Summary
De huidige studie demonstreert een zeer reproduceerbaar diermodel van acute regionale myocardischemie en reperfusieletsel bij konijnen met behulp van een linker mini-thoracotomie voor overlevingsgevallen of een middellijnsternotomie voor niet-overlevingsgevallen.
Abstract
Het protocol hier biedt een eenvoudige, zeer repliceerbare methodologie om in situ acute regionale myocardischemie bij het konijn te induceren voor niet-overlevings- en overlevingsexperimenten. Nieuw-Zeelands wit volwassen konijn wordt verdoofd met atropine, acepromazine, butorfanol en isofluraan. Het dier wordt geïntubeerd en aan de mechanische beademing gelegd. Een intraveneuze katheter wordt in de marginale oorader ingebracht voor de infusie van medicijnen. Het dier krijgt premedicatie met heparine, lidocaïne en Ringer-lactaatoplossing. Een halsslagader wordt doorgesneden om toegang tot de arteriële lijn te verkrijgen voor bloeddrukmeting. Bepaalde fysiologische en mechanische parameters worden bewaakt en geregistreerd door continue real-time analyse.
Met het dier verdoofd en volledig verdoofd, wordt ofwel een vierde intercostale ruimte kleine linker thoracotomie (overleving) of middellijn sternotomie (niet-overleving) uitgevoerd. Het hartzakje wordt geopend en de linker voorste dalende (LAD) slagader wordt gelokaliseerd.
Een polypropyleen hechtdraad wordt rond de tweede of derde diagonale tak van de LAD-slagader geleid en het polypropyleenfilament wordt door een kleine vinylbuis geregen en vormt een strik. Het dier wordt onderworpen aan 30 minuten regionale ischemie, bereikt door de LAD af te sluiten door de strik aan te spannen. Myocardiale ischemie wordt visueel bevestigd door regionale cyanose van het epicardium. Na regionale ischemie wordt de ligatuur losgemaakt en mag het hart opnieuw doorsmelten.
Voor zowel overlevings- als niet-overlevingsexperimenten kan de myocardiale functie worden beoordeeld via een echocardiografie (ECHO)-meting van de fractionele verkorting. Voor niet-overlevingsstudies kunnen gegevens van sonomicrometrie die zijn verzameld met behulp van drie digitale piëzo-elektrische ultrasone sondes die zijn geïmplanteerd in het ischemische gebied en de door de linkerventrikel ontwikkelde druk (LVDP) met behulp van een apicaal ingebrachte linkerventrikel (LV)-katheter continu worden verkregen voor het evalueren van respectievelijk de regionale en globale myocardfunctie.
Voor overlevingsstudies wordt de incisie gesloten, wordt een thoracentese met de linkernaald uitgevoerd voor pleurale luchtevacuatie en wordt postoperatieve pijnbestrijding bereikt.
Introduction
Hart- en vaatziekten zijn de belangrijkste doodsoorzaak ter wereld en dragen bij aan meer dan 18 miljoen sterfgevallen per jaar 1,2,3. Acuut myocardinfarct (MI) is een veel voorkomend medisch noodgeval dat ontstaat wanneer een bloedstolsel of een stukje atheromateuze plaque de bloedstroom van een kransslagader blokkeert. Dit veroorzaakt regionale myocardischemie in het gebied dat de slagader doordringt.
De huidige studie beschrijft een protocol dat gebruik maakt van een eenvoudige en betrouwbare methodologie om in situ acute regionale myocardischemie te creëren in een konijnenmodel voor niet-overlevings- en overlevingsexperimenten. Het oorspronkelijke doel van deze methode was het evalueren van de effecten van mitochondriale transplantatie op het moduleren van myocardiale necrose en het verhogen van de post-ischemische hartfunctie na een ischemische gebeurtenis. Eerder onderzoek heeft het optreden van mitochondriale veranderingen en een snelle daling van hoogenergetische fosfaatspiegels aangetoond na het begin van ischemie en een vermindering van de zuurstoftoevoer, wat resulteert in een drastische afname van de cardiale energievoorraden4. Onderzoekers hebben geprobeerd de post-ischemische functie te verbeteren en myocardiale weefselnecrose te verminderen met behulp van farmacologische interventies en/of procedurele technieken, maar deze technieken bieden beperkte cardioprotectie en hebben een minimale impact op mitochondriale schade en disfunctie 5,6,7. Ons team en anderen hebben eerder aangetoond dat mitochondriale schade voornamelijk optreedt tijdens ischemie en dat contractiel herstel kan worden verbeterd en de grootte van het myocardinfarct kan afnemen met behoud van de mitochondriale ademhalingsfunctie tijdens reperfusie 8,9,10. Zo veronderstelden we dat mitochondriale transplantatie van weefsels die niet zijn aangetast door ischemie naar het gebied van ischemie voorafgaand aan reperfusie een alternatieve benadering zou bieden om myocardiale necrose te verminderen en de myocardfunctie te verbeteren. Hierin beschrijven we het protocol dat is gebruikt om deze theorie te testen en de representatieve resultaten die zijn verkregen uit onze eerste studieanalyse.
Bovendien hebben verschillende onderzoekers zich gericht op andere onderwerpen die een integraal onderdeel zijn van het definiëren van de impact van myocardischemie-reperfusieletsel en het vaststellen van passende therapeutische interventies. Een van die onderzoeksgebieden is dat van preconditionering. Myocardiale ischemische preconditionering is een cardioprotectief mechanisme dat wordt geactiveerd door korte ischemische stress en dat resulteert in een vermindering van de snelheid van hartcelnecrose tijdens opeenvolgende episodes van langdurige ischemie. Deze mechanismen kunnen worden geactiveerd door hypoxie of coronaire occlusie. Mandel et al. toonden aan dat hypoxisch-hyperoxische preconditionering hielp om de balans van stikstofmonoxidemetabolieten te behouden, de hyperproductie van endotheline-1 te verminderen en orgaanbescherming te ondersteunen11. Bovendien is het concept van ischemische preconditionering op afstand, een fenomeen waarbij preconditionering van één orgaan systemische bescherming biedt, onderzocht. Ali et al. ontdekten dat, bij patiënten die een electieve open abdominale aorta-aneurysmareparatie ondergingen, preconditionering op afstand, uitgevoerd door met tussenpozen de gemeenschappelijke iliacale slagader kruislings vast te klemmen om als stimulus te dienen, de incidentie van postoperatief myocardletsel, myocardinfarct en nierinsufficiëntie verminderde.
Konijnenmodellen bieden potentiële voordelen ten opzichte van modellen met andere soorten en worden al tientallen jaren in meerdere verschillende scenario's gebruikt, waaronder de inductie van aritmieën, wereldwijde en regionale ischemische modellen en onderzoek naar hartcontractie, onder andere13,14,15. Hoewel het konijnenhart kleiner is dan dat van een hond of varken, is het groot genoeg om gemakkelijk chirurgische ingrepen uit te voeren tegen veel lagere kosten13. Het konijnenhart wordt vaak gebruikt omdat het nauw aansluit bij het menselijk hart; Het heeft inderdaad een vergelijkbare stofwisseling, brengt β-myosine zware keten tot expressie en mist significante myocardiale xanthine-oxidase16. De techniek die hierin wordt beschreven om regionale myocardischemie te induceren, is eenvoudig, herhaalbaar en kosteneffectief. Deze methode maakt zowel niet-overleving als overleving mogelijk, aangezien alleen regionale ischemie wordt geïnduceerd in plaats van globale ischemie, en de benodigde materialen niet-gespecialiseerd zijn. Er kunnen twee verschillende chirurgische benaderingen (d.w.z. sternotomie en mini-thoracotomie) worden gebruikt, waardoor de operator en experimentele protocollen meer vrijheid krijgen in termen van de onderzoeksopzet. Bovendien vereist de procedure geen gebruik van een cardiopulmonale bypass. In deze context zijn minimaal invasieve benaderingen van coronaire bypasstransplantatie waardevolle alternatieven geworden voor patiënten die revascularizaiton met meerdere vaten nodig hebben17,18. Dit model kan worden gebruikt om de verschillen tussen deze benaderingen te bestuderen en een op dieren gebaseerd leermiddel te bieden voor chirurgische stagiairs. Bovendien kan het uitvoeren van hartkatheterisatie met behulp van dit model nuttig zijn voor fysiologisch onderzoek en/of chirurgische training.
Ons model biedt een methodologie voor toepassingen waarbij het induceren van regionale myocardischemie en vervolgens het meten van de infarctgrootte, myocardfunctie en cellulaire veranderingen van belang zijn. Met dit protocol hebben we verschillende markers van cellulaire functie en aanpassing aan ischemie en de voorgestelde therapeutische interventie (d.w.z. mitochondriale transplantatie) kunnen evalueren door de internalisatie van organellen, zuurstofverbruik, hoogenergetische fosfaatsynthese en de inductie van cytokinemediatoren en proteomische routes te onderzoeken. Deze uitkomsten zijn belangrijk voor het behoud van de myocardiale energetica, de levensvatbaarheid van de cellen en de hartfunctie en maken de objectieve evaluatie mogelijk van cardioprotectieve technieken na ischemie-reperfusieletsel. Dit model zou kunnen worden gebruikt om vergelijkbare biologische routes en alternatieven te bestuderen op het gebied van post-ischemische myocardiale pathologie en herstel.
Het doel van dit protocol is om een zeer reproduceerbare methodologie te bieden om in situ acute regionale myocardischemie bij het konijn te induceren voor niet-overlevings- en overlevingsexperimenten. Dit model biedt een methodologie met een hoge overleving, lage intraoperatieve mortaliteit en minimale morbiditeit19. Andere modellen voor acute regionale myocardischemie zijn beschreven met behulp van radioactief gelabelde materialen, contrastmiddelen, magnetische resonantiebeeldvorming of computersimulaties20,21,22. Ons protocol biedt een betrouwbare en eenvoudige methodologie die kosteneffectief en consistent reproduceerbaar is en een lage technische eis heeft en dus kan worden uitgevoerd door onderzoekers zonder chirurgische expertise. Dit protocol is geschikt voor een overlevingsproject met behulp van een linker mini-thoracotomie of een niet-overlevingsmodel met behulp van een middellijnsternotomie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit onderzoek werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health voor de verzorging en het gebruik van dieren en werd goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van het Boston Children's Hospital (Protocol 20-08-4247R). Alle dieren kregen humane zorg in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. Diersoorten, verdovingsmiddelen en pijnstillers
- Diersoorten: Gebruik Nieuw-Zeelandse witte konijnen (wildtype stam; vrouwelijk geslacht; geslachtsrijp 15-20 weken oud; 3-4 kg lichaamsgewicht) voor experimentele studies.
- Verdovingsmiddelen en pijnstillers:
- Gebruik atropine in een dosis van 0,01 mg/kg intramusculair (IM)
- Gebruik acepromazine in een dosis van 0,5 mg/kg IM voor initiële sedatie en 0,5 mg/kg intraveneus (IV) voor volledige anesthesie.
- Gebruik butorfanol in een dosis van 0,5 mg/kg IM.
- Gebruik isofluraan via een nauwkeurig verdampt gezichtsmasker van 3% voor inductie, gevolgd door intubatie van 1%-2%, zuurstof (O2) van 100% bij 2 l/min en algemene anesthesie van 1% voor onderhoud.
- Gebruik medetomidine in een dosis van 0,25 mg/kg IM.
- Gebruik ketamine in een dosis van 10 mg/kg IV.
- Gebruik een bupivacaïne intercostale blokkade op de plaats van de thoracotomie in een dosis van maximaal 3 mg/kg IM.
- Gebruik 1% lidocaïne in een dosis van 1-1,5 ml/kg IV.
- Gebruik een pleister van 1-4 μg/kg fentanyl voor transdermaal gebruik gedurende 72 uur.
2. Procedurele stappen (figuur 1)
- Bezadigde Nieuw-Zeelandse witte volwassen konijnen met een enkele gecombineerde IM-injectie van atropine, acepromazine en butorfanol. Induceer het dier met 3% isofluraan via een nauwkeurig verdampt gezichtsmasker.
- Voorbereiding voorafgaand aan geblindeerde endotracheale intubatie (d.w.z. zonder visualisatie van de glottis)
- Besproei het strottenhoofd met 1% lidocaïne om laryngospasmen te voorkomen.
- Meet vooraf de lengte van de endotracheale tube (ETT) aan de buitenkant van het konijn vanaf de tanden tot de voorspelde carina, en plaats het konijn in een sternale liggende positie met de nek gestrekt.
- Intubeer het dier met een omboeide pediatrische maat (3-0 of 3-5 binnendiameter) ETT onder continue geïnhaleerde verdoving bij 1%-2% en O 2 bij 100% bij2 l/min.
- Steek de ETT in de mond en leid deze langs de torus in de keelholte.
- Schuif de ETT naar voren totdat de punt van de buis contact maakt met de glottis of de ademgeluiden verloren gaan, wat aangeeft dat de punt van de buis door de glottische opening is gegaan.
- Trek de buis iets terug totdat de ademgeluiden zijn herwonnen, en ga dan weer naar voren en zet de buis op zijn plaats.
- Beadem het dier met mechanische ondersteuning (ademvolume: 10 ml/kg, fractie van ingeademde O 2: 40%, ademhalingsfrequentie: 30-40 ademhalingen/min, positieve eind-expiratoire druk: 5-10 cmH2O).
- Pas de FiO2 aan zoals getolereerd om een O2-verzadiging van meer dan92 % te bereiken, gemeten met pulsoximetrie om hyperoxie te voorkomen, wat een systemische ontstekingsreactie kan veroorzaken.
- Controleer de juiste plaatsing van de ETT door middel van een lichamelijk onderzoek (d.w.z. auscultatie), klinische symptomen (d.w.z. observatie van condensatie aan het uiteinde van de endotracheale tube) en met objectieve metingen (d.w.z. end-tidal kooldioxide).
- Dien na ongeveer 10 minuten een IM-injectie met medetomidine toe aan het konijn om gelijktijdige verdovende en pijnstillende effecten te verkrijgen.
- Handhaaf de algemene anesthesie met 1% isofluraan voor de duur van de chirurgische ingreep.
- Steek een 22 G IV-katheter in de marginale oorader en zet deze vast met tape om perifere IV-toegang te verkrijgen.
OPMERKING: De dijbeenader kan worden gebruikt als een alternatieve plaats van veneuze toegang.- Verdoof het dier volledig met acepromazine IV en ketamine IV.
- Injecteer vóór de incisie 1.000 E/ml heparine in een dosis van 3 mg/kg IV.
- Dien in eerste instantie 1.000 E/ml heparine toe in een dosis van 3 mg/kg en herdoseer elk uur tot het einde van het experiment om een geactiveerde stollingstijd van >400 s te behouden, in overeenstemming met het huidige chirurgische protocol.
- Dien indien nodig 1% lidocaïne IV en/of epicardiale asynchrone defibrillatie toe als ventrikelfibrilleren optreedt tijdens de operatie. Ventriculaire fibrillatie stopt meestal met één of twee doses lidocaïne.
- Perfuseer lactaat Ringer's oplossing continu met 10 ml/kg/uur.
OPMERKING: Gezien de kleine hoeveelheid toegediende vloeistoffen en de korte operatietijden, hadden de dieren in overlevingsstudies in dit werk geen diurese nodig voorafgaand aan extubatie of tijdens de herstelperiode. Als het dier een verslechterende longstatus ontwikkelt (d.w.z. verhoging van de beademingsinstellingen, tekenen van longoedeem bij auscultatie, enz.), wordt diurese geadviseerd.
- Voer een halsslagadersnede uit en plaats een 4 of 5 Franse arteriële lijn om de intra-operatieve monitoring van de arteriële bloeddruk (BP) te vergemakkelijken.
OPMERKING: De dijbeenslagader kan worden gebruikt als een alternatieve plaats voor arteriële toegang. - Bewaak en registreer alle fysiologische en mechanische variabelen door continue real-time analyse.
- Bewaak de arteriële bloeddruk met de halsslagaderarteriële lijn en registreer de O 2-verzadiging met behulp van pulsoximetrie via een sensor die op een geschoren poot is geplaatst.
- Monitor met een elektrocardiogram (ECG) met drie ledemaatafleidingen: I, II en III, en drie berekende verhoogde afleidingen: aVL, aVR en aVF.
- Noteer de ECG-traceringen bij de pre-ischemische basislijn, tijdens ischemie, tijdens reperfusie en serieel gedurende dag 7-28 van herstel (bij het uitvoeren van een overlevingsonderzoek).
- Bewaak het niveau van sedatie door continue monitoring van de bloeddruk en hartslag (HR).
- Bewaak de temperatuur met een rectale sonde.
- Gebruik 2D ECHO vanuit de linker parasternale en apicale weergaven om de myocardfunctie op gewenste tijdstippen te beoordelen in zowel de overlevings- als de niet-overlevingsgevallen.
- Beoordeel de myocardfunctie met behulp van de fractionele verkorting (FS) door de einddiastolische afstand van de linkerventrikel (LVEDD) en de eindsystolische afstand van de linkerventrikel (LVESD) te meten en de volgende formule te gebruiken:
FS = (LVEDD − LVESD)/LVEDD × 100
- Beoordeel de myocardfunctie met behulp van de fractionele verkorting (FS) door de einddiastolische afstand van de linkerventrikel (LVEDD) en de eindsystolische afstand van de linkerventrikel (LVESD) te meten en de volgende formule te gebruiken:
- Leg het dier tijdens de operatie op een circulerende warmwaterdeken om een stabiele lichaamstemperatuur te behouden.
- Bereid het dier voor en drapeer het op een steriele manier:
- Scheer de operatieplaats en bereid voor met betadine en 70% isopropylalcohol, elk in drievoud aangebracht. Dep het gebied droog met steriele gaasjes en drapeer het hele dier met steriele handdoeken.
- Linker mini-thoracotomie (overlevingsstudies)
- Voer een intercostale blokkade uit op de vooraf bepaalde thoracotomieplaats met bupivacaïne IM.
- Dien 1% lidocaïne IV toe via de auriculaire ader voorafgaand aan de incisie.
- Voer een linker mini-thoracotomie uit door de vierde intercostale ruimte langs het bovenste gedeelte van de vijfde rib om de neuromusculaire bundel te vermijden, die zich evenwijdig aan de onderkant van elke rib bevindt.
- Voer een anterolaterale thoracotomie uit voor de beste visualisatie van het anterolaterale oppervlak van het hart (d.w.z. de anatomische locatie van de diagonale takken van de LAD).
- Plaats het konijn met de linkerkant ongeveer 30° omhoog met behulp van een kussen of zitzak.
- Zet de ipsilaterale poot van het konijn boven zijn kop vast om ruimte te creëren voor zowel het operatieveld als tussen de ribben.
- Palpeer en omlijn de benige oriëntatiepunten, inclusief de ribben, het borstbeen en het schouderblad, met een viltstift. Snijd de huid over de vijfde rib in met een #10 mes. Zorg ervoor dat de incisie evenwijdig aan de rib blijft.
- Gebruik elektrocauterisatie om de musculus pectoralis major en de musculus anterior van serratus te verdelen. Verdeel de intercoastale spieren net boven de vijfde rib met elektrocauterisatie om de neurovasculaire bundel te behouden.
- Betreed voorzichtig de pleurale ruimte via de vierde intercostale ruimte met scherpe of stompe dissectie. Verleng de eerste pleurale incisie evenwijdig aan de rib in beide richtingen met scherpe of stompe dissectie totdat een ribspreider of sternale retractor kan worden ingebracht.
- Plaats een ribspreider of sternale retractor in de ribruimte en verbreed deze om voldoende visualisatie van het hart en de pericardiale zak te bieden. Til het hartzakje op met een DeBakey-pincet en open het hartzakje met een Metzenbaum-schaar.
- Isolatie van de LAD-slagader
- Omcirkel de tweede of derde diagonale tak van de LAD-slagader met een polypropyleen hechtdraad (3-0) op een conische naald. Verwijder de naald en rijg beide uiteinden van het polypropyleenfilament door een kleine vinylbuis om een strik te vormen.
- Plaats een pledget tussen de strik en de kransslagader om beschadiging van de kransslagader en/of vasospasme met ligatie te voorkomen.
- Pak met een DeBakey-pincet een rechthoekig PTFE-vilt op (ongeveer 7 mm x 3 mm). Plaats de pledget tussen de twee polypropyleen filamenten zodat deze wordt ingeklemd tussen de geïsoleerde LAD-slagader en de vinylbuis wanneer de strik wordt aangedraaid.
- Middellijnsternotomie (niet-overlevingsstudies)
OPMERKING: De middellijnsternotomiebenadering is ideaal voor gevallen van niet-overleving, waarvoor meer invasieve monitoring met LVDP en sonomicrometrie kan worden gebruikt.- Voer een middellijnsternotomie uit met behulp van een gebogen Mayo-schaar. Plaats een sternale retractor en verbreed deze om een adequate visualisatie van het hart en de pericardiale zak te bieden.
- Til het hartzakje op met een DeBakey-pincet en open het hartzakje met een Metzenbaum-schaar.
- Het plaatsen van de drie piëzo-elektrische sonomicrometriekristallen:
- Maak drie kleine sneden van 1 mm in het epicardium van de LV en vorm de hoeken van een driehoek. Plaats de piëzo-elektrische sonomicrometriekristallen in de epicardiumsneden.
- Bevestig de draden aan het hartoppervlak met een 5-0 polypropyleen U-steek. Wanneer u opneemt met behulp van sonomicrometrie, pauzeert u de mechanische ventilatie om een nauwkeurige opname over twee tot drie hartslagen mogelijk te maken.
OPMERKING: Als het hart fibrilleert, 1% lidocaïne niet effectief is en epicardiale defibrillatie nodig is, schakelt u de sonomicrometer uit en koppelt u deze los van het data-acquisitiesysteem om beide te beschermen tegen elektrische invoer.
- Isolatie van de LAD-slagader:
- Omcirkel de tweede of derde diagonale tak van de LAD-slagader met een polypropyleen hechtdraad (3-0) op een conische naald.
- Verwijder de naald en rijg beide uiteinden van het polypropyleenfilament door een kleine vinylbuis om een strik te vormen.
- Plaats een pledget tussen de strik en de kransslagader om beschadiging van de kransslagader en/of vasospasme met ligatie te voorkomen.
- Pak met een DeBakey-pincet een rechthoekig PTFE-vilt op (ongeveer 7 mm x 3 mm). Plaats de pledget tussen de twee polypropyleen filamenten zodat deze wordt ingeklemd tussen de geïsoleerde LAD-slagader en de vinylbuis wanneer de strik wordt aangedraaid.
- Meting van de LVDP:
- Plaats een 5-0 polypropyleen U-steek in de top van de LV. Maak een kleine incisie van 1 mm met een mes van 11 in de LV-top.
- Breng een 3 Franse ballonkatheter in het LV-lumen in. Bevestig de katheter aan de LV door deze vast te binden aan de 5-0 polypropyleen U-stitch hechtdraad.
- Sluit de katheter aan op de transducer die op de monitor is aangesloten om de LVDP op te nemen. Neem de LVDP op met behulp van het data-acquisitiesysteem (hieronder beschreven). Zet de katheter op nul om de hemodynamische variabelen vast te leggen door de driewegkraan naar de lucht te openen en op de monitor op nul te zetten.
- Data-acquisitie systeem
- Start het data-acquisitiesysteem (zie de materiaaltabel) op de computer/laptop die wordt gebruikt. Sluit de draad van de monitor aan op de computer/laptop.
- Selecteer Kanaal 1 op het data-acquisitiesysteem en noem het LVDP. Zet de transducer op nul met behulp van de monitor.
NOTITIE: Als u de bloeddruk en hartslag aansluit op het data-acquisitiesysteem, volgt u hetzelfde proces: sluit de draad aan op de laptop, selecteer Kanaal en nul als u de bloeddruk meet.
- Sluit de kransslagader af door de strik strakker te maken door op de vinylbuis te drukken terwijl u aan de polypropyleen hechtdraden trekt. Handhaaf de gewenste dichtheid met een muggenklem door de buis direct vast te klemmen en op zijn plaats te bevestigen.
- Bevestig myocardischemie visueel door de regionale cyanose van het epicardium. Regionale ischemie kan ook worden bevestigd op ECG met de aanwezigheid van een ST-segment en T-golfveranderingen.
- Induceer na visuele bevestiging regionale ischemie gedurende 30 minuten onder anesthesie.
- Beoordeel na 0 min, 10 min, 20 min en 30 min tijdens de regionale ischemie de FS met 2D ECHO voor zowel de overlevings- als niet-overlevingsgevallen.
- Beoordeel de LVDP en sonomicrometrie continu tijdens de pre-ischemietijd, myocardischemietijd en post-ischemische tijd voor de gevallen van niet-overleving.
- Baken indien nodig het risicogebied af door de slagader opnieuw af te binden met de polypropyleen hechtdraad die op zijn plaats blijft. Klem de aorta kruislings vast en injecteer Monastral Blue-pigment 98% (verdund 1:5 in PBS) door de aorta met behulp van een cardioplegienaald. De doorbloede delen van het myocardium zullen blauw kleuren en het risicogebied zal ongekleurd blijven.
- Bewaak en registreer continu de hartslag-, bloeddruk- en O 2-verzadiging.
- Laat het dier 2 uur (niet-overleving) of 28 dagen (overleving) herstellen.
OPMERKING: ECG kan worden gebruikt om reperfusie te bevestigen. Hoewel niet gezien in het experiment dat in deze studie is uitgevoerd, kan hypokaliëmie vaak optreden tijdens reperfusie en kan het worden gecorrigeerd met kaliumcontrole of een geschikte infusie.
- Afsluiting van de procedure
- Overlevings gevallen
- Knip in overlevingsgevallen de 3-0 polypropyleendraad af die voor de snare wordt gebruikt, bind de uiteinden losjes aan elkaar en laat deze op zijn plaats. Identificeer het risicogebied en de infarctzone aan de hand van de 3-0 polypropyleen schroefdraad.
- Nadat de procedure is voltooid, sluit u de incisie in drie lagen.
- Sluit de eerste laag door twee 2-0 polyglactine 910 achtvormige steken rond de ribben te binden.
- Sluit de spier- en onderhuidse lagen met een 3-0 polydioxanonhechting op een lopende manier.
- Sluit de huid subcuticulaire met behulp van een 5-0 monofilament hechtdraad. Gebruik een ingegraven lopende hechting om de irritatie van het dier te minimaliseren.
- Evacueer de pleurale lucht door een naaldthoracentese uit te voeren.
- Breng gedurende 72 uur een fentanylpleister voor transdermaal gebruik aan om de postoperatieve pijnbestrijding te vergemakkelijken.
- Voer transthoracale echocardiografie uit op de tijdstippen van 1 week en 2 weken postoperatief om de trends in de FS te beoordelen.
- Verdoof, intubeer en verdoven het dier na de vooraf bepaalde herstelperiode zoals hierboven. Voer een mediane sternotomie uit. Leg de pericardiale zak bloot en open deze. Euthanaseer het konijn onder diepe verdoving door het hart en bloc te verwijderen, waardoor het dier kan sterven door verbloeding.
- Niet-overlevende gevallen
- Na het experiment en na het verzekeren van diepe anesthesie, stelt u het hart volledig bloot en verwijdert u het en bloc voor biochemische en weefselanalyse. Het dier sterft door verbloeding.
- Overlevings gevallen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het protocol (Figuur 1) werd myocardischemie onmiddellijk bevestigd door de directe visualisatie van cyanose van het epicardium.
Standaard ECG's (drie ledemaatafleidingen: I, II en III, en drie berekende verhoogde afleidingen: aVL, aVR en aVF) werden continu geregistreerd pre-ischemie, tijdens ischemie en bij reperfusie (Figuur 2). De ECG's tonen tachycardie, aritmieën (d.w.z. ventriculaire fibrillatie), defecten in het geleidingssysteem (d.w.z. bundeltakblok), de ontwikkeling van infarct-gerelateerde Q-golven en ST-segmentafwijking23.
Tijdens regionale ischemie werd regionale hypokinesie direct met het blote oog waargenomen in de middenholte van de voorwand in alle harten, consistent met het perfusiegebied van de LAD-slagader dat ischemisch werd gemaakt door de beperking van de stroom met de tijdelijke verstrikking van de LAD. In zowel de overlevings- als de niet-overlevingsgevallen werden 2D ECHO-metingen verkregen tijdens pre-ischemie, net voor het induceren van regionale ischemie, en op verschillende tijdstippen tijdens het experiment: 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min en 120 min. De einddiastolische (LVEDD) en linkerventrikel eindsystolische afmetingen (LVESD) werden gemeten met een 2D-geleide M-modus ECHO bij respectievelijk de maximale en minimale LV-omtrek. De regionale contractiliteit van de LV-wand in de myocardiale ischemische zone werd beoordeeld aan de hand van korte-asaanzichten van de LV met behulp van de M-modus, waarbij de curserlijn over het risicogebied lag. De fractionele verkorting (FS) werd berekend met de volgende formule: FS = (LVEDD − LVESD)/LVEDD × 10024. De resultaten toonden aan dat de fractionele verkorting afnam tijdens de ischemische tijd en post-ischemische tijd in vergelijking met de pre-ischemische tijd (Figuur 3)
Om de omvang van myocardletsel te kwantificeren, kan de grootte van het infarct biochemisch worden gemeten met trifenyltetrazoliumchloride (TTC) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) kleuring. In dit werk werd het risicogebied afgebakend door de herbinding van de betrokken slagader door de Prolene-steek op zijn plaats te binden. De aorta werd kruislings vastgeklemd en Monastral Blue-pigment (verdund 1:5 in PBS) werd via de aorta toegediend met behulp van een cardioplegienaald. De gebieden met geperfundeerd myocardium waren blauw gekleurd en het risicogebied bleef ongekleurd als gevolg van de ligatie van de slagader.
Het hart werd over de lange as van de linker hartkamer gesneden, van top tot basis, in dwarsdoorsneden van 1 cm dik, tussen glasplaten geplaatst en samengedrukt met bulldogklemmen. Het risicogebied voor elke kant van elke sectie werd getraceerd op een doorzichtige acetaatplaat. De hartsecties werden gedurende 20 minuten geïncubeerd in een donkere container met 1% TTC in fosfaatbuffer (pH 7,4) bij 38 °C. De hartsecties werden vervolgens gedurende 24 uur vóór de laatste metingen opgeslagen in een 10% formaldehyde-oplossing om de visualisatie van de infarctzone te verbeteren. De secties werden tussen glasplaten geplaatst en samengeperst met bulldogklemmen. Myocardiale necrose bleek uit een wit gebied op het myocardweefsel en de steenrode gebieden toonden het levensvatbare weefsel. (Figuur 4) De infarctgebieden (wit) binnen de risicogebieden voor elke kant van elke sectie werden getraceerd op het doorzichtige acetaatvel. Planimetrie werd gebruikt om het risicogebied en de infarctzone te meten. De volumes van het risicogebied en de infarctzone werden berekend door de planimetergebieden te vermenigvuldigen met de plakdikte. Het infarctvolume werd uitgedrukt als een percentage van het totale LV-volume voor elk hart25. De verhouding tussen het risicogebied en het LV-gewicht werd berekend en de grootte van het infarct werd uitgedrukt als een percentage van het risicogebied. Ons eerdere werk toonde aan dat, na 2 uur en 28 dagen herstel, de risicogebieden (d.w.z. als percentage van de LV-massa) respectievelijk ongeveer 29% en 27% waren voor zowel de mitochondriale als de controlegroep Na 2 uur en 28 dagen herstel was de grootte van het infarct (d.w.z. de grootte van het infarct/risicogebied) in de mitochondriale harten 9,8% en 7,9%, respectievelijk, vergeleken met 37% en 34% in de controleharten26. Bovendien waren in onze eerdere experimenten de fractionele verkorting en LVDP in de controlegroep afgenomen tot respectievelijk 50%-60% en 70%-80% in vergelijking met de uitgangswaarde.
Figuur 1: Protocoldiagram. Het protocol kan worden aangepast op basis van de behoeften van het experiment, hetzij voor overlevings- of niet-overlevingsgevallen. Niet-overlevingsgevallen kunnen worden uitgevoerd met een meer invasieve chirurgische benadering met behulp van een middellijnsternotomie, waardoor het gebruik van sonomicrometriekristallen, epicardiale echocardiografie (ECHO) en een LV-katheter voor het meten van de fractionele verkorting en LVDP mogelijk is. Voor overlevingsgevallen, waarvoor incisiegenezing en pijnbestrijding moeten worden overwogen, kan een linker mini-thoracotomie worden uitgevoerd en kan de myocardfunctie op verschillende tijdstippen tijdens een langere onderzoeksperiode worden beoordeeld met behulp van 2D ECHO. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatief elektrocardiogram (ledemaat II en berekende verhoogde lood aVL) vóór de regionale ischemie-inductie, tijdens de ischemische tijd en tijdens de reperfusie. Millivolt- en millisecondeschalen worden aan de linkerkant weergegeven. De tijdstippen en het moment van de verstrikking van de linker voorste dalende slagader worden onderaan weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Echocardiografische beoordeling van het hart door het meten van de fractionele verkorting (FS). De fractionele verkorting werd gemeten door de einddiastolische afstand van de linkerventrikel en de eindsystolische afstand van de linkerventrikel te verkrijgen met de 2D-geleide M-modus bij respectievelijk de maximale en minimale LV-omtrek. De fractionele verkorting werd beoordeeld bij (A) baseline/pre-ischemie, (B) tijdens de tijdelijke verstrikking van de linker voorste dalende (LAD) slagader met de cursorlijn over het risicogebied, en (C) tijdens reperfusie na het loslaten van de strik op de LAD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve beelden van de grootte van het infarct voor een hart gekleurd met 1% trifenyltetrazoliumchloride na 30 minuten geïnduceerde myocardiale regionale ischemie. Het levensvatbare weefsel wordt gezien als rood, terwijl het infarct wordt gezien als witte gebieden. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ons protocol demonstreert een betrouwbare methodologie voor het uitvoeren van acute regionale myocardischemie bij het konijn. De linker mini-thoracotomiebenadering is ideaal voor overlevingsgevallen, waarvoor de incisie en de bijbehorende pijn tot een minimum moeten worden beperkt. Belangrijk is dat diuretische therapie niet nodig was voorafgaand aan extubatie, en er was geen mortaliteit intraoperatief in de niet-overlevingsgroep of 4 weken postoperatief in de overlevingsgroep. Wanneer het ontwerp van het protocol een niet-overlevingsgeval vereist, of wanneer meer gedetailleerde monitoring van de globale en regionale myocardfunctie nodig is, kan een middellijnsternotomie worden gebruikt (Figuur 1).
De meest kritische stappen van het protocol zijn het zorgvuldig omringen van de LAD met een taps toelopende naald zonder de slagader te beschadigen of veneuze bloedingen te veroorzaken en het afsluiten van de LAD om een consistent risicogebied te creëren.
Enkele complicaties die kunnen optreden bij het uitvoeren van de beschreven operatie zijn overmatige longexpansie tijdens mechanische beademing als gevolg van een hoog teugvolume, bloeding door beschadiging van de LAD, bloeding secundair aan intercostale vaatbeschadiging, die meestal optreedt bij binnenkomst of door manipulatie van het retractor, en/of hartritmestoornissen (intraoperatieve ventriculaire fibrillatie) met LAD-ligatie. Andere postoperatieve complicaties kunnen ook optreden, zoals postoperatieve wondinfectie, slechte mobilisatie van dieren als gevolg van pijn en/of resterende myocardiale regionale hypokinese. Ondanks dat de incidentie van deze complicaties erg laag is, moet de onderzoeker ze gemakkelijk en effectief kunnen aanpakken.
Konijnen presenteren zich als een uitstekend diermodel voor myocardiale studies. Hun hartslag is vergelijkbaar met de menselijke hartslag en hun grootte is voldoende klein, maar maakt histologische analyse onder een optische microscoop mogelijk.
Een beperking in deze studie moet worden erkend; In het bijzonder is het konijnenhart kleiner en klinisch minder relevant voor vergelijkingen met het menselijk hart dan de harten van andere grote diermodellen zoals het varken.
Vanwege de incidentie en prevalentie van hart- en vaatziekten is het van het grootste belang om een diermodel te hebben dat regionale myocardischemie simuleert. Deze methodologie kan meerdere toepassingen hebben en is nuttig gebleken in modellen van vasculair letsel, chronische myocardischemie en korte perioden van myocardverdoving 27,28,29,30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er worden geen belangenconflicten, financieel of anderszins, verklaard door de auteurs.
Acknowledgments
De oorspronkelijke studie waarin dit protocol werd gebruikt, werd ondersteund door National Heart, Lung and Blood Institute Grants HL-103642 en HL-088206
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 blade | Bard Parker | 371210 | |
| #11 blade | Fisher Scientific | B3L | |
| 22 G PIV needle | BD Insyte | 381423 | |
| Acepromazine | VETONE | NDC 13985-587-50 | 0.5 mg/kg IM and IV |
| Aline pressure bag | Infu-Stat | 2139 | |
| Angiocath | Becton Dickinson | 382512 | |
| Arterial Catheter | Teleflex | MC-004912 | |
| Atropine | Hikma Pharmaceuticals | NDC 0641-6006-01 | 0.01 mg/kg IM |
| Betadine and 70% isopropyl alcohol | McKesson | NDC 68599-2302-6 | |
| Blood gas machine | Siemens | MRK0025 | |
| Bovie | Valleylab | E6008 | |
| Bulldog clamps | World Precision Instruments | 14119 | |
| Bupivacaine | Auromedics | NDC 55150-249-50 | 3 mg/kg IM |
| Butorphanol | Roxane | NDC 2054-3090-36 | 0.5 mg/kg IM |
| Clear acetate sheet | Oxford Instruments | ID 51-1625-0213 | |
| Clipers | Andis | AGC2 | |
| DeBakey forceps | Integra | P6280 | |
| Echocardiography machine | Philips | IE33 F1 | |
| Electrocardiography machine | Meditech | MD908B | |
| Endotracheal tube | Medline | #922774 | |
| Fentanyl | West-Ward | NDC 0641-6030-01 | 1–4 µg/kg transdermal patch |
| Formaldehyde solution 10% | Epredia | 94001 | |
| Glass plates | United Scientific | B01MUHX6MR | |
| Heparin Sodium | Sagent | NDC 69-0058-02 | 1000U in 1 mL 3 mg/kg |
| Hot water blanket | 3M | 55577 | |
| Isoflurane | Penn Veterinary Supply, INC | NDC 50989-606-15 | 1%–3% |
| Ketamine | Dechra | NDC 42023-138-10 | 10 mg/kg IV |
| Lab Chart 7 Acquisition Software | Adinstruments | ||
| Lactated Ringer's solution | ICUmedical | NDC 0990-7953-09 | 10 mL/kg/h |
| Laryngoscope | Welch Allyn | 68044 | |
| Left ventricule lumen catheter 3Fr | McKesson | 385764-EA | |
| Lidocaine (1%) | Pfizer | 4276-01 | 1–1.5 mL/kg IV |
| LVDP transducer | Edward | PDP-ED | |
| Marking pen | Viscot | 1451SR-100 Unsterile | |
| Mayo scissors | Mayo | S7-1098 | |
| Medetomidine | Entireoly Pets Pharmacy | NDC 015914-005-01 | 0.25 mg/kg IM |
| Metzenbaum scissors | Cole-Parmer | UX-10821-05 | |
| Monastra. Blue pigment 98% | Chemsavers | MBTR1100G | |
| Monocryl 5-0 | Ethicon | Y463G | |
| Mosquito clamp | Shioda | 802N | |
| PDS 3-0 | Ethicon | 42312201 | |
| Piezoelectric sonomicrometry crystals | Sonometrics | Small 2mm round | |
| Plegets | DeRoyal | 32-363 | |
| Povuine Iodine Prep Solutions | Medline | MDS093940 | |
| Precision vaporized system face mask | Yuwell | B07PNH69BF | |
| Prolene 3-0 | Ethicon | 8665G | |
| Proline 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Pulse oximetry probe | Masimo | 9216-U | |
| Rib spreader | Medline | MDS5621025 | |
| S12 Pediatric Sector Probe | Phillips | 21380A | |
| Sonomicrometer | Sonometrics | BZ10123724 | |
| Sterile gauze | Medline | 3.00802E+13 | |
| Sterile towels | McKesson | MON 277860EA | |
| Sternal retractor | Medline | MDS5610321 | |
| Sutures for closure | J&J Dental | 8698G | |
| Telemetriy monitor | Meditech | MD908B | |
| Temperature probe | Omega | KHSS-116G-RSC-12 | |
| Triphenyl tetrazolium chloride (1%) | Millipore | MFCD00011963 | |
| Ventilator | MedGroup | MSLGA 11 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | V635H | |
| Vinyl tubing | ABE | DISW 3001 |
References
- Selvin, E., Erlinger, T. P. Prevalence of and risk factors for peripheral arterial disease in the United States: Results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2000. Circulation. 110 (6), 738-743 (2004).
- Bolli, R., et al. Myocardial protection at a crossroads: The need for translation into clinical therapy. Circulation Research. 95 (2), 125-134 (2004).
- Cohn, J. N., et al. Report of the National Heart, Lung, and Blood Institute Special Emphasis Panel on Heart Failure Research. Circulation. 95 (4), 766-770 (1997).
- Rousou, A. J., Ericsson, M., Federman, M., Levitsky, S., McCully, J. D. Opening of mitochondrial KATP channels enhances cardioprotection through the modulation of mitochondrial matrix volume, calcium accumulation, and respiration. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (5), H1967-H1976 (2004).
- Rao, V., et al. Insulin cardioplegia for elective coronary bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 119 (6), 1176-1184 (2000).
- Vinten-Johansen, J., Zhao, Z. Q., Jiang, R., Zatta, A. J. Myocardial protection in reperfusion with postconditioning. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 3 (6), 1035-1045 (2005).
- Wakiyama, H., et al. Selective opening of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels during surgically induced myocardial ischemia decreases necrosis and apoptosis. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 21 (3), 424-433 (2002).
- Chen, Q., Moghaddas, S., Hoppel, C. L., Lesnefsky, E. J. Reversible blockade of electron transport during ischemia protects mitochondria and decreases myocardial injury following reperfusion. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 319 (3), 1405-1412 (2006).
- Lesnefsky, E. J., et al. rather than reperfusion, inhibits respiration through cytochrome oxidase in the isolated, perfused rabbit heart: Role of cardiolipin. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), H258-H267 (2004).
- McCully, J. D., Rousou, A. J., Parker, R. A., Levitsky, S. Age- and gender-related differences in mitochondrial oxygen consumption and calcium with cardioplegia and diazoxide. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (3), 1102-1109 (2007).
- Mandel, I. A., et al. Influence of hypoxic and hyperoxic preconditioning on endothelial function in a model of myocardial is-chemia-reperfusion injury with cardiopulmonary bypass (Experimental study). International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5336 (2020).
- Ali, Z. A., et al. Remote ischemic preconditioning reduces myocardial and renal injury after elective abdominal aortic aneurysm repair: A randomized controlled trial. Circulation. 116, 98-105 (2007).
- Pogwizd, S. M., Bers, D. M.
- Tanaka, K., Hearse, D. J. Reperfusion-induced arrhythmias in the isolated rabbit heart: characterization of the influence of the duration of regional ischemia and the extracellular potassium concentration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 20 (3), 201-211 (1988).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Gupta, M. P. Factors controlling cardiac myosin-isoform shift during hypertrophy and heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43 (4), 388-403 (2007).
- Lapierre, H., Chan, V., Sohmer, B., Mesana, T. G., Ruel, M. Minimally invasive coronary artery bypass grafting via a small thoracotomy versus off-pump: A case-matched study. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 40 (4), 804-810 (2011).
- Aubin, H., Akhyari, P., Lichtenberg, A., Albert, A. Additional right-sided upper "half-mini-thoracotomy" for aortocoronary bypass grafting during minimally invasive multivessel revascularization. Journal of Cardiothoracic Surgery. 10, 130 (2015).
- Hu, N., et al. Ligation of the left circumflex coronary artery with subsequent MRI and histopathology in rabbits. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (6), 838-844 (2010).
- Sievers, R. E., et al. A model of acute regional myocardial ischemia and reperfusion in the rat. Magnetic Resonance in Medicine. 10 (2), 172-181 (1989).
- Rodríguez, B., Trayanova, N., Noble, D.
- Sinusas, A. J., et al. Quantification of area at risk during coronary occlusion and degree of myocardial salvage after reperfusion with technetium-99m methoxyisobutyl isonitrile. Circulation. 82 (4), 1424-1437 (1990).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Pombo, J. F., Troy, B. L., Russell, R. O. J. Left ventricular volumes and ejection fraction by echocardiography. Circulation. 43 (4), 480-490 (1971).
- McCully, J. D., Wakiyama, H., Hsieh, Y. J., Jones, M., Levitsky, S. Differential contribution of necrosis and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), H1923-H1935 (2004).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 304 (7), 966-982 (2013).
- Abarbanell, A. M., et al. Animal models of myocardial and vascular injury. Journal of Surgical Research. 162 (2), 239-249 (2010).
- Pirat, B., et al. A novel feature-tracking echocardiographic method for the quantitation of regional myocardial function: Validation in an animal model of ischemia-reperfusion. Journal of the American College of Cardiology. 51 (6), 651-659 (2008).
- Verdouw, P. D., vanden Doel, M. A., de Zeeuw, S., Duncker, D. J. Animal models in the study of myocardial ischaemia and ischaemic syndromes. Cardiovascular Research. 39 (1), 121-135 (1998).
- Bolukoglu, H., et al. An animal model of chronic coronary stenosis resulting in hibernating myocardium. The American Journal of Physiology. 263, H20-H29 (1992).
- Heyndrickx, G. R., Millard, R. W., McRitchie, R. J., Maroko, P. R., Vatner, S. F. Regional myocardial functional and electrophysiological alterations after brief coronary artery occlusion in conscious dogs. Journal of Clinical Investigation. 56 (4), 978-985 (1975).
