Den nuværende protokol beskriver en effektiv metode til realtid og dynamisk erhvervelse af spændingsstyrede kalium (Kv) kanalstrømme i H9c2 kardiomyocytter ved hjælp af helcelle patch-clamp-teknikken.
Kaliumkanaler på myokardiecellemembranen spiller en vigtig rolle i reguleringen af celleelektrofysiologiske aktiviteter. At være en af de vigtigste ionkanaler, spændingsstyrede kaliumkanaler (Kv) er tæt forbundet med nogle alvorlige hjertesygdomme, såsom lægemiddelinduceret myokardieskade og myokardieinfarkt. I denne undersøgelse blev helcelle-patch-clamp-teknikken anvendt til at bestemme virkningerne af 1,5 mM 4-aminopyridin (4-AP, en bredspektret kaliumkanalhæmmer) og aconitin (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM og 200 μM) på Kv-kanalstrømmen (IKv) i H9c2-kardiomyocytter. Det blev konstateret, at 4-AP hæmmede I Kv med ca. 54%, mens den hæmmende virkning af AC på IKv viste en dosisafhængig tendens (ingen effekt for 25 μM, 30% hæmningshastighed for 50 μM, 46% hæmmende sats for 100 μM og 54% hæmmende sats for 200 μM). På grund af egenskaberne ved højere følsomhed og præcision vil denne teknik fremme udforskningen af kardiotoksicitet og de farmakologiske virkninger af etnomedicin rettet mod ionkanaler.
Ionkanaler er specielle integrerede proteiner indlejret i lipiddobbeltlaget i cellemembranen. I nærværelse af aktivatorer danner centrene for sådanne specielle integrerede proteiner meget selektive hydrofile porer, hvilket tillader ioner af en passende størrelse og ladning at passere igennem på en passiv transportmåde1. Ionkanaler er grundlaget for celle excitabilitet og bioelektricitet og spiller en nøglerolle i en række cellulære aktiviteter2. Hjertet leverer blod til andre organer gennem regelmæssige sammentrækninger som følge af en excitation-kontraktion-koblet proces initieret af handlingspotentialer3. Tidligere undersøgelser har bekræftet, at dannelsen af handlingspotentialer i kardiomyocytter er forårsaget af ændringen i intracellulær ionkoncentration, og aktivering og inaktivering af Na +, Ca2+ og K + ionkanaler i humane kardiomyocytter fører til dannelse af handlingspotentialer i en bestemt sekvens 4,5,6. Forstyrrede spændingsstyrede kaliumkanalstrømme (Kv) (IKv) kan ændre den normale hjerterytme, hvilket fører til arytmier, som er en af de førende dødsårsager. Derfor er optagelse af IKv afgørende for at forstå mekanismerne i lægemidler til behandling af livstruende arytmier7.
Kv-kanalen er en vigtig bestanddel af kaliumkanalen. Kv-kanalens koordinationsfunktion spiller en vigtig rolle i pattedyrshjertets elektriske aktivitet og myokardiekontraktilitet 8,9,10. I kardiomyocytter afhænger amplituden og varigheden af handlingspotentialer af co-ledningen af udadgående K + strømme af flere Kv-kanalundertyper11. Reguleringen af Kv-kanalfunktionen er meget vigtig for den normale repolarisering af hjertehandlingspotentialet. Selv den mindste ændring i Kv-konduktans påvirker i høj grad hjerterepolarisering og øger muligheden for arytmi12,13.
Som en grundlæggende metode i cellulær elektrofysiologisk forskning kan en tætning med høj modstand mellem et lille område af cellemembranen og en pipettespids til optagelse af helcelleplaster etableres ved at anvende et undertryk. Det kontinuerlige undertryk får cellemembranen til at komme i kontakt med pipettespidsen og klæbe fast på pipettens indre væg. Det resulterende komplette elektriske kredsløb gør det muligt at registrere en hvilken som helst enkelt ionkanalstrøm over overfladen af cellemembranen14. Denne teknik har en meget høj følsomhed for cellemembranens ionkanalstrøm og kan bruges til at detektere strømme i alle ionkanaler, og applikationerne er ekstremt brede15. Desuden har patch-clamp højere autoritet og nøjagtighed16 sammenlignet med fluorescerende mærkning og radioaktiv mærkning. På nuværende tidspunkt er helcelle-patch-clamp-teknikken blevet brugt til at detektere de traditionelle kinesiske medicinkomponenter, der virker på Kv-kanalstrømme17,18,19. For eksempel brugte Wang et al. helcelle-patch-klemme-teknikken og bekræftede, at den effektive komponent i lotusfrøet kunne opnå hæmning af Kv4.3-kanalen ved at blokere de aktiverede tilstandskanaler19. Aconitin (AC) er en af de effektive og aktive ingredienser i Aconitum arter, såsom Aconitum carmichaeli Debx og Aconitum pendul Busch. Talrige undersøgelser har vist, at overdoser af AC kan forårsage arytmier og endda hjertestop20. Samspillet mellem AC og spændingsstyrede ionkanaler fører til forstyrrelse af intracellulær ionhomeostase, som er nøglemekanismen for kardiotoksicitet21. Derfor anvendes helcelleplaster-klemme-teknikken i denne undersøgelse til at bestemme virkningerne af AC på IKv af kardiomyocytter.
Den elektrofysiologiske teknik med patch-clamp bruges hovedsageligt til at registrere og reflektere den elektriske aktivitet og funktionelle egenskaber ved ionkanaler på cellemembranen25. På nuværende tidspunkt inkluderer de vigtigste optagelsesmetoder for patch-clamp-teknikken enkeltkanalsoptagelse og helcelleoptagelse26. Til helcelletilstand bruges glasmikroelektroden og undertrykket til at danne en højmodstandsforsegling mellem et lille område af cellemembranen og e…
The authors have nothing to disclose.
Vi sætter pris på den økonomiske støtte fra National Natural Science Foundation of China (82130113) og Key F &D and Transformation Program fra Science & Technology Department of Qinghai Province (2020-SF-C33).
4-Aminopyridine | Sigma | MKCJ2184 | |
Aconitine | Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd | DSTDW000602 | |
Amplifier | Axon Instrument | MultiClamp 700B | |
Analytical Balance | Sartorius | 124S-CW | |
ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length) | Sutter Instrument | 163225-5 | |
Cell culture dish (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
Cell culture dish (35 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 3012022 | |
Clampex software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 5 | |
Clampfit software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 6. 0. 13 | data acqusition software |
D-(+)-glucose | Rhawn | RH289133 | |
Digital camera | Hamamatsu | C11440 | |
Digitizer | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco | 8121587 | |
EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 2166090RP | |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 | |
H9c2 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0111 | |
HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
HCl | Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd | 2106081 | |
HEPES | Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd | 20210221 | |
KCl | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020082501 | |
KOH | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020112601 | |
MgCl2 | Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute | 20160408 | |
MgCl2·6H2O | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2021020101 | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285A | |
Microscope | Olympus | IX73 | |
Microscope cover glass (20 × 20 mm) | Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd | 80340-0630 | |
Milli-Q | Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd | Milli-Q IQ 7005 | |
MultiClamp 700B commander | Axon Instrument | MultiClamp commander 2.0 | signal-amplifier software |
OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
PH meter | Mettler Toledo | S201K | |
Phosphate buffered saline (1x) | Gibco | 8120485 | |
Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |