Summary
כאן אנו מתארים שיטה ספציפית לזמן כדי לתפעל ביעילות מסלולים התפתחותיים קריטיים בשליית העכבר in vivo. זה מבוצע באמצעות הזרקה ואלקטרופורציה של פלסמידים CRISPR לתוך השליות של סכרים בהריון ביום העוברי 12.5.
Abstract
השליה היא איבר חיוני המווסת ומשמר את התפתחות היונקים ברחם. השליה אחראית על העברת חומרי מזון ופסולת בין האם לעובר ועל ייצור ואספקה של גורמי גדילה והורמונים. מניפולציות גנטיות שליה בעכברים הן קריטיות להבנת התפקיד הספציפי של השליה בהתפתחות טרום לידתי. לעכברים טרנסגניים בעלי ביטוי Cre ספציפי לשליה יש יעילות משתנה, ושיטות אחרות למניפולציה של גנים שליה יכולות להיות חלופות שימושיות. מאמר זה מתאר טכניקה לשינוי ישיר של ביטוי גנים שליה באמצעות מניפולציה של גן CRISPR, אשר ניתן להשתמש בה כדי לשנות את הביטוי של גנים ממוקדים. באמצעות גישה כירורגית מתקדמת יחסית, סכרים בהריון עוברים לפרוטומיה ביום העוברי 12.5 (E12.5), ופלסמיד CRISPR מועבר על ידי מיקרופיפטה זכוכית לתוך השליה הבודדת. הפלסמיד מחושמל מיד לאחר כל הזרקה. לאחר התאוששות הסכר, השליות והעוברים יכולים להמשיך בהתפתחות עד להערכה בנקודת זמן מאוחרת יותר. הערכת השליה והצאצאים לאחר השימוש בטכניקה זו יכולה לקבוע את התפקיד של תפקוד השליה הספציפי לזמן בהתפתחות. סוג זה של מניפולציה יאפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו גנטיקה ותפקוד של שליה משפיעים על גדילת העובר והתפתחותו בהקשרים של מחלות מרובות.
Introduction
השליה היא איבר חיוני המעורב בהתפתחות העובר. תפקידה העיקרי של השליה הוא לספק גורמים חיוניים ולווסת את העברת החומרים המזינים והפסולת אל העובר וממנו. שליות יונקים מורכבות הן מרקמה עוברית והן מרקמה אימהית, המרכיבות את הממשק העוברי-אימהי, ולכן הגנטיקה של האם והעובר משפיעה על הפונקציה1. אנומליות גנטיות או תפקוד לקוי של השליה יכולים לשנות באופן דרסטי את התפתחות העובר. עבודות קודמות הראו כי גנטיקה והתפתחות שליה קשורות להתפתחות משתנה של מערכות איברים ספציפיות בעובר. בפרט, הפרעות בשליה קשורות לשינויים במוח, בלב ובמערכת כלי הדם של העובר 2,3,4,5.
העברת הורמונים, גורמי גדילה ומולקולות אחרות מהשליה לעובר ממלאת תפקיד מרכזי בהתפתחות העובר6. הוכח כי שינוי ייצור השליה של מולקולות ספציפיות יכול לשנות את ההתפתחות העצבית. דלקת אימהית יכולה להגביר את ייצור הסרוטונין על ידי שינוי ביטוי הגן המטבולי טריפטופן (TRP) בשליה, אשר לאחר מכן יוצר הצטברות של סרוטונין במוח העובר7. מחקרים אחרים מצאו מומים בשליה לצד מומי לב. הפרעות בשליה נחשבות כתורמות למומי לב מולדים, המום המולד, השכיח ביותר בבני אדם8. מחקר שנערך לאחרונה זיהה מספר גנים בעלי מסלולים תאיים דומים הן בשליה והן בלב. אם הם משובשים, מסלולים אלה עלולים לגרום לפגמים בשני האיברים9. המומים בשליה עלולים להחמיר מומי לב מולדים. תפקידה של גנטיקה של השליה ותפקודה על התפתחות מערכת איברים עוברית ספציפית הוא תחום מחקר מתפתח.
לעכברים יש שליות המוכריאליות ותכונות אחרות של שליות אנושיות, מה שהופך אותם למודלים שימושיים ביותר לחקר מחלות אנושיות1. למרות חשיבותה של השליה, חסרות כיום מניפולציות גנטיות ממוקדות in vivo. יתר על כן, יש כיום יותר אפשרויות זמינות עבור נוקאאוטים או נוק-דאונים מאשר ביטוי יתר או מניפולציות רווח של פונקציה בשליה10. ישנם מספר קווים טרנסגניים למניפולציה ספציפית לשליה, כל אחד בשושלות טרופובלסטים שונות בנקודות זמן שונות. אלה כוללים Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER ו- Gcm1-Cre 11,12,13,14. בעוד טרנסגנים Cre אלה יעילים, הם עשויים שלא להיות מסוגלים לתפעל גנים מסוימים בנקודות זמן ספציפיות. שיטה נפוצה נוספת לביטוי גנים של שליה היא החדרת וקטורים לנטי-ויראליים לתרבית בלסטוציסט, מה שגורם למניפולציה גנטית ספציפית לטרופובלסט15,16. טכניקה זו מאפשרת שינוי משמעותי בביטוי גן השליה בשלב מוקדם בהתפתחות. השימוש בהפרעות RNA in vivo נוצל בדלילות בשליה. החדרת פלסמידים shRNA יכולה להתבצע באופן דומה לטכניקת CRIPSR המתוארת במאמר זה. זה נעשה ב E13.5 כדי להפחית בהצלחה את ביטוי PlGF בשליה, עם השפעות על כלי הדם במוח של צאצאים17.
בנוסף לטכניקות המשמשות בעיקר לנוקאאוט או להדחה, גרימת ביטוי יתר מבוצעת בדרך כלל עם אדנווירוסים או החדרת חלבון אקסוגני. לטכניקות המשמשות לביטוי יתר יש שיעורי הצלחה משתנים והן בוצעו לרוב בשלב מאוחר יותר בהריון. כדי לחקור את תפקידו של גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF-1) בתפקוד השליה, בוצעה העברת גן שליה בתיווך אדנובירל כדי לגרום לביטוי יתר של הגן IGF-1 18,19. זה בוצע מאוחר בהריון עכבר על E18.5 באמצעות הזרקת שליה ישירה. כדי לספק אפשרויות נוספות ולעקוף כשלים אפשריים של מניפולציות גנטיות מבוססות של שליה, כגון כשלים משולבים של Cre-Lox, הרעילות האפשרית של אדנווירוסים, וההשפעות מחוץ למטרה של shRNA, ניתן להשתמש במניפולציה ישירה של CRISPR in vivo של השליה 20,21,22. מודל זה פותח כדי לתת מענה להיעדר מודלים של ביטוי יתר וליצור מודל עם גמישות.
טכניקה זו מבוססת על עבודתם של Lecuyer et al., שבה פלסמידים shRNA ו- CRISPR כוונו ישירות in vivo לשליות עכבר כדי לשנות ביטוי PlGF 17. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לשנות ישירות את ביטוי גני השליה באמצעות מניפולציה של CRISPR במספר נקודות זמן; עבור עבודה זו, E12.5 נבחר. השליה התבגרה בשלב זה והיא גדולה מספיק כדי לבצע מניפולציות, מה שמאפשר החדרת פלסמיד CRISPR ספציפי על E12.5, אשר יכול להשפיע באופן משמעותי על התפתחות העובר מאמצע עד סוף ההריון23,24. בניגוד לגישות טרנסגניות, אך בדומה להשראות נגיפיות או הפרעות RNA, טכניקה זו מאפשרת ביטוי יתר או נוקאאוט בנקודות זמן מסוימות באמצעות גישה כירורגית מתקדמת יחסית, ובכך מונעת שליה לקויה אפשרית או קטלניות עוברית משינויים מוקדמים יותר. מכיוון שרק שליות מעטות מקבלות את פלסמיד הניסוי או הבקרה בתוך המלטה, הגישה מאפשרת שני סוגים של בקרות פנימיות. בקרות אלה הן אלה המוזרקות ומתחשמלות עם פלסמיד הבקרה המתאים ואלה שאינן מקבלות מניפולציה ישירה. טכניקה זו הותאמה ליצירת ביטוי יתר של הגן IGF-1 בשליית העכבר באמצעות פלסמיד CRISPR מתווך הפעלה סינרגיסטי (SAM). הגן IGF-1 נבחר, שכן IGF-1 הוא הורמון גדילה חיוני המועבר לעובר ומיוצר בעיקר בשליה לפני הלידה25,26. טכניקת CRISPR חדשה ממוקדת שליה זו תאפשר מניפולציה ישירה שתסייע להגדיר את הקשר בין תפקוד השליה להתפתחות העובר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בוצעו בהתאם ובהתאם לתקנות הפדרליות ולמדיניות אוניברסיטת איווה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
1. בעלי חיים ובעלי חיים
- שמור על בעלי החיים במחזור אור יום של 12 שעות עם מזון ומים עד ליביטום.
- השתמש בעכברות CD-1 בגילאי 8-15 שבועות. השתמש בנוכחות של תקע כפייתי כדי לזהות E0.5.
- ב-E0.5 מאכלסים לבדו את הסכרים ההריוניים.
2. כיול המיקרופיפטה
הערה: יש לבצע את כיול המיקרופיפטה לפני הניתוח במידת האפשר.
- לפני ייצור וכיול המיקרופיפטה, יש לדלל את כל הפלסמידים לריכוז המומלץ (0.1 מק"ג/מיקרוליטר) במים נטולי DNase. מערבבים את הפלסמיד עם צבע ירוק מהיר מדולל כראוי (1 מיקרוגרם/מיקרוליטר ב-PBS) (ריכוז פלסמיד סופי: 0.06 מק"ג/מק"ל).
- משוך מיקרופיפטות באמצעות נימי זכוכית בקוטר 10 ס"מ בקוטר חיצוני של 1.5 מ"מ וקוטר פנימי של 0.86 מ"מ עם מושך מיקרופיפטה.
- בזהירות לשבור את קצה micropipette (2-3 מ"מ) עם מלקחיים סטריליים.
- לטעון את micropipette לתוך קצה microcapillary מחובר microinjector. ודא שהמיקרו-מזרק מחובר למכונת המיקרו-הזרקה ושיש רמות מספיקות של חנקן כדי לכייל את המיקרופיפטה.
- לאחר חיבור המיקרופיפטה למיקרו-מזרק, טען אותה בתמיסת הצבע הירוק המהיר כדי לבצע את הכיול (1 מיקרוגרם/μL ב-PBS). כיילו את המיקרופיפטה להזרקת נפח של כ-3.5 μL. רוקנו ("שקוף") את המיקרופיפטה כהכנה להעמסת תמיסות הפלסמיד כמפורט להלן.
הערה: כל מיקרופיפטה תהיה שונה במקצת. כדי למנוע פגיעה בשליה במהלך ההזרקה, זמן ההזרקה צריך להיות מוגדר בין 0.5-1.5 שניות. הלחץ צריך להיות מוגדר בין 1-8.5 psi. כיול כל מיקרופיפטה בנפרד; אם micropipette לא ניתן לכייל בתוך פרמטרים אלה, אז זה לא צריך לשמש.
3. ניתוח (איור 1A)
הערה: כדי להכין, נקו את המשטחים הן של אזור ההכנה והן של אזור הניתוח עם אתנול 70%. הניחו תחתיכה סופגת באזור ההכנה. באזור הניתוח, הניחו כרית חימום כלפי מטה, ולאחר מכן הניחו כרית תחתונה סופגת מעליה. יש לעקר את כל הכלים לפני הניתוח. הזמן שהסכר נמצא תחת הרדמה צריך להיות מתחת לשעה.
- הרדמה
- יש לתת 5 מ"ג/ק"ג של NSAID (meloxicam) או משכך כאבים מאושר אחר לסכר ההריון 30 דקות עד שעה לפני הניתוח.
- הניחו את הסכר ההריוני בתא אינדוקציה המחובר לוופורייזר איזופלורן.
- כוונו את הוופורייזר ל-4% איזופלורן ו-3.5 ליטר/דקה חמצן.
- לאחר שההרדמה אושרה על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן וקצב נשימה מופחת, יש להסיר את הסכר מתא האינדוקציה לאזור ההכנה.
- הכנה לניתוח
- באזור ההכנה, מניחים את הסכר שכיבה עם חרוט האף.
- הפחיתו את הוופורייזר ל-2% איזופלורן ו-3.5 ליטר/דקה חמצן בזמן שהסכר נמצא בחרוט האף.
- לגלח היטב את בטן הסכר ולהסיר פרווה עודפת. ציפוי לסירוגין של הבטן המגולחת בתמיסת פובידון ואתנול 70% שלוש פעמים באמצעות אפליקטורים סטריליים מכותנה. החל את המעיל הסופי של תמיסת פובידון. כדי למנוע התייבשות של הקרנית, הניחו ג'ל דמעות מלאכותי על שתי העיניים של הסכר (איור 2A, B).
- לאחר ההכנה, העבירו את הסכר עם חרוט האף לאזור הניתוח המיועד.
- לפרוטומיה של הרחם
הערה: יש להשתמש בכפפות סטריליות לאורך כל ההליך הכירורגי. החליפו את הכפפות אם נוצר מגע עם משטח לא סטרילי.- באזור הניתוח, הניחו את עמוד השדרה של הסכר, והדקו את חרוט האף למקומו באמצעות נייר דבק. הניחו את כרית החימום מתחת לכרית הסופגת לטמפרטורה של 45°C.
- בעזרת מלקחיים ומספריים, לבצע חתך קו אמצע משוער 2 ס"מ דרך העור. השתמש במלקחיים כדי אוהל העור, ולעשות חתך אנכי לתוך העור. לאחר מכן, בצע חתך נוסף בגודל דומה דרך הצפק כדי לחשוף את קרני הרחם. בעזרת מלקחיים, מקמים את הצפק תוך כדי ביצוע החתך האנכי (איור 2C, D).
הערה: אי ביצוע אוהל כראוי בעת חיתוך הצפק עלול להוביל לחתך קטלני של המעיים. - לעסות בעדינות את קרני הרחם דרך החתך על ידי לחיצה על צידי הבטן. עשו זאת על ידי הנחיה זהירה של הרחם ללא כלים, תוך שימוש באצבעות בלבד כדי למנוע פגיעה בשוגג. הניחו את הרחם החשוף על גבי וילון כירורגי סטרילי המכסה את בטן הסכר ושמרו אותו לח לאורך כל הניתוח בעזרת טיפות מלח סטריליות, שניתן לחמם ל-30°C לפני השימוש לפי הצורך (איור 2E, F).
הערה: ניתן לזהות את קרני הרחם כמתואר ב- Wang et al.27. - לאחר שהרחם נחשף, בחר שלושה זוגות שליות למניפולציה.
הערה: ניתן לזהות את השליות כפי שתוארו על ידי Elmore et al.24. כדי למקסם את הישרדות העוברים, לא יותר מ 6 שליות צריך להיות מטופל. אם קיימים פחות מ-12 עוברים, יש להזריק לא יותר מ-4 שליות. בחר שתי שליות סמוכות כך שאחת תקבל זריקת בקרה והשנייה תקבל את פלסמיד הניסוי. השימוש בשתי שליות סמוכות מאפשר השוואה טובה יותר של שליות במקומות דומים ברחם וגם מאפשר קצב הישרדות מוגבר. זוגות השליות שנבחרו נבחרים באופן אקראי ומרווחים לאורך שתי קרני הרחם (איור 1B). - רשום את מיקום מניפולציות השליה וארגון העוברים בתוך קרני הרחם, כך שניתן יהיה לזהות את העוברים והשליות במהלך האיסוף, שכן סכר אחד יישא הן שליות/עוברים שטופלו בניסוי.
- הזרקת שליה ואלקטרופורציה של פלסמיד הבקרה
הערה: כדי לשמור על טכניקה אספטית, יש לעקר את משוטי האלקטרופורציה ואת המיקרו-מזרק בחומר מעקר קר לפני השימוש. החליפו כפפות אם נוצר מגע עם משטח לא סטרילי.- באמצעות מיקרופיפטה מכוילת, לטעון כמות מספקת של פלסמיד הבקרה המתאים עבור שלוש זריקות. בצעו את כל ההזרקות בעומק של ~0.5 מ"מ לרוחב לתוך השליה בין אזור הדסידואה (לבן) לאזור הצומת (אדום כהה) (איור 3A-F).
- לבצע זריקות בשלוש שליות הביקורת.
הערה: בצע את כל זריקות פלסמיד הבקרה לפני זריקות הניסוי כדי למנוע זיהום צולב של הפלסמידים עם המיקרופיפטה. זה יאפשר להשתמש באותה מיקרופיפטה, שכן שינוי מיקרופיפטות וזמן כיול מגדיל באופן דרסטי את זמן הניתוח ומקטין את הישרדות הסכר. - בצע אלקטרופורציה של שליות הבקרה המוזרקות בפלסמיד תוך 2 דקות מההזרקה.
- עבור אלקטרופורציה, השתמש בזוג משוטים 3 מ"מ המחוברים למכונת אלקטרופורציה. כדי להבטיח יעילות שילוב CRISPR ואת הכדאיות של עוברים, השתמש בהגדרות האלקטרופורציה הבאות: 2 פולסים, 30 V, 30 ms פולס, 970 ms פולס כבוי, חד קוטבי.
- לאחר ההזרקה אך מיד לפני ההתחשמלות יש לצפות את מקומות המגע במי מלח סטריליים, ולמרוח את המלח בדיוק על שלושת האתרים בדופן הרחם והמשוטים בטפטפת או מזרק.
- לחץ בעדינות על משוטי האלקטרופורציה בצדדים הרוחביים של השליה. הניחו את משוט האנודה מעל אתר ההזרקה ואת הקתודה ישירות ממול (איור 4A-C).
- לחץ על הפולס במכשיר האלקטרופורציה, והמתן עד ששתי הפולסים יסתיימו לפני הסרת משוטי האלקטרופורציה.
הערה: כמות קטנה של קצף לבן נראית לעתים קרובות בין המשוטים לשליה במהלך פולסים. אם זה לא קורה, בדוק את המתח מהמשוטים עם מד מתח לפני שימוש נוסף. אם הקריאה במד המתח אינה תואמת את הגדרת מתח האלקטרופורציה, המשוטים אינם פונקציונליים.
- הזרקת שליה ואלקטרופורציה של פלסמיד ניסיוני
- בצע את אותן הוראות משלב 3.4.1. לשלב 3.4.2. שימוש בפלסמיד ניסיוני במקום פלסמיד הבקרה.
- בצע אלקטרופורציה של כל שלוש השליות המוזרקות הניסיוניות תוך 2 דקות מההזרקה. זה צריך להתבצע באותו אופן כמו עבור אלה מוזרקים עם פלסמידים בקרה. בצע את שלב 3.4.4. לשלב 3.4.7.
- סיום הניתוח
- לאחר השלמת מניפולציית השליה, עסו בעדינות את קרני הרחם בחזרה לתוך חלל הבטן באמצעות אצבעות בלבד (איור 5A).
- ראשית, בצע תפרים בודדים בעלי קשר כפול על שכבת הצפק באמצעות תפרים מצופים וקלועים הניתנים להמסת מסה באורך 45 ס"מ עם סגסוגת מחט 3/8c 13 מ"מ. רווח את התפרים במרחק של 2-3 מ"מ זה מזה (איור 5B).
- לאחר תפירת שכבת הצפק, תפרו את העור בתפרים נמסים. קשר משולש התפרים הבודדים במרחק של 2-3 מ"מ זה מזה כדי להבטיח שהסכר לא יוכל לבטל את התפר (איור 5C).
- לאחר השלמת התפירה, כוונו את האיזופלורן ל-1% ואת החמצן ל-3.5 ליטר/דקה, ומרחו דבק רקמות על התפרים שעל העור (איור 5D).
הערה: דבק רקמות הוא אופציונלי אך מומלץ למנוע פתיחה מחדש של החתך עקב לעיסת סכר. - כאשר דבק הרקמה התייבש, כבו את מכשיר האידוי והוציאו את הסכר מאזור הניתוח. הניחו את הסכר בכלוב תומך על גבו.
4. טיפול ומעקב לאחר הניתוח
- לאפשר לסכר ההרה להתאושש בכלוב נקי תחת השגחה למשך 30 דקות לפחות כדי להבטיח שלא יהיו סיבוכים מיידיים של הניתוח. התבונן עד שהוא אמבולטורי לחלוטין ויכול להתהפך על רגליו ללא סיוע. לשכן את הסכר לאחר הניתוח.
- יש לעקוב אחר הטיפול והמעקב המוסדיים שלאחר הניתוח עד לאיסוף העוברים. רשום את משקל הסכר, ועקוב אחר התפרים ואתר החתך מדי יום.
5. איסוף שליה E14.5
- ב-E14.5, יש להרדים עמוקות את הסכר עם קוקטייל קטמין/קסילזין (1 מ"ג/מ"ל קטמין ו-0.1 מ"ג/מ"ל קסילזין), ולאחר מכן לנקוע את הסכר בצוואר הרחם.
- בצע חתך בצורת V לתוך הבטן של הסכר עם מספריים, ולהסיר את הרחם. מניחים מיד על צלחת פטרי בקוטר 5 ס"מ על קרח. באמצעות מלקחיים, בזהירות להסיר את העובר ואת השליה המתאימה מן הרחם.
הערה: שמור תיעוד של מיקום העובר והשליה המתאימה בקרני הרחם כדי לקבוע מי קיבל את המניפולציה הישירה במהלך הניתוח. - רשום את משקלי השליה. באמצעות מלקחיים וסכיני גילוח נטולי RNAse, חתכו את השליה לשניים לאורך קו האמצע. הכניסו מחצית אחת ל-4% PFA בטמפרטורה של 4°C. חתכו שוב את החצי הנותר לשניים, ואחסנו את שני הרבעונים הנותרים בטמפרטורה של 80°C בשני צינורות, אחד עם מגיב אחסון RNA.
הערה: ניתן לאחסן עוברים ורקמות אימהיות אחרות מהאוסף בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי.
6. ניתוח ביטוי גנים שליה
- השתמש ברבע השליה המאוחסנת ב -80 מעלות צלזיוס בריאגנט אחסון RNA.
- עבד את השליות עבור qPCR כמתואר ב- Elser et al. באמצעות שיטת Trizol לבידוד RNA, ספקטרופוטומטר לריכוז RNA, ערכת סינתזת cDNA ו- qPCR עם SYBR Green Master Mix28. במקום ערכת Turbo DNAfree DNAse המוזכרת ב- Elser et al., השתמש בערכת RNAcleanup לאחר בידוד ה- RNA של Trizol כדי להבטיח שהדגימות אינן מכילות מזהמים28.
הערה: קרא את גיליון נתוני בטיחות החומרים (MSDS) עבור Trizol, והשתמש בו במכסה אדים כימי. - להעריך את החדרת הפלסמיד של פלסמיד הבקרה עם פריימרים GFP ושל פלסמיד ניסיוני עם פריימרים BLAST (פריימרים המפורטים בטבלה משלימה 1). השתמש בערך CT כדי לקבוע את נוכחותו של פלסמיד.
הערה: ערכי CT מעל 35 הם תוצאות חיוביות שגויות, ורק אלה מתחת ל -35 צריכים להיחשב אינדיקטור חיובי לכך שהפלסמיד הוכנס בהצלחה. - להעריך את ביטוי השליה IGF-1 מנורמל לגן משק הבית 18s (פריימרים המפורטים בטבלה משלימה 1). השתמש בשיטת ddCT כדי לחשב את שינוי הקיפול, ולאחר מכן חשב את שינוי הקיפול המנורמל של דגימות הניסוי לשינוי הקיפול הממוצע של דגימות הבקרה.
7. ניתוח רמת חלבון שליה
- השתמש ברבע השליה שאוחסנה ב -80 מעלות צלזיוס. הומוגניזציה של הרקמה בתמיסת חיץ העשויה 11.5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl 2 ומעכב פרוטאז 10 mM ב- diH2 O עם pH סופי של 7.4. השתמש הומוגנייזר כף יד ו pestle כדי לפרק את הרקמה.
הערה: הדגימה לא תעלה על 10% מנפח המאגר. - דללו את הדגימות ההומוגניות במאגר ביחס של 1:12, כך שהן יהיו בטווח הניתן לזיהוי של ערכת בדיקת חומצה ביכונית. בצע את בדיקת BCA בהתאם להוראות היצרן, וכמת את סך החלבון באמצעות קורא לוחות.
- לאחר ביצוע בדיקת BCA, לנרמל את כל הדגימות לאותו ריכוז חלבון כולל של 2 מ"ג / מ"ל עבור IGF-1 ELISA, כפי שנעשה Gumusoglu et al.29.
- בצע את IGF-1 ELISA בהתאם להוראות היצרן, וכמת את רמות החלבון IGF-1 באמצעות קורא לוחות באמצעות עקומת ריכוז סטנדרטית.
8. אימות CRIPSR מרחבי באמצעות תיוג הכלאה פלואורסצנטי באתרו
- לאחר שחצאי השליה קובעו כראוי ב-4% PFA ב-4°C למשך 1-3 ימים, העבירו אותם ל-20% סוכרוז ב-4°C לפני הקפאתם בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT).
- באופן סריאלי חותכים את השליה המשובצת OCT בחצי קריוסטט של -20 מעלות צלזיוס למקטעים של 10 מיקרומטר, ומניחים אותם על שקופיות כדי להיות מסומנים. חתכו את חצאי השליה כך שכל שלושת אזורי המשנה יהיו גלויים. אחסנו את המגלשות בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש להכלאה באתר .
- בצע תיוג הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) בהתאם לפרוטוקולים של היצרן. בצע הכלאה של שקופית אחת עם בדיקה dCas9-3xNLS-VP64 ושקופית "אחות" שנייה של אותה שליה עם בדיקה Prl8a8.
הערה: הבדיקה dCas9-3xNLS-VP64 מזהה את נוכחותו של פלסמיד ביטוי יתר. הגשושית Prl8a8 מדגישה ספונגיוטרופובלסטים של אזור הצומת, מה שמאפשר לזהות את תת-האזורים של השליה. שתי בדיקות אלה מסומנות בשקופיות "אחות" נפרדות כדי למנוע הפרעה של פלואורסצנטיות רב-ערוצית עם האוטופלואורסצנטיות הירוקה בשליות. - תייגו את שתי הגשושיות בצבע הזיהוי (אופל 620). לאחר השלמת פרוטוקול היצרן עבור FISH, החל מדיום הרכבה DAPI והנח מכסה על השקופית. אטמו את הכיסוי בלק שקוף.
- דמיינו את השקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי מורכב זקוף, ועבדו אותן באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מתאימה. כאן נעשה שימוש בתוכנת CellSens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות כלליות של הליכים (איור 6)
במחקר היו שלוש קבוצות שעברו מניפולציה. אלה כללו שליות שהוזרקו עם פלסמיד בקרה כללי CRISPR Cas9 (Cas9 Control), פלסמיד CRISPR בקרת הפעלה (Act Control), או פלסמיד הפעלת IGF-1 SAM (Igf1-OE). בקרת Cas9 מתאימה יותר לפלסמידים נוקאאוט, ובקרת ההפעלה מתאימה יותר לפלסמידים של ביטוי יתר/הפעלה. כדי להעריך את שינויי הכדאיות הנגרמים על-ידי מניפולציה של השליות באמצעות הזרקה והתחשמלות, הישרדות העוברים בתוך המלטה נותחה ב-E14.5 (איור 6A). נקודת זמן זו נבחרה כאשר מחקרים אחרים שביצעו החדרת in vivo של פלסמידים CRISPR באמצעות אלקטרופורציה הראו כי ניתן להשיג שינויי ביטוי תוך 8-22 שעות30,31,32. איסוף ב-E14.5 מאפשר לפלסמיד הקריספר כ-48 שעות להשתלב ולהפעיל עלייה בביטוי הגנים. נמצא כי מניפולציה כירורגית של הסכר השפיעה על הישרדותם של כל העוברים, אך העוברים הקשורים לשליות שעברו מניפולציה ועברו הזרקה ואלקטרופורציה הפחיתו משמעותית את הישרדותם. שיעור ההישרדות של העוברים שלא טופלו (באותה המלטה אך לא עברו מניפולציה ממוקדת) ירד מ-100% הישרדות לממוצע של 79.05%. חלה ירידה משמעותית בהישרדות העוברים שעברו מניפולציה, עם שיעור הישרדות ממוצע של 55.56%. לא נמצא הבדל משמעותי בין שלוש הקבוצות שעברו מניפולציה.
