Настоящий протокол описывает эффективный метод получения в режиме реального времени и динамического получения токов калиевого (Kv) канала с напряжением в кардиомиоцитах H9c2 с использованием метода зажима цельноклеточного пластыря.
Калиевые каналы на клеточной мембране миокарда играют важную роль в регуляции электрофизиологической деятельности клеток. Будучи одним из основных ионных каналов, калиевые каналы с напряжением (Kv) тесно связаны с некоторыми серьезными заболеваниями сердца, такими как лекарственно-индуцированное повреждение миокарда и инфаркт миокарда. В настоящем исследовании был использован метод цельноклеточного пластырь-зажима для определения влияния 1,5 мМ 4-аминопиридина (4-AP, ингибитор калиевого канала широкого спектра действия) и аконитина (AC, 25 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ и 200 мкМ) на ток канала Kv (IKv) в кардиомиоцитах H9c2. Было установлено, что 4-AP ингибирует IKv примерно на 54%, в то время как ингибирующее действие AC на IKv показало дозозависимую тенденцию (отсутствие эффекта для 25 мкМ, 30% ингибирующая скорость для 50 мкМ, 46% ингибирующая скорость для 100 мкМ и 54% ингибирующая скорость для 200 мкМ). Благодаря характеристикам более высокой чувствительности и точности, этот метод будет способствовать исследованию кардиотоксичности и фармакологических эффектов этномедицины, нацеленной на ионные каналы.
Ионные каналы представляют собой специальные интегрированные белки, встроенные в липидный бислой клеточной мембраны. В присутствии активаторов центры таких специальных интегрированных белков образуют высокоселективные гидрофильные поры, позволяющие ионам соответствующего размера и заряда проходить пассивным транспортным способом1. Ионные каналы являются основой возбудимости и биоэлектричества клеток и играют ключевую роль в различных клеточных активностях2. Сердце снабжает кровью другие органы посредством регулярных сокращений, возникающих в результате процесса возбуждения-сокращения, инициированного потенциалами действия3. Предыдущие исследования подтвердили, что генерация потенциалов действия в кардиомиоцитах обусловлена изменением внутриклеточной концентрации ионов, а активация и инактивация ионных каналов Na+, Ca2+ и K+ в кардиомиоцитах человека приводят к образованию потенциалов действия в определенной последовательности 4,5,6. Нарушенные напряжения калиевых (Kv) каналов (IKv) могут изменить нормальный сердечный ритм, что приводит к аритмиям, которые являются одной из ведущих причин смерти. Поэтому запись IKv имеет решающее значение для понимания механизмов препаратов для лечения угрожающих жизни аритмий7.
Канал Kv является важным компонентом калиевого канала. Координационная функция канала Kv играет важную роль в электрической активности и сократимости миокарда сердца млекопитающих 8,9,10. В кардиомиоцитах амплитуда и продолжительность потенциалов действия зависят от копроводности внешних токов K+ несколькими подтипамиKv-каналов 11. Регуляция функции канала Kv очень важна для нормальной реполяризации потенциала сердечного действия. Даже малейшее изменение проводимости Кв сильно влияет на реполяризацию сердца и увеличивает вероятность развития аритмиина 12,13.
Представляя собой фундаментальный метод в клеточных электрофизиологических исследованиях, высокопрочное уплотнение между небольшой площадью клеточной мембраны и наконечником пипетки для записи цельноклеточного зажима может быть установлено путем применения отрицательного давления. Непрерывное отрицательное давление заставляет клеточную мембрану соприкасаться с наконечником пипетки и прилипать к внутренней стенке пипетки. Полученная полная электрическая цепь позволяет регистрировать любой ток ионного канала через поверхность клеточной мембраны14. Этот метод имеет очень высокую чувствительность к току ионного канала клеточной мембраны и может быть использован для обнаружения токов во всех ионных каналах, а приложения чрезвычайношироки 15. Более того, по сравнению с флуоресцентной маркировкой и радиоактивной маркировкой, патч-зажим имеет более высокий авторитет и точность16. В настоящее время для обнаружения компонентов традиционной китайской медицины, действующих на токи канала Kv 17,18,19, используется метод цельноклеточного пластыря-зажима. Например, Wang et al. использовали технику зажима цельноклеточного пластыря и подтвердили, что эффективный компонент семени лотоса может достичь ингибирования канала Kv4.3 путем блокирования каналов активированного состояния19. Аконитин (AC) является одним из эффективных и активных ингредиентов видов Aconitum, таких как Aconitum carmichaeli Debx и Aconitum pendulum Busch. Многочисленные исследования показали, что передозировка АС может вызвать аритмию и даже остановку сердца20. Взаимодействие между переменным током и ионными каналами с напряжением приводит к нарушению внутриклеточного ионного гомеостаза, который является ключевым механизмом кардиотоксичности21. Поэтому в данном исследовании для определения влияния ПЕРЕМЕННОГО тока на IКв кардиомиоцитов используется методика цельноклеточных пластырей-зажимов.
Электрофизиологический метод патч-зажима в основном используется для регистрации и отражения электрической активности и функциональных характеристик ионных каналов на клеточной мембране25. В настоящее время основными методами записи патч-зажимной техники являются одно…
The authors have nothing to disclose.
Мы ценим финансовую поддержку со стороны Национального фонда естественных наук Китая (82130113) и Программы ключевых исследований и разработок и трансформации Департамента науки и технологий провинции Цинхай (2020-SF-C33).
4-Aminopyridine | Sigma | MKCJ2184 | |
Aconitine | Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd | DSTDW000602 | |
Amplifier | Axon Instrument | MultiClamp 700B | |
Analytical Balance | Sartorius | 124S-CW | |
ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length) | Sutter Instrument | 163225-5 | |
Cell culture dish (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
Cell culture dish (35 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 3012022 | |
Clampex software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 5 | |
Clampfit software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 6. 0. 13 | data acqusition software |
D-(+)-glucose | Rhawn | RH289133 | |
Digital camera | Hamamatsu | C11440 | |
Digitizer | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco | 8121587 | |
EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 2166090RP | |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 | |
H9c2 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0111 | |
HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
HCl | Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd | 2106081 | |
HEPES | Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd | 20210221 | |
KCl | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020082501 | |
KOH | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020112601 | |
MgCl2 | Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute | 20160408 | |
MgCl2·6H2O | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2021020101 | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285A | |
Microscope | Olympus | IX73 | |
Microscope cover glass (20 × 20 mm) | Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd | 80340-0630 | |
Milli-Q | Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd | Milli-Q IQ 7005 | |
MultiClamp 700B commander | Axon Instrument | MultiClamp commander 2.0 | signal-amplifier software |
OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
PH meter | Mettler Toledo | S201K | |
Phosphate buffered saline (1x) | Gibco | 8120485 | |
Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |