Summary
Il presente studio dimostra un modello animale altamente riproducibile di ischemia miocardica regionale acuta e danno da riperfusione nei conigli utilizzando una mini-toracotomia sinistra per i casi di sopravvivenza o una sternotomia della linea mediana per i casi di non sopravvivenza.
Abstract
Il protocollo fornisce una metodologia semplice e altamente replicabile per indurre in situ l'ischemia miocardica regionale acuta nel coniglio per esperimenti di non sopravvivenza e sopravvivenza. Il coniglio bianco adulto della Nuova Zelanda viene sedato con atropina, acepromazina, butorfanolo e isoflurano. L'animale viene intubato e posto in ventilazione meccanica. Un catetere endovenoso viene inserito nella vena marginale dell'orecchio per l'infusione di farmaci. L'animale viene pre-medicato con eparina, lidocaina e soluzione di Ringer lattato. Viene eseguita una riduzione della carotide per ottenere l'accesso alla linea arteriosa per il monitoraggio della pressione arteriosa. I parametri fisiologici e meccanici selezionati vengono monitorati e registrati da un'analisi continua in tempo reale.
Con l'animale sedato e completamente anestetizzato, viene eseguita una toracotomia sinistra del quarto spazio intercostale (sopravvivenza) o una sternotomia della linea mediana (non sopravvivenza). Il pericardio viene aperto e si trova l'arteria discendente anteriore sinistra (LAD).
Una sutura in polipropilene viene fatta passare attorno al secondo o terzo ramo diagonale dell'arteria LAD e il filamento di polipropilene viene infilato attraverso un piccolo tubo di vinile, formando un laccio. L'animale viene sottoposto a 30 minuti di ischemia regionale, ottenuta occludendo il LAD stringendo il laccio. L'ischemia miocardica è confermata visivamente dalla cianosi regionale dell'epicardio. A seguito di un'ischemia regionale, la legatura viene allentata e il cuore può ripercepirsi.
Sia per gli esperimenti di sopravvivenza che per quelli di non sopravvivenza, la funzione miocardica può essere valutata tramite una misurazione ecocardiografica (ECHO) dell'accorciamento frazionario. Per gli studi di non sopravvivenza, i dati della sonomicrometria raccolti utilizzando tre sonde a ultrasuoni piezoelettriche digitali impiantate all'interno dell'area ischemica e della pressione sviluppata dal ventricolo sinistro (LVDP) utilizzando un catetere del ventricolo sinistro inserito apicamente (LV) possono essere acquisiti in modo continuo per valutare rispettivamente la funzione miocardica regionale e globale.
Per gli studi di sopravvivenza, l'incisione viene chiusa, viene eseguita una toracentesi con ago sinistro per l'evacuazione dell'aria pleurica e si ottiene il controllo del dolore postoperatorio.
Introduction
Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte nel mondo e contribuiscono a oltre 18 milioni di decessi ogni anno 1,2,3. L'infarto miocardico acuto (IM) è un'emergenza medica comune che si sviluppa quando un coagulo di sangue o un pezzo di placca ateromatosa blocca il flusso sanguigno di un'arteria coronaria. Ciò provoca ischemia miocardica regionale nel territorio in cui l'arteria perfue.
Il presente studio descrive un protocollo che utilizza una metodologia semplice e affidabile per creare un'ischemia miocardica regionale acuta in situ in un modello di coniglio per esperimenti di non sopravvivenza e sopravvivenza. L'obiettivo iniziale di questa metodica era quello di valutare gli effetti del trapianto mitocondriale sulla modulazione della necrosi miocardica e sull'aumento della funzione cardiaca post-ischemica a seguito di un evento ischemico. Ricerche precedenti hanno dimostrato l'insorgenza di alterazioni mitocondriali e un rapido declino dei livelli di fosfato ad alta energia in seguito all'insorgenza di ischemia e una riduzione dell'apporto di ossigeno, con conseguente drastica diminuzione delle riserve di energia cardiaca4. I ricercatori hanno tentato di migliorare la funzione post-ischemica e ridurre la necrosi del tessuto miocardico utilizzando interventi farmacologici e/o tecniche procedurali, ma queste tecniche forniscono una cardioprotezione limitata e hanno un impatto minimo sul danno mitocondriale e sulla disfunzione 5,6,7. Il nostro team e altri hanno precedentemente dimostrato che il danno mitocondriale si verifica principalmente durante l'ischemia e che il recupero contrattile può essere migliorato e le dimensioni dell'infarto miocardico diminuite con la conservazione della funzione respiratoria mitocondriale durante la riperfusione 8,9,10. Pertanto, abbiamo ipotizzato che il trapianto mitocondriale da tessuti non interessati da ischemia all'area di ischemia prima della riperfusione fornirebbe un approccio alternativo per ridurre la necrosi miocardica e migliorare la funzione miocardica. In questo articolo, descriviamo in dettaglio il protocollo utilizzato per testare questa teoria e i risultati rappresentativi ottenuti dalla nostra analisi iniziale dello studio.
Inoltre, diversi ricercatori si sono concentrati su altri argomenti fondamentali per definire l'impatto del danno da ischemia-riperfusione miocardica e stabilire interventi terapeutici appropriati. Una di queste aree di ricerca è quella del precondizionamento. Il precondizionamento ischemico miocardico è un meccanismo cardioprotettivo attivato da un breve stress ischemico che si traduce in una riduzione del tasso di necrosi delle cellule cardiache durante i successivi episodi di ischemia prolungata. Questi meccanismi possono essere attivati dall'ipossia o dall'occlusione coronarica. Mandel et al. hanno dimostrato che il precondizionamento ipossico-iperossico ha contribuito a mantenere l'equilibrio dei metaboliti dell'ossido nitrico, ha ridotto l'iperproduzione di endotelina-1 e ha supportato la protezione degli organi11. Inoltre, è stato esplorato il concetto di precondizionamento ischemico remoto, un fenomeno in cui il precondizionamento di un singolo organo fornisce una protezione sistemica. Ali et al. hanno scoperto che, nei pazienti sottoposti a riparazione elettiva dell'aneurisma dell'aorta addominale aperta, il precondizionamento remoto, eseguito mediante il clampaggio incrociato intermittente dell'arteria iliaca comune per fungere da stimolo, ha ridotto l'incidenza di lesioni miocardiche postoperatorie, infarto miocardico e compromissione renale12.
I modelli di coniglio offrono potenziali vantaggi rispetto ai modelli con altre specie e sono stati utilizzati in molteplici scenari diversi per decenni, tra cui l'induzione di aritmie, modelli ischemici globali e regionali e ricerca sulla contrazione cardiaca, tra gli altri13,14,15. Sebbene il cuore del coniglio sia più piccolo di quello di un cane o di un maiale, è abbastanza grande da poter eseguire facilmente procedure chirurgiche a un costo molto inferiore13. Il cuore del coniglio è spesso usato in quanto è strettamente parallelo al cuore umano; Infatti, ha un tasso metabolico simile, esprime la catena pesante β-miosina e manca di una significativa xantina ossidasimiocardica 16. La tecnica qui descritta per indurre l'ischemia miocardica regionale è semplice, ripetibile ed economica. Questo metodo consente sia i casi di non sopravvivenza che quelli di sopravvivenza, poiché viene indotta solo l'ischemia regionale piuttosto che l'ischemia globale e i materiali necessari non sono specializzati. Possono essere utilizzati due diversi approcci chirurgici (sternotomia e mini-toracotomia), fornendo così all'operatore e ai protocolli sperimentali una maggiore libertà in termini di disegno dello studio. Inoltre, la procedura non richiede l'uso di un bypass cardiopolmonare. In questo contesto, gli approcci minimamente invasivi all'innesto di bypass aortocoronarico sono diventati valide alternative per i pazienti che necessitano di rivascolarizzazione multivascolare17,18. Questo modello potrebbe essere utilizzato per studiare le differenze tra questi approcci e fornire uno strumento di apprendimento basato sugli animali per i tirocinanti chirurgici. Inoltre, l'esecuzione del cateterismo cardiaco utilizzando questo modello può essere utile per la ricerca fisiologica e/o la formazione chirurgica.
Il nostro modello fornisce una metodologia per applicazioni in cui l'induzione dell'ischemia miocardica regionale e la successiva misurazione delle dimensioni dell'infarto, della funzione miocardica e dei cambiamenti cellulari sono importanti. Con questo protocollo, siamo stati in grado di valutare diversi marcatori della funzione cellulare e dell'adattamento all'ischemia e all'intervento terapeutico proposto (i.e., trapianto mitocondriale) esaminando l'internalizzazione degli organelli, il consumo di ossigeno, la sintesi di fosfati ad alta energia e l'induzione di mediatori citochinici e vie proteomiche. Questi risultati sono importanti per preservare l'energetica miocardica, la vitalità cellulare e la funzione cardiaca e consentono la valutazione obiettiva delle tecniche cardioprotettive a seguito di danno da ischemia-riperfusione. Questo modello potrebbe essere utilizzato per studiare percorsi biologici simili e alternative nel campo della patologia miocardica post-ischemica e del recupero.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire una metodologia altamente riproducibile per indurre in situ l'ischemia miocardica regionale acuta nel coniglio per esperimenti di non sopravvivenza e sopravvivenza. Questo modello fornisce una metodologia con un'elevata sopravvivenza, una bassa mortalità intraoperatoria e una morbilità minima19. Altri modelli per l'ischemia miocardica regionale acuta sono stati descritti utilizzando materiali radiomarcati, agenti di contrasto, risonanza magnetica o simulazioni al computer20,21,22. Il nostro protocollo fornisce una metodologia affidabile e semplice, conveniente, costantemente riproducibile, con una bassa richiesta tecnica e, quindi, può essere eseguita da sperimentatori senza esperienza chirurgica. Questo protocollo si adatta a un progetto di sopravvivenza utilizzando una mini-toracotomia sinistra o a un modello di non sopravvivenza utilizzando una sternotomia della linea mediana.
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Protocol
Questa indagine è stata condotta secondo le linee guida del National Institutes of Health sulla cura e l'uso degli animali ed è stata approvata dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del Boston Children's Hospital (Protocollo 20-08-4247R). Tutti gli animali hanno ricevuto cure umane in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Specie animali, agenti anestetici e analgesici
- Specie animali: utilizzare conigli bianchi della Nuova Zelanda (ceppo selvatico; sesso femminile; sessualmente maturo 15-20 settimane; 3-4 kg di peso corporeo) per studi sperimentali.
- Agenti anestetici e analgesici:
- Utilizzare atropina alla dose di 0,01 mg/kg per via intramuscolare (IM)
- Utilizzare acepromazina alla dose di 0,5 mg/kg IM per la sedazione iniziale e 0,5 mg/kg per via endovenosa (IV) per l'anestesia completa.
- Utilizzare butorfanolo alla dose di 0,5 mg/kg IM.
- Utilizzare l'isoflurano tramite una maschera facciale vaporizzata di precisione al 3% per l'induzione, seguita dall'intubazione all'1%-2%, dall'ossigeno (O2) al 100% a 2 L/min e dall'anestesia generale all'1% per il mantenimento.
- Utilizzare medetomidina alla dose di 0,25 mg/kg IM.
- Utilizzare ketamina alla dose di 10 mg/kg EV.
- Utilizzare un blocco intercostale di bupivacaina nel sito di toracotomia a una dose non superiore a 3 mg/kg IM.
- Utilizzare lidocaina all'1% alla dose di 1-1,5 ml/kg EV.
- Utilizzare un cerotto transdermico a base di fentanil da 1-4 μg/kg per 72 ore.
2. Fasi procedurali (Figura 1)
- Tranquillizzare conigli adulti bianchi neozelandesi con una singola iniezione IM combinata di atropina, acepromazina e butorfanolo. Indurre l'animale con isoflurano al 3% tramite una maschera facciale vaporizzata di precisione.
- Preparazione prima dell'intubazione endotracheale in cieco (cioè senza visualizzazione della glottide)
- Spruzzare la laringe con lidocaina all'1% per prevenire il laringospasmo.
- Pre-misurare la lunghezza del tubo endotracheale (ETT) all'esterno del coniglio dai denti alla carena prevista e posizionare il coniglio in posizione di decubito sternale con il collo esteso.
- Intubare l'animale con una ETT pediatrica cuffizzata (diametro interno 3-0 o 3-5) in anestesia inalatoria continua all'1%-2% e O 2 al 100% a2 L/min.
- Inserire l'ETT nella bocca e dirigerlo oltre il toroide nella faringe.
- Far avanzare l'ETT fino a quando la punta del tubo non entra in contatto con la glottide o i suoni del respiro non vengono persi, indicando che la punta del tubo è passata attraverso l'apertura glottica.
- Ritirare leggermente il tubo fino a quando i suoni del respiro non vengono riacquistati, quindi avanzare di nuovo e fissare il tubo in posizione.
- Ventilare l'animale con un supporto meccanico (volume corrente: 10 ml/kg, frazione di Oinspirato 2 : 40%, frequenza respiratoria: 30-40 respiri/min, pressione positiva di fine espirazione: 5-10 cmH2O).
- Regolare la FiO2 come tollerato per ottenere una saturazione di O2 superiore al 92% misurata mediante pulsossimetria per prevenire l'iperossia, che può provocare una risposta infiammatoria sistemica.
- Verificare il corretto posizionamento dell'ETT mediante un esame fisico (ad esempio, auscultazione), segni clinici (ad esempio, osservazione della condensa all'estremità del tubo endotracheale) e con misure oggettive (ad esempio, anidride carbonica di fine espirazione).
- Dopo circa 10 minuti, somministrare un'iniezione IM di medetomidina al coniglio per fornire effetti anestetici e analgesici simultanei.
- Mantenere l'anestesia generale con isoflurano all'1% per tutta la durata della procedura chirurgica.
- Inserire un catetere endovenoso da 22 G nella vena marginale dell'orecchio e fissarlo con del nastro adesivo per ottenere l'accesso periferico per via endovenosa.
NOTA: La vena femorale può essere utilizzata come sito alternativo di accesso venoso.- Anestetizzare completamente l'animale con acepromazina IV e ketamina IV.
- Prima dell'incisione, iniettare 1.000 U/mL di eparina alla dose di 3 mg/kg EV.
- Somministrare inizialmente 1.000 U/mL di eparina alla dose di 3 mg/kg e ridosare ogni ora fino alla fine dell'esperimento per mantenere un tempo di coagulazione attivato di >400 s, in linea con l'attuale protocollo chirurgico.
- Somministrare lidocaina EV all'1% e/o defibrillazione epicardica asincronizzata secondo necessità se la fibrillazione ventricolare si verifica durante l'intervento chirurgico. La fibrillazione ventricolare di solito si interrompe con una o due dosi di lidocaina.
- Perfuse la soluzione di lattato di Ringer in continuo a 10 mL/kg/h.
NOTA: Dato il piccolo volume di liquidi somministrati e i brevi tempi operatori, gli animali negli studi di sopravvivenza in questo lavoro non hanno richiesto diuresi prima dell'estubazione o durante il periodo di recupero. Se l'animale sviluppa un peggioramento dello stato polmonare (ad esempio, aumento delle impostazioni del ventilatore, evidenza di edema polmonare all'auscultazione, ecc.), si consiglia la diuresi.
- Eseguire un taglio della carotide e posizionare una linea arteriosa francese 4 o 5 per facilitare il monitoraggio intraoperatorio della pressione arteriosa (PA).
NOTA: L'arteria femorale può essere utilizzata come sito alternativo di accesso arterioso. - Monitora e registra tutte le variabili fisiologiche e meccaniche tramite analisi continue in tempo reale.
- Monitorare la pressione arteriosa con la linea arteriosa carotide e registrare la saturazione di O2 utilizzando la pulsossimetria tramite un sensore posizionato su una zampa rasata.
- Monitorare con un elettrocardiogramma (ECG) con tre derivazioni degli arti: I, II e III e tre derivazioni aumentate calcolate: aVL, aVR e aVF.
- Registrare i tracciati ECG al basale pre-ischemico, durante l'ischemia, durante la riperfusione e in modo seriale durante i giorni 7-28 di recupero (se si esegue uno studio di sopravvivenza).
- Monitorare il livello di sedazione mediante il monitoraggio continuo della pressione arteriosa e della frequenza cardiaca (FC).
- Monitorare la temperatura con una sonda rettale.
- Utilizzare ECHO 2D dalla vista parasternale e apicale sinistra per valutare la funzione miocardica nei punti temporali desiderati sia nei casi di sopravvivenza che in quelli di non sopravvivenza.
- Valutare la funzione miocardica utilizzando l'accorciamento frazionario (FS) misurando la distanza telediastolica del ventricolo sinistro (LVEDD) e la distanza telesistolica del ventricolo sinistro (LVESD) e utilizzando la seguente formula:
FS = (LVEDD − LVESD)/LVEDD × 100
- Valutare la funzione miocardica utilizzando l'accorciamento frazionario (FS) misurando la distanza telediastolica del ventricolo sinistro (LVEDD) e la distanza telesistolica del ventricolo sinistro (LVESD) e utilizzando la seguente formula:
- Durante l'intervento chirurgico, posizionare l'animale su una coperta di acqua calda circolante per mantenere stabile la temperatura corporea interna.
- Preparare e drappeggiare l'animale in modo sterile:
- Radere il sito chirurgico e preparare con betadine e alcol isopropilico al 70%, ciascuno applicato in triplice copia. Asciuga l'area con garze sterili e copri l'intero animale con asciugamani sterili.
- Mini-toracotomia sinistra (studi di sopravvivenza)
- Eseguire un blocco intercostale nel sito di toracotomia predeterminato con bupivacaina IM.
- Somministrare lidocaina EV all'1% attraverso la vena auricolare prima dell'incisione.
- Eseguire una mini-toracotomia sinistra attraverso il quarto spazio intercostale lungo la porzione superiore della quinta costola per evitare il fascio neuromuscolare, che si trova parallelo alla superficie inferiore di ciascuna costola.
- Eseguire una toracotomia anterolaterale per la migliore visualizzazione della superficie anterolaterale del cuore (cioè la posizione anatomica dei rami diagonali LAD).
- Posiziona il coniglio con il lato sinistro sollevato di circa 30° utilizzando un cuscino o una poltrona a sacco.
- Fissare la zampa omolaterale del coniglio sopra la testa per creare spazio sia per il campo operatorio che tra gli spazi delle costole.
- Palpare e delineare i punti di riferimento ossei, tra cui le costole, lo sterno e la scapola, con un pennarello. Incidere la pelle sovrastante la quinta costola utilizzando una lama #10. Assicurarsi che l'incisione rimanga parallela alla costola.
- Utilizzare l'elettrocauterizzazione per dividere il muscolo grande pettorale e il muscolo dentato anteriore. Dividi i muscoli intercostieri proprio sopra la quinta costola con l'elettrocauterizzazione per preservare il fascio neurovascolare.
- Entrare con cautela nello spazio pleurico attraverso il quarto spazio intercostale con dissezione acuta o smussata. Estendere l'incisione pleurica iniziale parallelamente alla costola in entrambe le direzioni con dissezione acuta o smussata fino a quando non è possibile inserire un divaricatore per costole o un divaricatore sternale.
- Posizionare un divaricatore delle costole o un divaricatore sternale all'interno dello spazio delle costole e allargare per fornire un'adeguata visualizzazione del cuore e del sacco pericardico. Sollevare il pericardio con la pinza DeBakey e aprire il pericardio con le forbici Metzenbaum.
- Isolamento dell'arteria LAD
- Circondare il secondo o terzo ramo diagonale dell'arteria LAD con una sutura in polipropilene (3-0) su un ago conico. Rimuovere l'ago e infilare entrambe le estremità del filamento di polipropilene attraverso un piccolo tubo di vinile per formare un laccio.
- Posizionare un pegno tra il laccio e l'arteria coronaria per evitare di danneggiare la coronaria e/o causare vasospasmo con la legatura.
- Usando una pinza DeBakey, prendi un pegno rettangolare in feltro PTFE (circa 7 mm x 3 mm). Posizionare il pegno tra i due filamenti di polipropilene in modo che sia inserito tra l'arteria LAD isolata e il tubo in vinile quando il laccio è serrato.
- Sternotomia della linea mediana (studi di non sopravvivenza)
NOTA: L'approccio della sternotomia della linea mediana è ideale per i casi di non sopravvivenza, per i quali è possibile utilizzare un monitoraggio più invasivo con LVDP e sonomicrometria.- Eseguire una sternotomia sulla linea mediana utilizzando forbici Mayo curve. Posizionare un divaricatore sternale e allargarlo per fornire un'adeguata visualizzazione del cuore e del sacco pericardico.
- Sollevare il pericardio con la pinza DeBakey e aprire il pericardio con le forbici Metzenbaum.
- Posizionamento dei tre cristalli di sonomicrometria piezoelettrica:
- Fai tre piccoli tagli di 1 mm sull'epicardio del ventricolo sinistro, formando gli angoli di un triangolo. Posizionare i cristalli di sonomicrometria piezoelettrica all'interno dei tagli dell'epicardio.
- Fissare i fili alla superficie cardiaca con una cucitura a U in polipropilene 5-0. Quando si registra utilizzando la sonomicrometria, mettere in pausa la ventilazione meccanica per consentire una registrazione accurata su due o tre battiti cardiaci.
NOTA: Se il cuore fibrilla, la lidocaina all'1% non è efficace ed è necessaria la defibrillazione epicardica, spegnere il sonomicrometro e scollegarlo dal sistema di acquisizione dati per proteggere entrambi dall'ingresso elettrico.
- Isolamento dell'arteria LAD:
- Circondare il secondo o terzo ramo diagonale dell'arteria LAD con una sutura in polipropilene (3-0) su un ago conico.
- Rimuovere l'ago e infilare entrambe le estremità del filamento di polipropilene attraverso un piccolo tubo di vinile per formare un laccio.
- Posizionare un pegno tra il laccio e l'arteria coronaria per evitare di danneggiare l'arteria coronaria e/o causare vasospasmo con la legatura.
- Usando una pinza DeBakey, prendi un pegno rettangolare in feltro PTFE (circa 7 mm x 3 mm). Posizionare il pegno tra i due filamenti di polipropilene in modo che sia inserito tra l'arteria LAD isolata e il tubo in vinile quando il laccio è serrato.
- Misurazione dell'LVDP:
- Posizionare un punto a U in polipropilene 5-0 all'apice del LV. Praticare una piccola incisione di 1 mm con una lama 11 nell'apice LV.
- Inserire un catetere a palloncino 3 French nel lume ventricolare. Fissare il catetere al ventricolo sinistro legandolo alla sutura con punto a U in polipropilene 5-0.
- Collegare il catetere al trasduttore collegato al monitor per registrare l'LVDP. Registrare l'LVDP utilizzando il sistema di acquisizione dati (descritto di seguito). Azzerare il catetere per registrare le variabili emodinamiche aprendo il rubinetto a tre vie verso l'aria e azzerando sul monitor.
- Sistema di acquisizione dati
- Avviare il sistema di acquisizione dati (vedere la Tabella dei materiali) sul computer/laptop in uso. Collegare il cavo dal monitor al computer/laptop.
- Selezionare Canale 1 sul sistema di acquisizione dati e denominarlo LVDP. Azzerare il trasduttore utilizzando il monitor.
NOTA: Se si collegano la pressione arteriosa e la frequenza cardiaca al sistema di acquisizione dati, seguire la stessa procedura: collegare il cavo al laptop, selezionare Canale e azzerare se si misura la pressione arteriosa.
- Occludere l'arteria coronaria stringendo il laccio premendo sul tubo in vinile mentre si tirano verso l'alto i filamenti di sutura in polipropilene. Mantenere la tenuta desiderata con una fascetta per zanzare bloccando direttamente il tubo e fissandolo in posizione.
- Confermare visivamente l'ischemia miocardica dalla cianosi regionale dell'epicardio. L'ischemia regionale può essere confermata anche all'ECG con la presenza di un tratto ST e cambiamenti dell'onda T.
- Dopo la conferma visiva, indurre l'ischemia regionale per 30 minuti in anestesia.
- A 0 min, 10 min, 20 min e 30 min durante l'ischemia regionale, valutare la FS mediante ECHO 2D sia per i casi di sopravvivenza che per quelli di non sopravvivenza.
- Valutare la LVDP e la sonomicrometria in modo continuo durante il tempo di pre-ischemia, il tempo di ischemia miocardica e il tempo post-ischemico per i casi di non sopravvivenza.
- Se necessario, delineare l'area a rischio legando nuovamente l'arteria con il punto di sutura in polipropilene lasciato in posizione. Clampare l'aorta in modo incrociato e iniettare il pigmento Monastral Blue 98% (diluito 1:5 in PBS) attraverso l'aorta utilizzando un ago per cardioplegia. Le aree perfuse del miocardio si coloreranno di blu e l'area a rischio rimarrà non colorata.
- Monitora e registra continuamente la saturazione di FC, BP e O2 .
- Lasciare che l'animale si riprenda per 2 ore (non sopravvivenza) o 28 giorni (sopravvivenza).
NOTA: L'ECG può essere utilizzato per confermare la riperfusione. Sebbene non sia stata osservata nell'esperimento condotto in questo studio, l'ipokaliemia può spesso verificarsi durante la riperfusione e può essere corretta con il controllo del potassio o un'infusione appropriata.
- Conclusione della procedura
- Casi di sopravvivenza
- Nei casi di sopravvivenza, tagliare il filo di polipropilene 3-0 utilizzato per il rullante, legare insieme le estremità e lasciarlo in posizione. Identificare l'area a rischio e la zona dell'infarto con il filo di polipropilene 3-0.
