Summary
Denne studien demonstrerer en svært reproduserbar dyremodell av akutt regional myokardiskemi og reperfusjonsskade hos kaniner ved bruk av venstre mini-torakotomi for overlevelsestilfeller eller midtlinjesternotomi for ikke-overlevelsestilfeller.
Abstract
Protokollen her gir en enkel, svært replikerbar metodikk for å indusere in situ akutt regional myokardiskemi hos kaninen for ikke-overlevelses- og overlevelseseksperimenter. New Zealand Hvit voksen kanin er bedøvet med atropin, acepromazin, butorfanol og isofluran. Dyret er intubert og plassert på mekanisk ventilasjon. Et intravenøst kateter settes inn i den marginale ørevenen for infusjon av medisiner. Dyret er premedisinert med heparin, lidokain og laktert Ringers løsning. En carotis-nedskjæring utføres for å oppnå arteriell linjetilgang for blodtrykksovervåking. Utvalgte fysiologiske og mekaniske parametere overvåkes og registreres ved kontinuerlig sanntidsanalyse.
Med dyret bedøvet og fullt bedøvet, utføres enten et fjerde interkostalrom rom liten venstre torakotomi (overlevelse) eller midtlinje sternotomi (ikke-overlevelse). Perikardiet åpnes, og venstre fremre synkende (LAD) arterie er lokalisert.
En polypropylensutur føres rundt den andre eller tredje diagonale grenen av LAD-arterien, og polypropylenfilamentet tres gjennom et lite vinylrør og danner en snare. Dyret blir utsatt for 30 min regional iskemi, oppnådd ved å okkludere LAD ved å stramme snaren. Myokardiskemi bekreftes visuelt ved regional cyanose av epikardiet. Etter regional iskemi løsnes ligaturen, og hjertet får lov til å re-perfusere.
For både overlevelses- og ikke-overlevelseseksperimenter kan myokardfunksjonen vurderes ved ekkokardiografi (ECHO) måling av fraksjonsforkortningen. For ikke-overlevelsesstudier kan data fra sonomikrometri samlet inn ved hjelp av tre digitale piezoelektriske ultralydprober implantert i det iskemiske området og venstre ventrikkel utviklet trykk (LVDP) ved hjelp av et apikalt innsatt venstre ventrikkelkateter (LV) kontinuerlig anskaffes for å evaluere henholdsvis regional og global myokardfunksjon.
For overlevelsesstudier lukkes snittet, venstre nål thoracentese utføres for pleuraluftevakuering, og postoperativ smertekontroll oppnås.
Introduction
Hjerte- og karsykdommer er den ledende dødsårsaken i verden og bidrar til over 18 millioner dødsfall hvert år 1,2,3. Akutt hjerteinfarkt (MI) er en vanlig medisinsk nødsituasjon som utvikler seg når en blodpropp eller et stykke ateromatøs plakk blokkerer blodstrømmen til en koronararterie. Dette forårsaker regional myokardiskemi på territoriet som arterien perfuserer.
Denne studien beskriver en protokoll som benytter en enkel og pålitelig metodikk for å lage in situ akutt regional myokardiskemi i en kaninmodell for ikke-overlevelses- og overlevelseseksperimenter. Det opprinnelige målet med denne metoden var å evaluere effekten av mitokondrietransplantasjon på modulerende myokardnekrose og øke den postiskemiske hjertefunksjonen etter en iskemisk hendelse. Tidligere forskning har vist forekomsten av mitokondrielle endringer og en rask nedgang i høyenergifosfatnivåer etter utbruddet av iskemi og en reduksjon i oksygenforsyningen, noe som resulterer i en drastisk reduksjon i hjerteenergilagrene4. Etterforskere har forsøkt å forbedre postiskemisk funksjon og redusere myokardvevnekrose ved hjelp av farmakologiske inngrep og / eller prosedyreteknikker, men disse teknikkene gir begrenset kardioproteksjon og har minimal innvirkning på mitokondriell skade og dysfunksjon 5,6,7. Vårt team og andre har tidligere vist at mitokondrieskade primært oppstår ved iskemi og at kontraktil restitusjon kan forsterkes og hjerteinfarktstørrelsen reduseres ved bevaring av mitokondriell respirasjonsfunksjon under reperfusjon 8,9,10. Dermed antydet vi at mitokondriell transplantasjon fra vev upåvirket av iskemi til iskemiområdet før reperfusjon ville gi en alternativ tilnærming for å redusere myokardnekrose og forbedre myokardfunksjonen. Her beskriver vi protokollen som ble brukt til å teste denne teorien og de representative resultatene som ble oppnådd fra vår første studieanalyse.
Videre har flere etterforskere fokusert på andre emner som er viktige for å definere virkningen av myokardiskemi-reperfusjonsskade og etablere passende terapeutiske tiltak. Et slikt forskningsområde er prekondisjonering. Myokardiskemisk prekondisjonering er en kardioprotektiv mekanisme aktivert av kortvarig iskemisk stress som resulterer i en reduksjon i frekvensen av hjertecellenekrose under påfølgende episoder med langvarig iskemi. Disse mekanismene kan aktiveres ved enten hypoksi eller koronar okklusjon. Mandel et al. viste at hypoksisk-hyperoksisk prekondisjonering bidro til å opprettholde balansen mellom nitrogenoksidmetabolitter, redusert endotelin-1 hyperproduksjon og støttet organbeskyttelse11. Videre har begrepet fjerniskemisk prekondisjonering, et fenomen der enkeltorganforkondisjonering gir systemisk beskyttelse, blitt utforsket. Ali et al. fant at hos pasienter som gjennomgikk elektiv åpen abdominal aortaaneurismereparasjon, fjernkondisjonering, utført ved intermitterende kryssklemming av arteria iliaca communis for å tjene som stimulus, reduserte forekomsten av postoperativ myokardskade, hjerteinfarkt og nedsatt nyrefunksjon12.
Kaninmodeller gir potensielle fordeler i forhold til modeller med andre arter og har blitt brukt i flere forskjellige scenarier i flere tiår, inkludert induksjon av arytmier, globale og regionale iskemiske modeller og hjertekontraksjonsforskning, blant annet13,14,15. Selv om kaninhjertet er mindre enn en hund eller gris, er det stort nok til enkelt å utføre kirurgiske prosedyrer til en mye lavere pris13. Kaninhjertet brukes ofte da det er nært parallelt med menneskets hjerte; Faktisk har den en lignende metabolsk hastighet, uttrykker β-myosin tung kjede, ogmangler signifikant myokardial xantinoksidase16. Teknikken her beskrevet for å indusere regional myokardiskemi er enkel, repeterbar og kostnadseffektiv. Denne metoden tillater både ikke-overlevelse og overlevelsestilfeller, da bare regional iskemi induseres i stedet for global iskemi, og materialene som trengs er ikke-spesialiserte. To forskjellige kirurgiske tilnærminger (dvs. sternotomi og mini-torakotomi) kan benyttes, og gir dermed operatøren og eksperimentelle protokoller mer frihet når det gjelder studiedesign. I tillegg krever prosedyren ikke bruk av en kardiopulmonal bypass. I denne sammenheng har minimalt invasive tilnærminger til koronar bypasstransplantasjon blitt verdifulle alternativer for pasienter med behov for multi-vessel revascularizaiton17,18. Denne modellen kan brukes til å studere forskjellene mellom disse tilnærmingene og gi et dyrebasert læringsverktøy for kirurgiske praktikanter. I tillegg kan utførelse av hjertekateterisering ved hjelp av denne modellen være nyttig for fysiologisk forskning og / eller kirurgisk trening.
Vår modell gir en metodikk for applikasjoner der indusering av regional myokardiskemi og deretter måling av infarktstørrelse, myokardfunksjon og cellulære endringer er av betydning. Med denne protokollen har vi vært i stand til å evaluere flere markører for cellulær funksjon og tilpasning til iskemi og den foreslåtte terapeutiske intervensjonen (dvs. mitokondrietransplantasjon) ved å undersøke internalisering av organeller, oksygenforbruk, høy-energi fosfatsyntese og induksjon av cytokinmediatorer og proteomiske veier. Disse resultatene er viktige for å bevare myokardial energi, celle levedyktighet og hjertefunksjon og tillater objektiv evaluering av kardioprotektive teknikker etter iskemi-reperfusjonsskade. Denne modellen kan brukes til å studere lignende biologiske veier og alternativer innen postiskemisk myokardpatologi og gjenoppretting.
Målet med denne protokollen er å gi en svært reproduserbar metodikk for å indusere in situ akutt regional myokardiskemi hos kaninen for ikke-overlevelses- og overlevelseseksperimenter. Denne modellen gir en metodikk med høy overlevelse, lav intraoperativ mortalitet og minimal sykelighet19. Andre modeller for akutt regional myokardiskemi har blitt beskrevet ved hjelp av radiomerkede materialer, kontrastmidler, magnetisk resonansavbildning eller datasimuleringer20,21,22. Vår protokoll gir en pålitelig og enkel metodikk som er kostnadseffektiv, konsekvent reproduserbar, og har lav teknisk etterspørsel og dermed kan utføres av etterforskere uten kirurgisk kompetanse. Denne protokollen rommer enten et overlevelsesprosjekt ved hjelp av en venstre mini-torakotomi eller en ikke-overlevelsesmodell ved bruk av midtlinjesternotomi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøkelsen ble utført i henhold til National Institutes of Healths retningslinjer for dyrepleie og bruk og ble godkjent av Boston Children's Hospital's Animal Care and Use Committee (protokoll 20-08-4247R). Alle dyrene fikk human omsorg i samsvar med Veilederen for stell og bruk av forsøksdyr.
1. Dyrearter, bedøvelsesmidler og smertestillende midler
- Dyrearter: Bruk New Zealand hvite kaniner (villtype stamme; kvinnelig kjønn; kjønnsmoden 15-20 uker gammel; 3-4 kg kroppsvekt) for eksperimentelle studier.
- Anestetiske og smertestillende midler:
- Bruk atropin i en dose på 0,01 mg/kg intramuskulært (i.m.)
- Bruk acepromazin i en dose på 0,5 mg / kg i.m. for innledende sedasjon og 0,5 mg / kg intravenøs (IV) for full bedøvelse.
- Bruk butorfanol i en dose på 0,5 mg/kg i.m.
- Bruk isofluran via en presisjonsfordampet systemmaske ved 3 % for induksjon, etterfulgt av intubering ved 1%-2 %, oksygen (O2) ved 100 % ved 2 l/min, og generell anestesi ved 1 % for vedlikehold.
- Bruk medetomidin i en dose på 0,25 mg/kg i.m.
- Bruk ketamin i en dose på 10 mg / kg IV.
- Bruk en bupivakain interkostal blokk på torakotomistedet i en dose som ikke overstiger 3 mg/kg i.m.
- Bruk 1% lidokain i en dose på 1-1,5 ml / kg IV.
- Bruk et 1-4 mikrogram/kg fentanyl depotplaster i 72 timer.
2. Prosedyretrinn (figur 1)
- Sedate New Zealand Hvite voksne kaniner med en enkelt kombinert IM-injeksjon av atropin, acepromazin og butorfanol. Indusere dyret med 3 % isofluran via en ansiktsmaske med presisjonsfordampet system.
- Forberedelse før blindet endotrakeal intubasjon (dvs. uten visualisering av glottis)
- Spray strupehodet med 1% lidokain for å forhindre laryngospasme.
- Forhåndsmål endotrakealrørets (ETT) lengde på utsiden av kaninen fra tennene til den forutsagte carina, og plasser kaninen i en sternal liggende stilling med nakken forlenget.
- Intuber dyret med en mansjett pediatrisk størrelse (3-0 eller 3-5 indre diameter) ETT under kontinuerlig inhalert bedøvelse ved 1% -2% og O 2 ved 100% ved2 l / min.
- Sett ETT inn i munnen, og rett den forbi torusen inn i svelget.
- Flytt ETT til enten tuppen av røret kommer i kontakt med glottis eller pustelydene går tapt, noe som indikerer at rørspissen har passert gjennom den glottiske åpningen.
- Trekk litt ut røret til pustelydene er gjenvunnet, og fortsett deretter igjen, og fest røret på plass.
- Luft dyret med mekanisk støtte (tidevannsvolum: 10 ml/kg, fraksjon avinspirert Ø2: 40 %, respirasjonsfrekvens: 30-40 pust/min, positivt endeekspiratorisk trykk: 5-10 cmH2O).
- Juster FiO2 som tolerert for å oppnå en O2-metning større enn92 % målt ved pulsoksimetri for å forhindre hyperoksi, noe som kan provosere en systemisk inflammatorisk respons.
- Kontroller riktig plassering av ETT ved en fysisk eksamen (dvs. auskultasjon), kliniske tegn (dvs. observasjon av kondensasjon på slutten av endotrakealrøret) og med objektive tiltak (dvs. karbondioksid ved tidevann).
- Etter ca. 10 minutter skal en i.m. injeksjon av medetomidin gis til kaninen for å gi samtidig anestesi- og smertestillende effekt.
- Opprettholde generell anestesi med 1% isofluran i løpet av den kirurgiske prosedyren.
- Sett inn et 22 G IV kateter i den marginale ørevenen, og fest det med tape for å oppnå perifer IV-tilgang.
MERK: Lårvenen kan brukes som et alternativt sted for venøs tilgang.- Fullt anestesere dyret med acepromazin IV og ketamin IV.
- Før snittet injiseres 1000 E/ml heparin i en dose på 3 mg/kg i.v.
- Administrer 1000 E/ml heparin i en dose på 3 mg/kg initialt, og re-dose hver time til slutten av forsøket for å opprettholde en aktivert koagulasjonstid på >400 s, i tråd med gjeldende kirurgisk protokoll.
- Administrer 1% lidokain IV og / eller epikardial asynkronisert defibrillering etter behov hvis ventrikkelflimmer oppstår under operasjonen. Ventrikkelflimmer stopper vanligvis med en eller to doser lidokain.
- Perfuse laktat Ringers oppløsning kontinuerlig ved 10 ml/kg/t.
MERK: Gitt det lille volumet av væske som ble administrert og de korte operative tidene, krevde dyrene i overlevelsesstudier i dette arbeidet ikke diurese før ekstubering eller i restitusjonsperioden. Hvis dyret utvikler en forverret lungestatus (dvs. økning av ventilatorinnstillingene, tegn på lungeødem ved auskultasjon, etc.), anbefales diurese.
- Utfør en carotis kutt ned, og plasser en 4 eller 5 fransk arteriell linje for å lette intraoperativ overvåking av arterielt blodtrykk (BP).
MERK: Lårarterien kan brukes som et alternativt sted for arteriell tilgang. - Overvåk og registrer alle fysiologiske og mekaniske variabler ved kontinuerlig sanntidsanalyse.
- Overvåk arteriell BP med halspulsåren, og registrerO2-metningen ved hjelp av pulsoksymetri via en sensor plassert på en barbert pote.
- Monitor med et elektrokardiogram (EKG) med tre lemledninger: I, II og III, og tre beregnede forstørrede ledninger: aVL, aVR og aVF.
- Registrer EKG-sporingene ved pre-iskemisk baseline, under iskemi, under reperfusjon og serielt i løpet av dag 7-28 av utvinning (hvis du utfører en overlevelsesstudie).
- Overvåk sedasjonsnivået ved kontinuerlig overvåking av BP og hjertefrekvens (HR).
- Overvåk temperaturen med en rektal sonde.
- Bruk 2D ECHO fra venstre parasternale og apikale visninger for å vurdere myokardfunksjonen ved ønskede tidspunkter i både overlevelses- og ikke-overlevelsestilfeller.
- Vurder myokardfunksjonen ved hjelp av fraksjonell forkortelse (FS) ved å måle venstre ventrikkels endediastoliske avstand (LVEDD) og venstre ventrikkels endesystoliske avstand (LVESD) og bruke følgende formel:
FS = (LVEDD − LVESD)/LVEDD × 100
- Vurder myokardfunksjonen ved hjelp av fraksjonell forkortelse (FS) ved å måle venstre ventrikkels endediastoliske avstand (LVEDD) og venstre ventrikkels endesystoliske avstand (LVESD) og bruke følgende formel:
- Under operasjonen, legg dyret på et sirkulerende varmtvannsteppe for å opprettholde en stabil kjerne kroppstemperatur.
- Forbered og draper dyret på en steril måte:
- Barber operasjonsstedet, og prep med betadin og 70% isopropylalkohol, hver påført i triplikat. Klapp området tørt med sterile gasbind, og draper hele dyret med sterile håndklær.
- Venstre mini-torakotomi (overlevelsesstudier)
- Utfør en intercostal blokk på det forhåndsbestemte torakotomistedet med bupivakain IM.
- Administrer 1 % lidokain IV via ørevenen før snitt.
- Utfør en venstre mini-torakotomi gjennom det fjerde interkostalrommet langs den øvre delen av den femte ribben for å unngå den nevromuskulære bunten, som ligger parallelt med underoverflaten av hver ribbe.
- Utfør en anterolateral torakotomi for best mulig visualisering av den anterolaterale overflaten av hjertet (dvs. den anatomiske plasseringen av LAD diagonale grener).
- Plasser kaninen med venstre side hevet ca. 30° ved hjelp av en pute eller bønnepose.
- Fest kaninens ipsilaterale ben over hodet for å skape plass til både operasjonsfeltet og mellom ribbeområdene.
- Palpate og skissere de benete landemerkene, inkludert ribbeina, brystbenet og scapulaen, med en filttippet merkepenn. Snitt huden over den femte ribben ved hjelp av en # 10 blad. Sørg for at snittet forblir parallelt med ribben.
- Bruk elektrocautery å dele pectoralis store muskel og serratus anterior muskel. Del de intercoastal musklene rett over den femte ribben med elektrocautery for å bevare nevrovaskulær bunt.
- Gå forsiktig inn i pleuralrommet gjennom det fjerde interkostalrommet med skarp eller stump disseksjon. Forleng det første pleurasnittet parallelt med ribben i begge retninger med skarp eller stump disseksjon til en ribbespreder eller sternal retractor kan settes inn.
- Plasser en ribbe spreder eller sternal retractor innenfor ribbe plass, og utvide for å gi tilstrekkelig visualisering av hjertet og perikardial sac. Løft perikardiet med DeBakey-tang, og åpne perikardiet med Metzenbaum-saks.
- LAD arterie isolasjon
- Omkrans den andre eller tredje diagonale grenen av LAD-arterien med en polypropylensutur (3-0) på en konisk nål. Fjern nålen, og tre begge ender av polypropylenfilamentet gjennom et lite vinylrør for å danne en snare.
- Plasser en pledget mellom snaren og koronararterien for å unngå å skade koronar og / eller forårsake vasospasme med ligering.
- Bruk DeBakey tang til å plukke opp en rektangulær PTFE filtpant (ca. 7 mm x 3 mm). Plasser pledget mellom de to polypropylenfilamentene slik at det blir klemt mellom den isolerte LAD-arterien og vinylrøret når snaren strammes.
- Midtlinjesternotomi (ikke-overlevelsesstudier)
MERK: Midtlinjen sternotomi tilnærming er ideell for ikke-overlevelse tilfeller, for hvilke mer invasiv overvåking med LVDP og sonomicrometry kan benyttes.- Utfør en midtlinjesternotomi ved hjelp av buet Mayo-saks. Plasser en sternal retractor, og utvide den for å gi tilstrekkelig visualisering av hjertet og perikardial sac.
- Løft perikardiet med DeBakey-tang, og åpne perikardiet med Metzenbaum-saks.
- Plassering av de tre piezoelektriske sonomikrometrikrystallene:
- Lag tre små 1 mm kutt på LVs epikardium, og danner hjørnene i en trekant. Plasser de piezoelektriske sonomikrometrikrystallene inne i epikardiumkuttene.
- Fest ledningene til hjerteoverflaten med en 5-0 polypropylen U-søm. Når du tar opp ved hjelp av sonomikrometri, pause den mekaniske ventilasjonen for å muliggjøre et nøyaktig opptak over to til tre hjerteslag.
MERK: Hvis hjertet fibrillerer, er 1% lidokain ikke effektivt, og epikardial defibrillering er nødvendig, slå av sonomicrometeret og koble det fra datainnsamlingssystemet for å beskytte begge mot elektrisk inngang.
- LAD arterie isolasjon:
- Omkrans den andre eller tredje diagonale grenen av LAD-arterien med en polypropylensutur (3-0) på en konisk nål.
- Fjern nålen, og tre begge ender av polypropylenfilamentet gjennom et lite vinylrør for å danne en snare.
- Plasser en pledget mellom snaren og koronararterien for å unngå å skade koronararterien og / eller forårsake vasospasme med ligering.
- Bruk DeBakey tang til å plukke opp en rektangulær PTFE filtpant (ca. 7 mm x 3 mm). Plasser pledget mellom de to polypropylenfilamentene slik at det blir klemt mellom den isolerte LAD-arterien og vinylrøret når snaren strammes.
- Måling av LVDP:
- Plasser en 5-0 polypropylen U-søm i toppen av LV. Lag et lite 1 mm snitt med et 11-blad i LV-toppen.
- Sett inn et 3 fransk ballongkateter i LV-lumen. Fest kateteret til LV ved å binde det til 5-0 polypropylen U-sømsuturen.
- Koble kateteret til transduseren som er koblet til skjermen for å registrere LVDP. Registrer LVDP ved hjelp av datainnsamlingssystemet (beskrevet nedenfor). Null kateteret for å registrere de hemodynamiske variablene ved å åpne treveis stoppekranen i luften og nullstille på skjermen.
- System for datainnsamling
- Start datainnsamlingssystemet (se materialfortegnelsen) på datamaskinen / den bærbare datamaskinen som brukes. Koble ledningen fra skjermen til datamaskinen / den bærbare datamaskinen.