כדי לקבוע אם חלו שינויים גסים משמעותיים בשליות המניפולטיביות, נרשם משקל השליה. לא היה הבדל משמעותי במשקל השליה של אף קבוצה (איור 6B), והמראה הגולמי של השליה והעובר לא השתנה. תמונות מייצגות לאחר נמק צולמו במיקרוסקופ דיסקציה באיסוף ב-E14.5. צולמו תמונות של השליות/עוברים מקבוצות טיפול שונות, כולם בתוך אותה המלטה. לא היה נזק או שינוי ניכר במראה הפנוטיפי באף אחת מקבוצות הטיפול, לא בשק מי השפיר ולא בעובר החשוף ובשליה המתאימה לו (איור 6D-I). בעוד שלא נצפו הבדלים גסים במורפולוגיה של הקבוצות שעברו מניפולציה עם השימוש בפלסמיד הפעלה IGF-1, ייתכן שזה לא נכון לגבי פלסמידים ניסיוניים אחרים המכוונים לגנים אחרים שעשויים להשפיע באופן משמעותי יותר על מווסתי גדילה ותפקוד חיוניים של השליה או העובר. לא נמצאו הבדלים בשום מדד בין שליות הבקרה Cas9 ובקרת המעשה. לכן, שתי קבוצות אלה שולבו וכונו Con או Controls עבור כל הניתוחים. תוצאות אלה מראות כי מניפולציה של שליות ברחם על E12.5 באמצעות טכניקה זו גורמת לירידה בהישרדות העובר, אך עדיין יש כדאיות משמעותית. התוצאות מראות גם כי צמיחת השליה אינה מושפעת באופן משמעותי, שכן לא היה שינוי משמעותי במשקל בין השליות שעברו מניפולציה ולא טופלו. זה מוכיח כי הטכניקה המוצעת יכולה לאפשר הישרדות של שליות בריאות ובנות קיימא עם מניפולציה של קריספר והעוברים המתאימים להן.
שינוי במשקל הסכר נרשם בכל יום לאחר הניתוח לפני איסוף העוברים ב-E14.5 (איור 6C). הניתוח בוצע ב-E12.5, כך שכל השינויים במשקל הסכר רשומים ביחס למשקל ב-E12.5. סכרי הניסוי (Exp) עברו מניפולציה של השליה, ואילו סכרי דמה עברו הרדמה ולפרוטומיה של משך זמן דומה ללא מניפולציה של השליה. סכרים הריוניים רבים הציגו ירידה קלה או ללא שינוי במשקל ביום שלאחר ההליך (E13.5); זאת, ככל הנראה, בשל הפרעות אכילה במהלך הניתוח ולאחריו. רוב הסכרים הראו עלייה במשקל ב-E14.5, אך מדי פעם עדיין נצפתה ירידה במשקל. מעקב אחר משקל הסכר האימהי לאחר הניתוח איפשר מעקב אחר הישרדות העובר. השונות בין משקל הסכרים ההריוניים לאחר הניתוח הייתה נפוצה ולא הצביעה על כך שכל העוברים שטופלו אבדו. לא היו הבדלים משמעותיים בשינויי משקל לאחר הניתוח בדמה לעומת סכרים ניסיוניים. זה מראה כי רווחתו של הסכר נשמרה בדרך כלל לאחר החדרת פלסמידים CRISPR לתוך השליה. בסך הכל, זה מראה כי בעוד טכניקה כירורגית זו יכולה לגרום לירידה בכדאיות של עוברים, זה עדיין מניב אחוז משמעותי של צאצאים בריאים שניתן להשתמש בהם למחקר.
ניתוח ביטוי ושילוב CRISPR בשליות E14.5 (איור 7)
כדי לקבוע אם ההחדרה התאית של פלסמיד ההפעלה IGF-1 הייתה מוצלחת לביטוי יתר של IGF-1, בוצע qPCR. כצפוי, ה-qPCR הראה עלייה משמעותית בביטוי IGF-1 בשליות IGF1-OE לעומת שליות הביקורת כאשר שינוי הקיפול נורמל לביטוי 18s (מבחן t של וולש, p = 0.0302) (איור 7A). כדי לקבוע אם רמות החלבון IGF-1 השתנו, בוצע ELISA על השליות מכל הקבוצות. בהתאם ל-qPCR, הערכת ELISA של שליות E14.5 הראתה עלייה משמעותית ברמות חלבון IGF-1 בשליות IGF1-OE לעומת שליות הביקורת (מבחן t של וולש, p = 0.0469) (איור 7B). ה-qPCR וה-ELISA הראו כי פלסמיד בעל ביטוי יתר הגביר בהצלחה את ביטוי הגנים IGF-1 ואת ייצור החלבון IGF-1, בהתאמה.
כדי להבטיח שמסירת הפלסמיד תהיה ספציפית לשליות המניפולציה, בוצע qPCR עבור פלסמיד ההפעלה הספציפי IGF-1 ופלסמיד הבקרה CRISPR Cas9. qPCR אלה בוצעו הן על השליות המניפולטיביות והן על השליות הלא מטופלות שהיו סמוכות לאלה שהוזרקו. פריימרים qPCR ששימשו להערכת ביטוי פלסמיד ההפעלה התמקדו ברצף של פלסמיד BLAST, שהוא חלק ממערכת ההפעלה (איור 7C). השליות שלא טופלו לא הראו נוכחות של פלסמיד BLAST (סף מחזור [CT] לא נקבע, מסומן כ-40 בגרף), והשליות Igf1-OE הראו CT סביב 30. ה-qPCR שבוצע כדי להעריך את ביטוי פלסמיד הבקרה התמקד ברצף מהגן GFP שהוחדר (איור 7D). השליות שלא טופלו הראו ערכי CT מעל 35, ככל הנראה כתוצאה מדימריזציה ראשונית, שכן ערכים אלה נמצאים מחוץ לטווח הביטוי הצפוי. קבוצת הביקורת הראתה ערך CT של כ-30. qPCR אלה משמשים כבדיקת איכות כדי להדגים את ביטוי היתר הצפוי של IGF-1 או היעדרו וכי הפלסמידים נמצאים רק בשליות המניפולציה הצפויות.
אימות מרחבי של פלסמיד ההפעלה IGF-1 בוצע באמצעות קטעי שליה. שליות שהיו קבועות ומוקפאות בתרכובת OCT חולקו באופן סדרתי ב -10 מיקרומטר על שקופיות כך שכל השכבות נראו. לאחר מכן הוקפאו המגלשות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש לסימון FISH. כדי לוודא היכן בתוך השליה שולב פלסמיד ההפעלה IGF-1 CRISPR, נעשה שימוש בבדיקה dCas9-3xNLS-VP64 עם תיוג פלואורסצנטי אדום. בדיקה זו מכוונת לרכיב פונקציונלי של מערכת ההפעלה. אוטופלואורסנציה ירוקה שימשה להדגמת תת-האזורים של ממשק השליה-האם והעובר (איור 7E,F). לא זוהה dCas9-3xNLS-VP64 בשליות שלא טופלו, מאחר שהן לא טופלו באמצעות מניפולציה של קריספר (איור 7E). כצפוי, שליות IGF1-OE הציגו תיוג עבור dCas9-3xNLS-VP64, כפי שניתן לראות באדום (איור 7F). שילוב קריספר נמצא בכל שלושת תתי-האזורים של השליה, עם הסימון הברור ביותר של אזור הצומת (איור 7E). עוצמת הפלואורסצנטיות של התיוג dCas9-3xNLS-VP64 השתנתה בין השליות שטופלו בפלסמיד, מה שמצביע על כך שחלקן ביטאו את הפלסמיד בצורה גבוהה יותר מאחרות, והיו שינויים במיקום / בהיקף המדויק של התיוג, אך התיוג היה קיים בדרך כלל בכל תתי האזורים. כדי לאשר את המיקום של התיוג dCas9-3xNLS-VP64, תיוג Prl8a8 FISH המכוון לספוגיוטרופובלסטים בוצע כדי לתייג את תת-אזור הצומת האמצעי (איור 7G,H). פעולה זו בוצעה במקטעים סמוכים מאותה שליה בשקופית "אחות" של המקטעים שסומנו עבור dCas9-3xNLS-VP64. כצפוי, המבנה שצוין על ידי תיוג Prl8a8 היה דומה בין IGF1-OE לבין שליות לא מטופלות. ניתן לזהות את אזור הדסידואה והמבוך באמצעות סימון הגרעינים הכחולים (DAPI) המקיפים את אזור הצומת האדום (איור 7G,H). תיוג FISH של dCas9-3xNLS-VP64 הבהיר כי הפלסמיד הוכנס לכל שלושת אזורי המשנה, וזה אושר עם תיוג Prl8a8. תוצאות תיוג FISH אישרו כי שילוב פלסמיד ההפעלה IGF-1 היה מוצלח, והפלסמיד לא נדד לשליות לא מטופלות.
איור 1: סכמה של הפרוטוקול. (A) סכמה פשוטה של ההליך הכירורגי. סדר כרונולוגי של השלבים העיקריים של הטכניקה. (B) סכמטי המציג דוגמה לריווח שליה מניפולטיבי בתוך קרני הרחם. שני הלוחות נוצרו עם BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הליך לפרוטומיה של הרחם. (A-B) במהלך ההכנה לניתוח, (A) הבטן המגולחת של סכר, ו-(B) האזור המגולח המצופה בתמיסת יוד. (ג-ו) באזור הניתוח, (C) חתך ~2 ס"מ בעור הבטן, ו-(D) חתך ~2 ס"מ בצפק; המעיים גלויים. (E) מניפולציה של קרני הרחם דרך אתר החתך. קרני הרחם גלויות. (F) קרני רחם חשופות לחלוטין שהונחו על רפש כירורגי סטרילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הזרקת פלסמידים מסוג קריספר לשליות E12.5. (A,B) כיוון העוברים והשליה בתוך קרני הרחם. (A) מבט אלכסוני על קרן רחם מסומנת המציגה החלטה, אזורי עובר ועובר. הקו המקווקו מייצג היכן צריך להיות אתר ההזרקה. (B) קרן רחם לא מסומנת מלוח A. (ג,ד) מבט מהצד על המיקרופיפטה המוחדרת לאתר ההזרקה בשליה. D הוא ה-decidua, FZ הוא אזורי העובר, E הוא העובר, והקו המקווקו מייצג את מיקום אתר ההזרקה. (D) תמונה ללא תווית של הכנסת מיקרופיפטה מלוח C. (ה,ו) מבט מהצד על הצבע בשליה לאחר ההזרקה. (E) תמונה מסומנת של קרן רחם המציגה שליה שהוזרקה לה פלסמיד CRIPSR המכיל צבע נראה לעין ושליה שלא הוזרקה. (F) תמונה ללא תווית של קרן הרחם בלוח E. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אלקטרופורציה של שליות E12.5 לאחר הזרקת פלסמידים מסוג קריספר. (A) מבט מלמעלה על שליות בקרן רחם. משוטי האנודה והאלקטרופורציה הקתודה מסומנים, והחץ הלבן מציין את מיקום אתר ההזרקה. (B) מבט אלכסוני על אלקטרופורציה של שליה. (C) מבט מהצד על אלקטרופורציה של שליה. (ד-ו) מיתאר מפושט של לוחות A, B ו- C. משוטי האנודה והקתודה מסומנים, P הוא השליה, E הוא העובר, והאזור הלא מסומן הוא הרחם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תפירה של עור הבטן והצפק . (A) קרני הרחם חזרו לבטן לאחר סיום הניתוח. עור הבטן וחתכי הצפק גלויים. (B) חתך פריטוניום תפור לחלוטין. (C) חתך בעור הבטן תפור לחלוטין. (ד) מריחת דבק רקמה על תפרי עור הבטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תוצאות הליך כללי. (A) שיעורי הישרדות עוברים לאחר ניתוח שנאספו ב-E14.5, יומיים לאחר ההליך. ירידה משמעותית בהישרדות נצפתה בקבוצות שעברו מניפולציה לעומת העוברים שלא טופלו (מבחן Mann-Whitney U: Untreated לעומת Cas9 Control, p = 0.0077; לא מטופל לעומת בקרת פעולה, p = 0.0330; ולא מטופל לעומת IGF1-OE, p = 0.0032). לא נצפו הבדלים משמעותיים בהישרדות של הקבוצות שעברו מניפולציה (ANOVA חד-כיוונית, p = 0.9454). כל נקודה מייצגת את אחוז ההישרדות מהמלטה בודדת (n = 22, Cas9 Control n = 9, Act Control n = 13 ו- IGF1-OE n = 22 המלטות). (B) משקל שליה של העוברים ששרדו ב-E14.5 (ANOVA חד-כיוונית, p = 0.1436) (לא מטופל n = 138, Cas9 Control n = 15, Act Control n = 20 ו-IGF1-OE n = 36 שליות). (C) שינויים במשקל הסכר לאחר הניתוח ב-E13.5 וב-E14.5 שנצפו בסכרים שעברו הליך לפרוטומי דמה או עברו מניפולציה ניסיונית (Exp) של השליה. לא נראה הבדל משמעותי בין שתי קבוצות השינויים במשקל הסכרים לאחר הניתוח (בדיקות t לא מזווגות: E13.5 p=0.5452 ו-E14.5 p=0.2493) (סכרי Sham n=3 וסכרי Exp n=10). כל קווי השגיאה מייצגים את ה- SEM. (D-F) תמונות של עוברי E14.5 לאחר נמק בשק מי השפיר כשהשליה עדיין מחוברת. (F) סרגל קנה המידה בפינה הימנית הקיצונית מייצג 3.75 מ"מ. (G-I) תמונה אלכסונית של העובר ומבט עליון של השליה המתאימה. (I) סרגל קנה המידה בפינה הימנית הקיצונית מייצג 3.75 מ"מ. (D-I) כל תוויות קבוצת הטיפול מפורטות מתחת לתמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: ניתוח ביטוי ושילוב CRISPR בשליות E14.5. (A) ניתוח qPCR של ביטוי IGF-1 בבקרת E14.5 ובשליות IGF1-OE. עלייה משמעותית בביטוי IGF-1 מנורמל לביטוי 18s נצפתה בשליות IGF1-OE (מבחן t של וולש, p = 0.0302) (בקרה n = 15 ו- IGF1-OE n = 20 שליות). (B) ELISA של רמות חלבון IGF-1 בבקרת E14.5 ובשליות IGF1-OE. עלייה משמעותית ברמות IGF-1 נצפתה בשליות IGF1-OE בהשוואה לרמות הביקורת (מבחן t של וולש, p = 0.0469) (בקרה n = 13 ו- IGF1-OE n = 15 שליות). (C) ניתוח qPCR של רצף BLAST מפלזמיד IGF-1 SAM. ביטוי BLAST נמצא בשליות IGF1-OE בלבד, וביטוי לא/לא מוגדר נמצא בשליות הלא מטופלות (n = 4 לא מטופל ו- IGF1-OE n = 9 שליות). (D) ניתוח qPCR של רצף GFP מפלסמיד הבקרה CRISPR Cas9. ביטוי הפלסמיד נמצא בשליות הביקורת, וערכי CT מעל 35/תוצאות חיוביות כוזבות נמצאו בדגימות שלא טופלו (n = 4 לא מטופל וביקורת = 5 שליות). הקו המקווקו מייצג את סף החיובי הכוזב ב- 35 CT. כל נקודת נתונים היא משליה אחת. כל קווי השגיאה מייצגים את SEM. (E-H) הכלאה פלואורסצנטית באתרו של מקטעי שליה E14.5 בעובי 10 מיקרומטר. (E) מקטעי שליה לא מטופלים ו-(F) IGF1-OE עם בדיקה dCas9-3xNLS-VP64 המסומנת באדום. האות האדום קיים רק בשליית IGF1-OE. האות הירוק הוא אוטופלואורסצנטיות המשמש לזיהוי תת-אזורי השליה. (G) מקטעי שליה לא מטופלים ו-(H) IGF1-OE עם בדיקה Prl8a8 המסומנים באדום לזיהוי ספונגיוטרופובלסטים של אזור הצומת האמצעי. DAPI בכחול מציג את אזורי ההחלטה והמבוך המקיפים את אזור הצומת. (H) סרגל קנה המידה בפינה הימנית הקיצונית מייצג 2 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה משלימה 1: פריימרים ששימשו במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השליה היא מווסת עיקרי של גדילת העובר, וכאמור, שינויים בביטוי או בתפקוד של גן השליה עשויים להשפיע באופן משמעותי על התפתחות העובר6. ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כאן לביצוע מניפולציה ממוקדת in vivo CRISPR של שליית העכבר בגישה כירורגית מתקדמת יחסית. טכניקה זו מאפשרת יבול משמעותי של עוברים בני קיימא והשליות התואמות שלהם שניתן להשתמש בהם למחקר נוסף (איור 6A,B). השיטה הזו אפשרה לנו לבטא בהצלחה את השליה IGF-1 ב-E14.5 (איור 7A,B). הפלסמידים שבהם נעשה שימוש הראו ייחודיות, מאחר שהפלסמידים שהוחדרו נשארו בשליות שעברו מניפולציה ולא היו נוכחים בשליות הסמוכות שלא טופלו (איור 7C,D). ההתפלגות המרחבית של פלסמיד ההפעלה IGF-1 אושרה על-ידי FISH עבור dCas9-3xNLS-VP64 ו-Prl8a8, אשר הראו כי פלסמיד ההפעלה היה נוכח בשלושת תת-האזורים של שליות IGF1-OE ולא באף תת-אזור של השליות הלא מטופלות (איור 7E-H). ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לשנות את ביטוי גני השליה בדרכים שאולי לא היו אפשריות בטכניקות קודמות. השימוש בטכניקה זו יאפשר הבנה טובה יותר של השפעת ביטוי ותפקוד גני השליה על התפתחות העובר בהקשרים מרובים.
כדי לייעל את ההצלחה של הליך זה עבור תוצאות אימהיות ועובריות, נבדקו ההשפעות של שינוי פרמטרים מרובים, כולל הגדרות ההזרקה והאלקטרופורציה, כמו גם החומרים המשמשים. כדי להגדיל את הישרדות הסכר ואת ההתאוששות, נמצא כי הזמן תחת הרדמה לא יעלה על 1 שעות, כמו תקופות ניתוח ארוכות יותר להפחית באופן משמעותי את ההישרדות. אם הזמן תחת הרדמה מגיע כ 2 שעות, הסיכוי של הישרדות הוא ירד באופן דרמטי לרמות מתחת 20%, כנראה בשל ההשפעות השליליות של זמן ממושך תחת isoflurane. מלבד הזמן תחת הרדמה, הסיבוך השכיח ביותר של הניתוח שהוביל למוות של האם היה כישלון לאוהל כראוי את הצפק בעת ביצוע חתכי העור והצפק. אם הצפק אינו אוהל כראוי, המעיים עלולים להיפגע, מה שעלול לגרום למוות בימים שלאחר הניתוח. זמן חשיפת הרחם משפיע גם על הישרדות הסכר והעוברים. הזמן הממוצע שבו נחשף הרחם בניסויים מוצלחים היה כ-15 דקות; חשיפה של יותר מ-30 דקות עלולה להוביל לספיגה מוגברת ולמחלות אימהיות אפשריות. הרחם החשוף וכל איברים חשופים אחרים (לעתים קרובות מעיים) חייבים להישמר לחים, אבל יותר מדי מלח יכול לקרר את החיה; כאשר מעת לעת להרטיב את האיברים החשופים, פחות מ 1 מ"ל של מלוחים סטריליים יש להשתמש.
הפרמטרים של ההזרקה והאלקטרופורציה השפיעו מאוד על הישרדות העובר. נפח ההזרקה לא יעלה על כ 4.5 μL, כמו זה הביא resorptions. זמן ההזרקה והלחץ חשובים כדי למקסם את ההישרדות; זמן ההזרקה צריך להיות מוגדר בין 0.5 שניות ל -1.5 שניות, אם כי 0.8 שניות נראה אופטימלי. הלחץ צריך להיות מוגדר בין 1-8.5 psi. שיעורי הישרדות עוברים נמוכים נצפו עם זמני הזרקה נמוכים ורמות PSI גבוהות בהזרקה. כמו כן נצפה כי אם המיקרופיפטה הייתה קהה מדי, עלולה להיות ירידה בכדאיות העוברית, והתמיסה גם תדלוף לעתים קרובות החוצה מהמיקרופיפטה. סוג הצבע המשמש לדמיון הזריקות יכול להשפיע על הישרדות. מתילן כחול הוביל למוות אימהות כאשר נעשה בו שימוש למטרה זו, אך תמיסת צבע ירוק מהיר מסוננת לא הראתה השפעות שליליות על בריאות האם. הגדרות האלקטרופורציה עברו אופטימיזציה מהגדרות היצרן המומלצות בהתבסס על מחקרי אלקטרופורציה קודמים in vivo33. אלקטרופורציה נמצאה כמניפולציה שגרמה לנזק הרב ביותר והפחיתה את הישרדות העובר. הגדרות אלקטרופורציה של עוברים in vivo המומלצות מציעות ארבעה פולסים כדי למקסם את יעילות הקריספר, אך שתי פעימות מומלצות לשיעור הישרדות גבוה יותר33. נמצא כי ארבע פעימות גרמו כמעט לכל העוברים לספוח מחדש. שני פולסים אפשרו כדאיות מוגברת תוך שמירה על יעילות הקריספר. גודל משוט האלקטרופורציה השפיע באופן משמעותי גם על הישרדות העובר. נמצא כי משוטי אלקטרופורציה 5 מ"מ הובילו לספיגה כמעט מלאה בשימוש עם ההגדרות המומלצות. ואכן, משוטי אלקטרופורציה 3 מ"מ מומלצים במדריך היצרן ומגדילים משמעותית את כדאיות העובר33. חשוב גם לציין כי משוטי אלקטרופורציה רבים יש חיי דופק מסוימים. לאחר שהם התרגלו למקסימום זה, ניתן לראות ירידה באיכות. ניתן לזהות זאת אם אין היווצרות של קצף לבן קטן בין המשוטים לשליה במהלך דופק. ניתן לבדוק את מתח משוט האלקטרופורציה באמצעות מד מתח כדי לקבוע אם הוא מייצר את המתח הצפוי.
מחקר זה מוגבל בכמה מובנים. טכניקה זו היא ספציפית לזמן וככל הנראה מומלץ לבצע אותה לא לפני E10.5 ולא יאוחר מ-E16.5. הסיבה לכך היא שהשליה קטנה מדי לפני E10.5, ולאחר E16.5, ייתכן שלפלסמיד לא יהיה מספיק זמן לייצר את האפקט הרצוי. מסגרת זמן זו פירושה שטכניקה זו מתאימה יותר לסוגים ספציפיים של מחקרים בעכברים. טכניקה זו שימושית לחקר התפתחות עצבית, שכן E12.5 נופל בזמן קריטי של נוירוגנזה עבור מבנים רבים במוח34. טכניקה זו עשויה שלא להיות שימושית לחקר השפעות שליה על השלבים המוקדמים של התפתחות, כגון היווצרות לוחות עצביים, המתרחשת על E8.535. התוצאות של פלסמיד CRISPR נוקאאוט אינן ידועות בשלב זה; היישום של שיטה זו להפחתת ביטוי גנים דורש חקירה נוספת מכיוון שהודגם רק ביטוי יתר / הפעלה של גן. למרות זאת, צפוי כי טכניקה זו תהיה מוצלחת גם עבור החדרת פלסמיד CRISPR נוקאאוט.
טכניקה זו יכולה גם לאפשר את האפשרות של ביצוע תרבית ראשונית של רקמת שליה מהונדסת גנטית36. בהתאם לסוג הקריספר שבו נעשה שימוש, כגון CRISPRi ו-CRISPRa, ניתן להשתמש בתרבית ראשונית לביצוע מחקר הצלה37,38. טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור עוד יותר את הקשרים בין הפרעות גנטיות שליה ותפקודית ובעיות בצאצאים. באופן ספציפי, מחקר קודם מצא מתאם מובהק בין דירוגי סיכון גנומיים ספציפיים לשליה לבין סיכונים לסכיזופרניה39. מחקר זה זיהה גנים שליה רבים שעשויים למלא תפקיד בהתפתחות סכיזופרניה שלא נחקרו במודלים של בעלי חיים. טכניקה זו משאילה את עצמה למחקרים נוספים מסוג זה ואחרים.
הידע שנצבר משינוי CRISPR של השליה יכול להיות מתורגם למגוון יישומים ביו-רפואיים שונים. מחקרים המזהים כיצד ביטוי גנים ספציפי בשליה יכול להשפיע על התפתחות העובר יכולים לשמש ליצירת התערבויות פרמקולוגיות ממוקדות שליה שיכולות לטפל בהפרעות אלה. טיפולים הממוקדים ישירות לעובר יכולים להיות קשים ומסוכנים40,41. השליה היא יעד נגיש יותר לטיפול. במקרה של בעיות התפתחותיות בלב או במוח שעשויות להיות ניתנות לשינוי לפני הלידה, מניפולציה ישירה בלב או במוח היא בסיכון גבוה. סיכון כזה יכול להימנע עם התערבות שליה, שהיא סבירה יותר ויכולה להוביל לאסטרטגיות מניעה להפרעות נוירו-התפתחותיות שעבורן הסביבה המולקולרית, המסופקת בחלקה על ידי השליה, עשויה להיות קריטית5. טכניקה זו יכולה לשמש גם לטיפול במחלות כגון מחלת לב מולדת, אשר נקשרה להפרעות שליה9. מכיוון שמחלת לב מולדת היא מום מולד נפוץ, לאפשרות של טיפול בהתערבות שליה יכולה להיות השפעה משמעותית8. מכיוון שלשליה יש תפקידים רבים, טכניקה זו יכולה לשמש לקידום הפיתוח של התערבויות למחלות מרובות. בסך הכל, טכניקה ממוקדת שליה זו יכולה לשמש כדי לקדם את ההבנה של ההשפעה של גנטיקה שליה ותפקוד על אזורים רבים של התפתחות העובר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מכירים במקורות המימון הבאים: R01 MH122435, NIH T32GM008629 ו-NIH T32GM145441. המחברים מודים לד"ר ואל שפילד ולמעבדות של ד"ר קלווין קרטר באוניברסיטת איווה על השימוש בחדר הניתוח ובציוד שלהם, כמו גם לד"ר אריק ואן אוטרלו, ד"ר ננדקומר נאראיאנן וד"ר מתיו ובר על עזרתם במיקרוסקופיה. המחברים מודים גם לד"ר שרה מאורר, מאיה אוונס וסרילקה קונדו על עזרתן בניתוחי הפיילוט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 - 44 - 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/? |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24x60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD - Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
References
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
- Rosenfeld, C. S.
- Maslen, C. L.
- Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
- Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
- Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
- Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
- Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
- Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
- Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
- Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
- Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
- Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
- Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
- Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
- Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
- Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
- Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T.
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
- Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
- Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
- Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
- Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
- Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
- Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
- Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
- Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
- Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
- Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
- Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
- Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
- Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
- Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
- Smajdor, A.
- Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).
