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Genetics

Mouse In Vivo Placental Alvo CRISPR Manipulação

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/64760
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 1,2,3,4
1Interdisciplinary Graduate Program in Genetics, University of Iowa, 2Department of Psychiatry, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Iowa Neuroscience Institute, Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Hawk-IDDRC, University of Iowa

Summary

Aqui descrevemos um método tempo-específico para manipular efetivamente vias críticas de desenvolvimento na placenta de camundongos in vivo. Isto é realizado através da injeção e eletroporação de plasmídeos CRISPR nas placentas de fêmeas grávidas no dia embrionário 12.5.

Abstract

A placenta é um órgão essencial que regula e mantém o desenvolvimento dos mamíferos no útero. A placenta é responsável pela transferência de nutrientes e resíduos entre a mãe e o feto e pela produção e entrega de fatores de crescimento e hormônios. Manipulações genéticas placentárias em camundongos são críticas para a compreensão do papel específico da placenta no desenvolvimento pré-natal. Camundongos transgênicos que expressam Cre específicos da placenta têm eficácia variável, e outros métodos para manipulação gênica placentária podem ser alternativas úteis. Este artigo descreve uma técnica para alterar diretamente a expressão gênica placentária usando a manipulação do gene CRISPR, que pode ser usada para modificar a expressão de genes-alvo. Usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada, as fêmeas grávidas são submetidas a uma laparotomia no dia embrionário 12.5 (E12.5), e um plasmídeo CRISPR é entregue por uma micropipeta de vidro nas placentas individuais. O plasmídeo é eletroporado imediatamente após cada injeção. Após a recuperação da barragem, as placentas e embriões podem continuar o desenvolvimento até a avaliação em um momento posterior. A avaliação da placenta e da prole após o uso dessa técnica pode determinar o papel da função placentária tempo-específica no desenvolvimento. Esse tipo de manipulação permitirá uma melhor compreensão de como a genética e a função placentárias afetam o crescimento e o desenvolvimento fetal em múltiplos contextos patológicos.

Introduction

A placenta é um órgão essencial envolvido no desenvolvimento do feto. O principal papel da placenta é fornecer fatores essenciais e regular a transferência de nutrientes e resíduos de e para o feto. As placentas de mamíferos são compostas por tecido fetal e materno, que compõem a interface feto-materna e, portanto, a genética da função de impacto materno-fetal1. Anomalias genéticas ou função prejudicada da placenta podem alterar drasticamente o desenvolvimento fetal. Trabalhos anteriores mostraram que a genética e o desenvolvimento placentário estão associados ao desenvolvimento alterado de sistemas orgânicos específicos no feto. Particularmente, anormalidades na placenta estão ligadas a alterações no cérebro, coração e sistema vascular fetal2,3,4,5.

O transporte de hormônios, fatores de crescimento e outras moléculas da placenta para o feto desempenha um papel importante no desenvolvimento fetal6. Tem sido demonstrado que alterar a produção placentária de moléculas específicas pode alterar o neurodesenvolvimento. A inflamação materna pode aumentar a produção de serotonina por alterar a expressão gênica metabólica do triptofano (TRP) na placenta, o que, posteriormente, cria um acúmulo de serotonina no cérebro fetal7. Outros estudos encontraram anormalidades placentárias ao lado de defeitos cardíacos. Acredita-se que anormalidades na placenta contribuam para defeitos cardíacos congênitos, o defeito congênito mais comum em humanos8. Um estudo recente identificou vários genes que têm vias celulares semelhantes na placenta e no coração. Se rompidas, essas vias podem causar defeitos em ambos os órgãos9. Os defeitos na placenta podem exacerbar defeitos cardíacos congênitos. O papel da genética e função placentária no desenvolvimento de sistemas de órgãos fetais específicos é um campo de estudo emergente.

Camundongos possuem placentas hemocoriais e outras características das placentas humanas, o que os torna modelos altamente úteis para o estudo de doenças humanas1. Apesar da importância da placenta, atualmente há uma falta de manipulações genéticas direcionadas in vivo. Além disso, atualmente há mais opções disponíveis para knockouts ou knockdowns do que manipulações de superexpressão ou ganho de função na placenta10. Existem várias linhas transgênicas de Cre-expressando para manipulação placentária-específica, cada uma em diferentes linhagens de trofoblastos em diferentes pontos de tempo. Estes incluem Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER, e Gcm1-Cre 11,12,13,14. Embora esses transgenes Cre sejam eficientes, eles podem não ser capazes de manipular alguns genes em pontos de tempo específicos. Outro método comumente utilizado para nocautear ou superexpressar a expressão gênica placentária é a inserção de vetores lentivirais em cultura de blastocisto, o que causa uma manipulação genética trofoblasto-específica15,16. Esta técnica permite uma mudança robusta na expressão gênica placentária no início do desenvolvimento. O uso de RNA de interferência in vivo tem sido pouco utilizado na placenta. A inserção de plasmídeos de shRNA pode ser realizada de forma semelhante à técnica CRIPSR descrita neste trabalho. Isso foi feito no E13.5 para diminuir com sucesso a expressão de PlGF na placenta, com impactos na vasculatura cerebral da prole17.

Além das técnicas que são usadas principalmente para knockout ou knockdown, a indução da superexpressão é comumente realizada com adenovírus ou a inserção de uma proteína exógena. As técnicas utilizadas para superexpressão têm taxas variáveis de sucesso e têm sido realizadas, na maioria das vezes, mais tardiamente na gestação. Para investigar o papel do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) na função placentária, uma transferência gênica placentária mediada por adenovírus foi realizada para induzir a superexpressão do gene IGF-1 18,19. Isso foi realizado no final da gestação de camundongos com E18.5 por injeção direta na placenta. Para fornecer opções adicionais e contornar possíveis falhas de manipulações genéticas placentárias estabelecidas, como falhas na combinação Cre-Lox, a possível toxicidade de adenovírus e os efeitos fora do alvo do shRNA, a manipulação direta in vivo de CRISPR da placenta pode ser usada20,21,22. Este modelo foi desenvolvido para resolver a falta de modelos de superexpressão e para criar um modelo com flexibilidade.

Essa técnica é baseada no trabalho de Lecuyer e cols., no qual plasmídeos shRNA e CRISPR foram direcionados diretamente in vivo para placentas de camundongos para alterar a expressão de PlGF 17. Esta técnica pode ser usada para alterar diretamente a expressão gênica placentária usando a manipulação de CRISPR em vários pontos de tempo; para este trabalho, foi selecionado o E12.5. A placenta já amadureceu a esse ponto e é grande o suficiente para manipular, permitindo a inserção de um plasmídeo CRISPR específico no E12.5, o que pode ter um impacto significativo no desenvolvimento fetal a partir de meados da gestação23,24. Ao contrário das abordagens transgênicas, mas semelhantes às induções virais ou interferência de RNA, esta técnica permite a superexpressão ou knockout em pontos de tempo específicos usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada, evitando assim possível placentação prejudicada ou letalidade embrionária de alterações anteriores. Como apenas algumas placentas recebem o plasmídeo experimental ou de controle dentro de uma ninhada, a abordagem permite dois tipos de controles internos. Esses controles são aqueles injetados e eletroporados com o plasmídeo de controle apropriado e aqueles que não recebem manipulação direta. Esta técnica foi otimizada para criar uma superexpressão do gene IGF-1 na placenta de camundongos através de um plasmídeo CRISPR mediador de ativação sinérgica (SAM). O gene IGF-1 foi escolhido, pois o IGF-1 é um hormônio de crescimento essencial entregue ao feto que é primariamente produzido na placenta antes do nascimento25,26. Esta nova técnica CRISPR direcionada à placenta permitirá a manipulação direta para ajudar a definir a conexão entre a função placentária e o desenvolvimento fetal.

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Protocol

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as regulamentações federais e a política da Universidade de Iowa e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.

1. Animais e criação

  1. Manter os animais em um ciclo diurno de 12 h com ração e água ad libitum.
  2. Use camundongos fêmeas CD-1 com idade entre 8-15 semanas. Utilizar a presença de um tampão copulatório para identificar o E0.5.
  3. Na E0.5, abrigar isoladamente as represas prenhes.

2. Calibração da micropipeta

NOTA: A calibração da micropipeta deve ser realizada antes da cirurgia, quando possível.

  1. Antes de fazer e calibrar a micropipeta, diluir todos os plasmídeos até a concentração recomendada (0,1 μg/μL) em água livre de DNase. Misturar o plasmídeo com o corante Fast Green adequadamente diluído (1 μg/μL em PBS) (concentração final do plasmídeo: 0,06 μg/μL).
  2. Puxe as micropipetas usando capilares de vidro de 10 cm com diâmetro externo de 1,5 mm e diâmetro interno de 0,86 mm com um puxador de micropipetas.
  3. Quebre cuidadosamente a ponta de uma micropipeta (2-3 mm) com pinças estéreis.
  4. Coloque a micropipeta em uma ponta microcapilar conectada a um microinjetor. Verifique se o microinjetor está conectado à máquina de microinjeção e se há níveis suficientes de nitrogênio para calibrar a micropipeta.
  5. Uma vez que a micropipeta esteja conectada ao microinjetor, carregue-a com a solução de corante Fast Green para realizar a calibração (1 μg/μL em PBS). Calibrar a micropipeta para injetar um volume de aproximadamente 3,5 μL. Esvaziar ("limpar") a micropipeta em preparação para carregar as soluções de plasmídeo conforme abaixo.
    NOTA: Cada micropipeta será ligeiramente diferente. Para evitar danificar a placenta durante a injeção, o tempo de injeção deve ser definido entre 0,5-1,5 s. A pressão deve ser ajustada entre 1-8,5 psi. Calibrar cada micropipeta separadamente; Se a micropipeta não puder ser calibrada dentro desses parâmetros, ela não deve ser usada.

3. Cirurgia (Figura 1A)

OBS: Para o preparo, limpe as superfícies das áreas de preparo e cirúrgicas com etanol 70%. Coloque uma almofada absorvente na área de preparação. Na área da cirurgia, coloque uma almofada de aquecimento para baixo e, em seguida, coloque uma almofada absorvente em cima desta. Esterilizar todas as ferramentas antes da cirurgia. O tempo que a barragem está sob anestesia deve ser inferior a 1 h.

  1. Anesthetization
    1. Administrar 5 mg/kg de AINE (meloxicam) ou outro analgésico aprovado à mãe gestante 30 min a 1 h antes da cirurgia.
    2. Coloque a barragem gestante em uma câmara de indução acoplada a um vaporizador de isoflurano.
    3. Ajuste o vaporizador para isoflurano a 4% e oxigênio a 3,5 L/min.
    4. Uma vez confirmada a anestesia pela falta de resposta a uma pinça do dedo do pé e uma taxa respiratória reduzida, remova a barragem da câmara de indução para a área de preparação.
  2. Preparo cirúrgico
    1. Na área de preparação, coloque a barragem em decúbito dorsal com um cone nasal.
    2. Reduzir o vaporizador para 2% de isoflurano e 3,5 L/min de oxigênio enquanto a barragem estiver no cone nasal.
    3. Faça a barba bem no abdômen da barragem e remova o excesso de pelos. Revestimento alternado do abdome raspado com solução de povidona e etanol 70% três vezes com aplicadores estéreis com ponta de algodão. Aplicar camada final de solução de povidona. Para evitar o ressecamento da córnea, colocar gel de lágrima artificial sobre os dois olhos da barragem (Figura 2A, B).
    4. Após o preparo, mova a barragem com o cone nasal para a área de cirurgia designada.
  3. Laparotomia uterina
    OBS: Utilizar luvas estéreis durante todo o procedimento cirúrgico. Troque as luvas se alguma superfície não estéril for contatada.
    1. Na área da cirurgia, coloque a barragem em decúbito dorsal e fixe o cone nasal no lugar com fita adesiva. Ajuste a almofada de aquecimento por baixo da almofada absorvente para 45 °C.
    2. Usando pinça e tesoura, faça uma incisão mediana de aproximadamente 2 cm através da pele. Use pinças para atendar a pele e faça uma incisão vertical na pele. Depois disso, faça outra incisão de tamanho semelhante através do peritônio para expor os cornos uterinos. Com pinças, tenda o peritônio enquanto se faz a incisão vertical (Figura 2C, D).
      NOTA: A falha em tenda adequada durante a incisão do peritônio pode levar a uma incisão fatal dos intestinos.
    3. Massageie suavemente os cornos uterinos através da incisão, pressionando os lados do abdômen. Faça isso guiando cuidadosamente o útero sem ferramentas, usando apenas os dedos para evitar lesões acidentais. Coloque o útero exposto em cima de um pano cirúrgico estéril cobrindo o abdome da barragem e mantenha-o úmido durante toda a cirurgia com gotas de soro fisiológico estéril, que pode ser aquecido a 30 °C antes do uso, conforme necessário (Figura 2E, F).
      NOTA: Os cornos uterinos podem ser identificados conforme descrito em Wang et al.27.
    4. Uma vez que o útero está exposto, selecione três pares de placentas para manipulação.
      NOTA: As placentas podem ser identificadas conforme descrito por Elmore et al.24. Para maximizar a sobrevivência dos embriões, não mais do que 6 placentas devem ser tratadas. Se houver menos de 12 embriões presentes, não mais do que 4 placentas devem ser injetadas. Selecionar duas placentas adjacentes para que uma receba uma injeção controle e a outra receba o plasmídeo experimental. O uso de duas placentas adjacentes permite uma melhor comparação de placentas em localizações semelhantes no útero e também possibilita um aumento da taxa de sobrevida. Os pares placentários selecionados são escolhidos aleatoriamente e espaçados ao longo de ambos os cornos uterinos (Figura 1B).
    5. Registrar a localização das manipulações placentárias e a organização dos embriões dentro dos cornos uterinos para que os embriões e placentas possam ser identificados durante a coleta, pois uma mãe carregará placentas/embriões controlados e tratados experimentalmente.
  4. Injeção placentária e eletroporação do plasmídeo controle
    OBS: Para manter uma técnica asséptica, esterilizar as pás de eletroporação e o microinjetor com um esterilizante a frio antes do uso. Troque as luvas se alguma superfície não estéril for contatada.
    1. Usando a micropipeta calibrada, carregar uma quantidade suficiente do plasmídeo de controle apropriado para três injeções. Realizar todas as injeções a uma profundidade de ~0,5 mm lateralmente na placenta entre a decídua (branca) e a zona juncional (vermelho escuro) (Figura 3A-F).
    2. Realizar injeções nas três placentas de controle.
      NOTA: Realizar todas as injeções de plasmídios de controle antes das injeções experimentais para evitar a contaminação cruzada dos plasmídeos com a micropipeta. Isso permitirá que a mesma micropipeta seja usada, pois a troca de micropipetas e o tempo de calibração aumentam drasticamente o tempo de cirurgia e diminuem a sobrevivência da barragem.
    3. Realizar eletroporação das placentas de controle injetadas por plasmídeos dentro de 2 min após a injeção.
    4. Para a eletroporação, use um par de pás de 3 mm acopladas a uma máquina de eletroporação. Para garantir a eficiência da incorporação CRISPR e a viabilidade dos embriões, use as seguintes configurações de eletroporação: 2 pulsos, 30 V, pulso de 30 ms, pulso de 970 ms desligado, unipolar.
    5. Após a injeção, mas imediatamente antes da eletroporação, cubra os locais de contato com soro fisiológico estéril, aplicando o soro fisiológico precisamente nos três locais da parede uterina e nas pás com um conta-gotas ou seringa.
    6. Pressione suavemente as pás de eletroporação nas laterais da placenta. Coloque a pá do ânodo sobre o local de injeção e o cátodo diretamente oposto (Figura 4A-C).
    7. Pressione o pulso na máquina de eletroporação e aguarde a conclusão dos dois pulsos antes de remover as pás de eletroporação.
      NOTA: Uma pequena quantidade de espuma branca é frequentemente vista entre as pás e a placenta durante os pulsos. Se isso não ocorrer, verifique a tensão das pás com um voltímetro antes de usar novamente. Se a leitura no voltímetro não corresponder à configuração de tensão de eletroporação, as pás não funcionarão.
  5. Injeção placentária e eletroporação do plasmídeo experimental
    1. Siga as mesmas instruções da etapa 3.4.1. para a etapa 3.4.2. usando o plasmídeo experimental em vez do plasmídeo controle.
    2. Realizar a eletroporação das três placentas experimentais injetadas dentro de 2 min após a injeção. Isso deve ser realizado da mesma maneira que para aqueles injetados com os plasmídeos de controle. Siga o passo 3.4.4. para a etapa 3.4.7.
  6. Conclusão da cirurgia
    1. Uma vez concluída a manipulação placentária, massageie suavemente os cornos uterinos de volta para dentro da cavidade abdominal usando apenas os dedos (Figura 5A).
    2. Primeiro, realizar suturas simples com dois nós na camada de peritônio usando suturas solúveis revestidas e trançadas com 45 cm de comprimento e uma liga de agulha 3/8c de 13 mm. Espaçar as suturas a 2-3 mm de distância (Figura 5B).
    3. Após sutura da camada peritoneal, sutura da pele com pontos solúveis. Nó triplo, as suturas únicas com 2-3 mm de distância para garantir que a barragem não possa desfazer a sutura (Figura 5C).
    4. Concluída a sutura, fixa-se o isoflurano a 1% e o oxigênio a 3,5 L/min, aplicando-se adesivo tecidual nas suturas sobre a pele (Figura 5D).
      NOTA: O adesivo tecidual é opcional, mas recomendado para evitar a reabertura da incisão devido à mastigação da barragem.
    5. Quando o adesivo de tecido tiver secado, desligue o vaporizador e remova a barragem da área da cirurgia. Coloque a barragem em uma gaiola de apoio nas costas.

4. Cuidados e acompanhamento pós-cirúrgico

  1. Permita que a mãe grávida se recupere em uma gaiola limpa sob supervisão por um mínimo de 30 minutos para garantir que não haja complicações imediatas da cirurgia. Observe até que esteja totalmente deambulado e possa virar para os pés sem assistência. Abriga isoladamente a barragem pós-cirurgia.
  2. Acompanhar os cuidados institucionais pós-operatórios e acompanhamento até a coleta do embrião. Registre o peso da barragem e monitore diariamente as suturas e o local da incisão.

5. E14.5 coleção placentária

  1. No E14.5, anestesiar profundamente a barragem com um coquetel de ketamina/xilazina (1 mg/mL de quetamina e 0,1 mg/mL de xilazina) e, em seguida, deslocar cervicamente a barragem.
  2. Faça uma incisão em forma de V no abdômen da barragem com tesoura e remova o útero. Coloque imediatamente em uma placa de Petri de 5 cm sobre gelo. Usando fórceps, remova cuidadosamente o embrião e a placenta correspondente do útero.
    NOTA: Manter um registro da localização do embrião e placenta correspondente nos cornos uterinos para determinar qual recebeu a manipulação direta durante a cirurgia.
  3. Registre os pesos placentários. Usando pinças e lâminas de barbear sem RNAse, corte a placenta ao meio na linha média. Colocar metade em 4% de PFA a 4 °C. Corte a metade restante ao meio novamente e armazene os dois quartos restantes a -80 °C em dois tubos, um com reagente de armazenamento de RNA.
    NOTA: Embriões e outros tecidos maternos podem ser armazenados da coleção a -80 °C para uso futuro.

6. Análise da expressão gênica placentária

  1. Use o quarto da placenta armazenado a -80 °C no reagente de armazenamento de RNA.
  2. Processar as placentas para qPCR como descrito em Elser e col. usando o método Trizol para isolamento de RNA, um espectrofotômetro para concentração de RNA, um kit de síntese de cDNA e qPCR com SYBR Green Master Mix28. No lugar do kit Turbo DNAfree referenciado em Elser et al., utilizar um kit de limpeza de RNA após o isolamento do RNA Trizol para garantir que as amostras não contenham contaminantes28.
    NOTA: Leia a ficha de dados de segurança do material (FISPQ) para Trizol e use-a em um exaustor de fumaça química.
  3. Avaliar a inserção plasmidial do plasmídeo controle com primers de GFP e do plasmídeo experimental com primers BLAST (primers listados na Tabela Suplementar 1). Use o valor de CT para determinar a presença do plasmídeo.
    NOTA: Valores de TC acima de 35 são falsos positivos, e apenas aqueles abaixo de 35 devem ser considerados um indicador positivo de que o plasmídeo foi inserido com sucesso.
  4. Avaliar a expressão placentária de IGF-1 normalizada para o gene housekeeping 18s (primers listados na Tabela Suplementar 1). Use o método ddCT para calcular a mudança de dobra e, em seguida, calcular a mudança de dobra normalizada das amostras experimentais para a mudança média de dobra das amostras controle.

7. Análise do nível de proteína placentária

  1. Use o quarto da placenta que foi armazenada a -80 °C. Homogeneizar o tecido em uma solução tampão à frente de 11,5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl 2 e 10 mM inibidor de protease em diH2 O com pH final de 7,4. Use um homogeneizador portátil e pilão para quebrar o tecido.
    NOTA: A amostra não deve exceder 10% do volume do buffer.
  2. Diluir as amostras homogeneizadas no tampão a 1:12, de modo a que estejam dentro do intervalo detectável de um kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA). Realizar o ensaio de BCA de acordo com as instruções do fabricante e quantificar a proteína total usando um leitor de placas.
  3. Após a realização do ensaio de BCA, normalizar todas as amostras para a mesma concentração de proteína total de 2 mg/mL para o ELISA de IGF-1, como feito em Gumusoglu et al.29.
  4. Realizar o ELISA de IGF-1 de acordo com as instruções do fabricante e quantificar os níveis de proteína IGF-1 com um leitor de placas usando uma curva de concentração padrão.

8. Verificação espacial do CRIPSR usando marcação fluorescente em hibridização in situ

  1. Depois que as metades placentárias tiverem sido adequadamente fixadas em PFA a 4% a 4 °C por 1-3 dias, mova-as para sacarose a 20% a 4 °C antes de congelá-las em composto de temperatura de corte ótima (OCT).
  2. Seccione serialmente as metades da placenta emblocadas em OCT em um criostato de -20 °C em seções de 10 μm e coloque-as em lâminas para serem marcadas. Seccione a placenta pela metade, de modo que todas as três sub-regiões sejam visíveis. Conservar as lâminas a -80 °C até à utilização para hibridização in situ .
  3. Realizar marcação por hibridação in situ fluorescente (FISH) seguindo os protocolos do fabricante. Hibridizar uma lâmina com uma sonda dCas9-3xNLS-VP64 e uma segunda lâmina "irmã" da mesma placenta com uma sonda Prl8a8.
    NOTA: A sonda dCas9-3xNLS-VP64 detecta a presença do plasmídeo de superexpressão. A sonda Prl8a8 destaca espongiotrofoblastos da zona juncional, o que permite identificar as sub-regiões da placenta. Essas duas sondas são marcadas em lâminas "irmãs" separadas para evitar a interferência da fluorescência multicanal com a autofluorescência verde nas placentas.
  4. Rotule ambas as sondas com o corante de detecção (Opal 620). Depois de completar o protocolo do fabricante para FISH, aplique o meio de montagem DAPI e coloque uma tampa na lâmina. Sele a lamínula com esmalte transparente.
  5. Obtenha imagens das lâminas em um microscópio de fluorescência composto vertical e processe-as usando um software de processamento de imagem apropriado. Aqui, foi utilizado o software CellSens.

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Representative Results

Resultados gerais do procedimento (Figura 6)
No estudo, houve três grupos manipulados. Estes incluíram placentas injetadas com um plasmídeo de controle geral CRISPR Cas9 (Cas9 Control), um plasmídeo CRISPR de controle de ativação (Act Control), ou um plasmídeo de ativação de IGF-1 SAM (Igf1-OE). O Cas9 Control é mais adequado para plasmídeos knockout, e o controle de ativação é mais adequado para plasmídeos de superexpressão/ativação. Para avaliar as alterações de viabilidade causadas pela manipulação das placentas por injeção e eletroporação, a sobrevivência do embrião dentro da ninhada foi analisada no E14.5 (Figura 6A). Este momento foi selecionado porque outros estudos que realizaram a inserção in vivo de plasmídeos CRISPR usando eletroporação mostraram que mudanças de expressão podem ser alcançadas dentro de 8-22 h30,31,32. A coleta no E14.5 permite que o plasmídeo CRISPR aproximadamente 48 h integre e ative um aumento na expressão gênica. Verificou-se que a manipulação cirúrgica da barragem impactou a sobrevivência de todos os embriões, mas os embriões associados às placentas manipuladas que foram submetidas à injeção e eletroporação tiveram sobrevida significativamente reduzida. A taxa de sobrevivência dos embriões não tratados (na mesma ninhada, mas não submetidos à manipulação direcionada) foi reduzida de 100% de sobrevivência para uma média de 79,05%. Houve diminuição significativa na sobrevivência dos embriões manipulados, com taxa média de sobrevivência de 55,56%. Não houve diferença significativa entre os três grupos manipulados.

Para determinar se ocorreram alterações macroscópicas significativas nas placentas manipuladas, o peso placentário foi registrado. Não houve diferença significativa no peso placentário de nenhum grupo (Figura 6B), e a aparência macroscópica da placenta e do embrião permaneceu inalterada. Imagens representativas pós-necroscopia foram obtidas em microscópio de dissecção na coleta no E14.5. Foram obtidas imagens das placentas/embriões de diferentes grupos de tratamento, todos dentro da mesma ninhada. Não houve dano perceptível ou alteração na aparência fenotípica em nenhum grupo de tratamento, seja na bolsa amniótica ou no embrião exposto e sua placenta correspondente (Figura 6D-I). Embora nenhuma diferença macroscópica tenha sido observada na morfologia dos grupos manipulados com o uso de um plasmídeo de ativação de IGF-1, isso pode não ser verdade para outros plasmídeos experimentais visando outros genes que podem afetar mais substancialmente os reguladores essenciais de crescimento e função da placenta ou embrião. Não foram encontradas diferenças em nenhuma medida entre as placentas Cas9 Control e Act Control. Portanto, esses dois grupos foram combinados e denominados Con ou Controles para todas as análises. Esses resultados demonstram que a manipulação de placentas in utero em E12.5 por essa técnica causa diminuição da sobrevivência embrionária, mas ainda há viabilidade significativa. Os resultados também demonstram que o crescimento placentário não é significativamente afetado, pois não houve mudança significativa de peso entre as placentas manipuladas e não tratadas. Isso demonstra que a técnica proposta pode permitir a sobrevivência de placentas saudáveis e viáveis manipuladas com CRISPR e seus embriões correspondentes.

A mudança de peso da mãe foi registrada a cada dia pós-operatório antes da coleta de embriões no E14.5 (Figura 6C). A cirurgia ocorreu no E12.5, portanto, todas as alterações de peso da mãe são listadas em relação ao peso no E12.5. As fêmeas experimentais (Exp) foram submetidas à manipulação placentária, enquanto as fêmeas sham foram submetidas à anestesia e a uma laparotomia de duração semelhante, sem manipulação placentária. Muitas gestantes apresentaram discreta diminuição ou nenhuma alteração de peso no dia seguinte ao procedimento (E13.5); Isso provavelmente se deveu à interrupção da alimentação durante e brevemente após a cirurgia. A maioria das mães apresentou aumento de peso no E14.5, mas ocasionalmente ainda foi observada diminuição no peso. O rastreamento do peso materno pós-operatório permitiu o monitoramento da sobrevivência embrionária. A variação entre o peso das fêmeas gestantes no pós-operatório foi comum e não indicou que todos os embriões tratados foram perdidos. Não houve diferenças significativas nas mudanças de peso pós-cirurgia nas fêmeas simuladas versus experimentais. Isso demonstra que o bem-estar da mãe foi geralmente preservado após a inserção dos plasmídeos CRISPR na placenta. No geral, isso mostra que, embora essa técnica cirúrgica possa causar uma diminuição na viabilidade de embriões, ela ainda produz uma porcentagem significativa de progênie saudável que pode ser usada para o estudo.

Análise da expressão e incorporação de CRISPR em placentas E14.5 (Figura 7)
Para determinar se a inserção celular do plasmídeo de ativação do IGF-1 foi bem sucedida para superexpressar IGF-1, qPCR foi realizada. Como esperado, a qPCR mostrou um aumento significativo na expressão de IGF-1 nas placentas de IGF1-OE versus placentas de controle quando a mudança de prega foi normalizada para a expressão de 18s (teste t de Welch, p = 0,0302) (Figura 7A). Para determinar se os níveis de proteína IGF-1 estavam alterados, um ELISA foi realizado nas placentas de todos os grupos. Consistente com a qPCR, a avaliação ELISA das placentas E14.5 mostrou um aumento significativo nos níveis da proteína IGF-1 nas placentas IGF1-OE versus as placentas controle (teste t de Welch, p = 0,0469) (Figura 7B). A qPCR e o ELISA mostraram que o plasmídeo de superexpressão aumentou com sucesso a expressão gênica do gene IGF-1 e a produção da proteína IGF-1, respectivamente.

Para garantir que a entrega do plasmídeo fosse específica para as placentas manipuladas, qPCR foi realizada para o plasmídeo de ativação específico de IGF-1 e para o plasmídeo CRISPR Cas9 Control. Essas qPCRs foram realizadas tanto nas placentas manipuladas quanto nas placentas não tratadas adjacentes àquelas injetadas. Os primers de qPCR utilizados para avaliar a expressão plasmidial de ativação tiveram como alvo uma sequência do plasmídeo BLAST, que faz parte do sistema de ativação (Figura 7C). As placentas não tratadas não mostraram presença do plasmídeo BLAST (limiar do ciclo [CT] indeterminado, marcado como 40 no gráfico), e as placentas Igf1-OE mostraram uma TC em torno de 30. A qPCR realizada para avaliar a expressão plasmidial de controle teve como alvo uma sequência do gene GFP inserido (Figura 7D). As placentas não tratadas apresentaram valores de TC acima de 35, provavelmente causados por dimerização dos primers, pois esses valores estão fora da faixa de expressão esperada. Os controles apresentaram um valor de TC de aproximadamente 30. Essas qPCRs servem como um controle de qualidade para demonstrar a superexpressão esperada de IGF-1 ou a falta dela e que os plasmídeos estão presentes apenas nas placentas manipuladas esperadas.

A verificação espacial do plasmídeo de ativação do IGF-1 foi realizada por meio de cortes placentários. As placentas fixadas e congeladas em composto OCT foram seccionadas em série a 10 μm em lâminas para que todas as camadas ficassem visíveis. As lâminas foram então congeladas a −80 °C até o uso para marcação de FISH. Para verificar onde dentro da placenta o plasmídeo de ativação do IGF-1 CRISPR foi incorporado, uma sonda dCas9-3xNLS-VP64 com marcação fluorescente vermelha foi usada. Este teste tem como alvo um componente funcional do sistema de ativação. A autofluorescência verde foi utilizada para demonstrar as sub-regiões da interface materno-fetal placentária (Figura 7E,F). Não foi detectada dCas9-3xNLS-VP64 nas placentas não tratadas, pois estas não haviam sido tratadas com manipulação de CRISPR (Figura 7E). Como esperado, as placentas IGF1-OE exibiram marcação para dCas9-3xNLS-VP64, como visto em vermelho (Figura 7F). A incorporação de CRISPR foi encontrada nas três sub-regiões da placenta, com a marcação mais clara da zona juncional (Figura 7E). A intensidade de fluorescência da marcação dCas9-3xNLS-VP64 variou entre as placentas tratadas com plasmídeo, indicando que algumas expressaram o plasmídeo mais altamente do que outras, e houve variações na localização/extensão precisa da marcação, mas a marcação estava geralmente presente em todas as sub-regiões. Para confirmar a localização da marcação dCas9-3xNLS-VP64, a marcação Prl8a8 FISH direciotrofoblastos foi realizada para marcar a sub-região juncional média (Figura 7G,H). Isso foi realizado em cortes adjacentes da mesma placenta em uma lâmina "irmã" dos cortes que foram marcados para dCas9-3xNLS-VP64. Como esperado, a estrutura indicada pela marcação de Prl8a8 foi semelhante entre o IGF1-OE e placentas não tratadas. A decídua e a zona labiríntica puderam ser identificadas pela marcação dos núcleos azuis (DAPI) ao redor da zona juncional vermelha (Figura 7G,H). A marcação FISH de dCas9-3xNLS-VP64 esclareceu que o plasmídeo foi inserido em todas as três sub-regiões, e isso foi confirmado com a marcação de Prl8a8. Os resultados da marcação de FISH confirmaram que a incorporação do plasmídeo de ativação do IGF-1 foi bem sucedida, e o plasmídeo não migrou para placentas não tratadas.

Figure 1
Figura 1: Esquema do protocolo . (A) Esquema simplificado do procedimento cirúrgico. Ordem cronológica dos principais passos da técnica. (B) Esquema exibindo um exemplo de espaçamento placentário manipulado dentro dos cornos uterinos. Ambos os painéis foram criados com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Laparotomia uterina. (A-B) Durante o preparo cirúrgico, (A) o abdome raspado de uma barragem e (B) a área raspada revestida com solução de iodo. (C-F) Na área cirúrgica, (C) uma incisão de ~2 cm na pele abdominal e (D) uma incisão de ~2 cm no peritônio; Os intestinos são visíveis. (E) Manipulação dos cornos uterinos através do local da incisão. Os chifres uterinos são visíveis. (F) Cornos uterinos completamente expostos colocados em campo cirúrgico estéril. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Injeção de plasmídeos CRISPR em placentas E12.5. (A,B) Orientação dos embriões e placenta dentro dos cornos uterinos. (A) Visão oblíqua de um corno uterino marcado mostrando decídua, zonas fetais e um embrião. A linha tracejada representa onde o local de injeção deve estar. (B) Um corno uterino não rotulado do painel A. (C,D) Vista lateral da micropipeta inserida no local da injeção na placenta. D é a decídua, FZ é a zona fetal, E é o embrião e a linha tracejada representa a localização do local da injeção. (D) Imagem não rotulada da inserção da micropipeta a partir do painel C. (E,F) Vista lateral do corante na placenta pós-injeção. (E) Imagem marcada de um corno uterino exibindo uma placenta que foi injetada com um plasmídeo CRIPSR contendo um corante visível e uma placenta que não foi injetada. (F) Imagem não rotulada do corno uterino no painel E. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Eletroporação das placentas E12.5 pós-injeção de plasmídeos CRISPR. (A) Vista superior das placentas em um corno uterino. As pás de eletroporação do ânodo e do cátodo são marcadas, e a seta branca indica a localização do local de injeção. (B) Visão oblíqua da eletroporação de uma placenta. (C) Vista lateral da eletroporação de uma placenta. (D-F) Contorno simplificado dos painéis A, B e C. As pás de ânodo e cátodo são marcadas, P é a placenta, E é o embrião e a área não marcada é o útero. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Sutura da pele e peritônio abdominal . (A) Os cornos uterinos retornaram ao abdome após o término da cirurgia. Incisões abdominais na pele e no peritônio são visíveis. (B) Incisão do peritônio completamente suturada. (C) Incisão da pele abdominal completamente suturada. (D) Aplicação de adesivo tecidual nas suturas cutâneas abdominais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Resultados gerais do procedimento. (A) Taxas de sobrevivência do embrião pós-cirurgia coletado no E14.5, 2 dias pós-procedimento. Uma diminuição significativa na sobrevivência foi observada nos grupos manipulados versus os embriões não tratados (teste U de Mann-Whitney: Não tratado vs. Cas9 Controle, p = 0,0077; Controle não tratado vs. controle de atos, p = 0,0330; e Não tratado vs. IGF1-OE, p = 0,0032). Não foram observadas diferenças significativas na sobrevida dos grupos manipulados (ANOVA one-way, p = 0,9454). Cada ponto representa a porcentagem de sobrevivência de uma única ninhada (Não tratada n = 22, Cas9 Controle n = 9, Act Control n = 13 e IGF1-OE n = 22 ninhadas). (B) Peso placentário dos embriões sobreviventes em E14.5 (ANOVA one-way, p = 0,1436) (Não tratado n = 138, Cas9 Controle n = 15, Act Control n = 20 e IGF1-OE n = 36 placentas). (C) Alterações no peso das mães pós-operatórias em E13.5 e E14.5 observadas em mães submetidas a um procedimento de laparotomia simulada ou submetidas à manipulação experimental (Exp) placentária. Não houve diferença significativa entre as alterações de peso dos dois grupos de mães no pós-operatório (testes t não pareados: E13,5 p=0,5452 e E14,5 p=0,2493) (barragens Sham n=3 e barragens Exp n=10). Todas as barras de erro representam a MEV. (D-F) Imagens de embriões E14.5 pós-necroscopia na bolsa amniótica com a placenta ainda aderida. (F) A barra de escala no canto direito representa 3,75 mm. (G-I) Imagem oblíqua do embrião e vista superior da placenta correspondente. (I) A barra de escala no canto direito representa 3,75 mm. (D-I) Todos os rótulos dos grupos de tratamento estão listados abaixo das imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Análise da expressão e incorporação de CRISPR em placentas E14.5. (A) Análise por qPCR da expressão de IGF-1 em placentas controle E14.5 e IGF1-OE. Um aumento significativo na expressão de IGF-1 normalizada para 18s foi observado nas placentas de IGF1-OE (teste t de Welch, p = 0,0302) (Controle n = 15 e IGF1-OE n = 20 placentas). (B) ELISA dos níveis de proteína IGF-1 nas placentas controle E14.5 e IGF1-OE. Um aumento significativo nos níveis de IGF-1 foi observado nas placentas de IGF1-OE em comparação com os níveis de controle (teste t de Welch, p = 0,0469) (Controle n = 13 e IGF1-OE n = 15 placentas). (C) análise por qPCR da sequência BLAST do plasmídeo SAM IGF-1. A expressão de BLAST foi encontrada apenas nas placentas de IGF1-OE, e não/indeterminada expressão foi encontrada nas placentas não tratadas (Não tratada n = 4 e IGF1-OE n = 9 placentas). (D) análise por qPCR da sequência GFP do plasmídeo de controle CRISPR Cas9. A expressão do plasmídeo foi encontrada nas placentas controle, e valores de TC acima de 35/falsos positivos foram encontrados nas amostras não tratadas (Não tratado n = 4 e Controle = 5 placentas). A linha tracejada representa o limiar de falso positivo em 35 CT. Cada ponto de dados é de uma placenta. Todas as barras de erro representam a hibridização in situ por fluorescência (E-H) de seções placentárias E14.5 com 10 μm de espessura. (E) Cortes de placenta de IGF1-OE não tratados com sonda dCas9-3xNLS-VP64 marcada em vermelho. O sinal vermelho está presente apenas na placenta do IGF1-OE. O sinal verde é a autofluorescência usada para ajudar a identificar as sub-regiões placentárias. (G) Cortes de placenta de IGF1-OE não tratados e (H) com sonda Prl8a8 marcada em vermelho para identificar espongiotrofoblastos da zona juncional média. DAPI em azul mostra as zonas de decídua e labirinto que circundam essa zona juncional. (H) A barra de escala no canto direito representa 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar 1: Cartilhas utilizadas neste estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

A placenta é um regulador primário do crescimento fetal e, como observado anteriormente, alterações na expressão ou função gênica placentária podem afetar significativamente o desenvolvimento fetal6. O protocolo descrito aqui pode ser usado para realizar uma manipulação CRISPR in vivo direcionada da placenta de camundongo usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada. Esta técnica permite um rendimento significativo de embriões viáveis e suas placentas correspondentes que podem ser usados para estudos posteriores (Figura 6A,B). Esta técnica nos permitiu superexpressar com sucesso o IGF-1 placentário em E14.5 (Figura 7A,B). Os plasmídeos utilizados apresentaram especificidade, pois os plasmídeos inseridos permaneceram nas placentas manipuladas e não estavam presentes nas placentas adjacentes não tratadas (Figura 7C,D). A distribuição espacial do plasmídeo de ativação do IGF-1 foi confirmada por FISH para dCas9-3xNLS-VP64 e Prl8a8, que demonstraram que o plasmídeo de ativação estava presente nas três sub-regiões das placentas do IGF1-OE e não em nenhuma sub-região das placentas não tratadas (Figura 7E-H). Esta técnica pode ser usada para alterar a expressão gênica placentária de maneiras que podem não ser possíveis com técnicas anteriores. O uso desta técnica permitirá uma maior compreensão da influência da expressão e função gênica placentária no desenvolvimento fetal em múltiplos contextos.

Para otimizar o sucesso desse procedimento para os resultados maternos e fetais, os efeitos da mudança de múltiplos parâmetros foram explorados, incluindo os ajustes de injeção e eletroporação, bem como os materiais utilizados. Para aumentar a sobrevivência e recuperação da barragem, verificou-se que o tempo sob anestesia não deve exceder 1 h, pois períodos cirúrgicos mais longos diminuíram significativamente a sobrevida. Se o tempo sob anestesia atingir aproximadamente 2 horas, a probabilidade de sobrevida é drasticamente reduzida para níveis abaixo de 20%, provavelmente devido aos efeitos negativos do tempo prolongado de uso do isoflurano. Além do tempo sob anestesia, a complicação mais comum da cirurgia que levou à morte materna foi a falha em tendar adequadamente o peritônio durante a realização das incisões na pele e no peritônio. Se o peritônio não estiver devidamente ajeitado, os intestinos podem ser feridos, o que pode causar a morte nos dias pós-cirurgia. O tempo de exposição do útero também impacta na sobrevivência da mãe e dos embriões. O tempo médio de exposição do útero em experimentos bem-sucedidos foi de aproximadamente 15 min; Mais de 30 minutos de exposição podem levar ao aumento das reabsorções e possível doença materna. O útero exposto e quaisquer outros órgãos expostos (muitas vezes intestinos) devem ser mantidos úmidos, mas muito soro fisiológico pode resfriar o animal; ao umedecer periodicamente os órgãos expostos, menos de 1 mL de soro fisiológico estéril deve ser usado.

Os parâmetros de injeção e eletroporação tiveram grande impacto na sobrevivência do embrião. O volume de injeção não deve exceder aproximadamente 4,5 μL, pois isso resultou em reabsorções. O tempo e a pressão de injeção são importantes para maximizar a sobrevida; O tempo de injeção deve ser ajustado entre 0,5 s e 1,5 s, embora 0,8 s pareça ideal. A pressão deve ser ajustada entre 1-8,5 psi. Baixas taxas de sobrevivência embrionária foram observadas com baixos tempos de injeção e altos níveis de PSI de injeção. Observou-se também que, se a micropipeta fosse muito romba, poderia haver uma diminuição da viabilidade embrionária, e a solução também vazaria frequentemente para fora da micropipeta. O tipo de corante usado para visualizar as injeções pode afetar a sobrevida. O azul de metileno levou à morte materna quando usado para esse fim, mas uma solução filtrada de corante Fast Green não mostrou impactos negativos na saúde materna. Os ajustes de eletroporação foram otimizados a partir das configurações recomendadas pelo fabricante com base em estudos prévios de eletroporação in vivo33. A eletroporação foi a manipulação que causou mais danos e diminuiu a sobrevivência do embrião. As configurações recomendadas de eletroporação embrionária in vivo sugerem quatro pulsos para maximizar a eficiência CRISPR, mas dois pulsos são recomendados para uma maior taxa de sobrevivência33. Verificou-se que quatro pulsos causaram a reabsorção de quase todos os embriões. Dois pulsos permitiram aumentar a viabilidade, mantendo a eficiência CRISPR. O tamanho da pá de eletroporação também impactou significativamente a sobrevivência do embrião. Verificou-se que as pás de eletroporação de 5 mm levaram à reabsorção quase completa quando usadas com as configurações recomendadas. De fato, pás de eletroporação de 3 mm são recomendadas no guia do fabricante e aumentam significativamente a viabilidade embrionária33. Também é importante notar que muitas pás de eletroporação têm certa vida de pulso. Depois de terem sido usados ao máximo, observa-se uma diminuição da qualidade. Isso pode ser identificado se não houver formação de uma pequena espuma branca entre as pás e a placenta durante um pulso. A tensão da pá de eletroporação pode ser verificada usando um voltímetro para determinar se ela está produzindo a tensão esperada.

Este estudo é limitado em alguns aspectos. Esta técnica é tempo-específica e provavelmente melhor executada não antes de E10.5 e não mais tarde do que E16.5. Isso ocorre porque a placenta é muito pequena antes de E10.5, e após E16.5, o plasmídeo pode não ter tempo suficiente para produzir o efeito desejado. Este período de tempo significa que esta técnica é mais adequada para tipos específicos de estudos em ratinhos. Essa técnica é útil para o estudo do neurodesenvolvimento, uma vez que o E12.5 se enquadra em um momento crucial da neurogênese para muitas estruturas dentro do cérebro34. Essa técnica pode não ser útil para estudar os impactos placentários nos estágios iniciais do desenvolvimento, como a formação da placa neural, que ocorre em E8.535. Os resultados de um plasmídeo CRISPR nocaute não são conhecidos no momento; A aplicação deste método na redução da expressão gênica necessita de maiores investigações, uma vez que apenas a superexpressão/ativação de um gene foi demonstrada. Apesar disso, espera-se que esta técnica também seja bem sucedida para a inserção de um plasmídeo CRISPR nocaute.