- Al termine della procedura, chiudere l'incisione in tre strati.
- Chiudete il primo strato legando due maglie 2-0 polyglactin 910 a forma di otto intorno alle coste.
- Chiudere gli strati muscolari e sottocutanei con una sutura in polidiossanone 3-0 in modo continuo.
- Chiudere la pelle in modo sottocuticolare utilizzando una sutura monofilamento 5-0. Utilizzare una sutura interrata per ridurre al minimo l'irritazione provata dall'animale.
- Evacuare l'aria pleurica eseguendo una toracentesi con ago.
- Applicare un cerotto transdermico al fentanil per 72 ore per facilitare la gestione del dolore postoperatorio.
- Eseguire l'ecocardiografia transtoracica a 1 settimana e 2 settimane dopo l'intervento per valutare l'andamento della FS.
- Dopo il periodo di recupero predeterminato, sedare, intubare e anestetizzare l'animale come sopra. Eseguire una sternotomia mediana. Esporre e aprire il sacco pericardico. Sopprimere il coniglio in anestesia profonda rimuovendo il cuore in blocco, lasciando spirare l'animale per dissanguamento.
- Casi di non sopravvivenza
- Dopo l'esperimento e dopo aver assicurato l'anestesia profonda, esporre completamente il cuore e rimuoverlo in blocco per l'analisi biochimica e tissutale. L'animale muore per dissanguamento.
- Casi di sopravvivenza
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Representative Results
Seguendo il protocollo (Figura 1), l'ischemia miocardica è stata confermata immediatamente dalla visualizzazione diretta della cianosi dell'epicardio.
Gli ECG standard (tre derivazioni degli arti: I, II e III e tre derivazioni aumentate calcolate: aVL, aVR e aVF) sono stati registrati continuamente prima dell'ischemia, durante l'ischemia e durante la riperfusione (Figura 2). Gli ECG dimostrano tachicardia, aritmie (cioè fibrillazione ventricolare), difetti del sistema di conduzione (cioè blocco di branca del fascio), lo sviluppo di onde Q correlate all'infarto e deviazione del tratto ST23.
Durante l'ischemia regionale, l'ipocinesia regionale è stata osservata direttamente ad occhio nudo nella cavità mediana della parete anteriore in tutti i cuori, coerentemente con l'area di perfusione dell'arteria LAD che è stata resa ischemica dalla restrizione del flusso con l'intrappolamento temporaneo del LAD. Sia nei casi di sopravvivenza che in quelli di non sopravvivenza, le letture ECHO 2D sono state ottenute durante la pre-ischemia, appena prima di indurre l'ischemia regionale e in diversi momenti durante l'esperimento: 5 minuti, 10 minuti, 15 minuti, 30 minuti, 60 minuti e 120 minuti. Le dimensioni telediastolica ventricolare sinistra (LVEDD) e telesistolica ventricolare sinistra (LVESD) sono state misurate con un ECHO M-mode guidato 2D rispettivamente alle circonferenze massime e minime del ventricolo sinistro. La contrattilità regionale della parete del ventricolo sinistro nella zona ischemica miocardica è stata valutata da viste dell'asse corto del ventricolo sinistro utilizzando la modalità M, con la linea del cursale sovrastante l'area a rischio. L'accorciamento frazionario (FS) è stato calcolato con la seguente formula: FS = (LVEDD − LVESD)/LVEDD × 10024. I risultati hanno mostrato che l'accorciamento frazionario è diminuito durante il tempo ischemico e post-ischemico rispetto al tempo pre-ischemico (Figura 3)
Per quantificare l'entità del danno miocardico, la dimensione dell'infarto può essere misurata biochimicamente con la colorazione con cloruro di trifenile tetrazolio (TTC) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). In questo lavoro, l'area a rischio è stata delineata dalla rilegatura dell'arteria coinvolta legando il punto Prolene lasciato in posizione. L'aorta è stata bloccata in modo incrociato e il pigmento Monastral Blue (diluito 1:5 in PBS) è stato somministrato attraverso l'aorta utilizzando un ago per cardioplegia. Le aree di miocardio perfuso sono state colorate di blu e l'area a rischio è rimasta non colorata a causa della legatura dell'arteria.
Il cuore è stato tagliato lungo l'asse lungo del ventricolo sinistro, dall'apice alla base, in sezioni trasversali spesse 1 cm, poste tra lastre di vetro e compresse con morsetti bulldog. L'area a rischio per ciascun lato di ogni sezione è stata tracciata su un foglio di acetato trasparente. Le sezioni cardiache sono state incubate in un contenitore buio con 1% di TTC in tampone fosfato (pH 7,4) a 38 °C per 20 minuti. Le sezioni cardiache sono state quindi conservate in una soluzione di formaldeide al 10% per 24 ore prima delle misurazioni finali per migliorare la visualizzazione della zona dell'infarto. Le sezioni sono state posizionate tra lastre di vetro e compresse con morsetti bulldog. La necrosi miocardica è stata evidenziata da un'area bianca sul tessuto miocardico e le aree rosso mattone hanno mostrato il tessuto vitale. (Figura 4) Le regioni infartuate (bianche) all'interno delle aree a rischio per ciascun lato di ciascuna sezione sono state tracciate sul foglio di acetato trasparente. La planimetria è stata utilizzata per misurare l'area a rischio e la zona dell'infarto. I volumi dell'area a rischio e della zona infartuata sono stati calcolati moltiplicando le aree planimetriche per lo spessore della fetta. Il volume dell'infarto è stato espresso come percentuale del volume totale del ventricolo sinistro per ciascun cuore25. È stato calcolato il rapporto tra l'area a rischio e il peso del ventricolo sinistro e la dimensione dell'infarto è stata espressa in percentuale dell'area a rischio. Il nostro lavoro precedente ha dimostrato che, dopo 2 ore e 28 giorni di recupero, le aree a rischio (cioè come percentuale della massa ventricolare) erano rispettivamente circa il 29% e il 27%, sia per il gruppo mitocondriale che per quello di controllo. rispettivamente, rispetto al 37% e al 34% nei cuori di controllo26. Inoltre, nei nostri precedenti esperimenti, l'accorciamento frazionario e l'LVDP sono diminuiti nel gruppo di controllo rispettivamente al 50%-60% e al 70%-80% rispetto al basale.
Figura 1: Diagramma del protocollo. Il protocollo può essere adattato in base alle esigenze dell'esperimento, sia per i casi di sopravvivenza che per quelli di non sopravvivenza. I casi di non sopravvivenza possono essere eseguiti con un approccio chirurgico più invasivo utilizzando una sternotomia della linea mediana, consentendo così l'uso di cristalli di sonomicrometria, ecocardiografia epicardica (ECHO) e un catetere ventricolare sinistro per la misurazione dell'accorciamento frazionario e della LVDP. Per i casi di sopravvivenza, per i quali è necessario considerare la guarigione dell'incisione e la gestione del dolore, è possibile eseguire una mini-toracotomia sinistra e la funzione miocardica può essere valutata in diversi momenti durante un periodo di studio più lungo utilizzando ECHO 2D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Elettrocardiogramma rappresentativo (arto II e aVL a derivazione aumentata calcolata) prima dell'induzione dell'ischemia regionale, durante il tempo ischemico e durante la riperfusione. Le scale dei millivolt e dei millisecondi sono mostrate a sinistra. I punti temporali e il momento dell'intrappolamento dell'arteria discendente anteriore sinistra sono mostrati in basso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Valutazione ecocardiografica del cuore misurando l'accorciamento frazionario (FS). L'accorciamento frazionario è stato misurato ottenendo la distanza telediastolica ventricolare sinistra e la distanza telesistolica ventricolare sinistra con modalità M guidata 2D rispettivamente alle circonferenze massime e minime del ventricolo sinistro. L'accorciamento frazionario è stato valutato a (A) basale/pre-ischemia, (B) durante la trappola temporanea dell'arteria discendente anteriore sinistra (LAD) con la linea del cursore sovrastante l'area a rischio e (C) durante la riperfusione dopo il rilascio del laccio sulla LAD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini rappresentative delle dimensioni dell'infarto per un cuore colorato con cloruro di trifeniltetrazolio all'1% dopo 30 minuti di ischemia regionale miocardica indotta. Il tessuto vitale è visto come rosso, mentre l'infarto è visto come aree bianche. Barra della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il nostro protocollo dimostra una metodologia affidabile per l'esecuzione dell'ischemia miocardica regionale acuta nel coniglio. L'approccio della mini-toracotomia sinistra è ideale per i casi di sopravvivenza, per i quali l'incisione e il dolore associato devono essere ridotti al minimo. È importante sottolineare che la terapia diuretica non era necessaria prima dell'estubazione e non c'è stata mortalità intraoperatoria nel gruppo non di sopravvivenza o a 4 settimane dopo l'intervento nel gruppo di sopravvivenza. Quando la progettazione del protocollo richiede un caso di non sopravvivenza, o quando è necessario un monitoraggio più dettagliato della funzione miocardica globale e regionale, è possibile utilizzare una sternotomia della linea mediana (Figura 1).
I passaggi più critici del protocollo consistono nell'accerchiare accuratamente il LAD con un ago conico senza danneggiare l'arteria o creare sanguinamento venoso e nell'occludere il LAD per creare un'area coerente a rischio.
Alcune complicanze che possono verificarsi durante l'esecuzione dell'intervento chirurgico descritto sono l'iperdistensione polmonare durante la ventilazione meccanica a causa di un elevato volume corrente, il sanguinamento da danni al LAD, il sanguinamento secondario a una lesione dei vasi intercostali, che di solito si verifica all'ingresso o dalla manipolazione del divaricatore, e/o l'aritmia cardiaca (fibrillazione ventricolare intraoperatoria) con legatura LAD. Possono verificarsi anche altre complicanze postoperatorie, come l'infezione del sito chirurgico, la scarsa mobilizzazione dell'animale a causa del dolore e/o l'ipocinesia regionale miocardica residua. Nonostante l'incidenza di queste complicanze sia molto bassa, lo sperimentatore dovrebbe essere in grado di affrontarle prontamente ed efficacemente.
I conigli rappresentano un eccellente modello animale per gli studi sul miocardio. La loro frequenza cardiaca è simile a quella umana e le loro dimensioni sono sufficientemente piccole, ma consentono l'analisi istologica al microscopio ottico.
