Summary
Hier beschrijven we een tijdspecifieke methode om kritische ontwikkelingspaden in de placenta van de muis in vivo effectief te manipuleren. Dit wordt uitgevoerd door de injectie en elektroporatie van CRISPR-plasmiden in de placenta's van zwangere moederdieren op embryonale dag 12.5.
Abstract
De placenta is een essentieel orgaan dat de ontwikkeling van zoogdieren in de baarmoeder reguleert en in stand houdt. De placenta is verantwoordelijk voor de overdracht van voedingsstoffen en afvalstoffen tussen moeder en foetus en de productie en afgifte van groeifactoren en hormonen. Placenta-genetische manipulaties bij muizen zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de specifieke rol van de placenta in de prenatale ontwikkeling. Placenta-specifieke Cre-expressing transgene muizen hebben verschillende effectiviteit, en andere methoden voor placentale genmanipulatie kunnen nuttige alternatieven zijn. Dit artikel beschrijft een techniek om placentale genexpressie direct te veranderen met behulp van CRISPR-genmanipulatie, die kan worden gebruikt om de expressie van gerichte genen te wijzigen. Met behulp van een relatief geavanceerde chirurgische aanpak ondergaan zwangere moederdieren een laparotomie op embryonale dag 12.5 (E12.5) en wordt een CRISPR-plasmide afgeleverd door een glazen micropipette in de individuele placenta's. Het plasmide wordt na elke injectie onmiddellijk geëlektropoeerd. Na damherstel kunnen de placenta's en embryo's zich verder ontwikkelen tot beoordeling op een later tijdstip. De evaluatie van de placenta en nakomelingen na het gebruik van deze techniek kan de rol van tijdspecifieke placentafunctie in de ontwikkeling bepalen. Dit type manipulatie zal een beter begrip mogelijk maken van hoe placentale genetica en functie de foetale groei en ontwikkeling in meerdere ziektecontexten beïnvloeden.
Introduction
De placenta is een essentieel orgaan dat betrokken is bij de ontwikkeling van de foetus. De belangrijkste rol van de placenta is om essentiële factoren te bieden en de overdracht van voedingsstoffen en afval van en naar de foetus te reguleren. Zoogdier placenta's zijn samengesteld uit zowel foetaal als maternaal weefsel, die de foetale-maternale interface vormen, en dus de genetica van zowel de moeder als de foetus beïnvloeden functie1. Genetische afwijkingen of verminderde functie van de placenta kunnen de foetale ontwikkeling drastisch veranderen. Eerder werk heeft aangetoond dat placentale genetica en ontwikkeling geassocieerd zijn met de veranderde ontwikkeling van specifieke orgaansystemen bij de foetus. Met name afwijkingen in de placenta zijn gekoppeld aan veranderingen in de foetale hersenen, het hart en het vasculaire systeem 2,3,4,5.
Het transport van hormonen, groeifactoren en andere moleculen van de placenta naar de foetus speelt een belangrijke rol in de foetale ontwikkeling6. Het is aangetoond dat het veranderen van de placentaproductie van specifieke moleculen de neurologische ontwikkeling kan veranderen. Maternale ontsteking kan de productie van serotonine verhogen door de metabole genexpressie van tryptofaan (TRP) in de placenta te veranderen, wat vervolgens een accumulatie van serotonine in de foetale hersenen creëert7. Andere studies hebben placenta-afwijkingen gevonden naast hartafwijkingen. Afwijkingen in de placenta worden verondersteld bij te dragen aan aangeboren hartafwijkingen, de meest voorkomende geboorteafwijking bij mensen8. Een recente studie heeft verschillende genen geïdentificeerd die vergelijkbare cellulaire routes hebben in zowel de placenta als het hart. Indien verstoord, kunnen deze paden defecten in beide organen veroorzaken9. De defecten in de placenta kunnen aangeboren hartafwijkingen verergeren. De rol van placentale genetica en functie op de ontwikkeling van specifieke foetale orgaansystemen is een opkomend vakgebied.
Muizen hebben hemochoriale placenta's en andere kenmerken van menselijke placenta's, waardoor ze zeer nuttige modellen zijn voor het bestuderen van menselijke ziekten1. Ondanks het belang van de placenta is er momenteel een gebrek aan gerichte in vivo genetische manipulaties. Bovendien zijn er momenteel meer opties beschikbaar voor knock-outs of knockdowns dan overexpressie of gain-of-function-manipulaties in de placenta10. Er zijn verschillende transgene Cre-expressing lijnen voor placenta-specifieke manipulatie, elk in verschillende trofoblastlijnen op verschillende tijdstippen. Deze omvatten Cyp19-Cre, Ada / Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER en Gcm1-Cre 11,12,13,14. Hoewel deze Cre-transgenen efficiënt zijn, zijn ze mogelijk niet in staat om sommige genen op specifieke tijdstippen te manipuleren. Een andere veelgebruikte methode om placentale genexpressie uit te schakelen of te overexpresseren is het inbrengen van lentivirale vectoren in de blastocystcultuur, die een trofoblastspecifieke genetische manipulatie veroorzaakt15,16. Deze techniek zorgt voor een robuuste verandering in de placenta-genexpressie vroeg in de ontwikkeling. Het gebruik van RNA-interferentie in vivo is schaars gebruikt in de placenta. Het inbrengen van shRNA-plasmiden kan op dezelfde manier worden uitgevoerd als de CRIPSR-techniek die in dit artikel wordt beschreven. Dit is gedaan bij E13.5 om met succes de PlGF-expressie in de placenta te verminderen, met gevolgen voor de hersenvasculatuurvan nakomelingen 17.
Naast technieken die voornamelijk worden gebruikt voor knock-out of knockdown, wordt het induceren van overexpressie vaak uitgevoerd met adenovirussen of het inbrengen van een exogene eiwit. De technieken die worden gebruikt voor overexpressie hebben verschillende succespercentages en zijn meestal later in de zwangerschap uitgevoerd. Om de rol van insuline-achtige groeifactor 1 (IGF-1) in de placentafunctie te onderzoeken, werd een adenoviraal-gemedieerde placentale genoverdracht uitgevoerd om de overexpressie van het IGF-1-gen 18,19 te induceren. Dit werd laat in de dracht van de muis uitgevoerd op E18,5 via directe placenta-injectie. Om extra opties te bieden en mogelijke mislukkingen van gevestigde placentale genetische manipulaties te omzeilen, zoals Cre-Lox-combinatiefouten, de mogelijke toxiciteit van adenovirussen en de off-target effecten van shRNA, kan in vivo directe CRISPR-manipulatie van de placenta worden gebruikt20,21,22. Dit model is ontwikkeld om het gebrek aan overexpressiemodellen aan te pakken en een model met flexibiliteit te creëren.
Deze techniek is gebaseerd op het werk van Lecuyer et al., waarin shRNA- en CRISPR-plasmiden in vivo direct op muis-placenta's werden gericht om de PlGF-expressie te veranderen17. Deze techniek kan worden gebruikt om placentale genexpressie direct te veranderen met behulp van CRISPR-manipulatie op meerdere tijdstippen; voor dit werk is gekozen voor E12.5. De placenta is op dit punt gerijpt en is groot genoeg om te manipuleren, waardoor een specifiek CRISPR-plasmide op E12.5 kan worden ingebracht, wat een aanzienlijke invloed kan hebben op de foetale ontwikkeling van midden tot laat in de zwangerschap23,24. In tegenstelling tot transgene benaderingen, maar vergelijkbaar met virale inducties of RNA-interferentie, maakt deze techniek overexpressie of knock-out op bepaalde tijdstippen mogelijk met behulp van een relatief geavanceerde chirurgische aanpak, waardoor mogelijke verminderde placentatie of embryonale letaliteit van eerdere veranderingen wordt vermeden. Omdat slechts enkele placenta's het experimentele of controleplasmide in een nest ontvangen, maakt de aanpak twee soorten interne controles mogelijk. Deze controles zijn die geïnjecteerd en geëlektropoeerd met het juiste controleplasmide en die geen directe manipulatie ontvangen. Deze techniek werd geoptimaliseerd om een overexpressie van het IGF-1-gen in de placenta van de muis te creëren via een synergetische activeringsmediator (SAM) CRISPR-plasmide. Het IGF-1-gen werd gekozen, omdat IGF-1 een essentieel groeihormoon is dat aan de foetus wordt afgegeven en dat voornamelijk vóór de geboorte in de placenta wordt geproduceerd25,26. Deze nieuwe placenta-gerichte CRISPR-techniek maakt directe manipulatie mogelijk om het verband tussen de placentafunctie en de foetale ontwikkeling te helpen definiëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met en in overeenstemming met de federale regelgeving en het beleid van de Universiteit van Iowa en werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Dieren en veehouderij
- Houd de dieren in een daglichtcyclus van 12 uur met voedsel en water ad libitum.
- Gebruik CD-1 vrouwelijke muizen in de leeftijd van 8-15 weken. Gebruik de aanwezigheid van een copulatorische plug om E0.5 te identificeren.
- Op E0.5, afzonderlijk huisvesten de zwangere moederdieren.
2. Kalibratie van de micropipette
OPMERKING: De kalibratie van de micropipette moet indien mogelijk vóór de operatie worden uitgevoerd.
- Voordat u de micropipet maakt en kalibreert, verdunt u alle plasmiden tot de aanbevolen concentratie (0,1 μg/μL) in DNasevrij water. Meng het plasmide met de juiste verdunde Fast Green-kleurstof (1 μg/μL in PBS) (uiteindelijke plasmideconcentratie: 0,06 μg/μL).
- Trek micropipettes met behulp van glazen haarvaten van 10 cm met een buitendiameter van 1,5 mm en een binnendiameter van 0,86 mm met een micropipettrekker.
- Breek de punt van een micropipette (2-3 mm) voorzichtig af met een steriele tang.
- Laad de micropipette in een microcapillaire punt die aan een micro-injector is bevestigd. Zorg ervoor dat de micro-injector is bevestigd aan de micro-injectiemachine en dat er voldoende stikstofniveaus zijn om de micropipet te kalibreren.
- Zodra de micropipette aan de micro-injector is bevestigd, laadt u deze met de Fast Green-kleurstofoplossing om de kalibratie uit te voeren (1 μg / μL in PBS). Kalibreer de micropipette om een volume van ongeveer 3,5 μl te injecteren. Leeg ("helder") de micropipette ter voorbereiding op het laden van de plasmide-oplossingen zoals hieronder.
OPMERKING: Elke micropipette zal iets anders zijn. Om beschadiging van de placenta tijdens de injectie te voorkomen, moet de injectietijd worden ingesteld tussen 0,5-1,5 s. De druk moet worden ingesteld tussen 1-8,5 psi. Kalibreer elke micropipette afzonderlijk; Als de micropipette niet binnen deze parameters kan worden gekalibreerd, mag deze niet worden gebruikt.
3. Chirurgie (figuur 1A)
OPMERKING: Om zich voor te bereiden, reinigt u de oppervlakken van zowel het preparaat als de chirurgische gebieden met 70% ethanol. Plaats een absorberende onderlaag in de bereidingsruimte. Plaats in het operatiegebied een verwarmingskussen naar beneden en plaats hier vervolgens een absorberende onderlegger op. Steriliseer alle hulpmiddelen voorafgaand aan de operatie. De tijd dat de moeder onder narcose is, moet minder dan 1 uur zijn.
- Verdoving
- Dien 5 mg/kg NSAID (meloxicam) of een ander goedgekeurd analgeticum toe aan de zwangere moeder 30 minuten tot 1 uur vóór de operatie.
- Plaats de zwangere dam in een inductiekamer die is bevestigd aan een isofluraan vaporizer.
- Stel de vaporizer in op 4% isofluraan en 3,5 L/min zuurstof.
- Zodra de verdoving is bevestigd door het gebrek aan reactie op een teenknijp en een verminderde ademhalingssnelheid, verwijdert u de dam van de inductiekamer naar het voorbereidingsgebied.
- Voorbereiding van de operatie
- Plaats in het voorbereidingsgebied de damrug met een neuskegel.
- Verlaag de vaporizer tot 2% isofluraan en 3,5 L/min zuurstof terwijl de dam in de neuskegel zit.
- Scheer de buik van de moeder grondig en verwijder overtollige vacht. Breng de geschoren buik afwisselend driemaal met povidonoplossing en 70% ethanol met steriele applicatoren met katoenpunt. Breng de laatste laag povidon-oplossing aan. Om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen, plaatst u kunstmatige traangel over beide ogen van de dam (figuur 2A, B).
- Verplaats na de voorbereiding de dam met de neuskegel naar het aangewezen operatiegebied.
- Baarmoederlaparotomie
OPMERKING: Gebruik steriele handschoenen tijdens de chirurgische ingreep. Vervang de handschoenen als er contact komt met een niet-steriel oppervlak.- Plaats in het operatiegebied de damrug en zet de neuskegel op zijn plaats met tape. Zet het verwarmingskussen onder het absorberende kussen op 45 °C.
- Maak met behulp van een tang en een schaar een incisie van ongeveer 2 cm middellijn door de huid. Gebruik een tang om de huid te tenten en maak een verticale incisie in de huid. Maak hierna nog een incisie van vergelijkbare grootte door het peritoneum om de baarmoederhoorns bloot te leggen. Gebruik een tang om het buikvlies te tenten terwijl u de verticale incisie maakt (figuur 2C, D).
OPMERKING: Het niet goed tenten tijdens het insnijden van het buikvlies kan leiden tot een fatale incisie van de darmen. - Masseer de baarmoederhoorns zachtjes door de incisie door op de zijkanten van de buik te drukken. Doe dit door de baarmoeder zorgvuldig te begeleiden zonder gereedschap, met alleen vingers om onbedoeld letsel te voorkomen. Plaats de blootgestelde baarmoeder bovenop een steriel chirurgisch gordijn dat de buik van de moeder bedekt en houd het vochtig tijdens de operatie met druppels steriele zoutoplossing, die vóór gebruik naar behoefte kunnen worden verwarmd tot 30 °C (figuur 2E, F).
OPMERKING: De baarmoederhoorns kunnen worden geïdentificeerd zoals beschreven in Wang et al.27. - Zodra de baarmoeder is blootgesteld, selecteert u drie paar placenta's voor manipulatie.
OPMERKING: De placenta's kunnen worden geïdentificeerd zoals beschreven door Elmore et al.24. Om de overleving van de embryo's te maximaliseren, mogen niet meer dan 6 placenta's worden behandeld. Als er minder dan 12 embryo's aanwezig zijn, mogen niet meer dan 4 placenta's worden geïnjecteerd. Selecteer twee aangrenzende placenta's zodat de ene een controle-injectie krijgt en de andere het experimentele plasmide. Het gebruik van twee aangrenzende placenta's zorgt voor een betere vergelijking van placenta's op vergelijkbare locaties in de baarmoeder en maakt ook een verhoogde overlevingskans mogelijk. De geselecteerde placentaparen worden willekeurig gekozen en verdeeld over beide baarmoederhoorns (figuur 1B). - Noteer de locatie van placentamanipulaties en organisatie van de embryo's in de baarmoederhoorns, zodat de embryo's en placenta's tijdens het verzamelen kunnen worden geïdentificeerd, omdat één moeder zowel controle- als experimenteel behandelde placenta's / embryo's zal dragen.
- Placenta-injectie en elektroporatie van het controleplasmide
OPMERKING: Om een aseptische techniek te behouden, steriliseert u de elektroporatiepeddels en micro-injector vóór gebruik met een koud sterilismiddel. Vervang handschoenen als er contact komt met een niet-steriel oppervlak.- Laad met behulp van de gekalibreerde micropipet een voldoende hoeveelheid van het juiste controleplasmide voor drie injecties. Voer alle injecties uit op een diepte van ~ 0,5 mm zijdelings in de placenta tussen de decidua (wit) en de junctionele zone (donkerrood) (figuur 3A-F).
- Voer injecties uit in de drie controleplacenta's.
OPMERKING: Voer alle controleplasmide-injecties uit voorafgaand aan de experimentele injecties om kruisbesmetting van de plasmiden met de micropipet te voorkomen. Hierdoor kan dezelfde micropipette worden gebruikt, omdat het veranderen van micropipetten en kalibratietijd de operatietijd drastisch verhoogt en de overleving van de moeder vermindert. - Voer elektroporatie uit van de controleplasmide-geïnjecteerde placenta's binnen 2 minuten na de injectie.
- Gebruik voor elektroporatie een paar peddels van 3 mm die aan een elektroporatiemachine zijn bevestigd. Om de efficiëntie van CRISPR-opname en de levensvatbaarheid van embryo's te garanderen, gebruikt u de volgende elektroporatie-instellingen: 2 pulsen, 30 V, 30 ms puls, 970 ms puls uit, unipolair.
- Na injectie, maar onmiddellijk voorafgaand aan elektroporatie, bedek de plaatsen van contact met steriele zoutoplossing en breng de zoutoplossing precies aan op de drie plaatsen op de baarmoederwand en de peddels met een druppelaar of spuit.
- Druk zachtjes op de elektroporatiepeddels aan de zijkanten van de placenta. Plaats de anodepeddel over de injectieplaats en de kathode recht tegenover elkaar (figuur 4A-C).
- Druk op de puls op de elektroporatiemachine en wacht tot de twee pulsen zijn voltooid voordat u de elektroporatiepeddels verwijdert.
OPMERKING: Een kleine hoeveelheid wit schuim wordt vaak gezien tussen de peddels en placenta tijdens pulsen. Als dit niet gebeurt, controleer dan de spanning van de peddels met een voltmeter voor verder gebruik. Als de aflezing op de voltmeter niet overeenkomt met de elektroporatiespanningsinstelling, zijn de peddels niet functioneel.
- Placenta-injectie en elektroporatie van het experimentele plasmide
- Volg dezelfde instructies uit stap 3.4.1. naar stap 3.4.2. met behulp van het experimentele plasmide in plaats van het controleplasmide.
- Voer elektroporatie uit van alle drie de experimentele geïnjecteerde placenta's binnen 2 minuten na de injectie. Dit moet op dezelfde manier worden uitgevoerd als voor degenen die met de controleplasmiden worden geïnjecteerd. Volg stap 3.4.4. naar stap 3.4.7.
- Voltooiing van de operatie
- Zodra de placentamanipulatie is voltooid, masseert u de baarmoederhoorns voorzichtig terug in de buikholte met alleen vingers (figuur 5A).
- Voer eerst dubbelgeknoopte enkele hechtingen uit op de peritoneumlaag met behulp van gecoate en gevlochten oplosbare hechtingen die 45 cm lang zijn met een 13 mm 3/8c naaldlegering. Plaats de hechtingen 2-3 mm uit elkaar (figuur 5B).
- Na het hechten van de peritoneumlaag, hecht u de huid met oplosbare hechtingen. Drievoudige knoop de enkele hecht 2-3 mm uit elkaar om ervoor te zorgen dat de dam de hechting niet ongedaan kan maken (figuur 5C).
- Zodra het hechten is voltooid, stelt u de isofluraan in op 1% en de zuurstof op 3,5 l/min en brengt u weefsellijm aan op de hechtingen op de huid (figuur 5D).
OPMERKING: Weefsellijm is optioneel, maar wordt aanbevolen om te voorkomen dat de incisie opnieuw wordt geopend als gevolg van damkauwen. - Wanneer de weefsellijm is opgedroogd, schakelt u de verdamper uit en verwijdert u de dam uit het operatiegebied. Plaats de dam in een ondersteunende kooi op zijn rug.
4. Postoperatieve zorg en monitoring
- Laat de zwangere moeder herstellen in een schone kooi onder toezicht gedurende minimaal 30 minuten om ervoor te zorgen dat er geen onmiddellijke complicaties van de operatie optreden. Observeer totdat het volledig ambulant is en zonder hulp op zijn voeten kan draaien. Afzonderlijk huisvesten van de dam na de operatie.
- Volg de institutionele postoperatieve zorg en monitoring tot het verzamelen van embryo's. Noteer het damgewicht en controleer dagelijks de hechtingen en de incisieplaats.
5. E14.5 placentale verzameling
- Op E14.5, verdoof de dam diep met een ketamine / xylazine cocktail (1 mg / ml ketamine en 0, 1 mg / ml xylazine), en vervolgens cervisch ontwrichten van de dam.
- Maak een V-vormige incisie in de buik van de dam met een schaar en verwijder de baarmoeder. Plaats direct op een petrischaal van 5 cm op ijs. Verwijder met een tang voorzichtig het embryo en de bijbehorende placenta uit de baarmoeder.
OPMERKING: Houd een register bij van de embryolocatie en de bijbehorende placenta in de baarmoederhoorns om te bepalen welke de directe manipulatie tijdens de operatie heeft ontvangen. - Noteer de placentagewichten. Gebruik een RNAse-vrije tang en scheermesjes om de placenta in tweeën te snijden langs de middellijn. Doe de helft in 4% PFA bij 4 °C. Snijd de resterende helft opnieuw doormidden en bewaar de resterende twee kwarten bij −80 °C in twee buisjes, waarvan één met RNA-opslagreagens.
OPMERKING: Embryo's en andere maternale weefsels kunnen uit de collectie worden bewaard bij −80 °C voor toekomstig gebruik.
6. Placenta-genexpressieanalyse
- Gebruik het kwart van de placenta dat is opgeslagen bij −80 °C in RNA-opslagreagens.
- Verwerk de placenta's voor qPCR zoals beschreven in Elser et al. met behulp van de Trizol-methode voor RNA-isolatie, een spectrofotometer voor RNA-concentratie, een cDNA-synthesekit en qPCR met SYBR Green Master Mix28. In plaats van de Turbo DNAfree-kit DNAse waarnaar wordt verwezen in Elser et al., gebruikt u een RNAcleanup-kit na de Trizol RNA-isolatie om ervoor te zorgen dat de monsters geen verontreinigingen bevatten28.
OPMERKING: Lees het veiligheidsinformatieblad (MSDS) voor Trizol en gebruik het in een chemische zuurkast. - Beoordeel de plasmide-insertie van het controleplasmide met GFP-primers en van het experimentele plasmide met BLAST-primers (primers vermeld in aanvullende tabel 1). Gebruik de CT-waarde om de aanwezigheid van het plasmide te bepalen.
OPMERKING: CT-waarden boven 35 zijn vals-positieven en alleen die onder 35 moeten worden beschouwd als een positieve indicator dat het plasmide met succes is ingebracht. - Beoordeel IGF-1 placenta-expressie genormaliseerd naar het huishoudgen 18s (primers vermeld in aanvullende tabel 1). Gebruik de ddCT-methode om de vouwverandering te berekenen en bereken vervolgens de genormaliseerde vouwverandering van de experimentele monsters naar de gemiddelde vouwverandering van de controlemonsters.
7. Analyse van het placenta-eiwitgehalte
- Gebruik het kwart van de placenta dat is bewaard bij −80 °C. Homogeniseer het weefsel in een bufferoplossing gemaakt van 11,5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl 2 en 10 mM proteaseremmer in diH2 O met een uiteindelijke pH van 7,4. Gebruik een draagbare homogenisator en stamper om het weefsel te breken.
OPMERKING: Het monster mag niet groter zijn dan 10% van het volume van de buffer. - Verdun de gehomogeniseerde monsters in de buffer op 1:12, zodat ze binnen het detecteerbare bereik van een bicinchoninic acid assay (BCA) kit liggen. Voer de BCA-test uit volgens de instructies van de fabrikant en kwantificeer het totale eiwit met behulp van een plaatlezer.
- Na het uitvoeren van de BCA-test, normaliseer alle monsters tot dezelfde totale eiwitconcentratie van 2 mg / ml voor de IGF-1 ELISA, zoals gedaan in Gumusoglu et al.29.
- Voer de IGF-1 ELISA uit volgens de instructies van de fabrikant en kwantificeer de IGF-1-eiwitniveaus met een plaatlezer met behulp van een standaardconcentratiecurve.
8. Ruimtelijke CRIPSR-verificatie met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie-etikettering
- Nadat de placentahelften gedurende 1-3 dagen op de juiste manier zijn gefixeerd in 4% PFA bij 4 °C, verplaatst u ze in 20% sucrose bij 4 °C voordat u ze invriest in een optimale snijtemperatuur (OCT) -verbinding.
- Snijd de oct-ingebedde placentahelften in een cryostaat van −20 °C serieel in secties van 10 μm en plaats ze op dia's die moeten worden geëtiketteerd. Snijd de placentahelften zodat alle drie de subregio's zichtbaar zijn. Bewaar de dia's bij −80 °C tot gebruik voor in situ hybridisatie.
- Voer fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) etikettering uit volgens de protocollen van de fabrikant. Hybridiseer één dia met een dCas9-3xNLS-VP64 sonde en een tweede "zuster" dia van dezelfde placenta met een Prl8a8 sonde.
OPMERKING: De dCas9-3xNLS-VP64 sonde detecteert de aanwezigheid van het overexpressieplasmide. De Prl8a8-sonde markeert spongiotrofoblasten van de junctionele zone, waardoor de subregio's van de placenta kunnen worden geïdentificeerd. Deze twee sondes zijn gelabeld op afzonderlijke "zuster" -dia's om interferentie van meerkanaalsfluorescentie met de groene autofluorescentie in de placenta's te voorkomen. - Label beide sondes met de detectiekleurstof (Opal 620). Nadat u het protocol van de fabrikant voor FISH hebt voltooid, brengt u DAPI-montagemedium aan en plaatst u een afdekplaat op de dia. Sluit de coverslip af met doorzichtige nagellak.
- Beeld de dia's af op een rechtopstaande samengestelde fluorescentiemicroscoop en verwerk ze met behulp van een geschikte beeldverwerkingssoftware. Hier werd de CellSens software gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Algemene procedureresultaten (figuur 6)
In de studie waren er drie gemanipuleerde groepen. Deze omvatten placenta's geïnjecteerd met een algemeen CRISPR Cas9-controleplasmide (Cas9 Control), een activeringscontrole CRISPR-plasmide (Act Control) of een IGF-1 SAM-activeringsplasmide (Igf1-OE). De Cas9 Control is beter geschikt voor knock-out plasmiden en de activatiecontrole is beter geschikt voor overexpressie/activatie plasmiden. Om de levensvatbaarheidsveranderingen te beoordelen die worden veroorzaakt door het manipuleren van de placenta's via injectie en elektroporatie, werd de overleving van embryo's in het nest geanalyseerd op E14.5 (figuur 6A). Dit tijdstip werd geselecteerd omdat andere studies die de in vivo insertie van CRISPR-plasmiden met behulp van elektroporatie hebben uitgevoerd, hebben aangetoond dat expressieveranderingen kunnen worden bereikt binnen 8-22 h30,31,32. Verzameling bij E14.5 stelt het CRISPR-plasmide ongeveer 48 uur in staat om te integreren en een toename van genexpressie te activeren. Het bleek dat chirurgische manipulatie van de moeder de overleving van alle embryo's beïnvloedde, maar de embryo's geassocieerd met de gemanipuleerde placenta's die injectie en elektroporatie ondergingen, hadden de overleving aanzienlijk verminderd. De overlevingskans van de onbehandelde embryo's (in hetzelfde nest maar zonder gerichte manipulatie) was verlaagd van 100% overleving naar een gemiddelde van 79,05%. Er was een significante afname van de overleving van de gemanipuleerde embryo's, met een gemiddelde overlevingskans van 55,56%. Er werd geen significant verschil gevonden tussen de drie gemanipuleerde groepen.
Om te bepalen of er significante grove veranderingen optraden in de gemanipuleerde placenta's, werd het placentagewicht geregistreerd. Er was geen significant verschil in het placentagewicht van een groep (figuur 6B) en het bruto uiterlijk van de placenta en het embryo was onveranderd. Representatieve postnecrosebeelden werden genomen met een dissectiemicroscoop bij de collectie op E14.5. Er zijn beelden gemaakt van de placenta's/embryo's van verschillende behandelgroepen, allemaal binnen hetzelfde nest. Er was geen merkbare schade of verandering in het fenotypische uiterlijk in behandelingsgroepen, noch in de vruchtzak, noch in het blootgestelde embryo en de bijbehorende placenta (figuur 6D-I). Hoewel er geen grote verschillen werden gezien in de morfologie van de gemanipuleerde groepen met het gebruik van een IGF-1-activeringsplasmide, is dit mogelijk niet waar voor andere experimentele plasmiden die zich richten op andere genen die een grotere invloed kunnen hebben op essentiële groei- en functieregulatoren van de placenta of het embryo. Er werden geen verschillen gevonden in enige mate tussen de Cas9 Control en Act Control placenta's. Daarom werden deze twee groepen gecombineerd en voor alle analyses Con of Controls genoemd. Deze resultaten tonen aan dat de manipulatie van placenta's in utero op E12.5 met behulp van deze techniek een afname van de overleving van het embryo veroorzaakt, maar er is nog steeds een aanzienlijke levensvatbaarheid. De resultaten tonen ook aan dat de placentagroei over het algemeen niet significant wordt beïnvloed, omdat er geen significante verandering in gewicht was tussen de gemanipuleerde en onbehandelde placenta's. Dit toont aan dat de voorgestelde techniek de overleving van gezonde en levensvatbare CRISPR-gemanipuleerde placenta's en hun bijbehorende embryo's mogelijk kan maken.
De gewichtsverandering van de moeder werd elke dag na de operatie geregistreerd voorafgaand aan de embryoverzameling op E14.5 (figuur 6C). De operatie vond plaats op E12,5, dus alle veranderingen in het moedergewicht worden vermeld ten opzichte van het gewicht op E12,5. De experimentele (Exp) moederdieren ondergingen placentamanipulatie, terwijl schijnmoeders anesthesie en een laparotomie van vergelijkbare duur ondergingen zonder placentamanipulatie. Veel drachtige moederdieren vertoonden de dag na de ingreep een lichte afname of geen gewichtsverandering (E13,5); Dit was waarschijnlijk te wijten aan verstoord eten tijdens en kort na de operatie. De meeste moederdieren vertoonden een verhoogd gewicht op E14,5, maar af en toe werd nog steeds een afname in gewicht waargenomen. Het volgen van het gewicht van de moeder na de operatie maakte het mogelijk om de overleving van het embryo te volgen. Variatie tussen het gewicht van de zwangere moederdieren na de operatie was gebruikelijk en gaf niet aan dat alle behandelde embryo's verloren waren gegaan. Er waren geen significante verschillen in gewichtsveranderingen na de operatie in de schijn- versus experimentele moederdieren. Dit toont aan dat het welzijn van de dam over het algemeen behouden bleef na het inbrengen van de CRISPR-plasmiden in de placenta. Over het algemeen toont dit aan dat hoewel deze chirurgische techniek een afname van de levensvatbaarheid van embryo's kan veroorzaken, het nog steeds een aanzienlijk percentage gezond nageslacht oplevert dat voor het onderzoek kan worden gebruikt.
Analyse van expressie en CRISPR-opname in E14.5-placenta's (figuur 7)
Om te bepalen of de cellulaire insertie van het IGF-1-activeringsplasmide succesvol was voor overexpressie van IGF-1, werd qPCR uitgevoerd. Zoals verwacht vertoonde de qPCR een significante toename in IGF-1-expressie in de IGF1-OE placenta's versus de controle placenta's wanneer de vouwverandering werd genormaliseerd tot 18s expressie (Welch's t-test, p = 0,0302) (Figuur 7A). Om te bepalen of de IGF-1-eiwitniveaus waren veranderd, werd een ELISA uitgevoerd op de placenta's van alle groepen. In overeenstemming met de qPCR toonde de ELISA-beoordeling van de E14.5-placenta's een significante toename van IGF-1-eiwitniveaus in de IGF1-OE-placenta's versus de controle-placenta's (Welch's t-test, p = 0,0469) (figuur 7B). De qPCR en ELISA toonden aan dat het overexpressieplasmide met succes respectievelijk de IGF-1-genexpressie en de IGF-1-eiwitproductie verhoogde.
Om ervoor te zorgen dat de afgifte van het plasmide specifiek was voor de gemanipuleerde placenta's, werd qPCR uitgevoerd voor het specifieke IGF-1-activeringsplasmide en CRISPR Cas9 Control-plasmide . Deze qPCR's werden uitgevoerd op zowel de gemanipuleerde placenta's als de onbehandelde placenta's die grenzen aan de geïnjecteerde placenta's. De qPCR-primers die werden gebruikt om de activeringsplasmide-expressie te beoordelen, waren gericht op een sequentie van het BLAST-plasmide, dat deel uitmaakt van het activeringssysteem (figuur 7C). De onbehandelde placenta's vertoonden geen aanwezigheid van het BLAST-plasmide (cyclusdrempel [CT] onbepaald, gelabeld als 40 op de grafiek), en de Igf1-OE-placenta's vertoonden een CT rond 30. De qPCR die werd uitgevoerd om de controleplasmide-expressie te beoordelen, was gericht op een sequentie van het ingebrachte GFP-gen (figuur 7D). De onbehandelde placenta's vertoonden CT-waarden van meer dan 35, waarschijnlijk veroorzaakt door primerdimerisatie, omdat deze waarden buiten een verwacht expressiebereik liggen. De controles toonden een CT-waarde van ongeveer 30. Deze qPCR's dienen als een kwaliteitscontrole om de verwachte overexpressie van IGF-1 of het ontbreken daarvan aan te tonen en dat de plasmiden alleen aanwezig zijn in de verwachte gemanipuleerde placenta's.
Ruimtelijke verificatie van het IGF-1-activeringsplasmide werd uitgevoerd met behulp van placentasecties. Placenta's die waren gefixeerd en bevroren in OCT-verbinding werden serieel gesneden op 10 μm op dia's, zodat alle lagen zichtbaar waren. De platen werden vervolgens ingevroren bij −80 °C tot gebruik voor FISH-etikettering. Om te controleren waar in de placenta het IGF-1 CRISPR-activeringsplasmide was opgenomen, werd een dCas9-3xNLS-VP64-sonde met rode fluorescerende etikettering gebruikt. Deze sonde richt zich op een functioneel onderdeel van het activeringssysteem. Groene autofluorescentie werd gebruikt om de subregio's van de placenta maternale-foetale interface aan te tonen (figuur 7E,F). Er werd geen dCas9-3xNLS-VP64 gedetecteerd in de onbehandelde placenta's, omdat ze niet waren behandeld met CRISPR-manipulatie (figuur 7E). Zoals verwacht vertoonden de IGF1-OE placenta's labeling voor dCas9-3xNLS-VP64, zoals te zien in het rood (figuur 7F). CRISPR-incorporatie werd gevonden in alle drie de subregio's van de placenta, met de duidelijkste labeling van de junctionele zone (figuur 7E). De fluorescentie-intensiteit van de dCas9-3xNLS-VP64-etikettering varieerde over de met plasmide behandelde placenta's, wat aangeeft dat sommige het plasmide hoger uitdrukten dan andere, en er waren variaties in de precieze locatie / omvang van de etikettering, maar etikettering was over het algemeen aanwezig in alle subregio's. Om de locatie van de dCas9-3xNLS-VP64-etikettering te bevestigen, werd Prl8a8 FISH-etikettering gericht op spongiotrofoblasten uitgevoerd om de middelste junctionele subregio te labelen (figuur 7G, H). Dit werd uitgevoerd in aangrenzende secties van dezelfde placenta op een "zuster" -dia van de secties die waren gelabeld voor dCas9-3xNLS-VP64. Zoals verwacht was de structuur die werd aangegeven door Prl8a8-etikettering vergelijkbaar tussen de IGF1-OE en onbehandelde placenta's. De decidua- en labyrintzone konden worden geïdentificeerd door de blauwe kernen (DAPI) die rond de rode junctionele zone werden gelabeld (figuur 7G, H). De FISH-etikettering van dCas9-3xNLS-VP64 verduidelijkte dat het plasmide in alle drie de subregio's werd ingebracht, en dit werd bevestigd met Prl8a8-etikettering. De resultaten van de FISH-etikettering bevestigden dat de opname van het IGF-1-activeringsplasmide succesvol was en dat het plasmide niet naar onbehandelde placenta's migreerde.
Figuur 1: Schema van het protocol . (A) Vereenvoudigd schema van de chirurgische ingreep. Chronologische volgorde van de belangrijkste stappen van de techniek. (B) Schema met een voorbeeld van gemanipuleerde placenta-afstand binnen de baarmoederhoorns. Beide panelen zijn gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Procedure voor uteriene laparotomie. (A-B) Tijdens de voorbereiding van de operatie, (A) de geschoren buik van een moeder, en (B) het geschoren gebied bedekt met jodiumoplossing. (C-F) In het operatiegebied, (C) een incisie van ~ 2 cm in de buikhuid en (D) een incisie van ~ 2 cm in het peritoneum; darmen zijn zichtbaar. (E) Het manipuleren van de baarmoederhoorns via de incisieplaats. Baarmoederhoorns zijn zichtbaar. (F) Volledig blootgestelde baarmoederhoorns geplaatst op een steriel chirurgisch gordijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Injectie van CRISPR-plasmiden in E12.5-placenta's. (A,B) Oriëntatie van de embryo's en placenta in de baarmoederhoorns. (A) Schuine weergave van een gelabelde baarmoederhoorn met decidua, foetale zones en een embryo. De stippellijn geeft aan waar de injectieplaats zich moet bevinden. (B) Een niet-gelabelde baarmoederhoorn van paneel A. (C,D) Zijaanzicht van de micropipette die in de injectieplaats in de placenta wordt ingebracht. D is de decidua, FZ is de foetale zones, E is het embryo en de stippellijn vertegenwoordigt de locatie van de injectieplaats. (D) Niet-gelabelde afbeelding van de micropipetinbrenging van paneel C. (E,F) Zijaanzicht van kleurstof in de placenta na injectie. (E) Gelabelde afbeelding van een baarmoederhoorn met een placenta die is geïnjecteerd met een CRIPSR-plasmide met een zichtbare kleurstof en een placenta die niet is geïnjecteerd. (F) Niet-gelabelde afbeelding van de baarmoederhoorn in paneel E. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Elektroporatie van E12.5 placenta's na injectie van CRISPR plasmiden. (A) Bovenaanzicht van placenta's in een baarmoederhoorn. De anode- en kathode-elektroporatiepeddels zijn gelabeld en de witte pijl geeft de locatie van de injectieplaats aan. (B) Schuine weergave van de elektroporatie van een placenta. (C) Zijaanzicht van de elektroporatie van een placenta. (D-F) Vereenvoudigde omtrek van panelen A, B en C. De anode- en kathodepeddels zijn gelabeld, P is de placenta, E is het embryo en het ongelabelde gebied is de baarmoeder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Hechting van de buikhuid en het buikvlies . (A) Baarmoederhoorns keerden terug naar de buik na voltooiing van de operatie. Abdominale huid en peritoneum incisies zijn zichtbaar. (B) Peritoneumincisie volledig gehecht. (C) Buikhuidincisie volledig gehecht. (D) Aanbrengen van weefsellijm op de hechtingen van de buikhuid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Algemene procedureresultaten. (A) Embryooverlevingspercentages na de operatie verzameld op E14.5, 2 dagen na de procedure. Een significante afname van de overleving werd waargenomen in de gemanipuleerde groepen versus de onbehandelde embryo's (Mann-Whitney U-test: Onbehandeld vs. Cas9 Controle, p = 0,0077; Onbehandeld vs. Act Control, p = 0,0330; en Onbehandeld vs. IGF1-OE, p = 0,0032). Er werden geen significante verschillen waargenomen in de overleving van de gemanipuleerde groepen (eenrichtings-ANOVA, p = 0,9454). Elk punt vertegenwoordigt het overlevingspercentage van een enkel nest (Onbehandelde n = 22, Cas9 Controle n = 9, Act Control n = 13 en IGF1-OE n = 22 nesten). (B) Placentagewicht van de overlevende embryo's op E14,5 (eenrichtingsverkeer ANOVA, p = 0,1436) (Onbehandeld n = 138, Cas9 Controle n = 15, Act Control n = 20 en IGF1-OE n = 36 placenta's). (C) Veranderingen in het moedergewicht na de operatie op E13.5 en E14.5 waargenomen bij moederdieren die een schijnlaparotomieprocedure ondergingen of experimentele (Exp) placentamanipulatie ondergingen. Er wordt geen significant verschil gezien tussen de gewichtsveranderingen van de twee groepen moederdieren na de operatie (ongepaarde t-tests: E13,5 p = 0,5452 en E14,5 p = 0,2493) (Sham-dammen n = 3 en Exp-dammen n = 10). Alle foutbalken vertegenwoordigen de SEM. (D-F) Afbeeldingen van E14.5-embryo's na necroscopie in de vruchtzak met de placenta nog steeds bevestigd. (F) De schaalbalk in de rechterbovenhoek vertegenwoordigt 3,75 mm. (G-I) Schuin beeld van het embryo en bovenaanzicht van de overeenkomstige placenta. (I) De schaalbalk in de rechterhoek vertegenwoordigt 3,75 mm. (D-I) Alle labels van de behandelingsgroep staan onder de afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Analyse van expressie en CRISPR-opname in E14.5 placenta's. (A) qPCR-analyse van IGF-1-expressie in E14.5-controle en IGF1-OE-placenta's. Een significante toename van IGF-1 expressie genormaliseerd tot 18s expressie werd waargenomen in de IGF1-OE placenta's (Welch's t-test, p = 0,0302) (Controle n = 15 en IGF1-OE n = 20 placenta's). (B) ELISA van IGF-1-eiwitniveaus in E14.5-controle en IGF1-OE-placenta's. Een significante toename van IGF-1-niveaus werd waargenomen in de IGF1-OE-placenta's in vergelijking met controleniveaus (Welch's t-test, p = 0,0469) (Controle n = 13 en IGF1-OE n = 15 placenta's.) (C) qPCR-analyse van de BLAST-sequentie uit het IGF-1 SAM-plasmide. De expressie van BLAST werd alleen gevonden in de IGF1-OE placenta's, en geen/onbepaalde expressie werd gevonden in de onbehandelde placenta's (Onbehandelde n = 4 en IGF1-OE n = 9 placenta's). (D) qPCR-analyse van de GFP-sequentie van het CRISPR Cas9-controleplasmide. Expressie van het plasmide werd gevonden in de controleplacenta's en CT-waarden van meer dan 35/fout-positieve resultaten werden gevonden in de onbehandelde monsters (onbehandelde n = 4 en controle = 5 placenta's). De stippellijn vertegenwoordigt de fout-positieve drempel bij 35 CT. Elk datapunt is van één placenta. Alle foutbalken vertegenwoordigen de SEM. (E-H) Fluorescentie in situ hybridisatie van E14.5 placentasecties bij 10 μm dikte. (E) Onbehandelde en (F) IGF1-OE placenta-secties met een dCas9-3xNLS-VP64-sonde met rood gelabeld. Het rode signaal is alleen aanwezig in de IGF1-OE placenta. Het groene signaal is autofluorescentie die wordt gebruikt om de placenta-subregio's te identificeren. (G) Onbehandelde en (H) IGF1-OE placenta-secties met een Prl8a8-sonde die in rood is gelabeld om spongiotrofoblasten van de middelste junctionele zone te identificeren. DAPI in blauw toont de decidua- en labyrintzones die die junctionele zone omringen. (H) De schaalbalk in de rechterbovenhoek vertegenwoordigt 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Primers gebruikt in dit onderzoek. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De placenta is een primaire regulator van foetale groei en zoals eerder opgemerkt, kunnen veranderingen in de expressie of functie van placenta-genen de foetale ontwikkeling aanzienlijk beïnvloeden6. Het hier beschreven protocol kan worden gebruikt om een gerichte in vivo CRISPR-manipulatie van de placenta van de muis uit te voeren met behulp van een relatief geavanceerde chirurgische aanpak. Deze techniek zorgt voor een aanzienlijke opbrengst van levensvatbare embryo's en hun bijbehorende placenta's die kunnen worden gebruikt voor verder onderzoek (figuur 6A, B). Deze techniek stelde ons in staat om met succes placenta IGF-1 te overexpresseren op E14.5 (figuur 7A, B). De gebruikte plasmiden vertoonden specificiteit, omdat de ingebrachte plasmiden in de gemanipuleerde placenta's bleven en niet aanwezig waren in de aangrenzende onbehandelde placenta's (figuur 7C,D). De ruimtelijke verdeling van het IGF-1 activatieplasmide werd bevestigd door FISH voor dCas9-3xNLS-VP64 en Prl8a8, wat aantoonde dat het activeringsplasmide aanwezig was in de drie subregio's van de IGF1-OE placenta's en niet in subregio's van de onbehandelde placenta's (figuur 7E-H). Deze techniek kan worden gebruikt om placentale genexpressie te veranderen op manieren die mogelijk niet mogelijk zijn met eerdere technieken. Het gebruik van deze techniek zal een beter begrip mogelijk maken van de invloed van placentale genexpressie en -functie op de foetale ontwikkeling in meerdere contexten.
Om het succes van deze procedure voor maternale en foetale uitkomsten te optimaliseren, werden de effecten van het veranderen van meerdere parameters onderzocht, waaronder de injectie- en elektroporatie-instellingen, evenals de gebruikte materialen. Om de overleving en het herstel van de moeder te vergroten, bleek dat de tijd onder anesthesie niet langer dan 1 uur mocht zijn, omdat langere operatieperioden de overleving aanzienlijk verminderden. Als de tijd onder anesthesie ongeveer 2 uur bereikt, is de overlevingskans dramatisch afgenomen tot niveaus onder de 20%, waarschijnlijk als gevolg van de negatieve effecten van langere tijd onder isofluraan. Afgezien van de tijd onder anesthesie, was de meest voorkomende complicatie van een operatie die leidde tot moedersterfte het niet goed tenteren van het peritoneum tijdens het maken van de huid- en peritoneumincisies. Als het buikvlies niet goed is getenteerd, kunnen de darmen gewond raken, wat de dood kan veroorzaken in de dagen na de operatie. De tijd dat de baarmoeder wordt blootgesteld, heeft ook invloed op de overleving van de moeder en embryo's. De gemiddelde tijd dat de baarmoeder werd blootgesteld in succesvolle experimenten was ongeveer 15 minuten; Meer dan 30 minuten blootstelling kan leiden tot verhoogde resorpties en mogelijke ziekte van de moeder. De blootgestelde baarmoeder en andere blootgestelde organen (vaak darmen) moeten vochtig worden gehouden, maar te veel zoutoplossing kan het dier koelen; bij het periodiek bevochtigen van de blootgestelde organen moet minder dan 1 ml steriele zoutoplossing worden gebruikt.
De parameters van de injectie en elektroporatie hadden een grote invloed op de overleving van het embryo. Het injectievolume mag niet groter zijn dan ongeveer 4,5 μl, omdat dit resulteerde in resorpties. De injectietijd en druk zijn belangrijk om de overleving te maximaliseren; De injectietijd moet worden ingesteld tussen 0,5 s en 1,5 s, hoewel 0,8 s optimaal leek. De druk moet worden ingesteld tussen 1-8,5 psi. Lage embryooverlevingspercentages werden gezien met lage injectietijden en hoge injectie-PSI-niveaus. Er werd ook waargenomen dat als de micropipette te bot was, er een afname van de embryonale levensvatbaarheid zou kunnen zijn en de oplossing zal ook vaak uit de micropipette lekken. Het type kleurstof dat wordt gebruikt om de injecties te visualiseren, kan de overleving beïnvloeden. Methyleenblauw leidde tot moedersterfte wanneer het voor dit doel werd gebruikt, maar een gefilterde Fast Green-kleurstofoplossing vertoonde geen negatieve effecten op de gezondheid van de moeder. De elektroporatie-instellingen werden geoptimaliseerd op basis van de aanbevolen fabrieksinstellingen op basis van eerdere elektroporatiestudies in vivo33. Elektroporatie bleek de manipulatie te zijn die de meeste schade veroorzaakte en de overleving van het embryo verminderde. De aanbevolen in vivo embryo-elektroporatie-instellingen suggereren vier pulsen om de CRISPR-efficiëntie te maximaliseren, maar twee pulsen worden aanbevolen voor een hogere overlevingskans33. Het bleek dat vier pulsen ervoor zorgden dat bijna alle embryo's resorbeerden. Twee pulsen zorgden voor een verhoogde levensvatbaarheid met behoud van de CRISPR-efficiëntie. De grootte van de elektroporatiepeddel had ook een aanzienlijke invloed op de overleving van het embryo. Het bleek dat 5 mm elektroporatiepeddels leidden tot bijna volledige resorptie bij gebruik met de aanbevolen instellingen. Inderdaad, 3 mm elektroporatiepeddels worden aanbevolen in de handleiding van de fabrikant en verhogen de levensvatbaarheid van het embryo aanzienlijk33. Het is ook belangrijk op te merken dat veel elektroporatiepeddels een bepaald pulsleven hebben. Nadat ze maximaal zijn gebruikt, is een afname in kwaliteit te zien. Dit kan worden geïdentificeerd als er tijdens een puls geen vorming van een klein wit schuim tussen de peddels en placenta optreedt. De elektroporatiepeddelspanning kan worden gecontroleerd met behulp van een voltmeter om te bepalen of deze de verwachte spanning produceert.
Deze studie is op een paar manieren beperkt. Deze techniek is tijdspecifiek en kan waarschijnlijk het beste niet eerder dan E10.5 en niet later dan E16.5 worden uitgevoerd. Dit komt doordat de placenta te klein is vóór E10.5 en na E16.5 heeft het plasmide mogelijk niet genoeg tijd om het gewenste effect te produceren. Dit tijdsbestek betekent dat deze techniek beter geschikt is voor specifieke soorten studies bij muizen. Deze techniek is nuttig voor het bestuderen van neurologische ontwikkeling, omdat E12.5 binnen een cruciale tijd van neurogenese valt voor veel structuren in de hersenen34. Deze techniek is mogelijk niet nuttig voor het bestuderen van placenta-effecten op de vroege stadia van ontwikkeling, zoals neurale plaatvorming, die plaatsvindt op E8.535. De resultaten van een knock-out CRISPR-plasmide zijn op dit moment niet bekend; De toepassing van deze methode op genexpressiereductie moet verder worden onderzocht, aangezien alleen de overexpressie/activering van een gen is aangetoond. Desondanks wordt verwacht dat deze techniek ook succesvol zou zijn voor het inbrengen van een knock-out CRISPR-plasmide.
Deze techniek zou ook de mogelijkheid kunnen bieden om een primaire kweek van genetisch gemodificeerd placentaweefseluit te voeren 36. Afhankelijk van het type CRISPR dat wordt gebruikt, zoals CRISPRi en CRISPRa, kan een primaire cultuur worden gebruikt om een reddingsonderzoek uit te voeren37,38. Deze techniek kan ook worden gebruikt om verbanden tussen placenta, genetische en functionele afwijkingen en problemen bij nakomelingen verder te onderzoeken. In het bijzonder vond een eerdere studie een significante correlatie tussen placentaspecifieke genomische risicoscores en schizofrenierisico's39. Deze studie identificeerde veel placentagenen die een rol kunnen spelen bij de ontwikkeling van schizofrenie die niet zijn onderzocht in diermodellen. Deze techniek leent zich voor verdere studies van dit type en andere.
De kennis die is opgedaan met CRISPR-modificatie van de placenta kan worden vertaald naar een reeks verschillende biomedische toepassingen. Studies die identificeren hoe specifieke genexpressie in de placenta de foetale ontwikkeling kan beïnvloeden, kunnen worden gebruikt om placenta-gerichte farmacologische interventies te creëren die deze afwijkingen kunnen behandelen. Behandelingen die rechtstreeks op een foetus zijn gericht, kunnen moeilijk en gevaarlijk zijn40,41. De placenta is een toegankelijker doelwit voor behandeling. In het geval van ontwikkelingsproblemen in het hart of de hersenen die prenataal kunnen worden gewijzigd, is directe hart- of hersenmanipulatie een hoog risico. Een dergelijk risico kan worden vermeden met placenta-interventie, wat plausibeler is en kan leiden tot preventieve strategieën voor neurologische ontwikkelingsstoornissen waarvoor de moleculaire omgeving, die gedeeltelijk door de placenta wordt geleverd, van cruciaal belang kan zijn5. Deze techniek kan ook worden gebruikt voor de behandeling van ziekten zoals aangeboren hartaandoeningen, die in verband zijn gebracht met placentaaandoeningen9. Aangezien aangeboren hartaandoeningen een veel voorkomende geboorteafwijking zijn, kan de mogelijkheid van een placenta-interventiebehandeling een aanzienlijke impact hebben8. Omdat de placenta veel functies heeft, kan deze techniek worden gebruikt om de ontwikkeling van interventies voor meerdere ziekten te bevorderen. Over het algemeen kan deze placenta-gerichte techniek worden gebruikt om het begrip van de invloed van placentagenetica en -functie op meerdere gebieden van foetale ontwikkeling te vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de volgende financieringsbronnen: R01 MH122435, NIH T32GM008629 en NIH T32GM145441. De auteurs bedanken Dr. Val Sheffield en Dr. Calvin Carter's laboratoria aan de Universiteit van Iowa voor het gebruik van hun operatiekamer en apparatuur, evenals Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan en Dr. Matthew Weber voor hun hulp bij microscopie. De auteurs bedanken ook Dr. Sara Maurer, Maya Evans en Sreelekha Kundu voor hun hulp bij de pilootoperaties.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 - 44 - 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/? |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24x60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD - Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
References
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
- Rosenfeld, C. S.
- Maslen, C. L.
- Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
- Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
- Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
- Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
- Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
- Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
- Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
- Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
- Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
- Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
- Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
- Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
- Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
- Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
- Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T.
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
- Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
- Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
- Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
- Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
- Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
- Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
- Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
- Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
- Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
- Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
- Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
- Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
- Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
- Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
- Smajdor, A.
- Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).
