Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Зависимая от напряжения регистрация тока калия на кардиомиоцитах H9c2 с помощью метода цельноклеточного пластыря-зажима

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64805
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3,4, 5, 1,3,4, 4
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Настоящий протокол описывает эффективный метод получения в режиме реального времени и динамического получения токов калиевого (Kv) канала с напряжением в кардиомиоцитах H9c2 с использованием метода зажима цельноклеточного пластыря.

Abstract

Калиевые каналы на клеточной мембране миокарда играют важную роль в регуляции электрофизиологической деятельности клеток. Будучи одним из основных ионных каналов, калиевые каналы с напряжением (Kv) тесно связаны с некоторыми серьезными заболеваниями сердца, такими как лекарственно-индуцированное повреждение миокарда и инфаркт миокарда. В настоящем исследовании был использован метод цельноклеточного пластырь-зажима для определения влияния 1,5 мМ 4-аминопиридина (4-AP, ингибитор калиевого канала широкого спектра действия) и аконитина (AC, 25 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ и 200 мкМ) на ток канала Kv (IKv) в кардиомиоцитах H9c2. Было установлено, что 4-AP ингибирует IKv примерно на 54%, в то время как ингибирующее действие AC на IKv показало дозозависимую тенденцию (отсутствие эффекта для 25 мкМ, 30% ингибирующая скорость для 50 мкМ, 46% ингибирующая скорость для 100 мкМ и 54% ингибирующая скорость для 200 мкМ). Благодаря характеристикам более высокой чувствительности и точности, этот метод будет способствовать исследованию кардиотоксичности и фармакологических эффектов этномедицины, нацеленной на ионные каналы.

Introduction

Ионные каналы представляют собой специальные интегрированные белки, встроенные в липидный бислой клеточной мембраны. В присутствии активаторов центры таких специальных интегрированных белков образуют высокоселективные гидрофильные поры, позволяющие ионам соответствующего размера и заряда проходить пассивным транспортным способом1. Ионные каналы являются основой возбудимости и биоэлектричества клеток и играют ключевую роль в различных клеточных активностях2. Сердце снабжает кровью другие органы посредством регулярных сокращений, возникающих в результате процесса возбуждения-сокращения, инициированного потенциалами действия3. Предыдущие исследования подтвердили, что генерация потенциалов действия в кардиомиоцитах обусловлена изменением внутриклеточной концентрации ионов, а активация и инактивация ионных каналов Na+, Ca2+ и K+ в кардиомиоцитах человека приводят к образованию потенциалов действия в определенной последовательности 4,5,6. Нарушенные напряжения калиевых (Kv) каналов (IKv) могут изменить нормальный сердечный ритм, что приводит к аритмиям, которые являются одной из ведущих причин смерти. Поэтому запись IKv имеет решающее значение для понимания механизмов препаратов для лечения угрожающих жизни аритмий7.

Канал Kv является важным компонентом калиевого канала. Координационная функция канала Kv играет важную роль в электрической активности и сократимости миокарда сердца млекопитающих 8,9,10. В кардиомиоцитах амплитуда и продолжительность потенциалов действия зависят от копроводности внешних токов K+ несколькими подтипамиKv-каналов 11. Регуляция функции канала Kv очень важна для нормальной реполяризации потенциала сердечного действия. Даже малейшее изменение проводимости Кв сильно влияет на реполяризацию сердца и увеличивает вероятность развития аритмиина 12,13.

Представляя собой фундаментальный метод в клеточных электрофизиологических исследованиях, высокопрочное уплотнение между небольшой площадью клеточной мембраны и наконечником пипетки для записи цельноклеточного зажима может быть установлено путем применения отрицательного давления. Непрерывное отрицательное давление заставляет клеточную мембрану соприкасаться с наконечником пипетки и прилипать к внутренней стенке пипетки. Полученная полная электрическая цепь позволяет регистрировать любой ток ионного канала через поверхность клеточной мембраны14. Этот метод имеет очень высокую чувствительность к току ионного канала клеточной мембраны и может быть использован для обнаружения токов во всех ионных каналах, а приложения чрезвычайношироки 15. Более того, по сравнению с флуоресцентной маркировкой и радиоактивной маркировкой, патч-зажим имеет более высокий авторитет и точность16. В настоящее время для обнаружения компонентов традиционной китайской медицины, действующих на токи канала Kv 17,18,19, используется метод цельноклеточного пластыря-зажима. Например, Wang et al. использовали технику зажима цельноклеточного пластыря и подтвердили, что эффективный компонент семени лотоса может достичь ингибирования канала Kv4.3 путем блокирования каналов активированного состояния19. Аконитин (AC) является одним из эффективных и активных ингредиентов видов Aconitum, таких как Aconitum carmichaeli Debx и Aconitum pendulum Busch. Многочисленные исследования показали, что передозировка АС может вызвать аритмию и даже остановку сердца20. Взаимодействие между переменным током и ионными каналами с напряжением приводит к нарушению внутриклеточного ионного гомеостаза, который является ключевым механизмом кардиотоксичности21. Поэтому в данном исследовании для определения влияния ПЕРЕМЕННОГО тока на IКв кардиомиоцитов используется методика цельноклеточных пластырей-зажимов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Коммерчески полученные кардиомиоциты крыс H9c2 (см. Таблицу материалов) инкубировали в DMEM, содержащем 10% инактивированной теплом фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина при 37 °C в 5% CO2 увлажненной атмосфере. Затем для обнаружения изменений в IKv в нормальных клетках H9c2 и 4-AP- или AC-обработанных клетках был использован метод зажима цельноклеточного пластыря (рисунок 1 и рисунок 2).

1. Приготовление раствора

  1. Готовят среду для культивирования клеток DMEM, содержащую 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин (см. Таблицу материалов).
  2. Готовят 1,5 М раствора 4-А, добавляя 14,1165 мг 4-АП к 100 мкл раствора ДМСО (см. Таблицу материалов). Разбавляют от 1,5 М4-АП до 1,5 мМ путем добавления внеклеточного раствора (этап 1,5).
  3. Готовят 400 мМ переменного тока, добавляя 5 мг переменного тока к 19,36 мкл раствора ДМСО (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все вышеуказанные растворы хранили в холодильнике с температурой 4°С, а конечная концентрация ДМСО не должна превышать 0,1% (v/v).
  4. Готовят 50 мл внутриклеточного раствора, добавляя 0,4100 г KCl (110,0 мМ), 0,0120 г MgCl2 (1,2 мМ), 0,1270 гNa2 АТФ (5,0 мМ), 0,1190 г HEPES (10,0 мМ) и 0,1900 г EGTA (10,0 мМ) в 50 мл дистиллированной воды (см. Таблицу 1 и Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значение рН внутриклеточного раствора корректировали до 7,2 с использованием 1 М КОН и аликвотировали в небольшие объемы (1,5-2 мл) и хранили при −20 °C.
  5. Готовят 50 мл внеклеточного раствора, добавляя 0,0185 г KCl (5,0 мМ), 0,3945 г NaCl (135,0 мМ), 0,0203 г MgCl2·6H2O (2,0 мМ), 0,0595 г HEPES (5,0 мМ) и 0,0990 г D-глюкозы (10,0 мМ) в 50 мл двойной дистиллированной воды (см. Таблицу 1 и Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внеклеточный раствор должен быть подготовлен к немедленному применению, а его значение рН необходимо скорректировать до 7,4 с помощью 1 М NaOH.

2. Клеточная культура

  1. Как только чашка для культивирования H9c2 станет на 80% сливающейся, переварите клетки с 0,25% трипсина в течение 30 с.
  2. Культивировать 2 х 105 клеток/мл с нормальной средой или лекарственной средой (25 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ и 200 мкМ переменного тока) в 35-мм посуде, покрытой стеклянными пластинами в течение 24 ч при 37 °C, с 5% атмосферой CO2 и относительной влажностью от 70% до 80% (см. Таблицу материалов).