- Velg Kanal 1 på datainnsamlingssystemet, og gi den navnet LVDP. Nullstill svingeren ved hjelp av skjermen.
MERK: Hvis du kobler BP og HR til datainnsamlingssystemet, følger du samme prosess: Koble ledningen til den bærbare datamaskinen, velg Kanal og null hvis du måler BP.
- Okkluder koronararterien ved å stramme snaren ved å trykke ned på vinylrøret mens du trekker opp polypropylensuturfilamentene. Opprettholde ønsket tetthet med en myggklemme ved å klemme røret direkte og feste det på plass.
- Bekreft myokardisk iskemi visuelt ved epikardiets regionale cyanose. Regional iskemi kan også bekreftes på EKG med tilstedeværelse av et ST-segment og T-bølgeendringer.
- Etter visuell bekreftelse, indusere regional iskemi i 30 minutter under anestesi.
- Ved 0 min, 10 min, 20 min og 30 minutter under regional iskemi, vurder FS ved 2D ECHO for både overlevelses- og ikke-overlevelsestilfeller.
- Vurder LVDP og sonomikrometri kontinuerlig i løpet av pre-iskemitiden, myokardiskemitiden og postiskemisk tid for ikke-overlevelsestilfellene.
- Hvis nødvendig, avgrens det risikofylte området ved å ligere arterien igjen med polypropylensutursømmen igjen på plass. Kryssklem aorta, og injiser Monastral Blue pigment 98% (fortynnet 1:5 i PBS) gjennom aorta ved hjelp av en kardiopleginål. De perfuserte områdene i myokardiet vil farget blått, og det aktuelle området vil forbli ufarget.
- Overvåk og registrer kontinuerlig HR-, BP- og O 2-metningen.
- La dyret komme seg i 2 timer (ikke-overlevelse) eller 28 dager (overlevelse).
MERK: EKG kan brukes til å bekrefte reperfusjon. Selv om det ikke er sett i forsøket som ble utført i denne studien, kan hypokalemi ofte oppstå under reperfusjon og kan korrigeres med kaliumkontroll eller en passende infusjon.
- Konklusjon av prosedyren
- Overlevelsessaker
- I overlevelsestilfeller, trim 3-0 polypropylentråden som brukes til snaren, bind endene løst sammen og la den være på plass. Identifiser området i fare og infarktsonen ved 3-0 polypropylentråden.
- Etter at prosedyren er fullført, lukk snittet i tre lag.
- Lukk det første laget ved å binde to 2-0 polyglactin 910 figur-of-eight masker rundt ribbeina.
- Lukk de muskulære og subkutane lagene med en 3-0 polydioxanon sutur på løpende måte.
- Lukk huden på en subkutulær måte ved hjelp av en 5-0 monofilament sutur. Bruk en nedgravd løpesetur for å minimere irritasjonen følt av dyret.
- Evakuer pleuralluften ved å utføre en nål thoracentese.
- Påfør et fentanyl depotplaster i 72 timer for å lette den postoperative smertebehandlingen.
- Utfør transtorakal ekkokardiografi postoperativt ved 1 ukes og 2 ukers tidspunkt for å vurdere trender i FS.
- Etter den forhåndsbestemte gjenopprettingsperioden, sedere, intubere og bedøve dyret som ovenfor. Utfør en median sternotomi. Utsett og åpne perikardialsekken. Avlive kaninen under dyp anestesi ved å fjerne hjertet en blokk, slik at dyret kan utløpe ved ekssanguinering.
- Ikke-overlevelsestilfeller
- Etter forsøket og etter å ha sikret dyp anestesi, eksponer hjertet helt, og fjern det en blokk for biokjemisk og vevsanalyse. Dyret utløper ved ekssanguinering.
- Overlevelsessaker
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter protokollen (figur 1) ble myokardiskemi bekreftet umiddelbart ved direkte visualisering av epikardets cyanose.
Standard EKG (tre lemavledninger: I, II og III, og tre beregnede forstørrede avledninger: aVL, aVR og aVF) ble registrert kontinuerlig pre-iskemi, under iskemi og ved reperfusjon (figur 2). EKG viser takykardi, arytmier (dvs. ventrikkelflimmer), ledningssystemdefekter (dvs. grenblokk), utvikling av infarktrelaterte Q-bølger og ST-segmentavvik23.
Under regional iskemi ble regional hypokinesi direkte observert med det blotte øye i midthulen i fremre vegg i alle hjerter, forenlig med LAD-arteriens perfusjonsområde som ble gjort iskemisk ved begrensning av strømning med midlertidig snaring av LAD. I både overlevelses- og ikke-overlevelsestilfeller ble 2D ECHO-avlesninger oppnådd under pre-iskemi, like før indusering av regional iskemi, og på forskjellige tidspunkter under forsøket: 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min og 120 min. Venstre ventrikkels endediastoliske (LVEDD) og venstre ventrikkels endesystoliske dimensjoner (LVESD) ble målt med 2D-veiledet M-modus ECHO ved henholdsvis maksimal og minimal LV-omkrets. Den regionale LV-veggkontraktiliteten i den myokardiale iskemiske sonen ble vurdert fra kortaksevisninger av LV ved bruk av M-modus, med markørlinjen overliggende området i fare. Brøkforkortelsen (FS) ble beregnet med følgende formel: FS = (LVEDD − LVESD)/LVEDD × 10024. Resultatene viste at fraksjonsforkortelsen avtok i løpet av iskemisk tid og postiskemisk tid sammenlignet med pre-iskemisk tid (figur 3)
For å kvantifisere omfanget av myokardskade kan infarktstørrelsen måles biokjemisk med trifenyltetrazoliumklorid (TTC) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) farging. I dette arbeidet ble det risikoutsatte området avgrenset ved religering av den involverte arterien ved å binde Prolen-sømmen som var igjen på plass. Aorta ble kryssklemt, og Monastral Blue pigment (fortynnet 1:5 i PBS) ble levert gjennom aorta ved hjelp av en kardiopleginål. Områdene med perfusert myokard ble farget blå, og det risikofylte området forble ufarget på grunn av arteriens ligering.
Hjertet ble skåret over venstre ventrikkels lange akse, fra apex til base, i 1 cm tykke tverrsnitt, plassert mellom glassplater og komprimert med bulldogklemmer. Risikoområdet for hver side av hver seksjon ble sporet på et klart acetatark. Hjerteseksjonene ble inkubert i en mørk beholder med 1 % TTC i fosfatbuffer (pH 7,4) ved 38 °C i 20 minutter. Hjerteseksjonene ble deretter lagret i en 10% formaldehydløsning i 24 timer før de endelige målingene for å forbedre visualiseringen av infarktsonen. Seksjonene ble plassert mellom glassplater og komprimert med bulldogklemmer. Myokardnekrose ble påvist av et hvitt område på myokardvevet, og de mursteinrøde områdene viste det levedyktige vevet. (Figur 4) De infarkterte områdene (hvite) innenfor risikoområdene for hver side av hver seksjon ble sporet på det klare acetatarket. Planimetri ble brukt for å måle risikoområdet og infarktsonen. Volumene i risikosonen og infarktsonen ble beregnet ved å multiplisere de planmålte arealene med skivetykkelsen. Infarktvolumet ble uttrykt i prosent av totalt LV-volum for hvert hjerte25. Forholdet mellom risikoområdet og LV-vekten ble beregnet, og infarktstørrelsen ble uttrykt som en prosentandel av risikoområdet. Vårt tidligere arbeid viste at etter 2 timer og 28 dager med utvinning var områdene i fare (dvs. i prosent av LV-massen) henholdsvis ca. 29% og 27% for både mitokondrie- og kontrollgruppen Men etter 2 timer og 28 dager med utvinning var infarktstørrelsen (dvs. infarktstørrelse / risikoområde) i mitokondriehjertene 9,8% og 7,9% henholdsvis, sammenlignet med 37 % og 34 % i kontrollhjertene26. I tillegg, i våre tidligere eksperimenter, ble fraksjonell forkortelse og LVDP redusert i kontrollgruppen til henholdsvis 50% -60% og 70% -80% sammenlignet med baseline.
Figur 1: Protokolldiagram. Protokollen kan justeres basert på eksperimentets behov, enten for overlevelses- eller ikke-overlevelsestilfeller. Ikke-overlevelsestilfeller kan utføres med en mer invasiv kirurgisk tilnærming ved bruk av midtlinjesternotomi, og dermed tillate bruk av sonomikrometrikrystaller, epikardial ekkokardiografi (ECHO) og et LV-kateter for måling av fraksjonell forkortelse og LVDP. For overlevelsestilfeller, hvor incisjonsheling og smertebehandling må vurderes, kan venstre mini-torakotomi utføres, og myokardfunksjonen kan vurderes på ulike tidspunkt i løpet av en lengre studieperiode med 2D ECHO. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Representativt elektrokardiogram (lem II og beregnet forstørret bly aVL) før regional iskemiinduksjon, i iskemisk tid og under reperfusjon. Millivolt- og millisekundskalaer vises til venstre. Tidspunktene og tidspunktet for venstre fremre synkende arterie snaring er vist nederst. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Ekkokardiografisk vurdering av hjertet ved måling av brøkforkortning (FS). Brøkforkortningen ble målt ved å oppnå venstre ventrikkels endediastoliske avstand og venstre ventrikkels endesystoliske avstand med 2D-styrt M-modus ved henholdsvis maksimal og minimal LV-omkrets. Den fraksjonelle forkortelsen ble vurdert ved (A) baseline/pre-iskemi, (B) under midlertidig snaring av venstre fremre synkende (LAD) arterie med markørlinjen overliggende området i fare, og (C) under reperfusjon etter frigjøring av snaren på LAD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Representative bilder av infarktstørrelse for et hjerte farget med 1% trifenyltetrazoliumklorid etter 30 min indusert myokardisk regional iskemi. Det levedyktige vevet ses som rødt, mens infarktet ses som hvite områder. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår protokoll viser en pålitelig metodikk for å utføre akutt regional myokardiskemi hos kaninen. Den venstre mini-torakotomi tilnærmingen er ideell for overlevelsestilfeller, hvor snittet og tilhørende smerte må minimeres. Det er viktig at diuretikabehandling ikke var nødvendig før ekstubasjon, og det var ingen mortalitet intraoperativt i ikke-overlevelsesgruppen eller 4 uker postoperativt i overlevelsesgruppen. Ved utforming av protokollen ved behov for ikke-overlevelse, eller ved behov for mer detaljert monitorering av global og regional myokardfunksjon, kan midtlinjesternotomi benyttes (figur 1).
De mest kritiske trinnene i protokollen er å omringe LAD forsiktig med en konisk nål uten å skade arterien eller skape venøs blødning og å okkludere LAD for å skape et konsistent område i fare.
Noen komplikasjoner som kan oppleves ved utførelse av den beskrevne operasjonen er lungeoverdistensjon under mekanisk ventilasjon på grunn av høyt tidalvolum, blødning fra skade på LAD, blødning sekundært til interkostalkarskade, som vanligvis oppstår ved inngang eller fra retractormanipulasjon, og / eller hjertearytmi (intraoperativ ventrikkelflimmer) med LAD ligering. Andre postoperative komplikasjoner kan også forekomme, som infeksjon på operasjonsstedet, dårlig dyremobilisering på grunn av smerte og/eller gjenværende myokardial regional hypokinese. Til tross for at forekomsten av disse komplikasjonene er svært lav, bør utprøver være i stand til å håndtere dem på en lett og effektiv måte.
Kaniner presenterer som en utmerket dyremodell for myokardstudier. Deres hjertefrekvens er lik den menneskelige hjertefrekvensen, og deres størrelse er tilstrekkelig liten, men tillater histologisk analyse under et optisk mikroskop.
En begrensning i denne studien bør anerkjennes; Spesielt er kaninhjertet mindre og klinisk mindre relevant for sammenligninger med menneskets hjerte enn hjertene til andre store dyremodeller som grisen.
På grunn av forekomsten og utbredelsen av kardiovaskulær sykdom er det av avgjørende betydning å ha en dyremodell som simulerer regional myokardiskemi. Denne metoden kan ha flere bruksområder og har vist seg å være nyttig i modeller av vaskulær skade, kronisk myokardiskemi og korte perioder med myokardbedøvelse 27,28,29,30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter, økonomiske eller på annen måte, er erklært av forfatterne.
Acknowledgments
Den opprinnelige studien der denne protokollen ble brukt, ble støttet av National Heart, Lung, and Blood Institute Grants HL-103642 og HL-088206
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 blade | Bard Parker | 371210 | |
| #11 blade | Fisher Scientific | B3L | |
| 22 G PIV needle | BD Insyte | 381423 | |
| Acepromazine | VETONE | NDC 13985-587-50 | 0.5 mg/kg IM and IV |
| Aline pressure bag | Infu-Stat | 2139 | |
| Angiocath | Becton Dickinson | 382512 | |
| Arterial Catheter | Teleflex | MC-004912 | |
| Atropine | Hikma Pharmaceuticals | NDC 0641-6006-01 | 0.01 mg/kg IM |
| Betadine and 70% isopropyl alcohol | McKesson | NDC 68599-2302-6 | |
| Blood gas machine | Siemens | MRK0025 | |
| Bovie | Valleylab | E6008 | |
| Bulldog clamps | World Precision Instruments | 14119 | |
| Bupivacaine | Auromedics | NDC 55150-249-50 | 3 mg/kg IM |
| Butorphanol | Roxane | NDC 2054-3090-36 | 0.5 mg/kg IM |
| Clear acetate sheet | Oxford Instruments | ID 51-1625-0213 | |
| Clipers | Andis | AGC2 | |
| DeBakey forceps | Integra | P6280 | |
| Echocardiography machine | Philips | IE33 F1 | |
| Electrocardiography machine | Meditech | MD908B | |
| Endotracheal tube | Medline | #922774 | |
| Fentanyl | West-Ward | NDC 0641-6030-01 | 1–4 µg/kg transdermal patch |
| Formaldehyde solution 10% | Epredia | 94001 | |
| Glass plates | United Scientific | B01MUHX6MR | |
| Heparin Sodium | Sagent | NDC 69-0058-02 | 1000U in 1 mL 3 mg/kg |
| Hot water blanket | 3M | 55577 | |
| Isoflurane | Penn Veterinary Supply, INC | NDC 50989-606-15 | 1%–3% |
| Ketamine | Dechra | NDC 42023-138-10 | 10 mg/kg IV |
| Lab Chart 7 Acquisition Software | Adinstruments | ||
| Lactated Ringer's solution | ICUmedical | NDC 0990-7953-09 | 10 mL/kg/h |
| Laryngoscope | Welch Allyn | 68044 | |
| Left ventricule lumen catheter 3Fr | McKesson | 385764-EA | |
| Lidocaine (1%) | Pfizer | 4276-01 | 1–1.5 mL/kg IV |
| LVDP transducer | Edward | PDP-ED | |
| Marking pen | Viscot | 1451SR-100 Unsterile | |
| Mayo scissors | Mayo | S7-1098 | |
| Medetomidine | Entireoly Pets Pharmacy | NDC 015914-005-01 | 0.25 mg/kg IM |
| Metzenbaum scissors | Cole-Parmer | UX-10821-05 | |
| Monastra. Blue pigment 98% | Chemsavers | MBTR1100G | |
| Monocryl 5-0 | Ethicon | Y463G | |
| Mosquito clamp | Shioda | 802N | |
| PDS 3-0 | Ethicon | 42312201 | |
| Piezoelectric sonomicrometry crystals | Sonometrics | Small 2mm round | |
| Plegets | DeRoyal | 32-363 | |
| Povuine Iodine Prep Solutions | Medline | MDS093940 | |
| Precision vaporized system face mask | Yuwell | B07PNH69BF | |
| Prolene 3-0 | Ethicon | 8665G | |
| Proline 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Pulse oximetry probe | Masimo | 9216-U | |
| Rib spreader | Medline | MDS5621025 | |
| S12 Pediatric Sector Probe | Phillips | 21380A | |
| Sonomicrometer | Sonometrics | BZ10123724 | |
| Sterile gauze | Medline | 3.00802E+13 | |
| Sterile towels | McKesson | MON 277860EA | |
| Sternal retractor | Medline | MDS5610321 | |
| Sutures for closure | J&J Dental | 8698G | |
| Telemetriy monitor | Meditech | MD908B | |
| Temperature probe | Omega | KHSS-116G-RSC-12 | |
| Triphenyl tetrazolium chloride (1%) | Millipore | MFCD00011963 | |
| Ventilator | MedGroup | MSLGA 11 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | V635H | |
| Vinyl tubing | ABE | DISW 3001 |
References
- Selvin, E., Erlinger, T. P. Prevalence of and risk factors for peripheral arterial disease in the United States: Results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2000. Circulation. 110 (6), 738-743 (2004).
- Bolli, R., et al. Myocardial protection at a crossroads: The need for translation into clinical therapy. Circulation Research. 95 (2), 125-134 (2004).
- Cohn, J. N., et al. Report of the National Heart, Lung, and Blood Institute Special Emphasis Panel on Heart Failure Research. Circulation. 95 (4), 766-770 (1997).
- Rousou, A. J., Ericsson, M., Federman, M., Levitsky, S., McCully, J. D. Opening of mitochondrial KATP channels enhances cardioprotection through the modulation of mitochondrial matrix volume, calcium accumulation, and respiration. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (5), H1967-H1976 (2004).
- Rao, V., et al. Insulin cardioplegia for elective coronary bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 119 (6), 1176-1184 (2000).
- Vinten-Johansen, J., Zhao, Z. Q., Jiang, R., Zatta, A. J. Myocardial protection in reperfusion with postconditioning. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 3 (6), 1035-1045 (2005).
- Wakiyama, H., et al. Selective opening of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels during surgically induced myocardial ischemia decreases necrosis and apoptosis. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 21 (3), 424-433 (2002).
- Chen, Q., Moghaddas, S., Hoppel, C. L., Lesnefsky, E. J. Reversible blockade of electron transport during ischemia protects mitochondria and decreases myocardial injury following reperfusion. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 319 (3), 1405-1412 (2006).
- Lesnefsky, E. J., et al. rather than reperfusion, inhibits respiration through cytochrome oxidase in the isolated, perfused rabbit heart: Role of cardiolipin. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), H258-H267 (2004).
- McCully, J. D., Rousou, A. J., Parker, R. A., Levitsky, S. Age- and gender-related differences in mitochondrial oxygen consumption and calcium with cardioplegia and diazoxide. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (3), 1102-1109 (2007).
- Mandel, I. A., et al. Influence of hypoxic and hyperoxic preconditioning on endothelial function in a model of myocardial is-chemia-reperfusion injury with cardiopulmonary bypass (Experimental study). International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5336 (2020).
- Ali, Z. A., et al. Remote ischemic preconditioning reduces myocardial and renal injury after elective abdominal aortic aneurysm repair: A randomized controlled trial. Circulation. 116, 98-105 (2007).
- Pogwizd, S. M., Bers, D. M.
- Tanaka, K., Hearse, D. J. Reperfusion-induced arrhythmias in the isolated rabbit heart: characterization of the influence of the duration of regional ischemia and the extracellular potassium concentration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 20 (3), 201-211 (1988).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Gupta, M. P. Factors controlling cardiac myosin-isoform shift during hypertrophy and heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43 (4), 388-403 (2007).
- Lapierre, H., Chan, V., Sohmer, B., Mesana, T. G., Ruel, M. Minimally invasive coronary artery bypass grafting via a small thoracotomy versus off-pump: A case-matched study. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 40 (4), 804-810 (2011).
- Aubin, H., Akhyari, P., Lichtenberg, A., Albert, A. Additional right-sided upper "half-mini-thoracotomy" for aortocoronary bypass grafting during minimally invasive multivessel revascularization. Journal of Cardiothoracic Surgery. 10, 130 (2015).
- Hu, N., et al. Ligation of the left circumflex coronary artery with subsequent MRI and histopathology in rabbits. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (6), 838-844 (2010).
- Sievers, R. E., et al. A model of acute regional myocardial ischemia and reperfusion in the rat. Magnetic Resonance in Medicine. 10 (2), 172-181 (1989).
- Rodríguez, B., Trayanova, N., Noble, D.
- Sinusas, A. J., et al. Quantification of area at risk during coronary occlusion and degree of myocardial salvage after reperfusion with technetium-99m methoxyisobutyl isonitrile. Circulation. 82 (4), 1424-1437 (1990).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Pombo, J. F., Troy, B. L., Russell, R. O. J. Left ventricular volumes and ejection fraction by echocardiography. Circulation. 43 (4), 480-490 (1971).
- McCully, J. D., Wakiyama, H., Hsieh, Y. J., Jones, M., Levitsky, S. Differential contribution of necrosis and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), H1923-H1935 (2004).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 304 (7), 966-982 (2013).
- Abarbanell, A. M., et al. Animal models of myocardial and vascular injury. Journal of Surgical Research. 162 (2), 239-249 (2010).
- Pirat, B., et al. A novel feature-tracking echocardiographic method for the quantitation of regional myocardial function: Validation in an animal model of ischemia-reperfusion. Journal of the American College of Cardiology. 51 (6), 651-659 (2008).
- Verdouw, P. D., vanden Doel, M. A., de Zeeuw, S., Duncker, D. J. Animal models in the study of myocardial ischaemia and ischaemic syndromes. Cardiovascular Research. 39 (1), 121-135 (1998).
- Bolukoglu, H., et al. An animal model of chronic coronary stenosis resulting in hibernating myocardium. The American Journal of Physiology. 263, H20-H29 (1992).
- Heyndrickx, G. R., Millard, R. W., McRitchie, R. J., Maroko, P. R., Vatner, S. F. Regional myocardial functional and electrophysiological alterations after brief coronary artery occlusion in conscious dogs. Journal of Clinical Investigation. 56 (4), 978-985 (1975).
