Het huidige protocol beschrijft een efficiënte methode voor de real-time en dynamische acquisitie van voltage-gated kalium (Kv) kanaalstromen in H9c2 cardiomyocyten met behulp van de whole-cell patch-clamp techniek.
Kaliumkanalen op het myocardiale celmembraan spelen een belangrijke rol bij de regulatie van celelektrofysiologische activiteiten. Omdat het een van de belangrijkste ionkanalen is, zijn voltage-gated kalium (Kv) -kanalen nauw verbonden met sommige ernstige hartaandoeningen, zoals door geneesmiddelen geïnduceerde myocardiale schade en een hartinfarct. In deze studie werd de whole-cell patch-clamp techniek gebruikt om de effecten van 1,5 mM 4-aminopyridine (4-AP, een breedspectrum kaliumkanaalremmer) en aconitine (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM en 200 μM) op de Kv-kanaalstroom (IKv) in H9c2-cardiomyocyten te bepalen. Het bleek dat 4-AP de IKv met ongeveer 54% remde, terwijl het remmende effect van AC op de IKv een dosisafhankelijke trend vertoonde (geen effect voor 25 μM, 30% remmend tarief voor 50 μM, 46% remmend tarief voor 100 μM en 54% remmend tarief voor 200 μM). Vanwege de kenmerken van hogere gevoeligheid en precisie, zal deze techniek de verkenning van cardiotoxiciteit en de farmacologische effecten van etnomedicine gericht op ionkanalen bevorderen.
Ionkanalen zijn speciale geïntegreerde eiwitten ingebed in de lipide bilayer van het celmembraan. In aanwezigheid van activatoren vormen de centra van dergelijke speciale geïntegreerde eiwitten zeer selectieve hydrofiele poriën, waardoor ionen van de juiste grootte en lading op een passieve transportmanier kunnen passeren1. Ionkanalen vormen de basis van celexcitabiliteit en bio-elektriciteit en spelen een sleutelrol in een verscheidenheid aan cellulaire activiteiten2. Het hart levert bloed aan andere organen door regelmatige samentrekkingen als gevolg van een excitatie-contractie-gekoppeld proces geïnitieerd door actiepotentialen3. Eerdere studies hebben bevestigd dat het genereren van actiepotentialen in cardiomyocyten wordt veroorzaakt door de verandering in intracellulaire ionenconcentratie, en de activering en inactivatie van Na+, Ca2+ en K+ ionkanalen in menselijke cardiomyocyten leiden tot de vorming van actiepotentialen in een bepaaldevolgorde 4,5,6. Verstoorde spanningsafhankelijke kalium (Kv) kanaalstromen (IKv) kunnen het normale hartritme veranderen, wat leidt tot aritmieën, die een van de belangrijkste doodsoorzaken zijn. Daarom is het opnemen van de IKv van cruciaal belang voor het begrijpen van de mechanismen van geneesmiddelen voor de behandeling van levensbedreigende aritmieën7.
Het Kv-kanaal is een belangrijk onderdeel van het kaliumkanaal. De coördinatiefunctie van het Kv-kanaal speelt een belangrijke rol in de elektrische activiteit en myocardiale contractiliteit van het zoogdierhart 8,9,10. Bij cardiomyocyten zijn de amplitude en de duur van de actiepotentialen afhankelijk van de cogeleiding van uitgaande K+-stromen door meerdere Kv-kanaalsubtypen11. De regulatie van de Kv-kanaalfunctie is erg belangrijk voor de normale repolarisatie van het cardiale actiepotentiaal. Zelfs de kleinste verandering in Kv-geleiding heeft een grote invloed op cardiale repolarisatie en verhoogt de kans op aritmie12,13.
Vertegenwoordigend een fundamentele methode in cellulair elektrofysiologisch onderzoek, kan een hoge weerstandsafdichting tussen een klein deel van het celmembraan en een pipetpunt voor de registratie van de hele cel patchklem worden vastgesteld door een negatieve druk toe te passen. De continue onderdruk zorgt ervoor dat het celmembraan in contact komt met de pipetpunt en op de binnenwand van de pipet blijft plakken. Het resulterende volledige elektrische circuit maakt het mogelijk om elke enkele ionkanaalstroom over het oppervlak van het celmembraan te registreren14. Deze techniek heeft een zeer hoge gevoeligheid voor de ionkanaalstroom van het celmembraan en kan worden gebruikt om stromen in alle ionkanalen te detecteren, en de toepassingen zijn extreem breed15. Bovendien heeft patch-clamp, in vergelijking met fluorescerende etikettering en radioactieve etikettering, een hogere autoriteit en nauwkeurigheid16. Op dit moment is de whole-cell patch-clamp-techniek gebruikt om de traditionele Chinese medicijncomponenten te detecteren die werken op Kv-kanaalstromen 17,18,19. Wang et al. gebruikten bijvoorbeeld de whole-cell patch-clamp-techniek en bevestigden dat de effectieve component van het lotuszaad de remming van het Kv4.3-kanaal zou kunnen bereiken door de geactiveerde toestandskanalen19 te blokkeren. Aconitine (AC) is een van de effectieve en actieve ingrediënten van Aconitum-soorten, zoals Aconitum carmichaeli Debx en Aconitum pendelbusch. Talrijke studies hebben aangetoond dat overdoses van AC aritmieën en zelfs hartstilstand kunnen veroorzaken20. De interactie tussen AC- en spanningsafhankelijke ionkanalen leidt tot de verstoring van intracellulaire ionhomeostase, het belangrijkste mechanisme van cardiotoxiciteit21. Daarom wordt in deze studie de whole-cell patch-clamp techniek gebruikt om de effecten van AC op de IKv van cardiomyocyten te bepalen.
De patch-clamp elektrofysiologische techniek wordt voornamelijk gebruikt om de elektrische activiteit en functionele kenmerken van ionkanalen op het celmembraan te registreren en weer te geven25. Op dit moment omvatten de belangrijkste opnamemethoden van de patch-clamp-techniek eenkanaalsopname en hele celopname26. Voor de hele celmodus worden de glasmicro-elektrode en negatieve druk gebruikt om een zeer resistente afdichting te vormen tussen een klein deel van het celmembr…
The authors have nothing to disclose.
We waarderen de financiële steun van de National Natural Science Foundation of China (82130113) en het Key R &D and Transformation Program van de afdeling Wetenschap & Technologie van de provincie Qinghai (2020-SF-C33).
4-Aminopyridine | Sigma | MKCJ2184 | |
Aconitine | Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd | DSTDW000602 | |
Amplifier | Axon Instrument | MultiClamp 700B | |
Analytical Balance | Sartorius | 124S-CW | |
ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length) | Sutter Instrument | 163225-5 | |
Cell culture dish (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
Cell culture dish (35 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 3012022 | |
Clampex software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 5 | |
Clampfit software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 6. 0. 13 | data acqusition software |
D-(+)-glucose | Rhawn | RH289133 | |
Digital camera | Hamamatsu | C11440 | |
Digitizer | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco | 8121587 | |
EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 2166090RP | |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 | |
H9c2 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0111 | |
HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
HCl | Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd | 2106081 | |
HEPES | Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd | 20210221 | |
KCl | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020082501 | |
KOH | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020112601 | |
MgCl2 | Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute | 20160408 | |
MgCl2·6H2O | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2021020101 | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285A | |
Microscope | Olympus | IX73 | |
Microscope cover glass (20 × 20 mm) | Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd | 80340-0630 | |
Milli-Q | Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd | Milli-Q IQ 7005 | |
MultiClamp 700B commander | Axon Instrument | MultiClamp commander 2.0 | signal-amplifier software |
OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
PH meter | Mettler Toledo | S201K | |
Phosphate buffered saline (1x) | Gibco | 8120485 | |
Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |