Summary
El presente estudio demuestra un modelo animal altamente reproducible de isquemia miocárdica regional aguda y lesión por reperfusión en conejos utilizando una minitoracotomía izquierda para los casos de supervivencia o una esternotomía de línea media para los casos de no supervivencia.
Abstract
El protocolo aquí proporciona una metodología simple y altamente replicable para inducir isquemia miocárdica regional aguda in situ en el conejo para experimentos de supervivencia y no supervivencia. El conejo blanco adulto de Nueva Zelanda está sedado con atropina, acepromazina, butorfanol e isoflurano. El animal es intubado y colocado en ventilación mecánica. Se inserta un catéter intravenoso en la vena marginal del oído para la infusión de medicamentos. El animal se medica previamente con heparina, lidocaína y solución de Ringer lactada. Se realiza un corte carotídeo para obtener acceso a la vía arterial para el control de la presión arterial. Los parámetros fisiológicos y mecánicos seleccionados se monitorean y registran mediante análisis continuos en tiempo real.
Con el animal sedado y completamente anestesiado, se realiza una pequeña toracotomía izquierda en el cuarto espacio intercostal (supervivencia) o una esternotomía de la línea media (no supervivencia). Se abre el pericardio y se localiza la arteria descendente anterior izquierda (DA).
Se pasa una sutura de polipropileno alrededor de la segunda o tercera rama diagonal de la arteria LAD, y el filamento de polipropileno se enhebra a través de un pequeño tubo de vinilo, formando una trampa. El animal es sometido a 30 min de isquemia regional, lograda ocluyendo la DA apretando la trampa. La isquemia miocárdica se confirma visualmente por cianosis regional del epicardio. Después de la isquemia regional, la ligadura se afloja y se permite que el corazón se vuelva a perfundir.
Tanto para los experimentos de supervivencia como para los de no supervivencia, la función miocárdica puede evaluarse mediante una medición ecocardiográfica (ECO) del acortamiento fraccional. En el caso de los estudios de no supervivencia, los datos de la sonomicrometría recogidos mediante tres sondas ultrasónicas piezoeléctricas digitales implantadas en el área isquémica y la presión desarrollada en el ventrículo izquierdo (DPVI) mediante un catéter de ventrículo izquierdo (VI) insertado apicalmente pueden adquirirse de forma continua para evaluar la función miocárdica regional y global, respectivamente.
Para los estudios de supervivencia, se cierra la incisión, se realiza una toracocentesis con aguja izquierda para la evacuación del aire pleural y se logra el control del dolor postoperatorio.
Introduction
Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en el mundo y contribuyen a más de 18 millones de muertes cada año1,2,3. El infarto agudo de miocardio (IM) es una emergencia médica común que se desarrolla cuando un coágulo de sangre o un trozo de placa de ateroma bloquea el flujo sanguíneo de una arteria coronaria. Esto provoca isquemia miocárdica regional en el territorio que perfunde la arteria.
El presente estudio describe un protocolo que utiliza una metodología simple y confiable para crear isquemia miocárdica regional aguda in situ en un modelo de conejo para experimentos de no supervivencia y supervivencia. El objetivo inicial de este método fue evaluar los efectos del trasplante mitocondrial en la modulación de la necrosis miocárdica y el aumento de la función cardíaca post-isquémica después de un evento isquémico. Investigaciones previas han demostrado la aparición de alteraciones mitocondriales y una rápida disminución de los niveles de fosfato de alta energía tras el inicio de la isquemia y una reducción en el suministro de oxígeno, lo que resulta en una disminución drástica de las reservas de energía cardíaca4. Los investigadores han intentado mejorar la función post-isquémica y disminuir la necrosis tisular miocárdica utilizando intervenciones farmacológicas y/o técnicas de procedimiento, pero estas técnicas proporcionan una cardioprotección limitada y tienen un impacto mínimo en el daño y la disfunción mitocondrial 5,6,7. Nuestro equipo y otros han demostrado previamente que el daño mitocondrial ocurre principalmente durante la isquemia y que la recuperación contráctil puede mejorarse y el tamaño del infarto de miocardio puede disminuir con la preservación de la función respiratoria mitocondrial durante la reperfusión 8,9,10. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el trasplante mitocondrial de tejidos no afectados por la isquemia al área de isquemia antes de la reperfusión proporcionaría un enfoque alternativo para reducir la necrosis miocárdica y mejorar la función miocárdica. En este trabajo se detalla el protocolo utilizado para probar esta teoría y los resultados representativos obtenidos del análisis inicial de nuestro estudio.
Además, varios investigadores se han centrado en otros temas integrales para definir el impacto de la lesión por isquemia-reperfusión miocárdica y establecer intervenciones terapéuticas adecuadas. Una de esas áreas de investigación es la del preacondicionamiento. El preacondicionamiento miocárdico isquémico es un mecanismo cardioprotector activado por un breve estrés isquémico que da lugar a una reducción de la tasa de necrosis de las células cardíacas durante los episodios posteriores de isquemia prolongada. Estos mecanismos pueden ser activados por hipoxia u oclusión coronaria. Mandel et al. demostraron que el preacondicionamiento hipóxico-hiperóxico ayudó a mantener el equilibrio de los metabolitos del óxido nítrico, redujo la hiperproducción de endotelina-1 y apoyó la protección de los órganos11. Además, se ha explorado el concepto de precondicionamiento isquémico remoto, un fenómeno por el cual el precondicionamiento de un solo órgano proporciona protección sistémica. Ali et al. encontraron que, en pacientes sometidos a reparación electiva de aneurisma de aorta abdominal abierta, el preacondicionamiento remoto, realizado mediante pinzamiento cruzado intermitente de la arteria ilíaca común para que sirviera como estímulo, redujo la incidencia de lesión miocárdica postoperatoria, infarto de miocardio e insuficiencia renal12.
Los modelos de conejo ofrecen ventajas potenciales sobre los modelos con otras especies y se han utilizado en múltiples escenarios diferentes durante décadas, incluyendo la inducción de arritmias, modelos isquémicos globales y regionales, y la investigación de contracción cardíaca, entre otros13,14,15. Aunque el corazón del conejo es más pequeño que el de un perro o un cerdo, es lo suficientemente grande como para realizar fácilmente procedimientos quirúrgicos aun costo mucho menor. El corazón de conejo se usa a menudo, ya que es muy paralelo al corazón humano; De hecho, tiene una tasa metabólica similar, expresa β-cadena pesada de miosina y carece de xantina oxidasa16 miocárdica significativa. La técnica aquí descrita para inducir isquemia miocárdica regional es simple, repetible y costo-efectiva. Este método permite tanto los casos de no supervivencia como los de supervivencia, ya que solo se induce isquemia regional en lugar de isquemia global, y los materiales necesarios no son especializados. Se pueden utilizar dos enfoques quirúrgicos diferentes (es decir, esternotomía y minitoracotomía), lo que proporciona al operador y a los protocolos experimentales más libertad en cuanto al diseño del estudio. Además, el procedimiento no requiere el uso de un bypass cardiopulmonar. En este contexto, los abordajes mínimamente invasivos para el injerto de revascularización de la arteria coronaria se han convertido en alternativas valiosas para los pacientes que necesitan revascularización multivaso17,18. Este modelo podría utilizarse para estudiar las diferencias entre estos enfoques y proporcionar una herramienta de aprendizaje basada en animales para los aprendices de cirugía. Además, la realización de cateterismo cardíaco utilizando este modelo puede ser útil para la investigación fisiológica y/o el entrenamiento quirúrgico.
Nuestro modelo proporciona una metodología para aplicaciones en las que la inducción de isquemia miocárdica regional y la posterior medición del tamaño del infarto, la función miocárdica y los cambios celulares son importantes. Con este protocolo, hemos podido evaluar varios marcadores de función celular y adaptación a la isquemia y la intervención terapéutica propuesta (es decir, trasplante mitocondrial) examinando la internalización de orgánulos, el consumo de oxígeno, la síntesis de fosfato de alta energía y la inducción de mediadores de citoquinas y vías proteómicas. Estos resultados son importantes para preservar la energía miocárdica, la viabilidad celular y la función cardíaca y permiten la evaluación objetiva de las técnicas cardioprotectoras después de la lesión por isquemia-reperfusión. Este modelo podría utilizarse para estudiar vías biológicas similares y alternativas en el campo de la patología y recuperación miocárdica post-isquémica.
El objetivo de este protocolo es proporcionar una metodología altamente reproducible para inducir isquemia miocárdica regional aguda in situ en el conejo para experimentos de no supervivencia y supervivencia. Este modelo proporciona una metodología con alta supervivencia, baja mortalidad intraoperatoria y mínima morbilidad19. Otros modelos de isquemia miocárdica regional aguda han sido descritos utilizando materiales radiomarcados, agentes de contraste, resonancia magnética o simulaciones computacionales20,21,22. Nuestro protocolo proporciona una metodología fiable y sencilla que es rentable, reproducible de forma consistente y tiene una baja demanda técnica y, por lo tanto, puede ser realizada por investigadores sin experiencia quirúrgica. Este protocolo se adapta a un proyecto de supervivencia mediante una minitoracotomía izquierda o a un modelo de no supervivencia mediante una esternotomía de línea media.
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Protocol
Esta investigación se llevó a cabo de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud sobre el cuidado y uso de animales y fue aprobada por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Boston Children's Hospital (Protocolo 20-08-4247R). Todos los animales recibieron cuidados humanitarios de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Especies animales, agentes anestésicos y analgésicos
- Especies animales: Utilizar conejos blancos de Nueva Zelanda (cepa de tipo salvaje; sexo femenino; sexualmente maduros de 15 a 20 semanas de edad; 3-4 kg de peso corporal) para estudios experimentales.
- Agentes anestésicos y analgésicos:
- Usar atropina a una dosis de 0,01 mg/kg por vía intramuscular (IM)
- Use acepromazina a una dosis de 0,5 mg/kg IM para la sedación inicial y de 0,5 mg/kg por vía intravenosa (IV) para anestesia completa.
- Use butorfanol a una dosis de 0,5 mg/kg IM.
- Use isoflurano a través de una mascarilla facial de sistema vaporizado de precisión al 3% para la inducción, seguida de intubación al 1%-2%, oxígeno (O2) al 100% a 2 L/min y anestesia general al 1% para mantenimiento.
- Utilizar medetomidina a una dosis de 0,25 mg/kg IM.
- Use ketamina a una dosis de 10 mg/kg IV.
- Utilizar un bloqueo intercostal de bupivacaína en el sitio de la toracotomía a una dosis no superior a 3 mg/kg IM.
- Utilizar lidocaína al 1% a una dosis de 1-1,5 ml/kg IV.
- Utilizar un parche transdérmico de fentanilo de 1-4 μg/kg durante 72 h.
2. Etapas del procedimiento (Figura 1)
- Sedar conejos adultos blancos de Nueva Zelanda con una sola inyección IM combinada de atropina, acepromazina y butorfanol. Inducir al animal con isoflurano al 3% a través de una mascarilla facial con sistema vaporizado de precisión.
- Preparación previa a la intubación endotraqueal a ciegas (es decir, sin visualización de la glotis)
- Rocíe la laringe con lidocaína al 1% para prevenir el laringoespasmo.
- Mida previamente la longitud del tubo endotraqueal (TET) en el exterior del conejo desde los dientes hasta la carina prevista, y coloque al conejo en decúbito esteral con el cuello extendido.
- Intubar al animal con un TET pediátrico de tamaño manguito (3-0 o 3-5 de diámetro interno) bajo anestesia inhalada continua al 1%-2% yØ2 al 100% a 2 L/min.
- Inserte el TET en la boca y diríjalo más allá del toro hacia la faringe.
- Avance el TET hasta que la punta del tubo entre en contacto con la glotis o se pierdan los sonidos respiratorios, lo que indica que la punta del tubo ha pasado a través de la abertura glótica.
- Retire ligeramente el tubo hasta que se recuperen los sonidos de la respiración, y luego vuelva a avanzar y asegure el tubo en su lugar.
- Ventilar al animal con apoyo mecánico (volumen corriente: 10 mL/kg, fracción de O 2 inspirado: 40%, frecuencia respiratoria: 30-40 respiraciones/min, presión positiva al final de la espiración: 5-10 cmH2O).
- Ajustar la FiO2 según lo tolerado para lograr una saturación de O2 superior al92 % medida por oximetría de pulso para prevenir la hiperoxia, que puede provocar una respuesta inflamatoria sistémica.
- Verificar la colocación correcta del TET mediante un examen físico (es decir, auscultación), signos clínicos (es decir, observación de condensación en el extremo del tubo endotraqueal) y con medidas objetivas (es decir, dióxido de carbono al final de la espiración).
- Después de aproximadamente 10 minutos, administre una inyección IM de medetomidina al conejo para proporcionar efectos anestésicos y analgésicos simultáneos.
- Mantener la anestesia general con isoflurano al 1% durante todo el procedimiento quirúrgico.
- Inserte un catéter intravenoso de 22 G en la vena marginal del oído y asegúrelo con cinta adhesiva para obtener un acceso intravenoso periférico.
NOTA: La vena femoral se puede utilizar como un sitio alternativo de acceso venoso.- Anestesiar completamente al animal con acepromazina IV y ketamina IV.
- Antes de la incisión, inyecte 1.000 U/mL de heparina a una dosis de 3 mg/kg IV.
- Administrar 1.000 U/mL de heparina a una dosis inicial de 3 mg/kg y volver a administrar cada hora hasta el final del experimento para mantener un tiempo de coagulación activado de >400 s, de acuerdo con el protocolo quirúrgico actual.
- Administrar lidocaína IV al 1% y/o desfibrilación asincrónica epicárdica según sea necesario si se produce fibrilación ventricular durante la cirugía. La fibrilación ventricular generalmente se detiene con una o dos dosis de lidocaína.
- Perfundir la solución de lactato de Ringer de forma continua a 10 mL/kg/h.
NOTA: Dado el pequeño volumen de líquidos administrados y los cortos tiempos operatorios, los animales en los estudios de supervivencia en este trabajo no requirieron diuresis antes de la extubación ni durante el período de recuperación. Si el animal desarrolla un empeoramiento del estado pulmonar (es decir, aumento de la configuración del ventilador, evidencia de edema pulmonar en la auscultación, etc.), se recomienda la diuresis.
- Realizar un corte carotídeo, y colocar 4 o 5 vías arteriales francesas para facilitar el seguimiento intraoperatorio de la presión arterial (PA).
NOTA: La arteria femoral se puede utilizar como un sitio alternativo de acceso arterial. - Monitoriza y registra todas las variables fisiológicas y mecánicas mediante análisis continuos en tiempo real.
- Monitorizar la PA arterial con la vía arterial carotídea y registrar la saturación deO2 mediante oximetría de pulso a través de un sensor colocado en una pata afeitada.
- Monitor con un electrocardiograma (ECG) con tres derivaciones de las extremidades: I, II y III, y tres derivaciones aumentadas computarizadas: aVL, aVR y aVF.
- Registre los trazados del ECG en la línea de base preisquémica, durante la isquemia, durante la reperfusión y en serie durante los días 7-28 de recuperación (si se realiza un estudio de supervivencia).
- Monitorizar el nivel de sedación mediante la monitorización continua de la PA y la frecuencia cardíaca (FC).
- Controle la temperatura con una sonda rectal.
- Utilice el ECHO 2D desde las vistas paraesternales y apicales izquierdas para evaluar la función miocárdica en los puntos de tiempo deseados tanto en los casos de supervivencia como en los de no supervivencia.
- Evaluar la función miocárdica mediante el acortamiento fraccional (FS) midiendo la distancia telediastólica del ventrículo izquierdo (DAVI) y la distancia telesistólica del ventrículo izquierdo (DSVI) y utilizando la siguiente fórmula:
FS = (LVEDD − LVESD)/LVEDD × 100
- Evaluar la función miocárdica mediante el acortamiento fraccional (FS) midiendo la distancia telediastólica del ventrículo izquierdo (DAVI) y la distancia telesistólica del ventrículo izquierdo (DSVI) y utilizando la siguiente fórmula:
- Durante la cirugía, coloque al animal sobre una manta de agua caliente circulante para mantener una temperatura corporal central estable.
- Preparar y cubrir al animal de forma estéril:
- Afeitar el sitio quirúrgico y preparar con betadine y alcohol isopropílico al 70%, cada uno aplicado por triplicado. Seque el área con gasas estériles y cubra a todo el animal con toallas estériles.
- Minitoracotomía izquierda (estudios de supervivencia)
- Realizar un bloqueo intercostal en el sitio predeterminado de la toracotomía con bupivacaína IM.
- Administre lidocaína IV al 1% a través de la vena auricular antes de la incisión.
- Realice una minitoracotomía izquierda a través del cuarto espacio intercostal a lo largo de la porción superior de la quinta costilla para evitar el haz neuromuscular, que se encuentra paralelo a la superficie inferior de cada costilla.
- Realizar una toracotomía anterolateral para la mejor visualización de la superficie anterolateral del corazón (es decir, la ubicación anatómica de las ramas diagonales de la DA).
- Coloque al conejo con el lado izquierdo elevado aproximadamente 30° usando una almohada o una bolsa de frijoles.
- Asegure la pata ipsilateral del conejo por encima de su cabeza para crear espacio tanto para el campo operatorio como entre los espacios de las costillas.
- Palpa y delinea los puntos de referencia óseos, incluidas las costillas, el esternón y la escápula, con un rotulador. Haga una incisión en la piel que recubre la quinta costilla con una cuchilla # 10. Asegúrese de que la incisión permanezca paralela a la costilla.
- Utilice la electrocauterización para dividir el músculo pectoral mayor y el músculo serrato anterior. Divida los músculos intercosteros justo por encima de la quinta costilla con electrocauterización para preservar el haz neurovascular.
- Entrar con precaución en el espacio pleural a través del cuarto espacio intercostal con disección aguda o roma. Extienda la incisión pleural inicial paralela a la costilla en ambas direcciones con una disección aguda o roma hasta que se pueda insertar un separador de costillas o un retractor esternal.
- Coloque un separador de costillas o un retractor esternal dentro del espacio de las costillas y ensanche para proporcionar una visualización adecuada del corazón y el saco pericárdico. Levante el pericardio con unas pinzas DeBakey y abra el pericardio con unas tijeras Metzenbaum.
- Aislamiento de la arteria de la DA
- Rodear la segunda o tercera rama diagonal de la arteria de la DA con una sutura de polipropileno (3-0) en una aguja cónica. Retira la aguja y enhebra ambos extremos del filamento de polipropileno a través de un pequeño tubo de vinilo para formar una caja.
- Coloque un pledget entre el lazo y la arteria coronaria para evitar dañar la coronaria y/o causar vasoespasmo con la ligadura.
- Con unas pinzas DeBakey, coge una prenda rectangular de fieltro de PTFE (aproximadamente 7 mm x 3 mm). Coloque la prenda entre los dos filamentos de polipropileno de modo que quede intercalada entre la arteria LAD aislada y el tubo de vinilo cuando se apriete la trampa.
- Estesterotomía de la línea media (estudios sin supervivencia)
NOTA: El abordaje de esternotomía de línea media es ideal para los casos de no supervivencia, para los cuales se puede utilizar una monitorización más invasiva con LVDP y sonomicrometría.- Realiza una esternotomía de la línea media con unas tijeras curvas de Mayo. Coloque un retractor esternal y ensanche para proporcionar una visualización adecuada del corazón y el saco pericárdico.
