Summary
Burada, fare plasentasındaki kritik gelişim yollarını in vivo olarak etkili bir şekilde manipüle etmek için zamana özgü bir yöntem açıklıyoruz. Bu, embriyonik gün 12.5'te CRISPR plazmidlerinin hamile barajların plasentalarına enjeksiyonu ve elektroporasyonu yoluyla gerçekleştirilir.
Abstract
Plasenta, uterodaki memeli gelişimini düzenleyen ve sürdüren önemli bir organdır. Plasenta, anne ve fetüs arasındaki besin maddelerinin ve atıkların transferinden ve büyüme faktörlerinin ve hormonların üretiminden ve verilmesinden sorumludur. Farelerde plasental genetik manipülasyonlar, plasentanın doğum öncesi gelişimdeki spesifik rolünü anlamak için kritik öneme sahiptir. Plasental spesifik Cre eksprese eden transgenik fareler farklı etkinliklere sahiptir ve plasental gen manipülasyonu için diğer yöntemler yararlı alternatifler olabilir. Bu makalede, hedeflenen genlerin ekspresyonunu değiştirmek için kullanılabilecek CRISPR gen manipülasyonunu kullanarak plasental gen ekspresyonunu doğrudan değiştirmek için bir teknik açıklanmaktadır. Nispeten gelişmiş bir cerrahi yaklaşım kullanarak, hamile barajlar embriyonik gün 12.5'te (E12.5) bir laparotomiye tabi tutulur ve bir CRISPR plazmidi bir cam mikropipet tarafından bireysel plasentalara verilir. Plazmid her enjeksiyondan sonra hemen elektropone edilir. Baraj iyileşmesinden sonra, plasentalar ve embriyolar daha sonraki bir zaman noktasında değerlendirilene kadar gelişime devam edebilir. Bu tekniğin kullanımından sonra plasenta ve yavruların değerlendirilmesi, zamana özgü plasenta fonksiyonunun gelişimdeki rolünü belirleyebilir. Bu tür bir manipülasyon, plasenta genetiğinin ve fonksiyonunun çoklu hastalık bağlamlarında fetal büyüme ve gelişimi nasıl etkilediğinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.
Introduction
Plasenta, fetüsün gelişiminde rol oynayan önemli bir organdır. Plasentanın ana rolü, temel faktörleri sağlamak ve besinlerin ve atıkların fetüse ve fetüsten transferini düzenlemektir. Memeli plasentaları, fetal-maternal arayüzü oluşturan hem fetal hem de maternal dokudan oluşur ve bu nedenle hem anne hem de fetüsün genetiği fonksiyon1'i etkiler. Plasentanın genetik anomalileri veya bozulmuş fonksiyonu fetal gelişimi büyük ölçüde değiştirebilir. Önceki çalışmalar, plasenta genetiği ve gelişiminin fetüste spesifik organ sistemlerinin değişmiş gelişimi ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Özellikle, plasentadaki anormallikler fetal beyin, kalp ve vasküler sistemdeki değişikliklerle bağlantılıdır 2,3,4,5.
Hormonların, büyüme faktörlerinin ve diğer moleküllerin plasentadan fetüse taşınması fetal gelişimde önemli bir rol oynar6. Spesifik moleküllerin plasenta üretimini değiştirmenin nörogelişimi değiştirebileceği gösterilmiştir. Maternal inflamasyon, plasentadaki triptofan (TRP) metabolik gen ekspresyonunu değiştirerek serotonin üretimini artırabilir, bu da daha sonra fetal beyinde serotonin birikimi yaratır7. Diğer çalışmalar, kalp kusurlarının yanı sıra plasenta anormallikleri de bulmuştur. Plasentada anormalliklerin, insanlarda en sık görülen doğum kusuru olan konjenital kalp kusurlarına katkıda bulunduğu düşünülmektedir8. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, hem plasentada hem de kalpte benzer hücresel yollara sahip birkaç gen tanımlamıştır. Bozulursa, bu yollar her iki organda da kusurlara neden olabilir9. Plasentadaki kusurlar konjenital kalp kusurlarını şiddetlendirebilir. Plasenta genetiğinin ve fonksiyonunun spesifik fetal organ sistemi gelişimi üzerindeki rolü yeni ortaya çıkan bir çalışma alanıdır.
Fareler hemokoryal plasentalara ve insan plasentalarının diğer özelliklerine sahiptir, bu da onları insan hastalıklarını incelemek için oldukça yararlı modeller haline getirir1. Plasentanın önemine rağmen, şu anda hedefli in vivo genetik manipülasyonların eksikliği vardır. Ayrıca, şu anda nakavtlar veya nakavtlar için plasenta10'daki aşırı ekspresyon veya fonksiyon kazancı manipülasyonlarından daha fazla seçenek bulunmaktadır. Plasentaya özgü manipülasyon için, her biri farklı zaman noktalarında farklı trofoblast soylarında bulunan birkaç transgenik Cre eksprese eden çizgi vardır. Bunlar arasında Cyp19-Cre, Ada / Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER ve Gcm1-Cre11,12,13,14 bulunur. Bu Cre transgenleri verimli olsa da, belirli zaman noktalarında bazı genleri manipüle edemeyebilirler. Plasental gen ekspresyonunu nakavt etmek veya aşırı eksprese etmek için yaygın olarak kullanılan bir diğer yöntem, lentiviral vektörlerin blastosist kültürüne yerleştirilmesidir ve bu da trofoblasta özgü bir genetik manipülasyona neden olur15,16. Bu teknik, gelişimin erken dönemlerinde plasental gen ekspresyonunda sağlam bir değişiklik sağlar. RNA girişiminin in vivo kullanımı plasentada seyrek olarak kullanılmıştır. ShRNA plazmidlerinin yerleştirilmesi, bu makalede açıklanan CRIPSR tekniğine benzer şekilde gerçekleştirilebilir. Bu, plasentadaki PlGF ekspresyonunu başarılı bir şekilde azaltmak için E13.5'te yapılmıştır ve yavru beyin vaskülatürü17 üzerindeki etkileri vardır.
Öncelikle nakavt veya nakavt için kullanılan tekniklere ek olarak, aşırı ekspresyonu indüklemek yaygın olarak adenovirüslerle veya eksojen bir proteinin yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Aşırı ekspresyon için kullanılan teknikler değişen başarı oranlarına sahiptir ve çoğunlukla gebeliğin ilerleyen dönemlerinde uygulanmıştır. İnsülin benzeri büyüme faktörü 1'in (IGF-1) plasenta fonksiyonundaki rolünü araştırmak için, IGF-1 geninin aşırı ekspresyonunu indüklemek için adenoviral aracılı plasental gen transferi yapıldı18,19. Bu, E18.5'te fare gebeliğinin geç dönemlerinde direkt plasenta enjeksiyonu ile gerçekleştirildi. Ek seçenekler sağlamak ve Cre-Lox kombinasyon başarısızlıkları, adenovirüslerin olası toksisitesi ve shRNA'nın hedef dışı etkileri gibi yerleşik plasental genetik manipülasyonların olası başarısızlıklarını atlatmak için, plasentanın in vivo doğrudan CRISPR manipülasyonu kullanılabilir20,21,22. Bu model, aşırı ifade modellerinin eksikliğini gidermek ve esnekliğe sahip bir model oluşturmak için geliştirilmiştir.
Bu teknik, shRNA ve CRISPR plazmidlerinin PlGF ekspresyonunu değiştirmek için doğrudan in vivo fare plasentalarına hedeflendiği Lecuyer ve ark.'nın çalışmalarına dayanmaktadır17. Bu teknik, birden fazla zaman noktasında CRISPR manipülasyonu kullanarak plasenta gen ekspresyonunu doğrudan değiştirmek için kullanılabilir; Bu çalışma için E12.5 seçildi. Plasenta bu noktaya kadar olgunlaşmıştır ve manipüle edilebilecek kadar büyüktür, bu da E12.5 üzerine spesifik bir CRISPR plazmidinin yerleştirilmesine izin verir, bu da gebeliğin ortasından sonuna kadar fetal gelişim üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir23,24. Transgenik yaklaşımlardan farklı olarak, ancak viral indüksiyonlara veya RNA girişimine benzer şekilde, bu teknik, nispeten gelişmiş bir cerrahi yaklaşım kullanarak belirli zaman noktalarında aşırı ekspresyon veya nakavta izin verir, böylece daha önceki değişikliklerden kaynaklanan olası bozulmuş plasentasyon veya embriyonik ölümcüllükten kaçınır. Sadece birkaç plasenta bir çöp içindeki deneysel veya kontrol plazmidini aldığından, yaklaşım iki tür iç kontrole izin verir. Bu kontroller, uygun kontrol plazmidi ile enjekte edilen ve elektropoize edilen ve doğrudan manipülasyon almayan kontrollerdir. Bu teknik, sinerjik aktivasyon aracısı (SAM) CRISPR plazmidi aracılığıyla fare plasentasındaki IGF-1 geninin aşırı ekspresyonunu oluşturmak için optimize edilmiştir. IGF-1 geni seçildi, çünkü IGF-1, doğumdan önce plasentada öncelikle üretilen fetüse verilen önemli bir büyüme hormonudur25,26. Bu yeni plasenta hedefli CRISPR tekniği, plasenta fonksiyonu ile fetal gelişim arasındaki bağlantıyı tanımlamaya yardımcı olmak için doğrudan manipülasyona izin verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler federal düzenlemelere ve Iowa Üniversitesi politikasına uygun ve uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Hayvanlar ve hayvancılık
- Hayvanları yiyecek ve su ad libitum ile 12 saatlik bir gün ışığı döngüsünde tutun.
- 8-15 haftalık CD-1 dişi fareleri kullanın. E0.5'i tanımlamak için bir çiftleşme fişinin varlığını kullanın.
- E0.5'te, hamile barajları tek başına barındırın.
2. Mikropipetin kalibrasyonu
NOT: Mikropipetin kalibrasyonu mümkünse ameliyattan önce yapılmalıdır.
- Mikropipeti yapmadan ve kalibre etmeden önce, tüm plazmidleri DNaz içermeyen suda önerilen konsantrasyona (0,1 μg/μL) kadar seyreltin. Plazmidi uygun şekilde seyreltilmiş Hızlı Yeşil boya (PBS'de 1 μg / μL) ile karıştırın (nihai plazmid konsantrasyonu: 0.06 μg / μL).
- Dış çapı 1,5 mm ve iç çapı 0,86 mm olan 10 cm'lik cam kılcal damarları kullanarak mikropipetleri mikropipet çektirme makinesi ile çekin.
- Bir mikropipetin ucunu (2-3 mm) steril forseps ile dikkatlice kırın.
- Mikropipeti bir mikroenjektöre bağlı bir mikro kılcal uca yükleyin. Mikroenjektörün mikroenjeksiyon makinesine takılı olduğundan ve mikropipeti kalibre etmek için yeterli azot seviyeleri olduğundan emin olun.
- Mikropipet mikro enjektöre bağlandıktan sonra, kalibrasyonu gerçekleştirmek için Hızlı Yeşil boya çözeltisi ile yükleyin (PBS'de 1 μg / μL). Mikropipeti, yaklaşık 3,5 μL'lik bir hacim enjekte edecek şekilde kalibre edin.
NOT: Her mikropipet biraz farklı olacaktır. Enjeksiyon sırasında plasentaya zarar vermemek için, enjeksiyon süresi 0.5-1.5 s arasında ayarlanmalıdır. Basınç 1-8.5 psi arasında ayarlanmalıdır. Her mikropipeti ayrı ayrı kalibre edin; Mikropipet bu parametreler dahilinde kalibre edilemiyorsa, kullanılmamalıdır.
3. Cerrahi (Şekil 1A)
NOT: Hazırlamak için, hem preparat hem de cerrahi alanların yüzeylerini% 70 etanol ile temizleyin. Hazırlık alanına emici bir alt ped yerleştirin. Ameliyat alanında, bir ısıtma yastığı yerleştirin ve ardından bunun üzerine emici bir alt ped yerleştirin. Ameliyattan önce tüm aletleri sterilize edin. Barajın anestezi altında kaldığı süre 1 saatin altında olmalıdır.
- Anestezi
- Ameliyattan 30 dakika ila 1 saat önce gebe barajına 5 mg / kg NSAID (meloksikam) veya başka bir onaylanmış analjezik uygulayın.
- Hamile barajı bir izofluran buharlaştırıcısına bağlı bir indüksiyon odasına yerleştirin.
- Buharlaştırıcıyı %4 izofluran ve 3,5 L/dak oksijene ayarlayın.
- Anestezi, bir ayak parmağı sıkışmasına yanıt verilmemesi ve solunum hızının azalması ile doğrulandıktan sonra, barajı indüksiyon odasından hazırlık alanına çıkarın.
- Ameliyat hazırlığı
- Hazırlık alanında, barajı sırtüstü bir burun konisi ile yerleştirin.
- Baraj burun konisindeyken buharlaştırıcıyı %2 izofluran ve 3,5 L/dak oksijene düşürün.
- Barajın karnını iyice tıraş edin ve fazla kürkü çıkarın. Tıraş edilmiş karın bölgesini povidon çözeltisi ve% 70 etanol ile steril pamuk uçlu aplikatörler kullanarak üç kez alternatif olarak kaplayın. Povidon çözeltisinin son katını uygulayın. Kornea kurumasını önlemek için, barajın her iki gözünün üzerine yapay gözyaşı jeli yerleştirin (Şekil 2A, B).
- Hazırlık yaptıktan sonra, burun konisi ile barajı belirlenen ameliyat alanına taşıyın.
- Uterin laparotomi
NOT: Cerrahi işlem boyunca steril eldiven kullanın. Steril olmayan herhangi bir yüzeye temas ederse eldivenleri değiştirin.- Ameliyat alanında, baraj sırtını yerleştirin ve burun konisini bantla yerine sabitleyin. Emici pedin altındaki ısıtma yastığını 45 °C'ye ayarlayın.
- Forseps ve makas kullanarak, cilt boyunca yaklaşık 2 cm'lik bir orta hat kesisi yapın. Cildi çadırlamak için forseps kullanın ve cilde dikey bir kesi yapın. Bundan sonra, uterus boynuzlarını ortaya çıkarmak için peritondan benzer büyüklükte bir kesi daha yapın. Forseps kullanarak, dikey insizyonu yaparken peritona çadır uygulayın (Şekil 2C, D).
NOT: Peritonun kesilmesi sırasında düzgün bir şekilde çadır kurulmaması, bağırsakların ölümcül bir insizyonuna yol açabilir. - Karın yanlarına bastırarak uterus boynuzlarına kesiden hafifçe masaj yapın. Bunu, uterusu alet kullanmadan dikkatlice yönlendirerek, kazara yaralanmayı önlemek için sadece parmaklarınızı kullanarak yapın. Açıkta kalan uterusu, barajın karnını kaplayan steril bir cerrahi örtünün üzerine yerleştirin ve gerektiğinde kullanımdan önce 30 ° C'ye ısıtılabilen steril salin damlaları ile ameliyat boyunca nemli tutun (Şekil 2E, F).
NOT: Rahim boynuzları Wang ve ark.27'de tarif edildiği gibi tanımlanabilir. - Rahim açığa çıktıktan sonra, manipülasyon için üç çift plasenta seçin.
NOT: Plasentalar Elmore ve ark.24 tarafından tanımlandığı gibi tanımlanabilir. Embriyoların hayatta kalmasını en üst düzeye çıkarmak için, 6'dan fazla plasenta tedavi edilmemelidir. 12'den az embriyo varsa, 4'ten fazla plasenta enjekte edilmemelidir. İki bitişik plasenta seçin, böylece biri bir kontrol enjeksiyonu ve diğeri deneysel plazmid alır. İki bitişik plasentanın kullanılması, uterustaki benzer yerlerdeki plasentaların daha iyi karşılaştırılmasını sağlar ve ayrıca hayatta kalma oranının artmasını sağlar. Seçilen plasental çiftler rastgele seçilir ve her iki uterus boynuzu boyunca aralıklı olarak yerleştirilir (Şekil 1B). - Plasenta manipülasyonlarının yerini ve embriyoların uterus boynuzları içindeki organizasyonunu kaydedin, böylece embriyolar ve plasentalar toplama sırasında tanımlanabilir, çünkü bir baraj hem kontrol hem de deneysel olarak tedavi edilen plasenta / embriyoları taşıyacaktır.
- Plasental enjeksiyon ve kontrol plazmidinin elektroporasyonu
NOT: Aseptik bir tekniği sürdürmek için, kullanmadan önce elektroporasyon küreklerini ve mikro enjektörünü soğuk bir sterilant ile sterilize edin. Steril olmayan herhangi bir yüzeye temas ederse eldivenleri değiştirin.- Kalibre edilmiş mikropipeti kullanarak, üç enjeksiyon için yeterli miktarda uygun kontrol plazmidini yükleyin. Tüm enjeksiyonları, desidua (beyaz) ve kavşak bölgesi (koyu kırmızı) arasındaki plasentaya lateral olarak ~ 0.5 mm derinlikte gerçekleştirin (Şekil 3A-F).
- Üç kontrol plasentanına enjeksiyon yapın.
NOT: Plazmidlerin mikropipet ile çapraz kontaminasyonunu önlemek için deneysel enjeksiyonlardan önce tüm kontrol plazmid enjeksiyonlarını gerçekleştirin. Bu, aynı mikropipetin kullanılmasına izin verecektir, çünkü mikropipetlerin ve kalibrasyon süresinin değiştirilmesi ameliyat süresini önemli ölçüde artırır ve barajın sağkalımını azaltır. - Kontrol plazmid enjekte edilen plasentaların elektroporasyonunu enjeksiyondan sonraki 2 dakika içinde gerçekleştirin.
- Elektroporasyon için, bir elektroporasyon makinesine bağlı bir çift 3 mm'lik kürek kullanın. CRISPR birleştirme verimliliğini ve embriyoların yaşayabilirliğini sağlamak için aşağıdaki elektroporasyon ayarlarını kullanın: 2 darbe, 30 V, 30 ms darbe, 970 ms darbe kapalı, tek kutuplu.
- Enjeksiyondan sonra, ancak elektroporasyondan hemen önce, salini uterus duvarındaki üç bölgeye ve küreklere bir damlalık veya şırınga ile tam olarak uygulayarak, steril salin ile temas yerlerini kaplayın.
- Plasentanın lateral taraflarındaki elektroporasyon küreklerini yavaşça bastırın. Anot küreğini enjeksiyon bölgesine ve katotu tam karşısına yerleştirin (Şekil 4A-C).
- Elektroporasyon makinesindeki darbeye basın ve elektroporasyon küreklerini çıkarmadan önce iki darbenin tamamlanmasını bekleyin.
NOT: Nabızlar sırasında kürekler ve plasenta arasında genellikle az miktarda beyaz köpük görülür. Bu gerçekleşmezse, daha fazla kullanmadan önce pedallardan gelen voltajı bir voltmetre ile kontrol edin. Voltmetre üzerindeki okuma elektroporasyon voltajı ayarına uymuyorsa, kürekler işlevsizdir.
- Plasental enjeksiyon ve deneysel plazmidin elektroporasyonu
- Adım 3.4.1'deki aynı talimatları izleyin. Adım 3.4.2'ye gidin. Kontrol plazmidi yerine deneysel plazmid kullanımı.
- Enjeksiyondan sonraki 2 dakika içinde üç deneysel enjekte plasentanın hepsinin elektroporasyonunu gerçekleştirin. Bu, kontrol plazmidleri ile enjekte edilenlerle aynı şekilde yapılmalıdır. 3.4.4 adımını izleyin. adım 3.4.7'ye gidin.
- Ameliyatın tamamlanması
- Plasental manipülasyon tamamlandıktan sonra, uterus boynuzlarına sadece parmaklarınızı kullanarak karın boşluğunun içine nazikçe masaj yapın (Şekil 5A).
- İlk olarak, 13 mm 3/8c iğne alaşımı ile 45 cm uzunluğunda kaplamalı ve örgülü çözünebilir dikişler kullanarak periton tabakası üzerinde çift düğümlü tek dikişler uygulayın. Dikişleri birbirinden 2-3 mm aralıklarla yerleştirin (Şekil 5B).
- Periton tabakasını diktikten sonra, cildi çözülebilir dikişlerle dikin. Barajın dikişi geri alamamasını sağlamak için tek dikişleri 2-3 mm arayla üçlü düğümleyin (Şekil 5C).
- Dikiş tamamlandıktan sonra, izofluran'ı% 1'e ve oksijeni 3.5 L / dak'ya ayarlayın ve ciltteki dikişlere doku yapıştırıcısı uygulayın (Şekil 5D).
NOT: Doku yapıştırıcısı isteğe bağlıdır, ancak baraj çiğneme nedeniyle insizyonun tekrar açılmasını önlemek için önerilir. - Doku yapıştırıcısı kuruduğunda, buharlaştırıcıyı kapatın ve barajı ameliyat alanından çıkarın. Barajı sırtındaki destekleyici bir kafese yerleştirin.
4. Ameliyat sonrası bakım ve izleme
- Ameliyatın acil komplikasyonlarını önlemek için hamile barajının gözetim altında temiz bir kafeste en az 30 dakika iyileşmesine izin verin. Tamamen ambulatuvar olana ve yardım almadan ayaklarının üzerine dönene kadar gözlemleyin. Ameliyat sonrası barajı tek başına barındırın.
- Embriyo toplanmasına kadar kurumsal postoperatif bakım ve takibi takip edin. Baraj ağırlığını kaydedin ve dikişleri ve kesi yerini günlük olarak izleyin.
5. E14.5 plasenta toplanması
- E14.5'te, barajı bir ketamin / ksilazin kokteyli (1 mg / mL ketamin ve 0.1 mg / mL ksilazin) ile derinlemesine uyuşturun ve ardından barajı servikal olarak yerinden çıkarın.
- Barajın karnına makasla V şeklinde bir kesi yapın ve uterusu çıkarın. Hemen buz üzerinde 5 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Forseps kullanarak, embriyoyu ve ilgili plasentayı uterustan dikkatlice çıkarın.
NOT: Ameliyat sırasında hangisinin doğrudan manipülasyon aldığını belirlemek için embriyonun yerinin ve uterus boynuzlarındaki ilgili plasentanın kaydını tutun. - Plasenta ağırlıklarını kaydedin. RNAse içermeyen forseps ve tıraş bıçağı kullanarak, plasentayı orta çizginin yarısına kadar kesin. Bir yarısını 4 ° C'de% 4 PFA'ya koyun. Kalan yarısını tekrar ikiye bölün ve kalan iki çeyreği -80 ° C'de, biri RNA depolama reaktifi olan iki tüpte saklayın.
NOT: Embriyolar ve diğer maternal dokular, gelecekte kullanılmak üzere koleksiyondan -80 ° C'de saklanabilir.
6. Plasental gen ekspresyon analizi
- RNA depolama reaktifinde -80 ° C'de depolanan plasentanın çeyreğini kullanın.
- RNA izolasyonu için Trizol yöntemini, RNA konsantrasyonu için bir spektrofotometreyi, bir cDNA sentez kitini ve SYBR Green Master Mix28 ile qPCR'yi kullanarak Elser ve ark.'da açıklandığı gibi qPCR için plasentaları işleyin. Elser ve ark.'da atıfta bulunulan Turbo DNAfree kiti DNAse yerine, numunelerin kirletici madde içermediğinden emin olmak için Trizol RNA izolasyonundan sonra bir RNAcleanup kiti kullanın28.
NOT: Trizol için malzeme güvenlik bilgi formunu (MSDS) okuyun ve kimyasal bir duman davlumbazında kullanın. - Kontrol plazmidinin GFP primerleri ile ve deneysel plazmidin BLAST primerleri ile plazmid yerleştirilmesini değerlendirin ( Ek Tablo 1'de listelenen primerler). Plazmidin varlığını belirlemek için BT değerini kullanın.
NOT: 35'in üzerindeki BT değerleri yanlış pozitiftir ve sadece 35'in altındakiler plazmidin başarıyla yerleştirildiğinin pozitif bir göstergesi olarak düşünülmelidir. - Temizlik geni 18'lere normalleştirilmiş IGF-1 plasental ekspresyonunu değerlendirin (Ek Tablo 1'de listelenen primerler). Katlama değişimini hesaplamak için ddCT yöntemini kullanın ve ardından deneysel numunelerin normalleştirilmiş kıvrım değişimini kontrol numunelerinin ortalama kıvrım değişimine hesaplayın.
7. Plasental protein seviyesi analizi
- Plasentanın -80 ° C'de depolanan çeyreğini kullanın. Dokuyu, son pH'ı 7.4 olan diH 2 O'da 11.5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl2 ve 10 mM proteaz inhibitöründen yapılmış bir tampon çözeltisinde homojenizeedin. Dokuyu parçalamak için elde taşınan bir homojenizatör ve havane kullanın.
NOT: Numune, tampon hacminin %10'unu geçmemelidir. - Homojenize numuneleri tamponda 1:12'de seyreltin, böylece bir bisinkoninik asit testi (BCA) kitinin tespit edilebilir aralığında olurlar. BCA testini üreticinin talimatlarına göre yapın ve bir plaka okuyucu kullanarak toplam proteini ölçün.
- BCA testini yaptıktan sonra, tüm numuneleri, Gümüşoğlu ve ark.29'da yapıldığı gibi, IGF-1 ELISA için aynı toplam protein konsantrasyonu olan 2 mg / mL'ye normalleştirin.
- IGF-1 ELISA'yı üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin ve standart bir konsantrasyon eğrisi kullanarak IGF-1 protein seviyelerini bir plaka okuyucu ile ölçün.
8. Floresan in situ hibridizasyon etiketlemesi kullanarak mekansal CRIPSR doğrulaması
- Plasenta yarımları 1-3 gün boyunca 4 ° C'de% 4 PFA'da uygun şekilde sabitlendikten sonra, optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğinde dondurmadan önce 4 ° C'de% 20 sakaroza taşıyın.
- OCT'ye gömülü plasenta yarımlarını -20 ° C'lik bir kriyostatta seri olarak 10 μm bölümlere ayırın ve etiketlenecek slaytlara yerleştirin. Plasenta yarımlarını, üç alt bölgenin tümü görünecek şekilde bölümlere ayırın. Slaytları yerinde hibridizasyon için kullanılana kadar -80 ° C'de saklayın.
- Üreticinin protokollerini izleyerek floresan in situ hibridizasyon (FISH) etiketlemesi gerçekleştirin. Bir slaydı bir dCas9-3xNLS-VP64 probu ve aynı plasentanın ikinci bir "kardeş" slaydını bir Prl8a8 probu ile melezleştirin.
NOT: dCas9-3xNLS-VP64 probu, aşırı ekspresyon plazmidinin varlığını algılar. Prl8a8 probu, plasentanın alt bölgelerinin tanımlanabilir olmasını sağlayan kavşak bölgesinin spongiotrofoblastlarını vurgular. Bu iki prob, çok kanallı floresanın plasentalardaki yeşil otofloresan ile karışmasını önlemek için ayrı "kardeş" slaytlarda etiketlenmiştir. - Her iki probu da algılama boyası (Opal 620) ile etiketleyin. Üreticinin FISH protokolünü tamamladıktan sonra, DAPI montaj ortamını uygulayın ve slayta bir kapak fişi yerleştirin. Kapak kapağını şeffaf oje ile kapatın.
- Slaytları dik bileşik floresan mikroskobunda görüntüleyin ve uygun bir görüntü işleme yazılımı kullanarak işleyin. Burada CellSens yazılımı kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genel prosedür sonuçları (Şekil 6)
Çalışmada, manipüle edilmiş üç grup vardı. Bunlar arasında genel bir CRISPR Cas9 kontrol plazmidi (Cas9 Kontrolü), bir aktivasyon kontrolü CRISPR plazmidi (Act Control) veya bir IGF-1 SAM aktivasyon plazmidi (Igf1-OE) ile enjekte edilen plasentalar vardı. Cas9 Kontrolü nakavt plazmidler için daha uygundur ve aktivasyon kontrolü aşırı ekspresyon/aktivasyon plazmidleri için daha uygundur. Plasentaların enjeksiyon ve elektroporasyon yoluyla manipüle edilmesinin neden olduğu canlılık değişikliklerini değerlendirmek için, çöp içindeki embriyo sağkalımı E14.5 üzerinde analiz edildi (Şekil 6A). Bu zaman noktası, elektroporasyon kullanılarak CRISPR plazmidlerinin in vivo yerleştirilmesini gerçekleştiren diğer çalışmalar, ekspresyon değişikliklerinin 8-22 saat içinde elde edilebileceğini gösterdiği içinseçildi 30,31,32. E14.5'teki toplama, CRISPR plazmidinin yaklaşık 48 saat gen ekspresyonunda bir artışı entegre etmesine ve aktive etmesine izin verir. Barajın cerrahi manipülasyonunun tüm embriyoların hayatta kalmasını etkilediği, ancak enjeksiyon ve elektroporasyon uygulanan manipüle edilmiş plasentalarla ilişkili embriyoların sağkalımı önemli ölçüde azalttığı bulunmuştur. Tedavi edilmeyen embriyoların hayatta kalma oranı (aynı çöpte ancak hedeflenen manipülasyona maruz kalmadan) %100 sağkalımdan ortalama %79.05'e düşürüldü. Manipüle edilen embriyoların sağkalımında anlamlı bir azalma vardı ve ortalama sağkalım oranı% 55.56'ydı. Manipüle edilen üç grup arasında anlamlı bir fark bulunamadı.
Manipüle edilen plasentalarda önemli brüt değişikliklerin meydana gelip gelmediğini belirlemek için, plasenta ağırlığı kaydedildi. Herhangi bir grubun plasenta ağırlığında anlamlı bir fark yoktu (Şekil 6B) ve plasenta ile embriyonun brüt görünümü değişmedi. Temsili nekroskopi sonrası görüntüler E14.5 üzerinde toplanan diseksiyon mikroskobunda alındı. Farklı tedavi gruplarından plasentaların / embriyoların görüntüleri, hepsi aynı çöp içinde çekildi. Amniyotik kesede veya maruz kalan embriyoda ve buna karşılık gelen plasentada herhangi bir tedavi grubunda fenotipik görünümde gözle görülür bir hasar veya değişiklik yoktu (Şekil 6D-I). Bir IGF-1 aktivasyon plazmidi kullanılarak manipüle edilen grupların morfolojisinde büyük bir farklılık görülmemesine rağmen, bu, plasenta veya embriyonun esansiyel büyümesini ve fonksiyon düzenleyicilerini daha önemli ölçüde etkileyebilecek diğer genleri hedef alan diğer deneysel plazmidler için geçerli olmayabilir. Cas9 Control ve Act Control plasentaları arasında herhangi bir ölçümde fark bulunmadı. Bu nedenle, bu iki grup birleştirildi ve tüm analizler için Con veya Controls olarak adlandırıldı. Bu sonuçlar, bu tekniği kullanarak E12.5 üzerinde uterodaki plasentaların manipülasyonunun embriyo sağkalımında bir azalmaya neden olduğunu, ancak hala önemli bir canlılık olduğunu göstermektedir. Sonuçlar ayrıca, plasenta büyümesinin genel olarak önemli ölçüde etkilenmediğini, çünkü manipüle edilen ve tedavi edilmeyen plasentalar arasında ağırlıkta önemli bir değişiklik olmadığını göstermektedir. Bu, önerilen tekniğin sağlıklı ve uygulanabilir CRISPR ile manipüle edilmiş plasentaların ve bunlara karşılık gelen embriyoların hayatta kalmasına izin verebileceğini göstermektedir.
Embriyo toplanmasından önce ameliyat sonrası her gün E14.5'te baraj ağırlığı değişimi kaydedildi (Şekil 6C). Ameliyat E12.5'te gerçekleşti, bu nedenle tüm baraj ağırlığı değişiklikleri E12.5'teki ağırlığa göre listelenmiştir. Deneysel (Exp) barajlara plasental manipülasyon uygulanırken, sahte barajlara anestezi ve plasenta manipülasyonu olmadan benzer sürede bir laparotomi uygulandı. Birçok gebe barajı, işlemden sonraki gün hafif bir azalma gösterdi veya ağırlıkta bir değişiklik göstermedi (E13.5); Bu muhtemelen ameliyat sırasında ve kısa bir süre sonra yemek yemenin bozulmasından kaynaklanıyordu. Çoğu baraj E14.5'te ağırlık artışı gösterdi, ancak zaman zaman ağırlıkta bir azalma gözlendi. Ameliyat sonrası maternal baraj ağırlığının izlenmesi, embriyo sağkalımının izlenmesine izin verdi. Gebe barajlarının ameliyat sonrası ağırlıkları arasındaki farklılık yaygındı ve tedavi edilen tüm embriyoların kaybolduğunu göstermedi. Ameliyat sonrası kilo değişikliklerinde sahte ve deneysel barajlarda anlamlı bir fark yoktu. Bu, barajın refahının genellikle CRISPR plazmidlerinin plasentaya yerleştirilmesinden sonra korunduğunu göstermektedir. Genel olarak, bu, bu cerrahi tekniğin embriyoların yaşayabilirliğinde bir azalmaya neden olabilmesine rağmen, yine de çalışma için kullanılabilecek sağlıklı soyunun önemli bir yüzdesini verdiğini göstermektedir.
E14.5 plasentalarda ekspresyon ve CRISPR katılımının analizi (Şekil 7)
IGF-1 aktivasyon plazmidinin hücresel yerleştirilmesinin IGF-1'in aşırı eksprese edilmesinde başarılı olup olmadığını belirlemek için qPCR yapıldı. Beklendiği gibi, qPCR, kıvrım değişimi 18s ekspresyonuna normalleştirildiğinde kontrol plasentalarına kıyasla IGF1-OE plasentalarında IGF-1 ekspresyonunda anlamlı bir artış gösterdi (Welch'in t-testi, p = 0.0302) (Şekil 7A). IGF-1 protein seviyelerinin değişip değişmediğini belirlemek için, tüm gruplardan plasentalar üzerinde bir ELISA yapıldı. qPCR ile tutarlı olarak, E14.5 plasentaların ELISA değerlendirmesi, IGF1-OE plasentalarındaki IGF-1 protein düzeylerinde kontrol plasentalarına kıyasla anlamlı bir artış göstermiştir (Welch'in t-testi, p = 0.0469) (Şekil 7B). qPCR ve ELISA, aşırı ekspresyon plazmidinin sırasıyla IGF-1 gen ekspresyonunu ve IGF-1 protein üretimini başarıyla arttırdığını göstermiştir.
Plazmidin verilmesinin manipüle edilen plasentalara özgü olmasını sağlamak için, spesifik IGF-1 aktivasyon plazmidi ve CRISPR Cas9 Kontrol plazmidi için qPCR yapıldı. Bu qPCR'ler hem manipüle edilmiş plasentalar hem de enjekte edilenlere bitişik olan tedavi edilmemiş plasentalar üzerinde gerçekleştirildi. Aktivasyon plazmid ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılan qPCR primerleri, aktivasyon sisteminin bir parçası olan BLAST plazmidinin bir dizisini hedeflemiştir (Şekil 7C). Tedavi edilmeyen plasentalar BLAST plazmidinin varlığını göstermedi (döngü eşiği [BT] belirlenmemiş, grafikte 40 olarak etiketlenmiş) ve Igf1-OE plasentaları 30 civarında bir BT gösterdi. Kontrol plazmid ekspresyonunu değerlendirmek için yapılan qPCR, yerleştirilen GFP geninden bir diziyi hedefledi (Şekil 7D). Tedavi edilmeyen plasentalar, muhtemelen primer dimerizasyonun neden olduğu 35'in üzerinde BT değerleri gösterdi, çünkü bu değerler beklenen bir ifade aralığının dışındaydı. Kontrollerde BT değeri yaklaşık 30 olarak görüldü. Bu qPCR'ler, IGF-1'in beklenen aşırı ekspresyonunu veya eksikliğini ve plazmidlerin sadece beklenen manipüle edilmiş plasentalarda bulunduğunu göstermek için bir kalite kontrolü görevi görür.
IGF-1 aktivasyon plazmidinin mekansal doğrulaması plasental kesitler kullanılarak yapıldı. OCT bileşiğinde sabitlenmiş ve dondurulmuş plasentalar, tüm katmanların görülebilmesi için slaytlar üzerine 10 μm'de seri olarak bölümlere ayrıldı. Slaytlar daha sonra FISH etiketlemesi için kullanılana kadar -80 ° C'de donduruldu. Plasenta içinde IGF-1 CRISPR aktivasyon plazmidinin nerede dahil edildiğini doğrulamak için, kırmızı floresan etiketli bir dCas9-3xNLS-VP64 probu kullanıldı. Bu prob, aktivasyon sisteminin işlevsel bir bileşenini hedefler. Plasental maternal-fetal arayüzün alt bölgelerini göstermek için yeşil otofloresan kullanıldı (Şekil 7E, F). Tedavi edilmeyen plasentalarda CRISPR manipülasyonu ile tedavi edilmedikleri için dCas9-3xNLS-VP64 tespit edilmedi (Şekil 7E). Beklendiği gibi, IGF1-OE plasentaları kırmızı renkte görüldüğü gibi dCas9-3xNLS-VP64 için etiketleme gösterdi (Şekil 7F). CRISPR katılımı, plasentanın her üç alt bölgesinde, kavşak bölgesinin en net etiketlenmesiyle bulundu (Şekil 7E). dCas9-3xNLS-VP64 etiketlemesinin floresan yoğunluğu, plazmidle muamele edilmiş plasentalar boyunca değişmiştir, bu da bazılarının plazmidi diğerlerinden daha yüksek oranda ifade ettiğini ve etiketlemenin kesin konumunda / kapsamı içinde farklılıklar olduğunu göstermektedir, ancak etiketleme genellikle tüm alt bölgelerde mevcuttu. dCas9-3xNLS-VP64 etiketlemesinin yerini doğrulamak için, orta bileşke alt bölgesini etiketlemek üzere sponjiyotrofoblastları hedefleyen Prl8a8 FISH etiketlemesi yapılmıştır (Şekil 7G, H). Bu, aynı plasentadan bitişik bölümlerde, dCas9-3xNLS-VP64 için etiketlenmiş bölümlerin "kardeş" slaytında gerçekleştirildi. Beklendiği gibi, Prl8a8 etiketlemesi ile gösterilen yapı, IGF1-OE ve tedavi edilmemiş plasenta arasında benzerdi. Desidua ve labirent bölgesi, kırmızı birleşim bölgesini çevreleyen mavi çekirdekler (DAPI) etiketlemesi ile tanımlanabilir (Şekil 7G, H). dCas9-3xNLS-VP64'ün FISH etiketlemesi, plazmidin her üç alt bölgeye de yerleştirildiğini açıklığa kavuşturdu ve bu Prl8a8 etiketlemesi ile doğrulandı. FISH etiketlemesinin sonuçları, IGF-1 aktivasyon plazmidinin dahil edilmesinin başarılı olduğunu ve plazmidin tedavi edilmemiş plasentalara göç etmediğini doğruladı.
Şekil 1: Protokolün şeması. (A) Cerrahi prosedürün basitleştirilmiş şeması. Tekniğin ana adımlarının kronolojik sırası. (B) Rahim boynuzları içinde manipüle edilmiş plasenta aralığının bir örneğini gösteren şematik. Her iki panel de BioRender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Uterin laparotomi prosedürü. (A-B) Ameliyat hazırlığı sırasında, (A) Bir barajın traş edilmiş karnı ve (B) iyot çözeltisi ile kaplanmış traş edilmiş alan. (C-F) Ameliyat alanında, (C) karın derisinde ~2 cm'lik bir kesi ve (D) peritonda ~2 cm'lik bir kesi; bağırsaklar görülebilir. (E) Rahim boynuzlarının kesi bölgesinden manipüle edilmesi. Rahim boynuzları görülebilir. (F) Steril bir cerrahi örtü üzerine yerleştirilen tamamen açıkta kalan uterus boynuzları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: CRISPR plazmidlerinin E12.5 plasentalarına enjeksiyonu. (A,B) Embriyoların ve plasentanın uterus boynuzları içindeki oryantasyonu. (A) Decidua, fetal bölgeler ve bir embriyoyu gösteren etiketli bir uterus boynuzunun eğik görünümü. Kesikli çizgi, enjeksiyon bölgesinin nerede olması gerektiğini temsil eder. (B) Panel A'dan etiketsiz bir uterus boynuzu. (C,D) Plasentada enjeksiyon bölgesine yerleştirilen mikropipetin yandan görünümü. D desidua, FZ fetal bölgeler, E embriyo ve kesikli çizgi enjeksiyon bölgesi yerini temsil eder. (D) C panelinden mikropipet yerleştirmenin etiketsiz görüntüsü. (E,F) Enjeksiyon sonrası plasentada boyanın yandan görünümü. (E) Görünür bir boya ve enjekte edilmemiş bir plasenta içeren bir CRIPSR plazmidi ile enjekte edilmiş bir plasentayı gösteren bir uterus boynuzunun etiketli görüntüsü. (F) Panel E'deki uterus boynuzunun etiketsiz görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: CRISPR plazmidlerinin enjeksiyonu sonrası E12.5 plasentaların elektroporasyonu. (A) Rahim boynuzunda plasentaların üstten görünümü. Anot ve katot elektroporasyon kürekleri etiketlenir ve beyaz ok enjeksiyon bölgesinin yerini gösterir. (B) Plasentanın elektroporasyonunun eğik görünümü. (C) Plasentanın elektroporasyonunun yandan görünümü. (D-F) A, B ve C panellerinin basitleştirilmiş taslağı. Anot ve katot kürekleri etiketlenir, P plasenta, E embriyo ve etiketlenmemiş alan uterustur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Karın derisinin ve peritonun dikilmesi . (A) Rahim boynuzları ameliyatın tamamlanmasından sonra karın bölgesine geri döndü. Karın derisi ve periton insizyonları görülebilir. (B) Periton insizyonu tamamen dikilir. (C) Karın derisi kesisi tamamen dikilmiş. (D) Karın derisi dikişlerine doku yapıştırıcısı uygulanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Genel prosedür sonuçları. (A) İşlemden 2 gün sonra E14.5'te toplanan ameliyat sonrası embriyo sağkalım oranları. Manipüle edilen gruplarda tedavi edilmeyen embriyolara göre sağkalımda anlamlı bir azalma gözlendi (Mann-Whitney U testi: Tedavi edilmemiş vs. Cas9 Kontrolü, p = 0.0077; Tedavi Edilmemiş ve Eylem Kontrolü, p = 0.0330; ve İşlenmemiş vs IGF1-OE, p = 0.0032). Manipüle edilen grupların sağkalımında anlamlı bir farklılık gözlenmedi (tek yönlü ANOVA, p = 0.9454). Her nokta, tek bir çöpün hayatta kalma yüzdesini temsil eder (İşlenmemiş n = 22, Cas9 Kontrol n = 9, Hareket Kontrolü n = 13 ve IGF1-OE n = 22 litre). (B) Hayatta kalan embriyoların E14.5 üzerindeki plasenta ağırlığı (tek yönlü ANOVA, p = 0.1436) (Tedavi edilmemiş n = 138, Cas9 Kontrol n = 15, Act Kontrol n = 20 ve IGF1-OE n = 36 plasenta). (C) Sahte laparotomi prosedürü uygulanan veya deneysel (Exp) plasental manipülasyon uygulanan barajlarda görülen E13.5 ve E14.5'te ameliyat sonrası baraj ağırlığı değişiklikleri. İki grup barajın ameliyat sonrası ağırlık değişiklikleri arasında anlamlı fark görülmemiştir (Eşlenmemiş t-testleri: E13.5 p=0.5452 ve E14.5 p=0.2493) (Şam barajları n=3 ve Exp barajları n=10). Tüm hata çubukları SEM'i temsil eder. (D-F) Amniyotik kesede nekroskopi sonrası E14.5 embriyolarının plasenta hala bağlı olduğu görüntüleri. (F) En sağ köşedeki ölçek çubuğu 3,75 mm. (G-I) Embriyonun eğik görüntüsünü ve karşılık gelen plasentanın üstten görünümünü temsil eder. (I) En sağ köşedeki ölçek çubuğu 3,75 mm'yi temsil eder. (D-I) Tüm tedavi grubu etiketleri resimlerin altında listelenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: E14.5 plasentalarında ekspresyon ve CRISPR katılımının analizi. (A) E14.5 kontrolünde ve IGF1-OE plasentalarında IGF-1 ekspresyonunun qPCR analizi. IGF1-OE plasentalarında (Welch'in t-testi, p = 0.0302) 18s ekspresyonuna normalleştirilmiş IGF-1 ekspresyonunda anlamlı bir artış gözlendi (Kontrol n = 15 ve IGF1-OE n = 20 plasenta). (B) E14.5 kontrolünde ve IGF1-OE plasentalarında IGF-1 protein seviyelerinin ELISA'sı. IGF1-OE plasentalarında IGF-1 düzeylerinde kontrol düzeylerine kıyasla anlamlı bir artış gözlenmiştir (Welch'in t-testi, p = 0.0469) (Kontrol n = 13 ve IGF1-OE n = 15 plasenta.) (C) IGF-1 SAM plazmidinden BLAST sekansının qPCR analizi. BLAST ekspresyonu sadece IGF1-OE plasentalarında bulundu ve tedavi edilmemiş plasentalarda (Tedavi edilmemiş n = 4 ve IGF1-OE n = 9 plasenta) hiçbir / belirlenmemiş ekspresyon bulundu. (D) CRISPR Cas9 kontrol plazmidinden GFP dizisinin qPCR analizi. Kontrol plasentalarında plazmid ekspresyonu bulundu ve tedavi edilmeyen örneklerde 35/yanlış pozitif sonucun üzerinde BT değerleri bulundu (Tedavi edilmemiş n = 4 ve Kontrol = 5 plasenta). Kesikli çizgi, 35 CT'de yanlış pozitif eşiği temsil eder. Her veri noktası bir plasentadandır. Tüm hata çubukları SEM. (E-H) 10 μm kalınlığında E14.5 plasenta kesitlerinin floresan in situ hibridizasyonunu temsil eder. (E) İşlem yapılmamış ve (F) kırmızı etiketli bir dCas9-3xNLS-VP64 probu ile IGF1-OE plasenta bölümleri. Kırmızı sinyal sadece IGF1-OE plasentasında bulunur. Yeşil sinyal, plasenta alt bölgelerinin tanımlanmasına yardımcı olmak için kullanılan otofloresandır. (G) Tedavi edilmemiş ve (H) orta bileşke bölgesinin sponjiyotrofoblastlarını tanımlamak için kırmızı ile etiketlenmiş bir Prl8a8 probu ile IGF1-OE plasenta bölümleri. Mavi renkli DAPI, bu kavşak bölgesini çevreleyen desidua ve labirent bölgelerini gösterir. (H) En sağ köşedeki ölçek çubuğu 2 mm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan astarlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plasenta fetal büyümenin birincil düzenleyicisidir ve daha önce de belirtildiği gibi, plasental gen ekspresyonundaki veya fonksiyonundaki değişiklikler fetal gelişimi önemli ölçüde etkileyebilir6. Burada özetlenen protokol, nispeten gelişmiş bir cerrahi yaklaşım kullanarak fare plasentasının hedefli bir in vivo CRISPR manipülasyonunu gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu teknik, daha ileri çalışmalar için kullanılabilecek canlı embriyoların ve bunlara karşılık gelen plasentaların önemli bir verimine izin verir (Şekil 6A, B). Bu teknik, plasental IGF-1'i E14.5'te başarılı bir şekilde aşırı eksprese etmemizi sağladı (Şekil 7A, B). Kullanılan plazmidler, yerleştirilen plazmidler manipüle edilmiş plasentalarda kaldığı ve bitişik tedavi edilmemiş plasentalarda bulunmadığı için özgüllük göstermiştir (Şekil 7C, D). IGF-1 aktivasyon plazmidinin uzamsal dağılımı, dCas9-3xNLS-VP64 ve Prl8a8 için FISH tarafından doğrulandı, bu da aktivasyon plazmidinin IGF1-OE plasentalarının üç alt bölgesinde mevcut olduğunu ve tedavi edilmemiş plasentaların herhangi bir alt bölgesinde bulunmadığını gösterdi (Şekil 7E-H). Bu teknik, plasental gen ekspresyonunu önceki tekniklerle mümkün olmayabilecek şekillerde değiştirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin kullanımı, plasental gen ekspresyonunun ve fonksiyonunun çoklu bağlamlarda fetal gelişim üzerindeki etkisinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.
Bu prosedürün maternal ve fetal sonuçlar için başarısını optimize etmek için, enjeksiyon ve elektroporasyon ayarlarının yanı sıra kullanılan malzemeler de dahil olmak üzere çoklu parametrelerin değiştirilmesinin etkileri araştırılmıştır. Baraj sağkalımını ve iyileşmesini arttırmak için, anestezi altındaki sürenin 1 saati geçmemesi gerektiği, çünkü daha uzun ameliyat sürelerinin sağkalımı önemli ölçüde azalttığı bulunmuştur. Anestezi altındaki süre yaklaşık 2 saate ulaşırsa, hayatta kalma olasılığı, muhtemelen izofluran altındaki uzun sürenin olumsuz etkileri nedeniyle% 20'nin altındaki seviyelere dramatik bir şekilde azalır. Anestezi altında geçirilen süre dışında, anne ölümüne yol açan cerrahinin en sık görülen komplikasyonu, deri ve periton insizyonları yapılırken periton düzgün bir şekilde çadır kurulamamasıydı. Periton düzgün bir şekilde çadır kurmazsa, bağırsaklar yaralanabilir ve bu da ameliyattan sonraki günlerde ölüme neden olabilir. Uterusun maruz kaldığı süre barajın ve embriyoların hayatta kalmasını da etkiler. Başarılı deneylerde uterusun maruz kaldığı ortalama süre yaklaşık 15 dakikaydı; 30 dakikadan fazla maruz kalmak, rezorpsiyonların artmasına ve olası maternal hastalıklara neden olabilir. Maruz kalan rahim ve diğer maruz kalan organlar (genellikle bağırsaklar) nemli tutulmalıdır, ancak çok fazla salin hayvanı soğutabilir; Maruz kalan organları periyodik olarak nemlendirirken, 1 mL'den az steril salin kullanılmalıdır.
Enjeksiyon ve elektroporasyon parametreleri embriyonun hayatta kalmasını büyük ölçüde etkiledi. Enjeksiyon hacmi yaklaşık 4.5 μL'yi geçmemelidir, çünkü bu rezorpsiyonlara neden olur. Enjeksiyon süresi ve basıncı hayatta kalmayı en üst düzeye çıkarmak için önemlidir; Enjeksiyon süresi 0,5 s ile 1,5 s arasında ayarlanmalıdır, ancak 0,8 s en uygun şekilde ortaya çıkmıştır. Basınç 1-8.5 psi arasında ayarlanmalıdır. Düşük enjeksiyon süreleri ve yüksek enjeksiyon PSI seviyeleri ile düşük embriyo sağkalım oranları görüldü. Ayrıca, mikropipet çok künt ise, embriyonik canlılıkta bir azalma olabileceği ve çözeltinin de sıklıkla mikropipetten sızacağı gözlenmiştir. Enjeksiyonları görselleştirmek için kullanılan boya türü hayatta kalmayı etkileyebilir. Metilen mavisi bu amaçla kullanıldığında anne ölümüne yol açtı, ancak filtrelenmiş bir Hızlı Yeşil boya çözeltisi anne sağlığı üzerinde olumsuz bir etki göstermedi. Elektroporasyon ayarları, in vivo33'teki önceki elektroporasyon çalışmalarına dayanarak önerilen üretici ayarlarından optimize edilmiştir. Elektroporasyonun en fazla hasara neden olan ve embriyo sağkalımını azaltan manipülasyon olduğu bulundu. Önerilen in vivo embriyo elektroporasyon ayarları, CRISPR verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için dört darbe önerir, ancak daha yüksek bir hayatta kalma oranı için iki darbe önerilir33. Dört nabzın neredeyse tüm embriyoların rezorbe olmasına neden olduğu bulundu. İki darbe, CRISPR verimliliğini korurken canlılığın artmasına izin verdi. Elektroporasyon küreğinin büyüklüğü embriyonun sağkalımını da önemli ölçüde etkiledi. 5 mm'lik elektroporasyon küreklerinin, önerilen ayarlarla kullanıldığında neredeyse tamamen emilime yol açtığı bulunmuştur. Gerçekten de, üreticinin kılavuzunda 3 mm elektroporasyon kürekleri tavsiye edilir ve embriyo canlılığını önemli ölçüde arttırır33. Birçok elektroporasyon küreğinin belirli nabız ömürlerine sahip olduğuna dikkat etmek de önemlidir. Bu maksimuma alıştıktan sonra, kalitede bir düşüş görülebilir. Bu, nabız sırasında kürekler ve plasenta arasında küçük beyaz bir köpük oluşumu yoksa tanımlanabilir. Elektroporasyon kürek voltajı, beklenen voltajı üretip üretmediğini belirlemek için bir voltmetre kullanılarak kontrol edilebilir.
Bu çalışma birkaç şekilde sınırlıdır. Bu teknik zamana özgüdür ve muhtemelen en iyi E10.5'ten önce ve E16.5'ten daha geç olmamak üzere gerçekleştirilir. Bunun nedeni, plasentanın E10.5'ten önce çok küçük olması ve E16.5'ten sonra, plazmidin istenen etkiyi üretmek için yeterli zamana sahip olmamasıdır. Bu zaman dilimi, bu tekniğin farelerde belirli çalışma türleri için daha uygun olduğu anlamına gelir. Bu teknik, nörogelişimi incelemek için yararlıdır, çünkü E12.5, beyindeki birçok yapı için nörogenezin çok önemli bir zamanına girer34. Bu teknik, E8.535 üzerinde gerçekleşen nöral plak oluşumu gibi gelişimin erken aşamalarındaki plasental etkileri incelemek için yararlı olmayabilir. Nakavt CRISPR plazmidinin sonuçları şu anda bilinmemektedir; Bu yöntemin gen ekspresyonu indirgemesine uygulanması, sadece bir genin aşırı ekspresyonu / aktivasyonu gösterildiğinden daha fazla araştırmaya ihtiyaç duymaktadır. Buna rağmen, bu tekniğin nakavt CRISPR plazmidinin yerleştirilmesi için de başarılı olacağı tahmin edilmektedir.
Bu teknik aynı zamanda genetiği değiştirilmiş plasenta dokusunun birincil kültürünü gerçekleştirme olasılığına da izin verebilir36. CRISPRi ve CRISPRa gibi kullanılan CRISPR türüne bağlı olarak, bir kurtarma çalışması yapmak için birincil bir kültür kullanılabilir37,38. Bu teknik, plasental genetik ve fonksiyonel anormallikler ile yavrulardaki problemler arasındaki bağlantıları daha fazla araştırmak için de kullanılabilir. Spesifik olarak, önceki bir çalışmada plasentaya özgü genomik risk skorları ile şizofreni riskleri arasında anlamlı bir korelasyon bulunmuştur39. Bu çalışma, hayvan modellerinde araştırılmamış şizofreni gelişiminde rol oynayabilecek birçok plasental geni tanımladı. Bu teknik, bu tür ve diğerlerinin daha ileri çalışmalarına kendini borçludur.
Plasentanın CRISPR modifikasyonundan elde edilen bilgiler, bir dizi farklı biyomedikal uygulamaya dönüştürülebilir. Plasentada spesifik gen ekspresyonunun fetal gelişimi nasıl etkileyebileceğini belirleyen çalışmalar, bu anormallikleri tedavi edebilecek plasenta hedefli farmakolojik müdahaleler oluşturmak için kullanılabilir. Doğrudan fetüsü hedef alan tedaviler zor ve tehlikeli olabilir40,41. Plasenta tedavi için daha erişilebilir bir hedeftir. Kalpte veya beyinde doğum öncesi olarak değiştirilebilen gelişimsel problemler durumunda, doğrudan kalp veya beyin manipülasyonu yüksek risklidir. Bu tür bir risk, daha makul olan ve kısmen plasenta tarafından sağlanan moleküler ortamın kritik olabileceği nörogelişimsel bozukluklar için önleyici stratejilere yol açabilecek plasenta müdahalesi ile önlenebilir5. Bu teknik, plasenta bozuklukları9 ile bağlantılı olan konjenital kalp hastalığı gibi hastalıkları tedavi etmek için de kullanılabilir. Konjenital kalp hastalığı yaygın bir doğum kusuru olduğundan, plasental müdahale tedavisi olasılığı önemli bir etkiye sahip olabilir8. Plasentanın birçok işlevi olduğu için, bu teknik çoklu hastalıklar için müdahalelerin geliştirilmesini ilerletmek için kullanılabilir. Genel olarak, bu plasental hedefli teknik, plasenta genetiğinin ve işlevinin fetal gelişimin birçok alanı üzerindeki etkisinin daha iyi anlaşılması için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar aşağıdaki finansman kaynaklarını kabul etmektedir: R01 MH122435, NIH T32GM008629 ve NIH T32GM145441. Yazarlar, Dr. Val Sheffield ve Dr. Calvin Carter'ın Iowa Üniversitesi'ndeki laboratuvarlarına ameliyathane ve ekipmanlarının kullanımı için ve ayrıca Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan ve Dr. Matthew Weber'e mikroskopi konusundaki yardımları için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Dr. Sara Maurer, Maya Evans ve Sreelekha Kundu'ya pilot ameliyatlardaki yardımları için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 - 44 - 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/? |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24x60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD - Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
References
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
- Rosenfeld, C. S.
- Maslen, C. L.
- Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
- Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
- Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
- Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
- Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
- Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
- Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
- Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
- Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
- Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
- Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
- Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
- Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
- Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
- Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T.
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
- Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
- Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
- Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
- Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
- Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
- Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
- Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
- Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
- Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
- Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
- Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
- Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
- Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
- Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
- Smajdor, A.
- Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).
