Summary
ここでは、マウス胎盤の重要な発生経路を in vivoで効果的に操作するための時間特異的な方法について説明します。これは、CRISPRプラスミドを妊娠ダムの胎盤に注入し、エレクトロポレーションすることによって行われます 12.5.
Abstract
胎盤は、 子宮内の哺乳類の発達を調節および維持する重要な器官です。胎盤は、母親と胎児の間の栄養素と老廃物の移動、および成長因子とホルモンの産生と送達に関与しています。マウスの胎盤遺伝子操作は、胎盤の出生前発達における特定の役割を理解するために重要です。胎盤特異的Cre発現トランスジェニックマウスは様々な有効性を有し、胎盤遺伝子操作のための他の方法は有用な代替手段となり得る。本論文では、CRISPR遺伝子操作を用いて胎盤遺伝子発現を直接変化させる技術について述べ、標的遺伝子の発現を改変することができる。比較的高度な外科的アプローチを使用して、妊娠中のダムは胚の12.5日目(E12.5)に開腹術を受け、CRISPRプラスミドはガラスマイクロピペットによって個々の胎盤に送達されます。プラスミドは、各注入後直ちにエレクトロポレーションされます。ダムの回復後、胎盤と胚は後の時点で評価されるまで発生を続けることができます。この技術を使用した後の胎盤および子孫の評価は、発生における時間特異的胎盤機能の役割を決定することができる。このタイプの操作により、胎盤の遺伝学と機能が複数の疾患の状況における胎児の成長と発達にどのように影響するかをよりよく理解することができます。
Introduction
胎盤は胎児の発育に関与する必須の器官です。胎盤の主な役割は、必須の要素を提供し、胎児との間の栄養素と老廃物の移動を調節することです。哺乳類の胎盤は、胎児と母体の界面を構成する胎児組織と母体組織の両方で構成されているため、母親と胎児の両方の遺伝学が機能に影響を与えます1。胎盤の遺伝的異常または機能障害は、胎児の発育を劇的に変化させる可能性があります。以前の研究では、胎盤の遺伝学と発達が胎児の特定の臓器系の発達の変化に関連していることが示されています。特に、胎盤の異常は、胎児の脳、心臓、血管系の変化と関連しています2,3,4,5。
胎盤から胎児へのホルモン、成長因子、およびその他の分子の輸送は、胎児の発育に大きな役割を果たします6。特定の分子の胎盤産生を変化させると、神経発達が変化する可能性があることが示されています。母親の炎症は、胎盤におけるトリプトファン(TRP)代謝遺伝子発現を変化させることによってセロトニンの産生を増加させることができ、その後、胎児の脳にセロトニンの蓄積を作り出す7。他の研究では、心臓の欠陥と一緒に胎盤の異常が見つかりました。胎盤の異常は、ヒトで最も一般的な先天性欠損症である先天性心疾患の一因となると考えられています8。最近の研究では、胎盤と心臓の両方で同様の細胞経路を持ついくつかの遺伝子が特定されました。破壊された場合、これらの経路は両方の臓器に欠陥を引き起こす可能性があります9。胎盤の欠陥は先天性心疾患を悪化させる可能性があります。胎盤遺伝学と特定の胎児臓器系の発達における機能の役割は、新たな研究分野です。
マウスは、血球胎盤などヒト胎盤の特徴を有しており、ヒトの疾患を研究するための非常に有用なモデルとなっています1。胎盤の重要性にもかかわらず、現在、標的を絞ったin vivo遺伝子操作が不足しています。さらに、現在、ノックアウトまたはノックダウンには、胎盤10の過剰発現または機能獲得操作よりも多くの選択肢があります。胎盤特異的操作のためのいくつかのトランスジェニックCre発現系統があり、それぞれが異なる時点で異なる栄養膜系統にあります。これらには、Cyp19-Cre、Ada/Tpbpa-Cre、PDGFRα-CreER、およびGcm1-Cre11,12,13,14が含まれる。これらのCre導入遺伝子は効率的ですが、特定の時点で一部の遺伝子を操作することができない場合があります。胎盤遺伝子発現をノックアウトまたは過剰発現させるために一般的に使用される別の方法は、レンチウイルスベクターを胚盤胞培養物に挿入することであり、これは絨毛膜特異的な遺伝子操作を引き起こす15,16。この技術は、発生の初期における胎盤遺伝子発現の堅牢な変化を可能にする。生体内でのRNA干渉の使用は、胎盤ではまばらに利用されています。shRNAプラスミドの挿入は、本論文に記載のCRIPSR法と同様に行うことができる。これはE13.5で行われ、胎盤でのPlGF発現を正常に減少させ、子孫の脳血管系に影響を与えました17。
主にノックアウトまたはノックダウンに使用される技術に加えて、過剰発現の誘導は、一般的にアデノウイルスまたは外因性タンパク質の挿入によって行われる。過剰発現に使用される技術は、成功率にばらつきがあり、主に妊娠後期に実施されています。胎盤機能におけるインスリン様成長因子1(IGF-1)の役割を調べるために、IGF-1遺伝子の過剰発現を誘導するために、アデノウイルス媒介胎盤遺伝子導入が行われた18,19。これは、E18.5のマウス妊娠後期に直接胎盤注射を介して実施されました。追加の選択肢を提供し、Cre−Lox併用の失敗、アデノウイルスの毒性の可能性、およびshRNAのオフターゲット効果などの確立された胎盤遺伝子操作の起こり得る失敗を回避するために、胎盤のin vivo直接CRISPR操作を使用することができる20、21、22。このモデルは、過剰発現モデルの欠如に対処し、柔軟性のあるモデルを作成するために開発されました。
この技術はLecuyerらの研究に基づいており、shRNAおよびCRISPRプラスミドをin vivoでマウス胎盤に直接標的化してPlGF発現を変化させました17。この手法は、複数の時点でCRISPR操作を使用して胎盤遺伝子発現を直接変更するために使用できます。この作業では、E12.5が選択されました。胎盤はこの時点で成熟しており、操作するのに十分な大きさであり、E12.5に特定のCRISPRプラスミドを挿入することができ、妊娠中期から後期の胎児の発育に大きな影響を与える可能性があります23,24。トランスジェニックアプローチとは異なり、ウイルス誘導やRNA干渉に似ていますが、この技術は、比較的高度な外科的アプローチを使用して特定の時点で過剰発現またはノックアウトを可能にするため、以前の変化による胎盤形成障害または胚致死の可能性を回避します。同腹仔内で実験プラスミドまたは対照プラスミドを受け取る胎盤はごくわずかであるため、このアプローチでは2種類の内部コントロールが可能になります。これらのコントロールは、適切なコントロールプラスミドを注入およびエレクトロポレーションしたものであり、直接操作を受けないものである。この技術は、相乗的活性化メディエーター(SAM)CRISPRプラスミドを介してマウス胎盤にIGF-1遺伝子の過剰発現を作り出すように最適化されました。IGF-1は胎児に送達される必須の成長ホルモンであり、主に出生前に胎盤で産生されるため、IGF-1遺伝子が選択されました25,26。この新しい胎盤を標的としたCRISPR技術により、胎盤機能と胎児の発育との関係を定義するのに役立つ直接操作が可能になります。
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Protocol
すべての手順は、連邦規制およびアイオワ大学の方針に従って実行され、それに準拠して実行され、施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
1.動物と飼育
- 動物を12時間の日光サイクルに保ち、食物と水を 自由に保ちます。
- 8〜15週齢のCD-1雌マウスを使用する。交尾プラグの存在を使用してE0.5を識別します。
- E0.5では、妊娠中のダムを単独で収容します。
2. マイクロピペットの校正
注:可能であれば、マイクロピペットのキャリブレーションを手術前に実行する必要があります。
- マイクロピペットを作製して校正する前に、すべてのプラスミドをDNaseフリー水で推奨濃度(0.1 μg/μL)に希釈してください。プラスミドを適度に希釈したファストグリーン色素(PBS溶液1 μg/μL)と混合します(最終プラスミド濃度:0.06 μg/μL)。
- マイクロピペットプーラーで外径1.5 mm、内径0.86 mmの10 cmガラスキャピラリーを使用してマイクロピペットを引きます。
- マイクロピペット(2〜3 mm)の先端を滅菌鉗子で慎重に切り離します。
- マイクロインジェクターに取り付けられたマイクロキャピラリーチップにマイクロピペットをロードします。マイクロインジェクターがマイクロインジェクションマシンに取り付けられていること、およびマイクロピペットを校正するのに十分なレベルの窒素があることを確認してください。
- マイクロピペットをマイクロインジェクターに取り付けたら、Fast Green色素溶液をロードしてキャリブレーションを実行します(PBS溶液1 μg/μL)。マイクロピペットを較正して、約3.5 μLの容量を注入します。 以下のように、プラスミド溶液をロードする準備としてマイクロピペットを空(「透明」)にします。
注意: 各マイクロピペットはわずかに異なります。注射中の胎盤の損傷を避けるために、注射時間は0.5〜1.5秒の間で設定する必要があります。圧力は1〜8.5psiの間で設定する必要があります。各マイクロピペットを個別に校正します。マイクロピペットをこれらのパラメータ内で校正できない場合は、使用しないでください。
3.手術(図1A)
注:準備するには、準備領域と手術領域の両方の表面を70%エタノールで洗浄します。準備エリアに吸収性アンダーパッドを置きます。手術エリアでは、加熱パッドを下に置いてから、その上に吸収性のアンダーパッドを置きます。手術前にすべての道具を滅菌してください。ダムが麻酔下にある時間は1時間未満でなければなりません。
- 麻酔
- 手術の30分から1時間前に、5 mg / kgのNSAID(メロキシカム)または別の承認された鎮痛薬を妊娠中のダムに投与します。.
- 妊娠中のダムをイソフルラン気化器に取り付けられた誘導チャンバーに置きます。
- 気化器を4%イソフルランと3.5 L / min酸素に設定します。
- つま先のつまみに対する反応の欠如と呼吸数の低下によって麻酔が確認されたら、ダムを誘導室から準備エリアに移します。
- 手術の準備
- 準備エリアで、ノーズコーンでダム仰臥位を置きます。
- ダムがノーズコーンにある間、気化器を2%イソフルランと3.5 L / min酸素に減らします。
- ダムの腹部を完全に剃り、余分な毛皮を取り除きます。滅菌綿先端アプリケーターを使用して、剃毛した腹部をポビドン溶液と70%エタノールで交互に3回コーティングします。ポビドン溶液の最終コートを適用します。角膜の乾燥を防ぐために、ダムの両目に人工涙液ゲルを置きます(図2A、B)。
- 準備が終わったら、ノーズコーン付きのダムを指定された手術部位に移動します。
- 子宮開腹術
注意: 手術中は滅菌手袋を使用してください。滅菌されていない表面に接触した場合は、手袋を交換してください。- 手術部位にダムを仰臥位で置き、ノーズコーンをテープで固定します。吸収パッドの下の加熱パッドを45°Cに設定します。
- 鉗子とはさみを使用して、皮膚を通して約2 cmの正中線切開を行います。鉗子を使用して皮膚をテント張りにし、皮膚を垂直に切開します。この後、腹膜を通して別の同様のサイズの切開を行い、子宮角を露出させます。鉗子を使用して、垂直切開を行いながら腹膜にテントを張ります(図2C、D)。
注意: 腹膜を切開しながら適切にテントを張らないと、腸が致命的に切開される可能性があります。 - 腹部の側面を押して、切開部を通して子宮角を優しくマッサージします。偶発的な怪我を避けるために指だけを使って、道具なしで子宮を慎重に導くことによってこれを行います。ダムの腹部を覆う滅菌外科用ドレープの上に露出した子宮を置き、必要に応じて使用前に30°Cに温めることができる滅菌生理食塩水の滴で手術中湿らせてください(図2E、F)。
注:子宮角は、Wangら27に記載されているように識別できます。 - 子宮が露出したら、操作のために3対の胎盤を選択します。
注:胎盤は、Elmoreら24に記載されているように識別できます。胚の生存を最大化するために、6つ以下の胎盤を治療する必要があります。存在する胚が12個未満の場合は、4個以下の胎盤を注射する必要があります。隣接する2つの胎盤を選択して、一方が対照注射を受け、もう一方が実験プラスミドを受け取るようにします。隣接する2つの胎盤を使用すると、子宮内の同様の場所にある胎盤をより適切に比較でき、生存率を高めることもできます。選択された胎盤対はランダムに選択され、両方の子宮角全体に間隔を空けて選択されます(図1B)。 - 胎盤操作の位置と子宮角内の胚の組織を記録して、1つのダムが対照と実験的に処理された胎盤/胚の両方を運ぶため、収集中に胚と胎盤を識別できるようにします。
- コントロールプラスミドの胎盤注入とエレクトロポレーション
注意: 無菌技術を維持するには、使用前にエレクトロポレーションパドルとマイクロインジェクターを冷滅菌剤で滅菌してください。滅菌されていない表面に接触した場合は、手袋を交換してください。- 較正されたマイクロピペットを使用して、3回の注入に十分な量の適切なコントロールプラスミドをロードします。すべての注入を、脱落膜(白)と接合部(暗赤色)の間の胎盤に横方向に~0.5mmの深さで行います(図3A-F)。
- 3つの対照胎盤に注射を行います。
注:マイクロピペットによるプラスミドの交差汚染を避けるために、実験的注入の前にすべてのコントロールプラスミド注入を実行してください。これにより、マイクロピペットとキャリブレーション時間を変更すると手術時間が大幅に増加し、ダムの生存率が低下するため、同じマイクロピペットを使用できます。 - コントロールプラスミド注入胎盤のエレクトロポレーションを注射後2分以内に行う。
- エレクトロポレーションには、エレクトロポレーションマシンに取り付けられた3mmパドルのペアを使用します。CRISPRの取り込み効率と胚の生存率を確保するには、次のエレクトロポレーション設定を使用します:2パルス、30 V、30 msパルス、970 msパルスオフ、ユニポーラ。
- 注射後、エレクトロポレーションの直前に、接触場所を滅菌生理食塩水でコーティングし、生理食塩水を子宮壁の3つの部位とパドルにスポイトまたはシリンジで正確に塗布します。
- 胎盤の側面にあるエレクトロポレーションパドルをそっと押します。アノードパドルを注入部位とカソードの真向かいに配置します(図4A-C)。
- エレクトロポレーションマシンのパルスを押し、2つのパルスが完了するのを待ってから、エレクトロポレーションパドルを取り外します。
注:パルス中にパドルと胎盤の間に少量の白い泡がよく見られます。これが発生しない場合は、さらに使用する前に電圧計でパドルからの電圧を確認してください。電圧計の読み取り値がエレクトロポレーション電圧設定と一致しない場合、パドルは機能しません。
- 実験用プラスミドの胎盤注入とエレクトロポレーション
- 手順 3.4.1 と同じ手順に従います。ステップ 3.4.2 に移動します。コントロールプラスミドの代わりに実験用プラスミドを用いた。
- 注射から2分以内に、3つの実験的注入された胎盤すべてのエレクトロポレーションを実行します。これは、コントロールプラスミドを注入したものと同様にして行うべきである。手順 3.4.4 に従います。ステップ 3.4.7 に進みます。
- 手術の完了
- 胎盤操作が完了したら、指だけを使って子宮角を腹腔内で優しくマッサージします(図5A)。
- まず、長さ45cmのコーティングおよび編組溶解可能な縫合糸を13mm3/8c針合金で使用して、腹膜層に二重結節の単一縫合糸を行います。縫合糸を2〜3 mm離して配置します(図5B)。
- 腹膜層を縫合した後、溶解可能な縫合糸で皮膚を縫合する。ダムが縫合元を元に戻すことができないように、単一の縫合糸を2〜3 mm離してトリプルノットします(図5C)。
- 縫合が完了したら、イソフルランを1%、酸素を3.5 L / minに設定し、皮膚の縫合糸に組織接着剤を塗布します(図5D)。
注:組織接着剤はオプションですが、ダムの咀嚼による切開の再開を防ぐために推奨されます。 - 組織接着剤が乾いたら、気化器をオフにし、手術エリアからダムを取り外します。ダムを背中の支持ケージに入れます。
4.術後のケアとモニタリング
- 妊娠中のダムを監視下の清潔なケージで最低30分間回復させて、手術の即時の合併症がないことを確認します。それが完全に歩行可能になり、補助なしでその足にひっくり返ることができるまで観察してください。手術後のダムを単独で収容します。
- 胚の採取まで、施設の術後ケアとモニタリングに従ってください。ダムの重量を記録し、縫合糸と切開部位を毎日監視します。
5. E14.5胎盤コレクション
- E14.5では、ケタミン/キシラジンカクテル(1 mg / mLケタミンと0.1 mg / mLキシラジン)でダムを深く麻酔し、ダムを頸部脱臼させます。
- ハサミでダムの腹部にV字型の切開を行い、子宮を取り除きます。すぐに氷の上の5cmのペトリ皿に置きます。鉗子を使用して、胚と対応する胎盤を子宮から慎重に取り除きます。
注:子宮角の胚の位置と対応する胎盤を記録して、手術中に直接操作を受けたものを特定します。 - 胎盤の体重を記録します。RNAseフリーの鉗子とかみそりを使用して、胎盤を正中線の下で半分に切ります。4°Cで半分を4%PFAに入れます。 残りの半分を再度半分にカットし、残りの2/4を-80°Cで2本のチューブ(1本はRNA保存試薬付き)に保存します。
注:胚およびその他の母体組織は、将来の使用のために-80°Cでコレクションから保存できます。
6. 胎盤遺伝子発現解析
- -80°Cで保存された胎盤の四分の一をRNA保存試薬に使用します。
- RNA単離のためのTrizol法、RNA濃度のための分光光度計、cDNA合成キット、およびSYBRグリーンマスターミックス28を用いたqPCRを使用して、Elserらに記載されているようにqPCRのために胎盤を処理します。Elserらで参照されているターボDNAフリーキットDNAaseの代わりに、Trizol RNA単離後にRNAクリーンアップキットを使用して、サンプルに汚染物質が含まれていないことを確認します28。
注意: Trizolの製品安全データシート(MSDS)を読み、化学ヒュームフードで使用してください。 - GFPプライマーを用いた対照プラスミドおよびBLASTプライマーを用いた実験プラスミド( 補足表1に記載されているプライマー)のプラスミド挿入を評価します。CT値を使用して、プラスミドの存在を判断します。
注:35を超えるCT値は偽陽性であり、35未満のCT値のみがプラスミドが正常に挿入されたことを示す陽性の指標と見なす必要があります。 - ハウスキーピング遺伝子18sに正規化したIGF-1胎盤発現を評価する(補足表1に列挙するプライマー)。ddCT法を使用してフォールド変化を計算し、次に実験サンプルの正規化フォールド変化をコントロールサンプルの平均フォールド変化に計算します。
7.胎盤タンパク質レベルの分析
- -80°Cで保存された胎盤の四分の一を使用してください。 最終pH7.4のdiH 2 O中の11.5 mM Tris HCl、5 mM MgCl2、および10 mMプロテアーゼ阻害剤からなる緩衝溶液で組織をホモジナイズします。ハンドヘルドホモジナイザーと乳棒を使用して組織を破壊します。
注:サンプルはバッファーの容量の10%を超えてはなりません。 - ホモジナイズしたサンプルをバッファー中で1:12に希釈し、ビシンコニン酸アッセイ(BCA)キットの検出範囲内になるようにします。製造元の指示に従ってBCAアッセイを実行し、プレートリーダーを使用して総タンパク質を定量します。
- BCAアッセイを実行した後、Gumusogluら29で行われているように、IGF-1 ELISAのすべてのサンプルを同じ総タンパク質濃度2 mg/mLに正規化します。
- 製造元の指示に従ってIGF-1 ELISAを実行し、標準濃度曲線を用いてプレートリーダーでIGF-1タンパク質レベルを定量します。
8. 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション標識を用いた空間的クリプサー検証
- 胎盤の半分を4°Cの4%PFAで1〜3日間適切に固定した後、4°Cの20%スクロースに移してから、最適な切断温度(OCT)コンパウンドで凍結します。
- OCT包埋胎盤の半分を-20°Cのクライオスタットで10 μmの切片に連続切断し、ラベル付けするスライドに配置します。胎盤の半分を切断して、3つのサブ領域すべてが見えるようにします。 in situ ハイブリダイゼーションに使用するまで、スライドを-80°Cで保存してください。
- メーカーのプロトコルに従って蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)標識を実行します。1つのスライドをdCas9-3xNLS-VP64プローブとハイブリダイズし、同じ胎盤の2番目の「姉妹」スライドをPrl8a8プローブとハイブリダイズします。
注:dCas9-3xNLS-VP64プローブは、過剰発現プラスミドの存在を検出します。Prl8a8プローブは、接合帯の海綿状絨毛膜を強調し、胎盤のサブ領域を識別できるようにします。これらの2つのプローブは、胎盤内の緑色の自家蛍光とのマルチチャンネル蛍光の干渉を避けるために、別々の「姉妹」スライドに標識されています。 - 両方のプローブを検出色素(Opal 620)で標識します。FISHの製造元のプロトコルが完了したら、DAPI封入剤を塗布し、スライドにカバーガラスを置きます。透明なマニキュアでカバーガラスを密封します。
- 正立型複合蛍光顕微鏡でスライドを画像化し、適切な画像処理ソフトウェアを使用して処理します。ここでは、CellSensソフトウェアを使用しました。
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Representative Results
一般的な手順の結果(図6)
この研究では、3つの操作されたグループがありました。これらには、一般的なCRISPR Cas9コントロールプラスミド(Cas9コントロール)、活性化コントロールCRISPRプラスミド(Actコントロール)、またはIGF-1 SAM活性化プラスミド(Igf1-OE)を注入した胎盤が含まれていました。Cas9コントロールはノックアウトプラスミドに適しており、活性化コントロールは過剰発現/活性化プラスミドに適しています。注射およびエレクトロポレーションによる胎盤の操作によって引き起こされる生存率の変化を評価するために、同腹仔内の胚生存をE14.5で分析しました(図6A)。エレクトロポレーションを用いたCRISPRプラスミドのインビボ挿入を行った他の研究が、発現変化が8〜22時間以内に達成できることを示したので、この時点を選択した30、31、32。E14.5での収集により、CRISPRプラスミドは約48時間統合し、遺伝子発現の増加を活性化することができます。ダムの外科的操作はすべての胚の生存に影響を与えたが、注射およびエレクトロポレーションを受けた操作された胎盤に関連する胚は生存率を有意に低下させたことがわかった。未処理の胚(同じ同腹仔にいるが、標的操作を受けていない)の生存率は、100%の生存率から平均79.05%に減少した。操作された胚の生存率は有意に減少し、平均生存率は55.56%であった。操作された3つのグループ間に有意差は見られませんでした。