Va riconosciuta una limitazione in questo studio; In particolare, il cuore del coniglio è più piccolo e clinicamente meno rilevante per i confronti con il cuore umano rispetto ai cuori di altri modelli animali di grandi dimensioni come il maiale.
A causa dell'incidenza e della prevalenza delle malattie cardiovascolari, avere un modello animale che simula l'ischemia miocardica regionale è di fondamentale importanza. Questa metodologia potrebbe avere molteplici applicazioni e si è dimostrata utile in modelli di danno vascolare, ischemia miocardica cronica e brevi periodi di stordimento miocardico 27,28,29,30,31.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi, finanziario o di altro tipo, è dichiarato dagli autori.
Acknowledgments
Lo studio originale in cui è stato utilizzato questo protocollo è stato supportato dalle sovvenzioni HL-103642 e HL-088206 del National Heart, Lung, and Blood Institute
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 blade | Bard Parker | 371210 | |
| #11 blade | Fisher Scientific | B3L | |
| 22 G PIV needle | BD Insyte | 381423 | |
| Acepromazine | VETONE | NDC 13985-587-50 | 0.5 mg/kg IM and IV |
| Aline pressure bag | Infu-Stat | 2139 | |
| Angiocath | Becton Dickinson | 382512 | |
| Arterial Catheter | Teleflex | MC-004912 | |
| Atropine | Hikma Pharmaceuticals | NDC 0641-6006-01 | 0.01 mg/kg IM |
| Betadine and 70% isopropyl alcohol | McKesson | NDC 68599-2302-6 | |
| Blood gas machine | Siemens | MRK0025 | |
| Bovie | Valleylab | E6008 | |
| Bulldog clamps | World Precision Instruments | 14119 | |
| Bupivacaine | Auromedics | NDC 55150-249-50 | 3 mg/kg IM |
| Butorphanol | Roxane | NDC 2054-3090-36 | 0.5 mg/kg IM |
| Clear acetate sheet | Oxford Instruments | ID 51-1625-0213 | |
| Clipers | Andis | AGC2 | |
| DeBakey forceps | Integra | P6280 | |
| Echocardiography machine | Philips | IE33 F1 | |
| Electrocardiography machine | Meditech | MD908B | |
| Endotracheal tube | Medline | #922774 | |
| Fentanyl | West-Ward | NDC 0641-6030-01 | 1–4 µg/kg transdermal patch |
| Formaldehyde solution 10% | Epredia | 94001 | |
| Glass plates | United Scientific | B01MUHX6MR | |
| Heparin Sodium | Sagent | NDC 69-0058-02 | 1000U in 1 mL 3 mg/kg |
| Hot water blanket | 3M | 55577 | |
| Isoflurane | Penn Veterinary Supply, INC | NDC 50989-606-15 | 1%–3% |
| Ketamine | Dechra | NDC 42023-138-10 | 10 mg/kg IV |
| Lab Chart 7 Acquisition Software | Adinstruments | ||
| Lactated Ringer's solution | ICUmedical | NDC 0990-7953-09 | 10 mL/kg/h |
| Laryngoscope | Welch Allyn | 68044 | |
| Left ventricule lumen catheter 3Fr | McKesson | 385764-EA | |
| Lidocaine (1%) | Pfizer | 4276-01 | 1–1.5 mL/kg IV |
| LVDP transducer | Edward | PDP-ED | |
| Marking pen | Viscot | 1451SR-100 Unsterile | |
| Mayo scissors | Mayo | S7-1098 | |
| Medetomidine | Entireoly Pets Pharmacy | NDC 015914-005-01 | 0.25 mg/kg IM |
| Metzenbaum scissors | Cole-Parmer | UX-10821-05 | |
| Monastra. Blue pigment 98% | Chemsavers | MBTR1100G | |
| Monocryl 5-0 | Ethicon | Y463G | |
| Mosquito clamp | Shioda | 802N | |
| PDS 3-0 | Ethicon | 42312201 | |
| Piezoelectric sonomicrometry crystals | Sonometrics | Small 2mm round | |
| Plegets | DeRoyal | 32-363 | |
| Povuine Iodine Prep Solutions | Medline | MDS093940 | |
| Precision vaporized system face mask | Yuwell | B07PNH69BF | |
| Prolene 3-0 | Ethicon | 8665G | |
| Proline 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Pulse oximetry probe | Masimo | 9216-U | |
| Rib spreader | Medline | MDS5621025 | |
| S12 Pediatric Sector Probe | Phillips | 21380A | |
| Sonomicrometer | Sonometrics | BZ10123724 | |
| Sterile gauze | Medline | 3.00802E+13 | |
| Sterile towels | McKesson | MON 277860EA | |
| Sternal retractor | Medline | MDS5610321 | |
| Sutures for closure | J&J Dental | 8698G | |
| Telemetriy monitor | Meditech | MD908B | |
| Temperature probe | Omega | KHSS-116G-RSC-12 | |
| Triphenyl tetrazolium chloride (1%) | Millipore | MFCD00011963 | |
| Ventilator | MedGroup | MSLGA 11 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | V635H | |
| Vinyl tubing | ABE | DISW 3001 |
References
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