- Levante el pericardio con unas pinzas DeBakey y abra el pericardio con unas tijeras Metzenbaum.
- Colocación de los tres cristales de sonomicrometría piezoeléctrica:
- Realiza tres pequeños cortes de 1 mm en el epicardio del VI, formando las esquinas de un triángulo. Coloque los cristales de sonomicrometría piezoeléctrica dentro de los cortes del epicardio.
- Asegure los cables a la superficie cardíaca con una puntada en U de polipropileno 5-0. Al grabar con sonomicrometría, detenga la ventilación mecánica para permitir un registro preciso de dos o tres latidos cardíacos.
NOTA: Si el corazón fibra, la lidocaína al 1% no es efectiva y se necesita desfibrilación epicárdica, apague el sonomicrómetro y desconéctelo del sistema de adquisición de datos para proteger ambos de la entrada eléctrica.
- Aislamiento de la arteria LAD:
- Rodear la segunda o tercera rama diagonal de la arteria de la DA con una sutura de polipropileno (3-0) en una aguja cónica.
- Retira la aguja y enhebra ambos extremos del filamento de polipropileno a través de un pequeño tubo de vinilo para formar una caja.
- Coloque un pledget entre el lazo y la arteria coronaria para evitar dañar la arteria coronaria y/o causar vasoespasmo con la ligadura.
- Con unas pinzas DeBakey, coge una prenda rectangular de fieltro de PTFE (aproximadamente 7 mm x 3 mm). Coloque la prenda entre los dos filamentos de polipropileno de modo que quede intercalada entre la arteria LAD aislada y el tubo de vinilo cuando se apriete la trampa.
- Medición del LVDP:
- Coloque una puntada en U de polipropileno 5-0 en el ápice del VI. Haga una pequeña incisión de 1 mm con una cuchilla de 11 en el ápice del VI.
- Inserte un catéter de balón de 3 French en el lumen del ventrículo izquierdo. Asegure el catéter al VI atándolo a la sutura de puntada en U de polipropileno 5-0.
- Conecte el catéter al transductor conectado al monitor para registrar el DPVI. Registre el LVDP utilizando el sistema de adquisición de datos (descrito a continuación). Ponga a cero el catéter para registrar las variables hemodinámicas abriendo la llave de paso de tres vías al aire y poniendo a cero el monitor.
- Sistema de adquisición de datos
- Inicie el sistema de adquisición de datos (consulte la Tabla de materiales) en la computadora/computadora portátil que se está utilizando. Conecte el cable del monitor a la computadora/computadora portátil.
- Seleccione el canal 1 en el sistema de adquisición de datos y asígnele el nombre LVDP. Ponga a cero el transductor con el monitor.
NOTA: Si conecta la presión arterial y la frecuencia cardíaca al sistema de adquisición de datos, siga el mismo proceso: conecte el cable a la computadora portátil, seleccione Canal y ponga a cero si mide la presión arterial.
- Ocluya la arteria coronaria apretando la trampa presionando hacia abajo el tubo de vinilo mientras tira hacia arriba de los filamentos de sutura de polipropileno. Mantenga la estanqueidad deseada con una pinza antimosquitos sujetando directamente el tubo y fijándolo en su lugar.
- Confirmar visualmente la isquemia miocárdica por la cianosis regional del epicardio. La isquemia regional también puede confirmarse en el ECG con la presencia de un segmento ST y cambios en la onda T.
- Después de la confirmación visual, inducir isquemia regional durante 30 min bajo anestesia.
- A los 0 min, 10 min, 20 min y 30 min durante la isquemia regional, evaluar el SF mediante ECHO 2D tanto para los casos de supervivencia como para los de no supervivencia.
- Evaluar la DPVI y la sonomicrometría de forma continua durante el tiempo de preisquemia, el tiempo de isquemia miocárdica y el tiempo postisquémico para los casos de no supervivencia.
- Si es necesario, delinee el área en riesgo ligando la arteria nuevamente con la sutura de polipropileno dejada en su lugar. Pinza cruzada de la aorta e inyecte pigmento azul Monastral al 98% (diluido 1:5 en PBS) a través de la aorta con una aguja de cardioplejia. Las áreas perfundidas del miocardio se teñirán de azul y el área en riesgo permanecerá sin teñir.
- Monitoree y registre continuamente la frecuencia cardíaca, la presión arterial y la saturación deO2 .
- Deje que el animal se recupere durante 2 h (no supervivencia) o 28 días (supervivencia).
NOTA: El ECG se puede utilizar para confirmar la reperfusión. Aunque no se observó en el experimento realizado en este estudio, la hipopotasemia a menudo puede ocurrir durante la reperfusión y puede corregirse con control de potasio o una infusión adecuada.
- Conclusión del procedimiento
- Casos de supervivencia
- En los casos de supervivencia, recorta el hilo de polipropileno 3-0 utilizado para la caja, ata los extremos sin apretar y déjalo en su lugar. Identificar la zona de riesgo y la zona de infarto mediante el hilo de polipropileno 3-0.
- Una vez finalizado el procedimiento, cierre la incisión en tres capas.
- Cierra la primera capa atando dos puntos en forma de ocho de poliglactina 910 2-0 alrededor de las costillas.
- Cierre las capas musculares y subcutáneas con una sutura de polidioxanona 3-0 de forma corrida.
- Cerrar la piel de forma subcuticular con una sutura de monofilamento 5-0. Use una sutura enterrada para minimizar la irritación que siente el animal.
- Evacuar el aire pleural realizando una toracocentesis con aguja.
- Aplicar un parche transdérmico de fentanilo durante 72 h para facilitar el manejo del dolor postoperatorio.
- Realizar ecocardiografía transtorácica a las 1 semanas y 2 semanas del postoperatorio para evaluar las tendencias en el SF.
- Después del período de recuperación predeterminado, sede, intuba y anestesia al animal como se indicó anteriormente. Realizar una esternotomía mediana. Exponer y abrir el saco pericárdico. Sacrificar al conejo bajo anestesia profunda extirpando el corazón en bloque, permitiendo que el animal expire por exanguinación.
- Casos de no supervivencia
- Después del experimento y con la anestesia profunda asegurada, exponer completamente el corazón, y retirarlo en bloque para su análisis bioquímico y tisular. El animal expira por exanguinación.
- Casos de supervivencia
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Representative Results
Siguiendo el protocolo (Figura 1), la isquemia miocárdica fue confirmada inmediatamente por la visualización directa de la cianosis del epicardio.
Los ECG estándar (tres derivaciones de la extremidad: I, II y III, y tres derivaciones aumentadas computarizadas: aVL, aVR y aVF) se registraron de forma continua antes de la isquemia, durante la isquemia y en la reperfusión (Figura 2). Los ECG muestran taquicardia, arritmias (es decir, fibrilación ventricular), defectos del sistema de conducción (es decir, bloqueo de rama), el desarrollo de ondas Q relacionadas con el infarto y la desviación del segmento ST23.
Durante la isquemia regional, la hipocinesia regional se observó directamente a simple vista en la cavidad media de la pared anterior en todos los corazones, lo que concuerda con el área de perfusión de la arteria de la DA que se hizo isquémica por la restricción del flujo con el atrapamiento temporal de la DA. Tanto en los casos de supervivencia como en los de no supervivencia, se obtuvieron lecturas de ECHO 2D durante la preisquemia, justo antes de inducir la isquemia regional y en diferentes momentos del experimento: 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min y 120 min. Las dimensiones telediastólica del ventrículo izquierdo (DAVI) y telesistólica del ventrículo izquierdo (DSVI) se midieron con un ECHO en modo M guiado por 2D en las circunferencias máxima y mínima del VI, respectivamente. La contractilidad regional de la pared del VI en la zona isquémica miocárdica se evaluó a partir de vistas de eje corto del VI utilizando el modo M, con la línea de Curser superpuesta al área en riesgo. El acortamiento fraccionario (FS) se calculó con la siguiente fórmula: FS = (LVEDD − LVESD)/LVEDD × 10024. Los resultados mostraron que el acortamiento fraccional disminuyó durante el tiempo isquémico y el tiempo post-isquémico en comparación con el tiempo pre-isquémico (Figura 3)
Para cuantificar la extensión de la lesión miocárdica, el tamaño del infarto se puede medir bioquímicamente con tinción de cloruro de trifenil tetrazolio (TTC) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). En este trabajo, el área de riesgo fue delineada mediante la religadura de la arteria afectada mediante el atado de la sutura de Prolene dejada en su lugar. La aorta se sujetó con pinzas cruzadas y se administró pigmento azul monastral (diluido 1:5 en PBS) a través de la aorta con una aguja de cardioplejia. Las áreas de miocardio perfundido se tiñeron de azul y el área de riesgo permaneció sin teñir debido a la ligadura de la arteria.
El corazón se cortó a lo largo del eje del ventrículo izquierdo, desde el ápice hasta la base, en secciones transversales de 1 cm de grosor, se colocó entre placas de vidrio y se comprimió con pinzas bulldog. El área de riesgo para cada lado de cada sección se trazó en una lámina de acetato transparente. Las secciones del corazón se incubaron en un recipiente oscuro con TTC al 1% en tampón fosfato (pH 7,4) a 38 °C durante 20 min. A continuación, las secciones del corazón se almacenaron en una solución de formaldehído al 10% durante 24 h antes de las mediciones finales para mejorar la visualización de la zona del infarto. Las secciones se colocaron entre placas de vidrio y se comprimieron con abrazaderas bulldog. La necrosis miocárdica se evidenció por un área blanca en el tejido miocárdico, y las áreas de color rojo ladrillo mostraron el tejido viable. (Figura 4) Las regiones infartadas (blancas) dentro de las áreas de riesgo para cada lado de cada sección se trazaron en la lámina de acetato transparente. Se utilizó planimetría para medir el área de riesgo y la zona de infarto. Los volúmenes del área de riesgo y de la zona infartada se calcularon multiplicando las áreas planimetizadas por el espesor del corte. El volumen del infarto se expresó como porcentaje del volumen total del VI para cada corazón25. Se calculó la relación entre el área de riesgo y el peso del VI y el tamaño del infarto se expresó como porcentaje del área de riesgo. Nuestro trabajo anterior demostró que, después de 2 h y 28 días de recuperación, las áreas en riesgo (es decir, como porcentaje de la masa del VI) eran aproximadamente del 29% y el 27%, respectivamente, tanto para el grupo mitocondrial como para el grupo control. Sin embargo, después de 2 h y 28 días de recuperación, el tamaño del infarto (es decir, el tamaño del infarto/área en riesgo) en los corazones mitocondriales fue del 9,8% y 7,9%, respectivamente, en comparación con el 37% y el 34% en los corazones de control26. Además, en nuestros experimentos anteriores, el acortamiento fraccional y la DPVI se redujeron en el grupo de control al 50%-60% y al 70%-80%, respectivamente, en comparación con la línea de base.
Figura 1: Diagrama de protocolo. El protocolo se puede ajustar en función de las necesidades del experimento, ya sea para casos de supervivencia o no supervivencia. Los casos de no supervivencia se pueden realizar con un abordaje quirúrgico más invasivo mediante esternotomía de línea media, lo que permite el uso de cristales de sonomicrometría, ecocardiografía epicárdica (ECHO) y un catéter VI para la medición del acortamiento fraccional y la DPVI. Para los casos de supervivencia, en los que se debe considerar la cicatrización de la incisión y el manejo del dolor, se puede realizar una minitoracotomía izquierda y se puede evaluar la función miocárdica en diferentes momentos durante un período de estudio más largo utilizando 2D ECHO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Electrocardiograma representativo (extremidad II y derivación aumentada computarizada aVL) antes de la inducción de la isquemia regional, durante el tiempo isquémico y durante la reperfusión. Las escalas de milivoltios y milisegundos se muestran a la izquierda. Los puntos de tiempo y el momento de la captura de la arteria descendente anterior izquierda se muestran en la parte inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación ecocardiográfica del corazón mediante la medición del acortamiento fraccional (FS). El acortamiento fraccional se midió mediante la obtención de la distancia telediastólica del ventrículo izquierdo y la distancia telesistólica del ventrículo izquierdo con el modo M guiado 2D en las circunferencias máxima y mínima del VI, respectivamente. El acortamiento fraccional se evaluó en (A) basal/preisquemia, (B) durante el enganche temporal de la arteria descendente anterior izquierda (DA) con la línea del cursor sobre el área de riesgo, y (C) durante la reperfusión después de soltar el lazo en la DA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes representativas del tamaño del infarto para un corazón teñido con cloruro de trifenil tetrazolio al 1% después de 30 min de isquemia regional miocárdica inducida. El tejido viable se ve como rojo, mientras que el infarto se ve como áreas blancas. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Nuestro protocolo demuestra una metodología fiable para la realización de la isquemia miocárdica regional aguda en el conejo. El abordaje de la minitoracotomía izquierda es ideal para los casos de supervivencia, en los que se debe minimizar la incisión y el dolor asociado. Es importante destacar que el tratamiento con diuréticos no fue necesario antes de la extubación, y no hubo mortalidad intraoperatoria en el grupo de no supervivencia ni a las 4 semanas después de la operación en el grupo de supervivencia. Cuando el diseño del protocolo requiere un caso de no supervivencia, o cuando se necesita una monitorización más detallada de la función miocárdica global y regional, se puede utilizar una esternotomía de línea media (Figura 1).
Los pasos más críticos del protocolo son rodear cuidadosamente la DA con una aguja cónica sin dañar la arteria ni crear sangrado venoso y ocluir la DA para crear un área de riesgo consistente.
Algunas complicaciones que se pueden experimentar al realizar la cirugía descrita son la sobredistensión pulmonar durante la ventilación mecánica debido a un alto volumen corriente, sangrado por daño a la DA, sangrado secundario a lesión de vasos intercostales, que generalmente ocurre al ingreso o por manipulación del retractor, y/o arritmia cardíaca (fibrilación ventricular intraoperatoria) con ligadura de LAD. También pueden ocurrir otras complicaciones postoperatorias, como infección del sitio quirúrgico, mala movilización del animal debido al dolor y/o hipocinesia regional miocárdica residual. A pesar de que la incidencia de estas complicaciones es muy baja, el investigador debe ser capaz de abordarlas de manera rápida y efectiva.
Los conejos se presentan como un excelente modelo animal para estudios miocárdicos. Su frecuencia cardíaca es similar a la frecuencia cardíaca humana, y su tamaño es lo suficientemente pequeño, pero permite el análisis histológico bajo un microscopio óptico.
Se debe reconocer una limitación en este estudio; Específicamente, el corazón de conejo es más pequeño y clínicamente menos relevante para las comparaciones con el corazón humano que los corazones de otros modelos animales grandes como el cerdo.
Debido a la incidencia y prevalencia de las enfermedades cardiovasculares, contar con un modelo animal que simule la isquemia miocárdica regional es de suma importancia. Esta metodología podría tener múltiples aplicaciones y ha demostrado ser útil en modelos de lesión vascular, isquemia miocárdica crónica y períodos cortos de aturdimiento miocárdico 27,28,29,30,31.
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Disclosures
Los autores no declaran ningún conflicto de intereses, financiero o de otro tipo.
Acknowledgments
El estudio original en el que se utilizó este protocolo fue financiado por las subvenciones HL-103642 y HL-088206 del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 blade | Bard Parker | 371210 | |
| #11 blade | Fisher Scientific | B3L | |
| 22 G PIV needle | BD Insyte | 381423 | |
| Acepromazine | VETONE | NDC 13985-587-50 | 0.5 mg/kg IM and IV |
| Aline pressure bag | Infu-Stat | 2139 | |
| Angiocath | Becton Dickinson | 382512 | |
| Arterial Catheter | Teleflex | MC-004912 | |
| Atropine | Hikma Pharmaceuticals | NDC 0641-6006-01 | 0.01 mg/kg IM |
| Betadine and 70% isopropyl alcohol | McKesson | NDC 68599-2302-6 | |
| Blood gas machine | Siemens | MRK0025 | |
| Bovie | Valleylab | E6008 | |
| Bulldog clamps | World Precision Instruments | 14119 | |
| Bupivacaine | Auromedics | NDC 55150-249-50 | 3 mg/kg IM |
| Butorphanol | Roxane | NDC 2054-3090-36 | 0.5 mg/kg IM |
| Clear acetate sheet | Oxford Instruments | ID 51-1625-0213 | |
| Clipers | Andis | AGC2 | |
| DeBakey forceps | Integra | P6280 | |
| Echocardiography machine | Philips | IE33 F1 | |
| Electrocardiography machine | Meditech | MD908B | |
| Endotracheal tube | Medline | #922774 | |
| Fentanyl | West-Ward | NDC 0641-6030-01 | 1–4 µg/kg transdermal patch |
| Formaldehyde solution 10% | Epredia | 94001 | |
| Glass plates | United Scientific | B01MUHX6MR | |
| Heparin Sodium | Sagent | NDC 69-0058-02 | 1000U in 1 mL 3 mg/kg |
| Hot water blanket | 3M | 55577 | |
| Isoflurane | Penn Veterinary Supply, INC | NDC 50989-606-15 | 1%–3% |
| Ketamine | Dechra | NDC 42023-138-10 | 10 mg/kg IV |
| Lab Chart 7 Acquisition Software | Adinstruments | ||
| Lactated Ringer's solution | ICUmedical | NDC 0990-7953-09 | 10 mL/kg/h |
| Laryngoscope | Welch Allyn | 68044 | |
| Left ventricule lumen catheter 3Fr | McKesson | 385764-EA | |
| Lidocaine (1%) | Pfizer | 4276-01 | 1–1.5 mL/kg IV |
| LVDP transducer | Edward | PDP-ED | |
| Marking pen | Viscot | 1451SR-100 Unsterile | |
| Mayo scissors | Mayo | S7-1098 | |
| Medetomidine | Entireoly Pets Pharmacy | NDC 015914-005-01 | 0.25 mg/kg IM |
| Metzenbaum scissors | Cole-Parmer | UX-10821-05 | |
| Monastra. Blue pigment 98% | Chemsavers | MBTR1100G | |
| Monocryl 5-0 | Ethicon | Y463G | |
| Mosquito clamp | Shioda | 802N | |
| PDS 3-0 | Ethicon | 42312201 | |
| Piezoelectric sonomicrometry crystals | Sonometrics | Small 2mm round | |
| Plegets | DeRoyal | 32-363 | |
| Povuine Iodine Prep Solutions | Medline | MDS093940 | |
| Precision vaporized system face mask | Yuwell | B07PNH69BF | |
| Prolene 3-0 | Ethicon | 8665G | |
| Proline 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Pulse oximetry probe | Masimo | 9216-U | |
| Rib spreader | Medline | MDS5621025 | |
| S12 Pediatric Sector Probe | Phillips | 21380A | |
| Sonomicrometer | Sonometrics | BZ10123724 | |
| Sterile gauze | Medline | 3.00802E+13 | |
| Sterile towels | McKesson | MON 277860EA | |
| Sternal retractor | Medline | MDS5610321 | |
| Sutures for closure | J&J Dental | 8698G | |
| Telemetriy monitor | Meditech | MD908B | |
| Temperature probe | Omega | KHSS-116G-RSC-12 | |
| Triphenyl tetrazolium chloride (1%) | Millipore | MFCD00011963 | |
| Ventilator | MedGroup | MSLGA 11 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | V635H | |
| Vinyl tubing | ABE | DISW 3001 |
References
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