操作された胎盤に有意な肉眼的変化が生じたかどうかを判断するために、胎盤重量が記録された。いずれの群の胎盤重量にも有意差はなく(図6B)、胎盤と胚の肉眼的外観は変化しなかった。代表的な壊死後の画像は、E14.5の収集時に解剖顕微鏡で撮影されました。異なる治療群の胎盤/胚の画像は、すべて同じ同腹仔内で撮影されました。羊膜嚢または露出した胚とそれに対応する胎盤のいずれの治療群においても、表現型の外観に顕著な損傷または変化はありませんでした(図6D-I)。IGF-1活性化プラスミドを使用した操作群の形態には大きな違いは見られませんでしたが、胎盤または胚の本質的な成長および機能調節因子により実質的に影響を与える可能性のある他の遺伝子を標的とする他の実験用プラスミドには当てはまらない可能性があります。Cas9コントロール胎盤とActコントロール胎盤の間には、どの尺度にも差は見られませんでした。したがって、これら2つのグループは組み合わされ、すべての分析でConまたはControlsと呼ばれました。これらの結果は、この技術を用いたE12.5上の子宮内の胎盤の操作が胚の生存率の低下を引き起こすことを示していますが、それでも有意な生存率があります。結果はまた、操作された胎盤と未治療の胎盤の間で体重に大きな変化がなかったため、胎盤の成長は全体的に大きな影響を受けていないことを示しています。これは、提案された技術が、健康で生存可能なCRISPR操作胎盤およびそれに対応する胚の生存を可能にすることができることを示しています。
ダムの体重変化は、E14.5の胚採取前の術後毎日記録されました(図6C)。手術はE12.5で行われたため、すべてのダム重量の変化はE12.5の重量を基準にリストされています。実験的(Exp)ダムは胎盤操作を受けたが、偽ダムは麻酔と同様の期間の開腹術を受け、胎盤操作は行われなかった。多くの妊娠中のダムは、手順の翌日に体重のわずかな減少または変化を示しませんでした(E13.5)。これは、手術中および手術後の短時間の食事の乱れが原因である可能性があります。ほとんどのダムはE14.5で重量の増加を示しましたが、時折、重量の減少が依然として観察されました。術後の母体ダム重量の追跡により、胚の生存率をモニタリングすることができた。手術後の妊娠中のダムの体重の変動は一般的であり、処理されたすべての胚が失われたことを示すものではありませんでした。偽ダムと実験ダムの術後の体重変化に有意差はなかった。これは、CRISPRプラスミドを胎盤に挿入した後もダムの健康が一般的に保存されたことを示しています。全体として、これは、この外科的手法が胚の生存率の低下を引き起こす可能性がある一方で、それでも研究に使用できる健康な子孫のかなりの割合をもたらすことを示しています。
E14.5胎盤における発現とCRISPR取り込みの分析(図7)
IGF-1活性化プラスミドの細胞挿入がIGF-1の過剰発現に対して成功したかどうかを決定するために、qPCRを実施した。予想通り、qPCRは、フォールド変化を18s発現に正規化した場合、IGF1-OE胎盤対対照胎盤におけるIGF-1発現の有意な増加を示した(ウェルチのt検定、p = 0.0302)(図7A)。IGF-1タンパク質レベルが変化したかどうかを判断するために、すべてのグループの胎盤に対してELISAを実施しました。qPCRと一致して、E14.5胎盤のELISA評価は、対照胎盤と比較してIGF1-OE胎盤のIGF-1タンパク質レベルの有意な増加を示しました(ウェルチのt検定、p = 0.0469)(図7B)。qPCRおよびELISAは、過剰発現プラスミドがそれぞれIGF-1遺伝子発現およびIGF-1タンパク質産生を増加させることに成功したことを示した。
プラスミドの送達が操作された胎盤に特異的であることを確認するために、特異的 なIGF-1 活性化プラスミドおよびCRISPR Cas9コントロールプラスミドに対してqPCRを実施した。これらのqPCRは、操作された胎盤と注射されたものに隣接する未治療の胎盤の両方で実行されました。活性化プラスミド発現を評価するために使用されたqPCRプライマーは、活性化系の一部であるBLASTプラスミドの配列を標的としました(図7C)。未処理の胎盤はBLASTプラスミドの存在を示さず(周期閾値[CT]未定、グラフ上で40と表示)、Igf1-OE胎盤は30前後のCTを示した。qPCRを実施して、挿入されたGFP遺伝子由来の配列を標的としたコントロールプラスミド発現を評価した(図7D)。未治療の胎盤は35を超えるCT値を示し、これらの値は予想される発現範囲外であるため、おそらくプライマー二量体化によって引き起こされました。対照は約30のCT値を示した。これらのqPCRは、予想される IGF-1 の過剰発現またはその欠如、およびプラスミドが予想される操作された胎盤にのみ存在することを証明するための品質チェックとして機能します。
IGF-1活性化プラスミドの空間検証は、胎盤切片を用いて行った。OCTコンパウンドで固定および凍結した胎盤は、すべての層が見えるようにスライド上に10μmで連続切片化されました。その後、スライドをFISH標識に使用するまで-80°Cで凍結しました。胎盤内のどこにIGF-1 CRISPR活性化プラスミドが組み込まれているかを確認するために、赤色蛍光標識を施したdCas9-3xNLS-VP64プローブを使用しました。このプローブは、活性化システムの機能コンポーネントを標的とする。緑色の自家蛍光を使用して、胎盤の母体-胎児界面のサブ領域を実証しました(図7E、F)。未治療の胎盤はCRISPR操作で治療されていないため、dCas9-3xNLS-VP64は検出されませんでした(図7E)。予想通り、IGF1-OE胎盤は、赤で見られるように、dCas9-3xNLS-VP64の標識を示しました(図7F)。CRISPRの取り込みは、胎盤の3つのサブ領域すべてで見られ、接合部ゾーンの最も明確な標識がありました(図7E)。dCas9-3xNLS-VP64標識の蛍光強度は、プラスミド処理胎盤全体で異なり、プラスミドを他のプラセンタよりも高く発現するものがあり、標識の正確な位置/範囲にばらつきがありましたが、標識は一般的にすべてのサブ領域に存在していました。dCas9-3xNLS-VP64標識の位置を確認するために、海綿栄養膜を標的とするPrl8a8 FISH標識を行い、中央接合部部分領域を標識しました(図7G、H)。これは、dCas9-3xNLS-VP64でラベル付けされた切片の「姉妹」スライド上の同じ胎盤からの隣接する切片で行われた。予想通り、Prl8a8標識によって示された構造は、IGF1-OEと未処理の胎盤の間で類似していた。落膜帯と迷路帯は、赤色接合帯を囲む青色核(DAPI)標識によって識別できます(図7G、H)。dCas9-3xNLS-VP64のFISH標識により、プラスミドが3つのサブ領域すべてに挿入されていることが明らかになり、Prl8a8標識で確認されました。FISH標識の結果、IGF-1活性化プラスミドの取り込みに成功し、未処理の胎盤に移行しないことが確認されました。
図1:プロトコルの概略図。 (A)外科的処置の簡略化された概略図。テクニックの主要なステップの年代順。(B)子宮角内の胎盤間隔を操作した例を示す模式図。両方のパネルは BioRender.com で作成されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:子宮開腹術の手順。 (A-B)手術準備中に、(A)ダムの剃毛腹部、および(B)ヨウ素溶液でコーティングされた剃毛領域。(C-F)手術領域では、(C)腹部の皮膚を~2cm切開し、(D)腹膜を~2cm切開する。腸が見えます。(E)切開部位から子宮角を操作する。子宮角が見えます。(F)滅菌外科用ドレープの上に置かれた完全に露出した子宮角。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:E12.5胎盤へのCRISPRプラスミドの注入。 (A、B)子宮角内の胚と胎盤の向き。(A)脱落膜、胎児帯、および胚を示す標識された子宮角の斜め図。破線は、注射部位がどこにあるべきかを表します。(B)パネルAからのラベルのない子宮角。(C,D)胎盤の注射部位に挿入されたマイクロピペットの側面図。Dは脱落膜、FZは胎児帯、Eは胚、破線は注射部位の位置を表す。(D)パネルCからのマイクロピペット挿入のラベルなし画像。(E,F)注射後の胎盤の色素の側面図。(E)可視色素を含むCRIPSRプラスミドを注入した胎盤と注射していない胎盤を示す子宮角の標識画像。(F)パネルEの子宮角のラベルのない画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:CRISPRプラスミドの注入後のE12.5胎盤のエレクトロポレーション。 (A)子宮角の胎盤の上面図。アノードおよびカソードエレクトロポレーションパドルにはラベルが付けられており、白い矢印は注入部位の位置を示しています。(B)胎盤のエレクトロポレーションの斜め図。(C)胎盤のエレクトロポレーションの側面図。(D-F)パネルA、B、およびCの簡略化されたアウトライン。陽極パドルと陰極パドルにはラベルが付けられ、Pは胎盤、Eは胚、ラベルのない領域は子宮です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:腹部の皮膚と腹膜の縫合 。 (A)子宮角は手術終了後に腹部に戻った。腹部の皮膚と腹膜の切開が見えます。(B)腹膜切開を完全に縫合した。(C)腹部皮膚切開を完全に縫合した。(D)腹部皮膚縫合糸への組織接着剤の塗布。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:一般的な手順の結果。 (A)術後2日目のE14.5で収集された術後の胚生存率。操作群と未処理の胚で生存率の有意な減少が観察されました(Mann-Whitney U検定:未処理群とCas9対照、p = 0.0077;未処理対行為対照、p = 0.0330;未処理対IGF1-OE、p = 0.0032)。操作群の生存に有意差は認められなかった(一元配置ANOVA、p = 0.9454)。各点は、1リットルからの生存率を表す(未処理のn=22、Cas9コントロールn=9、Actコントロールn=13、およびIGF1-OEn=22)。(B)E14.5(一元配置分散分析、p = 0.1436)上の生存胚の胎盤重量(未処理のn = 138、Cas9コントロールn = 15、Actコントロールn = 20、およびIGF1-OE n = 36胎盤)。(C)偽開腹術を受けたダムまたは実験的(Exp)胎盤操作を受けたダムで見られるE13.5およびE14.5の手術後のダム重量変化。術後のダムの体重変化の2つのグループの間に有意差は見られませんでした(対応のないt検定:E13.5 p = 0.5452およびE14.5 p = 0.2493)(シャムダムn=3およびExpダムn=10)。すべてのエラーバーはSEMを表します。 (D-F)胎盤が付着したままの羊膜嚢内の壊死後のE14.5胚の画像。(F)右端のスケールバーは3.75mmを表す。 (G-I)胚の斜め画像と対応する胎盤の上面図。(I)右端のスケールバーは3.75mmを表します。 (D-I)すべての治療群ラベルは画像の下にリストされています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:E14.5胎盤における発現およびCRISPR取り込みの分析。 (A)E14.5コントロールおよびIGF1-OE胎盤におけるIGF-1発現のqPCR分析。18s発現に正規化されたIGF-1発現の有意な増加がIGF1-OE胎盤において観察された(ウェルチのt検定、p = 0.0302)(対照n=15およびIGF1-OE n = 20胎盤)。(b)E14.5コントロールおよびIGF1-OE胎盤におけるIGF-1タンパク質レベルのELISA。IGF1-OE胎盤では、対照レベルと比較してIGF-1レベルの有意な増加が観察された(ウェルチのt検定、p = 0.0469)(対照n = 13およびIGF1-OE n = 15胎盤)。(c)IGF-1 SAMプラスミド由来のBLAST配列のqPCR解析。BLASTの発現はIGF1-OE胎盤のみに認められ、未治療胎盤(未治療のn=4およびIGF1-OE n = 9胎盤)では発現なし/未確定が認められた。(d)CRISPR Cas9コントロールプラスミドからのGFP配列のqPCR解析。プラスミドの発現は対照胎盤で認められ、CT値は35を超える/偽陽性の結果が未処理のサンプルで見られました(未処理のn=4および対照=5胎盤)。破線は35CTにおける偽陽性閾値を表す。各データポイントは1つの胎盤からのものです。すべてのエラーバーはSEMを表します。 (E-H)10μmの厚さでのE14.5胎盤切片の蛍光in situハイブリダイゼーション。(E)未処理および(F)赤で標識されたdCas9-3xNLS-VP64プローブを有するIGF1-OE胎盤切片。赤色信号はIGF1-OE胎盤にのみ存在します。緑色のシグナルは、胎盤サブ領域の識別に役立つ自己蛍光です。(G)未処理および(H)IGF1-OE胎盤切片を赤色で標識したPrl8a8プローブを用いて、中部接合帯の海綿栄養膜を同定する。青色のDAPIは、その接合ゾーンを囲む落膜ゾーンと迷路ゾーンを示しています。(H)右端の縮尺記号は2mmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足表1:本研究で用いたプライマー。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
胎盤は胎児の成長の主要な調節因子であり、前述のように、胎盤の遺伝子発現または機能の変化は胎児の発育に大きな影響を与える可能性があります6。ここで概説したプロトコルは、比較的高度な外科的アプローチを使用して、マウス胎盤の標的in vivo CRISPR操作を実行するために使用できます。この技術により、生存可能な胚とそれに対応する胎盤のかなりの収量が可能になり、さらなる研究に使用できます(図6A、B)。この手法により、E14.5上の胎盤IGF-1を過剰発現させることに成功しました(図7A、B)。使用したプラスミドは、挿入されたプラスミドが操作された胎盤に残り、隣接する未処理の胎盤には存在しなかったため、特異性を示しました(図7C、D)。IGF-1活性化プラスミドの空間分布は、dCas9-3xNLS-VP64およびPrl8a8についてFISHによって確認され、活性化プラスミドはIGF1-OE胎盤の3つのサブ領域に存在し、未処理の胎盤のどのサブ領域にも存在しないことが示されました(図7E-H)。この技術は、以前の技術では不可能かもしれない方法で胎盤遺伝子発現を変化させるために使用することができる。この技術を使用することで、胎盤遺伝子の発現と機能が複数の状況で胎児の発育に与える影響をより深く理解することができます。
母体および胎児の転帰に対するこの手順の成功を最適化するために、注射およびエレクトロポレーションの設定、および使用される材料を含む、複数のパラメーターを変更した場合の影響が調査されました。ダムの生存と回復を増加させるために、手術期間が長くなると生存率が大幅に低下するため、麻酔下での時間は1時間を超えてはならないことがわかりました。麻酔下の時間が約2時間に達すると、生存の可能性は、おそらくイソフルラン下での延長時間の悪影響のために、20%未満のレベルまで劇的に減少する。麻酔下にある時間を除いて、妊産婦の死につながった手術の最も一般的な合併症は、皮膚と腹膜を切開している間に腹膜を適切にテント張りできなかったことでした。腹膜が適切にテントを張っていないと、腸が損傷する可能性があり、手術後数日で死亡する可能性があります。子宮が露出する時間もダムと胚の生存に影響を与えます。成功した実験で子宮が暴露された平均時間は約15分でした。30分以上の曝露は、吸収の増加と母親の病気の可能性があります。露出した子宮やその他の露出した臓器(多くの場合、腸)は湿らせておく必要がありますが、生理食塩水が多すぎると動物が冷える可能性があります。露出した臓器を定期的に湿らせる場合は、1 mL未満の滅菌生理食塩水を使用する必要があります。
注射とエレクトロポレーションのパラメータは、胚の生存に大きな影響を与えました。注入量は、吸収をもたらすため、約4.5μLを超えてはなりません。.注入時間と圧力は、生存を最大化するために重要です。射出時間は0.5秒から1.5秒の間で設定する必要がありますが、0.8秒が最適に見えました。圧力は1〜8.5psiの間で設定する必要があります。低い胚生存率は、短い注入時間と高い注入PSIレベルで見られました。また、マイクロピペットが鈍すぎると、胚の生存率が低下する可能性があり、溶液もマイクロピペットから漏れることが多いことも観察されました。注射を視覚化するために使用される染料の種類は、生存に影響を与える可能性があります。メチレンブルーは、この目的で使用した場合、妊産婦の死亡につながりましたが、ろ過されたFast Green色素溶液は、妊産婦の健康に悪影響を及ぼさなかった。エレクトロポレーション設定は、in vivoでの以前のエレクトロポレーション研究に基づいて推奨されるメーカー設定から最適化されました33。エレクトロポレーションは、最も多くの損傷を引き起こし、胚の生存率を低下させる操作であることがわかりました。推奨されるin vivo胚エレクトロポレーション設定は、CRISPR効率を最大化するために4つのパルスを推奨するが、より高い生存率のためには2つのパルスが推奨される33。4つのパルスがほぼすべての胚を再吸収させることがわかりました。2つのパルスにより、CRISPR効率を維持しながら生存率を高めることができました。エレクトロポレーションパドルのサイズは、胚の生存にも大きな影響を与えました。5mmエレクトロポレーションパドルは、推奨設定で使用するとほぼ完全な吸収につながることがわかりました。実際、3 mmエレクトロポレーションパドルはメーカーガイドで推奨されており、胚の生存率を大幅に向上させます33。また、多くのエレクトロポレーションパドルには一定のパルス寿命があることに注意することも重要です。この最大限に使用した後、品質の低下が見られます。これは、脈拍中にパドルと胎盤の間に小さな白い泡が形成されない場合に識別できます。エレクトロポレーションパドル電圧は、電圧計を使用してチェックし、予想される電圧を生成しているかどうかを判断できます。
この研究はいくつかの点で制限されています。この手法は時間固有であり、E10.5 より前および E16.5 以降に実行するのが最適です。これは、E10.5より前の胎盤が小さすぎるためであり、E16.5以降、プラスミドは所望の効果を生み出すのに十分な時間がない可能性がある。この時間枠は、この手法がマウスでの特定の種類の研究により適していることを意味します。E12.5は脳内の多くの構造にとって神経新生の重要な時期内にあるため、この技術は神経発達の研究に有用である34。この手法は、E8.535で起こる神経板形成など、発達の初期段階に対する胎盤の影響を研究するのには役立たない可能性があります。ノックアウトCRISPRプラスミドの結果は現時点では不明です。遺伝子発現減少へのこの方法の適用は、遺伝子の過剰発現/活性化のみが実証されているため、さらなる調査が必要です。それにもかかわらず、この技術はノックアウトCRISPRプラスミドの挿入にも成功すると予想されます。
この技術はまた、遺伝子改変胎盤組織36の初代培養を行う可能性を可能にすることができる。CRISPRiやCRISPRaなど、使用されるCRISPRの種類に応じて、初代培養を使用してレスキュー研究を行うことができます37,38。この手法は、胎盤の遺伝的および機能的異常と子孫の問題との関連をさらに調査するためにも使用できます。具体的には、以前の研究では、胎盤特異的ゲノムリスクスコアと統合失調症リスクとの間に有意な相関関係が見つかりました39。この研究では、動物モデルでは探索されていない統合失調症の発症に関与する可能性のある多くの胎盤遺伝子が特定されました。この手法は、このタイプの研究やその他の研究に役立ちます。
胎盤のCRISPR修飾から得られた知識は、さまざまな生物医学的用途に変換できます。胎盤における特異的遺伝子発現が胎児の発育にどのように影響するかを特定する研究は、これらの異常を治療する可能性のある胎盤を標的とした薬理学的介入を作成するために使用できます。胎児を直接標的とした治療は困難で危険な場合があります40,41。胎盤は治療のためのよりアクセスしやすい標的です。出生前に変更可能な心臓または脳の発達上の問題の場合、心臓または脳の直接操作はリスクが高い。このようなリスクは、よりもっともらしい胎盤介入によって回避することができ、胎盤によって部分的に提供される分子環境が重要である可能性のある神経発達障害の予防戦略につながる可能性があります5。この技術は、胎盤障害に関連している先天性心疾患などの疾患の治療にも利用できる可能性があります9。先天性心疾患は一般的な先天性欠損症であるため、胎盤介入治療の可能性は大きな影響を与える可能性があります8。胎盤には多くの機能があるため、この手法を使用して複数の疾患に対する介入の開発を進めることができます。全体として、この胎盤標的技術は、胎盤遺伝学の影響の理解を深めるために使用でき、胎児の発育の複数の領域に対する機能。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、R01 MH122435、NIH T32GM008629、およびNIH T32GM145441の資金源を認めている。著者らは、アイオワ大学のヴァル・シェフィールド博士とカルビン・カーター博士の研究室が手術室と機器を使用してくれたこと、そして顕微鏡検査の支援をしてくれたエリック・ヴァン・オッタールー博士、ナンダクマール・ナラヤナン博士、マシュー・ウェーバー博士に感謝の意を表した。著者はまた、パイロット手術を支援してくれたサラ・マウラー博士、マヤ・エバンス博士、スリーレカ・クンドゥ博士にも感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 - 44 - 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/? |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24x60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD - Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
References
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
- Rosenfeld, C. S.
- Maslen, C. L.
- Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
- Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
- Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
- Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
- Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
- Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
- Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
- Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
- Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
- Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
- Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
- Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
- Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
- Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
- Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T.
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
- Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
- Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
- Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
- Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
- Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
- Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
- Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
- Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
- Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
- Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
- Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
- Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
- Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
- Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
- Smajdor, A.
- Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).