3. Изготовление микропипеток

  1. Включите съемник микропипетки (см. Таблицу материалов) и разогрейте в течение 30 минут.
  2. Накладываем боросиликатный стеклянный капилляр с нитью накаливания (OD: 1,5 мм, ID: 1,10 мм, длина 10 см) на съемник микропипетки. Выберите программу, установленную на шаге 3.3, и нажмите Enter на панели управления. Нажмите на программу Ramp в правом верхнем углу, чтобы определить значение «Теплота» стеклянного капилляра.
  3. Напишите программу для вытягивания электрода согласно значению, определенному тестом «Ramp», и используйте следующие шаги: значение «Тепло» = значение «Ramp», Pull = 0, Vel = скорость перемещения тягового стержня, Time = 200-250. Нажмите на Pull , чтобы начать изготовление пипеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием обратите внимание на цвет осушителей в герметичном контейнере съемника микропипетки. Если цвет меняется с голубого на розовый, осушители необходимо заменить. Чтобы предотвратить загрязнение наконечника электрода, старайтесь не касаться средней части стеклянного капилляра во время приготовления пипетки. Впоследствии аккуратно извлеките произведенные пипетки, и поместите их в закрытую и герметичную емкость.

4. Настройка приборов

  1. Включите соответствующие приборы в следующем порядке: цифро-аналоговый преобразователь, усилитель сигнала, микроманипулятор, микроскоп, фотоаппарат (см. Таблицу материалов).
  2. Последовательно откройте приложение для обработки изображений, программное обеспечение усилителя сигнала и программное обеспечение для сбора данных (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прибор должен включаться последовательно; в противном случае после открытия программного обеспечения появится состояние "Demo Digitizer".

5. Настройка параметров IKv

  1. Отредактируйте протокол записи IKv , выполнив следующие действия.
    1. Нажмите «Редактировать» и выберите «Редактировать протокол» в программном обеспечении для сбора данных (см. Таблицу материалов).
    2. Отредактируйте программу в интерфейсе "Форма сигнала": Epoch A (Первый уровень = −60 мВ, Дельта-уровень = 0 мВ, Первая длительность = 20 мс, Дельта-длительность = 0 мс); Эпоха B (Первый уровень = −40 мВ, Дельта-уровень = 10 мВ, Первая длительность = 150 мс, Дельта-длительность = 0 мс) и Эпоха С (Первый уровень = −60 мВ, Дельта-уровень = 0 мВ, Первая длительность = 30 мс и Дельта-длительность = 0 мс).
    3. Затем нажмите на интерфейс Mode/Rate и установите данные «Иерархия пробной версии»: Задержка пробной версии = 0 с, Запуск = 1, Развертки = 11 и Длительность развертки = 0,22 с22,23.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Получение токов Iкв канала путем применения шагов деполяризации 150 мс от −40 мВ до +60 мВ с шагом 10 мВ при удерживающем потенциале −60 мВ в условиях управления. Общее время работы протокола должно быть больше, чем время, установленное в программе «Форма сигнала».
  2. Отредактируйте программу вычитания утечек P/N: нажмите «Редактировать протокол », чтобы выбрать кнопку «Стимул », и установите программу вычитания утечки в диалоговом окне « Вычитание утечки P/N »: количество подсвежей = 2-8 (4 в этом исследовании), Время успокоения = 100-1000 мс (200 в этом исследовании), «Полярность» = «Противоположно форме сигнала», уровень удержания = −80 мВ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вычитание утечки P/N должно иметь уровень удержания ниже, чем «Первое удержание» (−60 мВ).

6. Полностью клеточная патч-зажимная запись I Kv в режиме напряжения-зажима

  1. Установите путь хранения данных: нажмите «Файл» и выберите «Задать имена файлов данных» в программном обеспечении для сбора данных. Откройте установленный протокол IKv (шаг 5.1), выбрав Редактировать и щелкнув Open Protocol в программном обеспечении для сбора данных. Наконец, нажмите на опцию Инструменты и выберите Тест мембраны , чтобы начать запуск протокола.
  2. Добавьте внеклеточный раствор (стадия 1.5) в клеточную ванну на цельноклеточном зажимном аппарате (см. Таблицу материалов) и поместите крышку вверх с клетками H9c2 (культивируемыми на этапе 2.1) в ванне.
  3. Заполните 30% пипетки (изготовленной на этапе 3) внеклеточным раствором и установите ее на держатель регистрирующего электрода, интегрированный в зажимной аппарат. Затяните пипетку с помощью резиновой прокладки уплотнительного кольца и пластиковой шайбы. Затем опустите пипетку в ванну с микроманипулятором. Нажмите на интерфейс смещения Pipette программного обеспечения сигнал-усилитель (см. Таблицу материалов), чтобы поддерживать базовую линию тока IKv на уровне 0 пА.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внутриклеточный раствор (этап 1.4) должен контактировать с частью AgCl/Ag серебряной проволоки, и серебряная проволока не должна находиться близко к внутренней стенке пипетки. Сопротивление пипетки должно быть 2-6 МОм. Чтобы избежать окклюзии наконечника пипетки, непрерывное положительное давление должно подаваться на пипетку с помощью шприца объемом 1,0 мл, соединенного с держателем регистрирующего электрода через пластиковую трубку24.
  4. Подайте соответствующее положительное давление вручную с помощью шприца объемом 1,0 мл, подключенного к держателю регистрирующего электрода через пластиковую трубку. Слегка переместите пипетку, манипулируя микроманипулятором в трех измерениях, чтобы связаться с клеткой.
  5. После испытания мембраны квадратная волна падает на 1/3-1/2 после того, как пипетка коснется клеточной мембраны, удалите положительное давление и вручную подайте соответствующее отрицательное давление. Затем нажмите на интерфейс Patch программного обеспечения для сбора данных, чтобы сформировать печать GΩ. Используйте программное обеспечение усилителя сигнала «Cp Fast» и «Cp Slow» во время герметизации ячейки, чтобы компенсировать быструю и медленную емкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда мембранное испытание составляет ≥1 ГОм, между наконечником пипетки и ячейкой образуется конфигурация, прикрепленная к ячейке.
  6. Применяйте короткие импульсы отрицательного давления, чтобы разорвать участок клеточной мембраны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Резкое снижение сопротивления мембраны характеризует успешную схему регистрации целых клеток. Если сопротивление доступа (Ra) ≥30 МОм, ячейки должны быть повторно выбраны для шагов 6.3-6.6. Чтобы обеспечить точность записанных данных IKv , отрицательное давление должно быть удалено после разрыва клеточной мембраны.
  7. Выполните компенсацию емкости цельноклеточной мембраны, нажав на кнопку Whole-cell программного обеспечения усилителя сигнала. Наконец, сохраните и запишите данные, нажав на кнопку Запись данных .
  8. Откройте сохраненные данные IKv с помощью программного обеспечения для анализа данных. Сохраните отношения ток-напряжение (I−V): нажмите «Анализировать», чтобы выбрать «Статистика», чтобы сделать следующее: выберите Диапазон как Cousors 1,2 для анализа данных; нажмите кнопки Пиковая амплитуда и Среднее, а затем нажмите кнопку ОК, чтобы просмотреть данные на странице Результаты. Наконец, скопируйте столбец данных IKv mean в программное обеспечение для рисования функций (см. Таблицу материалов) для дальнейшего анализа.
  9. Сохраните репрезентативные IKv текущие трассировки : нажмите редактировать, чтобы выбрать Transfer Traces; затем выберите Полная трассировка в регионе для переноса; затем нажмите «Выбрать в выборе трассировки» и выберите IN 0 (pA) в «Сигналах»; наконец, нажмите OK , чтобы просмотреть данные на странице «Результаты», и скопируйте общие данные в программное обеспечение для рисования функций, чтобы нарисовать текущие следы.
  10. Сохраните протокол IKv : нажмите «Редактировать», чтобы выбрать «Создать сигнал сигнала стимула», и нажмите «ОК». Затем повторите шаг 6.9, за исключением выбора A0 # 0 (мА) в разделе «Сигналы».

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол позволял записывать IKv в соответствии с параметрами, заданными в технике полноклеточного патч-зажима. IKv запускался 150 мс деполяризующего импульсного стимула от −40 до +60 мВ при удерживающем потенциале −60 мВ (рисунок 3А). IKv кардиомиоцитов крыс H9c2 сначала появились около −20 мВ, а затем амплитуда увеличилась с дальнейшей деполяризацией. Среднее соотношение между IKv и мембранным потенциалом было рассчитано на основе измеренных амплитуд тока. Результаты показали, что по сравнению с контрольной группой амплитуда IKv была заметно снижена после 5-минутной обработки 1,5 мМ 4-AP (рисунок 3B). Кроме того, IKv значительно снижался при мембранных потенциалах от 10 мВ до 60 мВ дозозависимым образом после 24 ч лечения переменным током (рисунок 3C-F).

Figure 1
Рисунок 1: Оборудование и инструменты, необходимые для записи IKv. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Блок-схема электрофизиологической записи IKv в клетках H 9c2 с использованием метода цельноклеточного зажима. (A) Клеточная культура. (B) Приготовление внутриклеточных и внеклеточных растворов. (C) Схематическая иллюстрация записи всей ячейки. C1: Переместите пипетку близко к ячейке; C2: Сформировать уплотнение высокого сопротивления между пипеткой и ячейкой; C3: Разрыв клеточной мембраны. (D) Запишите IКв. D1: Принципиальная схема формирования тока K+; D2: Репрезентативные следы тока для IKv, записанные в режиме зажима напряжения цельной ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативный IKv в ячейках H9c2. (A) Репрезентативные следы тока для IKv, измеренные в клетках H9c2 без какой-либо обработки (контрольная группа), с AC-содержащими средами в течение 24 ч (25 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ и 200 мкМ) и с 1,5 мМ 4-AP в течение 5 мин. IKv запускался 150 мс деполяризующего импульса от −40 до +60 мВ при удерживающем потенциале −60 мВ. (B) Для стимуляции 1,5 мМ 4-AP IKv опускался при мембранных потенциалах от 10 мВ до 60 мВ. (С-Ф) Лечение переменным током снижало IKv концентрационно-зависимым образом при мембранных потенциалах с 10 мВ до 60 мВ. *p < 0,05 по сравнению с контрольной группой (n = 6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Внеклеточный раствор
Химикалии г/50 мл Состав (мМ)
НаКл 0.3945 135.0
ККл 0.1865 5.0
ХЕПЕС 0.5958 5.0
MgCl2·6H2O 0.2033 2.0
D-глюкоза 0.9900 10.0
Внутриклеточный раствор
Химикалии г/50 мл Состав (мМ)
ККл 0.4100 110.0
МгКл2 0.0120 1.2
На2-АТФ 0.1270 5.0
ХЕПЕС 0.1190 10.0
ЭГТА 0.1900 10.0

Таблица 1: Внутриклеточные и внеклеточные растворы для регистрации IКв в режиме напряжения-зажима.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Электрофизиологический метод патч-зажима в основном используется для регистрации и отражения электрической активности и функциональных характеристик ионных каналов на клеточной мембране25. В настоящее время основными методами записи патч-зажимной техники являются одноканальная запись и полностью клеточная запись26. Для полноэлементного режима стеклянный микроэлектрод и отрицательное давление используются для формирования высокопрочного уплотнения между небольшой областью клеточной мембраны и наконечникомпипетки 27. Как только устойчивое отрицательное давление приводит к разрыву кончика пипетки клеточной мембраны и мембрана прикрепляется к внутренней стенке пипетки, полная электрическая цепь, образованная между пипеткой и ячейкой, позволяет регистрировать плотность тока отдельных ионных каналов на поверхности клеточной мембраны26,27 . В последние годы метод цельноклеточных зажимов широко используется для исследований лекарств, нацеленных на заболевания, связанные с ионными каналами. Несмотря на высокие требования к операторам, этот метод по-прежнему остается «золотым стандартом» для исследования ионных каналов28. Кроме того, метод перфорированного пластырного зажима может также регистрировать текущие изменения в целевых ионных каналах в относительно стабильных внутриклеточных средах в течение длительного времени с использованием антибиотиков для формирования пор проницаемости в клеточной мембране29,30. Можно фиксировать и отслеживать динамические изменения напряжения или тока ионных каналов с помощью метода зажима для всего ячейки в режиме ток-зажим или напряжение-зажим, что делает это, несомненно, мощной платформой для оценки фармакологической активности или механизмов токсичности лекарств31,32.

АС является одним из основных токсичных компонентов вида Aconitum, относится к группе диэфирно-дитерпеноидных алкалоидов, и является высокотоксичным20,33. Доказательства показали, что AC может вызывать сердечно-сосудистую токсичность34,35. В качестве неселективного блокиратора каналов K+ сообщалось, что переменный ток может блокировать переходный ток K+, сверхбыстрый отсроченный ток выпрямителя K+ и быстрый отложенный выпрямитель наружу K+, вызывая аритмии 21,36,37. На сегодняшний день нет убедительных доказательств того, что зависимые от напряжения токи калия участвуют в кардиотоксичности переменного тока. Поэтому в данном исследовании ингибирующее действие AC на IKv в кардиомиоцитах H9c2 крыс изучали с использованием техники цельноклеточного пластыря-зажима. Активация каналов Na+ является широко признанным механизмом, с помощью которого АС оказывает фармакологическое или токсикологическое действие38. Интересно, что есть данные, что АС может воздействовать непосредственно на IКв 21,36,37. Однако данные, представленные в данной работе, не дают достаточных доказательств того, что ПЕРЕМЕННЫЙ ток может непосредственно ингибировать IKv. Ингибирующее действие IKv AC может быть обусловлено прямой активацией каналов Na+, что требует дальнейшего изучения.

С момента своего создания и разработки метод зажима цельноклеточного пластыря, используемый в этом исследовании, стал традиционным методом изучения кардиотоксичности лекарств с точки зрения ионных каналов. Этот эксперимент подтвердил, что переменный ток эффективно ингибировал IKv ячеек H9c2 в зависимости от концентрации в режиме напряжения-зажима. Однако каждый тип ионного канала, включая каналы K+ , содержит несколько подтипов, и в этом исследовании был зарегистрирован только общий ток канала K+ , зависящий от напряжения. Последующие исследования могут исследовать фармакологические и токсикологические механизмы АС с помощью модельных клеточных линий с высокой экспрессией специфических подтипов ионных каналов37. Альтернативно, можно включить специфические ионные каналы, помеченные флуоресцентными белками, для исследования токсичности миокарда AC визуально39. Критическими шагами в этом протоколе являются шаги 6.4-6.6; Выполнение этих трех шагов непосредственно определяет, будет ли последующая запись IKv успешной. По сравнению с другими технологиями, метод цельноклеточный пластырь-зажим является золотым стандартом и принятым методом регистрации тока в одиночных ионных каналах в клеточной мембране или мембране органелл, с характеристиками высоких технических требований и низкой пропускной способностью записи40. Таким образом, этот метод является не только основным методом исследования клеточной электрофизиологии, но и широко используется в неврологии, сердечно-сосудистой науке и других областях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы ценим финансовую поддержку со стороны Национального фонда естественных наук Китая (82130113) и Программы ключевых исследований и разработок и трансформации Департамента науки и технологий провинции Цинхай (2020-SF-C33).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
  2. Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).
  3. Varró, A., et al. Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior. Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).
  4. Campuzano, O., et al. Negative autopsy and sudden cardiac death. International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).
  5. Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. Cardiac sodium channelopathies. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).
  6. Benitah, J. P., et al. Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review. Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).
  7. Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).
  8. Nerbonne, J. M. Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity. Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).
  9. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  10. Olson, T. M., et al. Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation. Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).
  11. Christophersen, I. E., et al. Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation. European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).
  12. Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit. Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).
  13. Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization. Journal of Electrocardiology. 40, 6 Suppl 42-46 (2007).
  14. Jia, W. J., et al. Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).
  15. Leuthardt, E. C., et al. Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).
  16. Tian, J. The applying progress of patch-clamp technique. Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).
  17. Wang, Z. Q., et al. Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel. Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).
  18. Huang, X. Y. The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).
  19. Wang, C., et al. Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).
  20. Gao, Y., et al. Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270 (2022).
  21. Zhou, W., et al. Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison. Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).
  22. An, J. R., et al. The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).
  23. Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis. Neurochemistry International. 155, 105310 (2022).
  24. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protocols. 2 (2), 100442 (2021).
  25. Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves. STAR Protocols. 2 (1), 100266 (2021).
  26. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  27. Yoshimura, M., et al. Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).
  28. Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells. Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).
  29. Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).
  30. Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).
  31. Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. The development of in vivo patch clamp technique. Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).
  32. Lin, Y. F., Ouyang, S. Research progress and application of patch clamp technique. Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).
  33. Li, S., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  34. Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective. Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).
  35. Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity. Frontiers in Pharmacology. 13, 900842 (2022).
  36. Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. Shenyang Pharmaceutical University. , Shenyang, China. Master's thesis (2007).
  37. Li, Y., et al. Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels. Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).
  38. Campbell, D. T. Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine. The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).
  39. Huang, X. Y., Ying, Y. C. The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes. Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).
  40. Cao, J. B. Development and application of patch clamp technique. Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).

Tags

Медицина выпуск 189
Зависимая от напряжения регистрация тока калия на кардиомиоцитах H9c2 <em>с помощью</em> метода цельноклеточного пластыря-зажима
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li,… More

Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter