consistente.
Algumas complicações que podem ocorrer na realização da cirurgia descrita são a hiperdistensão pulmonar durante a ventilação mecânica devido ao alto volume corrente, sangramento por dano à DA, sangramento secundário à lesão do vaso intercostal, que geralmente ocorre na entrada ou por manipulação do afastador, e/ou arritmia cardíaca (fibrilação ventricular intraoperatória) com ligadura da ADA. Outras complicações pós-operatórias também podem ocorrer, como infecção do sítio cirúrgico, má mobilização do animal devido à dor e/ou hipocinesia regional miocárdica residual. Apesar da incidência dessas complicações ser muito baixa, o investigador deve ser capaz de abordá-las de forma pronta e eficaz.
Os coelhos apresentam-se como um excelente modelo animal para estudos miocárdicos. Sua frequência cardíaca é semelhante à frequência cardíaca humana, e seu tamanho é suficientemente pequeno, mas permite a análise histológica sob um microscópio óptico.
Uma limitação deste estudo deve ser reconhecida; Especificamente, o coração de coelho é menor e clinicamente menos relevante para comparações com o coração humano do que o coração de outros modelos animais de grande porte, como o porco.
Devido à incidência e prevalência de doença cardiovascular, ter um modelo animal que simule isquemia miocárdica regional é de suma importância. Essa metodologia pode ter múltiplas aplicações e tem se mostrado útil em modelos de lesão vascular, isquemia miocárdica crônica e curtos períodos de atordoamento miocárdico27,28,29,30,31.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse, financeiros ou não, declarados pelos autores.
Acknowledgments
O estudo original no qual este protocolo foi utilizado foi apoiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute Grants HL-103642 e HL-088206
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 blade | Bard Parker | 371210 | |
| #11 blade | Fisher Scientific | B3L | |
| 22 G PIV needle | BD Insyte | 381423 | |
| Acepromazine | VETONE | NDC 13985-587-50 | 0.5 mg/kg IM and IV |
| Aline pressure bag | Infu-Stat | 2139 | |
| Angiocath | Becton Dickinson | 382512 | |
| Arterial Catheter | Teleflex | MC-004912 | |
| Atropine | Hikma Pharmaceuticals | NDC 0641-6006-01 | 0.01 mg/kg IM |
| Betadine and 70% isopropyl alcohol | McKesson | NDC 68599-2302-6 | |
| Blood gas machine | Siemens | MRK0025 | |
| Bovie | Valleylab | E6008 | |
| Bulldog clamps | World Precision Instruments | 14119 | |
| Bupivacaine | Auromedics | NDC 55150-249-50 | 3 mg/kg IM |
| Butorphanol | Roxane | NDC 2054-3090-36 | 0.5 mg/kg IM |
| Clear acetate sheet | Oxford Instruments | ID 51-1625-0213 | |
| Clipers | Andis | AGC2 | |
| DeBakey forceps | Integra | P6280 | |
| Echocardiography machine | Philips | IE33 F1 | |
| Electrocardiography machine | Meditech | MD908B | |
| Endotracheal tube | Medline | #922774 | |
| Fentanyl | West-Ward | NDC 0641-6030-01 | 1–4 µg/kg transdermal patch |
| Formaldehyde solution 10% | Epredia | 94001 | |
| Glass plates | United Scientific | B01MUHX6MR | |
| Heparin Sodium | Sagent | NDC 69-0058-02 | 1000U in 1 mL 3 mg/kg |
| Hot water blanket | 3M | 55577 | |
| Isoflurane | Penn Veterinary Supply, INC | NDC 50989-606-15 | 1%–3% |
| Ketamine | Dechra | NDC 42023-138-10 | 10 mg/kg IV |
| Lab Chart 7 Acquisition Software | Adinstruments | ||
| Lactated Ringer's solution | ICUmedical | NDC 0990-7953-09 | 10 mL/kg/h |
| Laryngoscope | Welch Allyn | 68044 | |
| Left ventricule lumen catheter 3Fr | McKesson | 385764-EA | |
| Lidocaine (1%) | Pfizer | 4276-01 | 1–1.5 mL/kg IV |
| LVDP transducer | Edward | PDP-ED | |
| Marking pen | Viscot | 1451SR-100 Unsterile | |
| Mayo scissors | Mayo | S7-1098 | |
| Medetomidine | Entireoly Pets Pharmacy | NDC 015914-005-01 | 0.25 mg/kg IM |
| Metzenbaum scissors | Cole-Parmer | UX-10821-05 | |
| Monastra. Blue pigment 98% | Chemsavers | MBTR1100G | |
| Monocryl 5-0 | Ethicon | Y463G | |
| Mosquito clamp | Shioda | 802N | |
| PDS 3-0 | Ethicon | 42312201 | |
| Piezoelectric sonomicrometry crystals | Sonometrics | Small 2mm round | |
| Plegets | DeRoyal | 32-363 | |
| Povuine Iodine Prep Solutions | Medline | MDS093940 | |
| Precision vaporized system face mask | Yuwell | B07PNH69BF | |
| Prolene 3-0 | Ethicon | 8665G | |
| Proline 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Pulse oximetry probe | Masimo | 9216-U | |
| Rib spreader | Medline | MDS5621025 | |
| S12 Pediatric Sector Probe | Phillips | 21380A | |
| Sonomicrometer | Sonometrics | BZ10123724 | |
| Sterile gauze | Medline | 3.00802E+13 | |
| Sterile towels | McKesson | MON 277860EA | |
| Sternal retractor | Medline | MDS5610321 | |
| Sutures for closure | J&J Dental | 8698G | |
| Telemetriy monitor | Meditech | MD908B | |
| Temperature probe | Omega | KHSS-116G-RSC-12 | |
| Triphenyl tetrazolium chloride (1%) | Millipore | MFCD00011963 | |
| Ventilator | MedGroup | MSLGA 11 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | V635H | |
| Vinyl tubing | ABE | DISW 3001 |
References
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