Essa técnica também poderia permitir a realização de cultura primária de tecido placentário geneticamente modificado36. Dependendo do tipo de CRISPR utilizado, como CRISPRi e CRISPRa, uma cultura primária poderia ser usada para realizar um estudo de resgate37,38. Esta técnica também poderia ser usada para explorar mais a fundo as ligações entre anormalidades genéticas e funcionais placentárias e problemas na prole. Especificamente, um estudo anterior encontrou uma correlação significativa entre escores de risco genômico específico da placenta e riscos de esquizofrenia39. Este estudo identificou muitos genes placentários que podem desempenhar um papel no desenvolvimento da esquizofrenia que não foram explorados em modelos animais. Essa técnica se presta a novos estudos desse tipo e de outros.

O conhecimento adquirido com a modificação da placenta por CRISPR pode ser traduzido em uma variedade de diferentes aplicações biomédicas. Estudos que identificam como a expressão gênica específica na placenta pode afetar o desenvolvimento fetal podem ser usados para criar intervenções farmacológicas direcionadas à placenta que possam tratar essas anormalidades. Tratamentos direcionados diretamente ao feto podem ser difíceis e perigosos40,41. A placenta é um alvo mais acessível para o tratamento. No caso de problemas de desenvolvimento no coração ou cérebro que podem ser modificáveis pré-natal, a manipulação direta do coração ou do cérebro é de alto risco. Esse risco poderia ser evitado com a intervenção placentária, que é mais plausível e poderia levar a estratégias preventivas para distúrbios do neurodesenvolvimento para os quais o ambiente molecular, que é em parte fornecido pela placenta, pode ser crítico5. Essa técnica também poderia ser utilizada no tratamento de doenças como a cardiopatia congênita, que tem sido associada a distúrbios placentários9. Como a cardiopatia congênita é um defeito congênito comum, a possibilidade de um tratamento de intervenção placentária poderia ter um impacto significativo8. Como a placenta tem muitas funções, essa técnica poderia ser usada para avançar no desenvolvimento de intervenções para múltiplas doenças. Em geral, esta técnica direcionada à placenta poderia ser usada para aprofundar a compreensão da influência da genética e função placentária em múltiplas áreas do desenvolvimento fetal.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores reconhecem as seguintes fontes de financiamento: R01 MH122435, NIH T32GM008629 e NIH T32GM145441. Os autores agradecem aos laboratórios do Dr. Val Sheffield e do Dr. Calvin Carter na Universidade de Iowa pelo uso de sua sala de cirurgia e equipamentos, bem como ao Dr. Eric Van Otterloo, ao Dr. Nandakumar Narayanan, e ao Dr. Matthew Weber por sua assistência com microscopia. Os autores também agradecem à Dra. Sara Maurer, Maya Evans e Sreelekha Kundu por sua assistência com as cirurgias piloto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml Tubes USA Scientific Inc 1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS Thermo Fisher Scientific J61899.AP
96 Well plate Cornings 3598 For BCA kit
Absorbent Underpads Fisher Scientific 14-206-62
Activation Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-437275 Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0277L Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor Vetamac VAD-601TT VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel Akorn NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227 Protein quantification
Biovortexer Bellco Glass, Inc. 198050000 Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software Olympus V4.1.1 Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810 Eppendorf EP022628168 Plate centrifuge
Chloroform Thermo Fisher Scientific J67241-AP RNA isolation
Cotton Tipped Applicators ProAdvantage 77100 Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-418922 Dnase-free water provided for dilution
CryoStat Leica CM1950
Dissection Microscope Leica M125 C Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures Med Vet International J385H
Distilled Water Gibco 15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Thermo fisher Scientific 14190144 (-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0662 Generator only
Electric Razor Wahl CL9990 Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes BTX Harvard Apparatus 45-0487 3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK Grainger 21RK94 Placenta embedding cassettes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 268280010
F-Air Canisters Penn Veterinary Supply Inc BIC80120 Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF Sigma F7252-5G Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader) Fisher Scientific 14377576 Can be used for BCA and ELISA
Forceps VWR 82027-386 Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) Sutter Instrument B150-86-10 O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) Thermo Scientific 1861281 Protein homogenization buffer
Heating Pad Thermotech S766D Digitial Moist Heating Pad
Hemostats VWR 10806-188 Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath Fisher Scientific 20253 Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1) Santa Cruz Biotechnology sc-421056-ACT Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber Vetamac 941443 No specific liter size required
Isoflurane Piramal Pharma Limited NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal Fisher Scientific A451-4 RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml Akorn NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride Sigma Aldrich 63069-100ML 1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Fisher Scientific 4309849 Barcoded plates not required
Microcapillary Tip Eppendorf 5196082001 Attached to BTX Microinjector
Microinjector BTX Harvard Apparatus 45-0766 Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0751 MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97 Sutter Instrument P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker) scilogex 822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit R & D Systems MG100
Needles BD - Becton, Dickson, and Company 305106 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank Linde 7727-37-9 Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) Norbrook Laboratories Limited NDC 55529-040-10 Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone Vetamac 921609 9-14 mm
Opal 620 detection dye Akoya Biosciences SKU FP1495001KT Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound Sakura 4583
Oxygen Tank Linde 7782 - 44 - 7 Medical grade oxygen
Pestles USA Scientific Inc 14155390
Povidone-Iodine Solution, 5% Avrio Health L.P. NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4367659 Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers) New England Biolabs S1330S Use for cDNA synthesis
Razor Blade Grainger 26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator Zymo Research R1013
RNALater Thermo Fisher Scientific AM7021
RNAscope kit v.2.5 Advanced Cells Diagnostics 323100 Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 Advanced Cells Diagnostics  528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 Advanced Cells Diagnostics 527421
Roto-Therm Mini Benchmark R2020 Dry oven for in situ hybridization
Scissors VWR 82027-578 Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline) Hospra NDC 0409-4888-03 Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] Research Product International 03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical Fisher Scientific SS277 Protein homogenization buffer
Steamer Bella B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape Busse 696 Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60 Leica 3800160
Syringes BD - Becton, Dickson, and Company 309659 BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer Fisher Scientific 13-400-525 This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive 3M 1469SB VetBond
Tris HCl Thermo Fisher Scientific 15568025 1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018 RNA isolation
TSA Buffer Pack Advanced Cells Diagnostics 322810 Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit Vetamac 40200 Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope Olympus BX61VS Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI Vector Laboratories H-1200 Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block Thermo Fisher Scientific 4453536 This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color Amazon C450B
Xylazine 20mg/ml Anased 343730_RX

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Genética Placenta camundongo CRISPR fator de crescimento semelhante à insulina 1 eletroporação superexpressão desenvolvimento
Mouse <em>In Vivo</em> Placental Alvo CRISPR Manipulação
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Carver, A. J., Taylor, R. J., Stevens, H. E. Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation. J. Vis. Exp. (194), e64760, doi:10.3791/64760 (2023).

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