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पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक के माध्यम से एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स पर वोल्टेज-निर्भर पोटेशियम वर्तमान रिकॉर्डिंग

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64805
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3,4, 5, 1,3,4, 4
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग करके एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स में वोल्टेज-गेटेड पोटेशियम (केवी) चैनल धाराओं के वास्तविक समय और गतिशील अधिग्रहण के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है।

Abstract

मायोकार्डियल सेल झिल्ली पर पोटेशियम चैनल सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गतिविधियों के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। मुख्य आयन चैनलों में से एक होने के नाते, वोल्टेज-गेटेड पोटेशियम (केवी) चैनल कुछ गंभीर हृदय रोगों के साथ निकटता से जुड़े हुए हैं, जैसे कि दवा-प्रेरित मायोकार्डियल क्षति और मायोकार्डियल रोधगलन। वर्तमान अध्ययन में, पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक को एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स में केवी चैनल करंट (आईकेवी) पर 1.5 एमएम 4-एमिनोपाइरिडाइन (4-एपी, एक व्यापक स्पेक्ट्रम पोटेशियम चैनल अवरोधक) और एकोनिटाइन (एसी, 25 एसएम, 50 एसएम, 100 यूएम, और 200 एम) के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए नियोजित किया गया था। यह पाया गया कि 4-एपी नेआईकेवी को लगभग 54% तक रोक दिया, जबकिआईवी पर एसी के निरोधात्मक प्रभाव ने खुराक-निर्भर प्रवृत्ति दिखाई (25 μM के लिए कोई प्रभाव नहीं, 50 μM के लिए 30% निरोधात्मक दर, 100 μM के लिए 46% निरोधात्मक दर और 200 μM के लिए 54% निरोधात्मक दर)। उच्च संवेदनशीलता और परिशुद्धता की विशेषताओं के कारण, यह तकनीक कार्डियोटॉक्सिसिटी की खोज और आयन चैनलों को लक्षित करने वाले नृवंशविज्ञान के औषधीय प्रभावों को बढ़ावा देगी।

Introduction

आयन चैनल कोशिका झिल्ली के लिपिड बाइलेयर में एम्बेडेड विशेष एकीकृत प्रोटीन हैं। सक्रियकर्ताओं की उपस्थिति में, ऐसे विशेष एकीकृत प्रोटीन के केंद्र अत्यधिक चयनात्मक हाइड्रोफिलिक छिद्र बनाते हैं, जिससे उचित आकार और चार्ज के आयनों को निष्क्रियपरिवहन तरीके से गुजरने की अनुमति मिलती है। आयन चैनल सेल उत्तेजना और जैव-विद्युत का आधार हैं और विभिन्न सेलुलर गतिविधियों में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाते हैं। हृदय नियमित संकुचन के माध्यम से अन्य अंगों को रक्त की आपूर्ति करता है जो कार्रवाई क्षमता3 द्वारा शुरू की गई उत्तेजना-संकुचन-युग्मित प्रक्रिया से उत्पन्न होता है। पिछले अध्ययनों ने पुष्टि की है कि कार्डियोमायोसाइट्स में कार्रवाई क्षमता की पीढ़ी इंट्रासेल्युलर आयन एकाग्रता में परिवर्तन के कारण होती है, और मानव कार्डियोमायोसाइट्स में एनए +, सीए2 +, और के + आयन चैनलों की सक्रियता और निष्क्रियता एक निश्चित अनुक्रम 4,5,6 में कार्रवाई क्षमता के गठन का कारण बनती है। परेशान वोल्टेज-गेटेड पोटेशियम (केवी) चैनल धाराएं (आई केवी) सामान्य हृदय ताल को बदल सकती हैं, जिससे अतालता हो सकती है, जो मृत्यु के प्रमुख कारणों में से एक है। इसलिए, जीवन-धमकाने वाले अतालता 7 के इलाज के लिए दवाओं के तंत्र को समझने के लिएआईवी को रिकॉर्ड करना महत्वपूर्णहै।

केवी चैनल पोटेशियम चैनल का एक महत्वपूर्ण घटक है। केवी चैनल का समन्वय कार्य स्तनधारी हृदय 8,9,10 की विद्युत गतिविधि और मायोकार्डियल सिकुड़न में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। कार्डियोमायोसाइट्स में, क्रिया क्षमता का आयाम और अवधि कई केवी चैनलउपप्रकारों 11 द्वारा बाहरी के + धाराओं के सह-चालन पर निर्भर करती है। कार्डियक एक्शन क्षमता के सामान्य पुनर्ध्रुवण के लिए केवी चैनल फ़ंक्शन का विनियमन बहुत महत्वपूर्ण है। यहां तक कि केवी चालकता में थोड़ा सा भी परिवर्तन कार्डियक रिपोलराइजेशन को बहुत प्रभावित करता है और अतालता12,13 की संभावना को बढ़ाता है।

सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अनुसंधान में एक मौलिक विधि का प्रतिनिधित्व करते हुए, कोशिका झिल्ली के एक छोटे से क्षेत्र के बीच एक उच्च प्रतिरोध सील और पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए एक पिपेट टिप को नकारात्मक दबाव लागू करके स्थापित किया जा सकता है। निरंतर नकारात्मक दबाव कोशिका झिल्ली को पिपेट टिप के संपर्क में लाता है और पिपेट की आंतरिक दीवार पर चिपक जाता है। परिणामस्वरूप पूर्ण विद्युत सर्किट कोशिका झिल्ली 14 की सतह पर किसी भी एकल आयन चैनल प्रवाह को रिकॉर्ड करने की अनुमतिदेता है। इस तकनीक में कोशिका झिल्ली आयन चैनल धारा के लिए बहुत अधिक संवेदनशीलता है और इसका उपयोग सभी आयन चैनलों में धाराओं का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, और अनुप्रयोगबेहद व्यापक हैं। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट लेबलिंग और रेडियोधर्मी लेबलिंग की तुलना में, पैच-क्लैंप में उच्च अधिकार और सटीकता16 है। वर्तमान में, केवी चैनलधाराओं 17,18,19 पर काम करने वाले पारंपरिक चीनी चिकित्सा घटकों का पता लगाने के लिए पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग किया गया है। उदाहरण के लिए, वांग एट अल ने पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग किया और पुष्टि की कि कमल के बीज का प्रभावी घटक सक्रिय राज्य चैनल19 को अवरुद्ध करके केवी 4.3 चैनल के निषेध को प्राप्त कर सकता है। एकोनिटाइन (एसी) एकोनिटम प्रजातियों के प्रभावी और सक्रिय अवयवों में से एक है, जैसे कि एकोनिटम कारमाइकली डेबक्स और एकोनिटम पेंडुलम बुश। कई अध्ययनों से पता चला है कि एसी के ओवरडोज से अतालता और यहां तक कि कार्डियक अरेस्ट भी हो सकताहै। एसी और वोल्टेज-गेटेड आयन चैनलों के बीच बातचीत इंट्रासेल्युलर आयन होमियोस्टैसिस के विघटन की ओर ले जाती है, जो कार्डियोटॉक्सिसिटी21 का प्रमुख तंत्र है। इसलिए, इस अध्ययन में, कार्डियोमायोसाइट्स केआईवी पर एसी के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग किया जाता है।

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Protocol

व्यावसायिक रूप से प्राप्त एच 9 सी 2 चूहे कार्डियोमायोसाइट्स (सामग्री की तालिका देखें) को डीएमईएम में 5% सीओ2 ह्यूमिडिफाइड वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त इनक्यूबेट किया गया था। पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक को तब सामान्य एच 9 सी 2 कोशिकाओं और 4-एपी- या एसी-उपचारित कोशिकाओं (चित्रा 1 और चित्रा 2) मेंआईवी में परिवर्तन का पता लगाने के लिए नियोजित किया गया था।

1. समाधान तैयार करना

  1. डीएमईएम सेल कल्चर माध्यम तैयार करें जिसमें 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन हो ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. डीएमएसओ समाधान के 100 μL में 4-AP के 14.1165 मिलीग्राम जोड़कर 1.5 M 4-AP समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। बाह्य समाधान (चरण 1.5) को जोड़कर 1.5 एम 4-एपी को 1.5 एमएम तक पतला करें।
  3. डीएमएसओ समाधान के 19.36 μL में 5 मिलीग्राम एसी जोड़कर 400 mM AC तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: उपरोक्त सभी समाधान 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किए गए थे, और डीएमएसओ की अंतिम एकाग्रता 0.1% (वी / वी) से अधिक नहीं होनी चाहिए।
  4. 0.4100 ग्राम केसीएल (110.0 एमएम), 0.0120 ग्राम एमजीसीएल2 (1.2 एमएम), 0.1270 ग्राम एनए2 एटीपी (5.0 एमएम), 0.1190 ग्राम एचईपीईएस (10.0 एमएम), और 0.1900 ग्राम ईजीटीए (10.0 एमएम) को 50 एमएल में जोड़कर इंट्रासेल्युलर समाधान तैयार करें।
    नोट: इंट्रासेल्युलर समाधान के पीएच मान को 1 एम कोह का उपयोग करके 7.2 में समायोजित किया गया था और इसे छोटे वॉल्यूम (1.5-2 एमएल) में एलिकोट किया गया था और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था।
  5. 0.0185 ग्राम केसीएल (5.0 एमएम), 0.3945 ग्राम एनएसीएल (135.0 एमएम), 0.0203 ग्राम एमजीसीएल2.6एच2ओ (2.0 एमएम), 0.0595 ग्राम एचईपीईएस (5.0 एमएम), और 0.0990 ग्राम डी-ग्लूकोज (10.0 एमएम) को 50 एमएल में मिलाकर 50 एमएल बाह्य घोल तैयार करें।
    नोट: बाह्य समाधान को तत्काल उपयोग के लिए तैयार किया जाना चाहिए, और इसके पीएच मान को 1 एम एनएओएच का उपयोग करके 7.4 में समायोजित करने की आवश्यकता है।

2. सेल संस्कृति

  1. एक बार जब एच 9 सी 2 कल्चर डिश 80% कंफ्लुएंट हो जाती है, तो कोशिकाओं को 30 सेकंड के लिए 0.25% ट्रिप्सिन के साथ पचाएं।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए कांच कीप्लेटों के साथ कालीन 35 मिमी डिश में सामान्य मध्यम या दवा युक्त माध्यम (25 μM, 50 μM, 100 μM, और 200 μM AC) के साथ कल्चर 2 x 10 5 कोशिकाएं / एमएल, जिसमें 5%CO2 वातावरण और 70% से 80% सापेक्ष आर्द्रता होती है ( सामग्री की तालिका देखें)।

3. माइक्रोपिपेट्स का निर्माण

  1. माइक्रोपिपेट पुलर चालू करें ( सामग्री की तालिका देखें), और 30 मिनट के लिए प्रीहीट करें।
  2. माइक्रोपिपेट पुलर पर फिलामेंट (ओडी: 1.5 मिमी, आईडी: 1.10 मिमी, 10 सेमी लंबाई) के साथ एक बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका डालें। चरण 3.3 में सेट प्रोग्राम का चयन करें, और नियंत्रण कक्ष पर Enter पर क्लिक करें। ग्लास केशिका के "गर्मी" मूल्य को निर्धारित करने के लिए ऊपरी-दाएं कोने में रैंप प्रोग्राम पर क्लिक करें।
  3. "रैंप" परीक्षण द्वारा निर्धारित मान के अनुसार इलेक्ट्रोड को खींचने के लिए प्रोग्राम लिखें, और निम्नलिखित चरणों का उपयोग करें: "गर्मी" मान = "रैंप" मान, पुल = 0, वेल = रॉड खींचने की गति, समय = 200-250। पिपेट बनाना शुरू करने के लिए पुल पर क्लिक करें।
    नोट: इसका उपयोग करने से पहले माइक्रोपिपेट पुलर के सील कंटेनर में डेसिकेंट के रंग का निरीक्षण करें। यदि रंग नीले से गुलाबी में बदल जाता है, तो डेसिकेंट को प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। इलेक्ट्रोड टिप के संदूषण को रोकने के लिए, पिपेट तैयारी के दौरान ग्लास केशिका के मध्य भाग को छूने की कोशिश न करें। इसके बाद, उत्पादित पिपेट को सावधानीपूर्वक हटा दें, और उन्हें एक बंद और सील कंटेनर में रखें।

4. इंस्ट्रूमेंट सेटअप

  1. निम्नलिखित क्रम में संबंधित उपकरणों को चालू करें: डिजिटल-एनालॉग कनवर्टर, सिग्नल एम्पलीफायर, माइक्रोमैनिपुलेटर, माइक्रोस्कोप और कैमरा ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. इमेजिंग एप्लिकेशन, सिग्नल-एम्पलीफायर सॉफ़्टवेयर, और डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर को अनुक्रम में खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: उपकरण को क्रमिक रूप से चालू किया जाना चाहिए; अन्यथा, सॉफ्टवेयर खोलने के बाद "डेमो डिजिटाइज़र" स्थिति दिखाई देगी।

5.आईवी पैरामीटर सेटिंग

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुएआईकेवी को रिकॉर्ड करने के लिए प्रोटोकॉल संपादित करें।
    1. संपादित करें पर क्लिक करें, और डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में प्रोटोकॉल संपादित करें का चयन करें (सामग्री की तालिका देखें)।
    2. "वेवफॉर्म" इंटरफ़ेस में प्रोग्राम संपादित करें: युग ए (पहला स्तर = -60 एमवी, डेल्टा स्तर = 0 एमवी, पहली अवधि = 20 एमएस, और डेल्टा अवधि = 0 एमएस); युग B (प्रथम स्तर = −40 mV, डेल्टा स्तर = 10 mV, पहली अवधि = 150 ms, और डेल्टा अवधि = 0 ms), और युग C (पहला स्तर = −60 mV, डेल्टा स्तर = 0 mV, पहली अवधि = 30 ms, और डेल्टा अवधि = 0 ms)।
    3. फिर, मोड / दर इंटरफ़ेस पर क्लिक करें, और "ट्रायल पदानुक्रम" डेटा सेट करें: परीक्षण देरी = 0 एस, रन = 1, स्वीप = 11, और स्वीप अवधि = 0.22 एस22,23।
      नोट: नियंत्रण स्थितियों के तहत -60एमवी की होल्डिंग क्षमता पर 10 एमवी की वृद्धि के साथ -40 एमवी से +60 एमवी तक 150 एमएस डिपोलराइजिंग चरणों को लागू करके आईवी चैनल धाराओं का अधिग्रहण करें। प्रोटोकॉल का कुल समय "वेवफॉर्म" प्रोग्राम में निर्धारित समय से अधिक होना चाहिए।
  2. पी /एन रिसाव घटाव कार्यक्रम संपादित करें: स्टिमुलस बटन का चयन करने के लिए प्रोटोकॉल संपादित करें पर क्लिक करें, और पी / एन लीक घटाव संवाद बॉक्स में लीक घटाव कार्यक्रम सेट करें: सबस्वीप की संख्या = 2-8 (इस अध्ययन में 4), निपटान समय = 100-1,000 एमएस (इस अध्ययन में 200), "ध्रुवीयता" = "तरंग के विपरीत", धारण स्तर = −80 एमवी।
    नोट: पी / एन लीक घटाव में "पहली होल्डिंग" (−60 एमवी) से कम होल्डिंग स्तर होना चाहिए।

6. वोल्टेज-क्लैंप मोड में आईकेवी की पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग

  1. डेटा संग्रहण पथ स्थापित करें: फ़ाइल पर क्लिक करें, और डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में डेटा फ़ाइल नाम सेट करें का चयन करें. डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में संपादन का चयन करके और ओपन प्रोटोकॉल पर क्लिक करके स्थापित IKV प्रोटोकॉल (चरण 5.1) खोलें। अंत में, उपकरण विकल्प पर क्लिक करें, और प्रोटोकॉल चलाना शुरू करने के लिए मेम्ब्रेन टेस्ट का चयन करें।
  2. पूरे सेल पैच-क्लैंप उपकरण पर सेल स्नान में बाह्य समाधान (चरण 1.5) जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), और स्नान में एच 9 सी 2 कोशिकाओं (चरण 2.1 में सुसंस्कृत) के साथ कवरस्लिप को ऊपर की ओर रखें।
  3. बाह्य समाधान के साथ पिपेट (चरण 3 में निर्मित) का 30% भरें, और इसे पैच-क्लैंप उपकरण में एकीकृत रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड धारक पर स्थापित करें। ओ-रिंग रबर गैसकेट और प्लास्टिक वॉशर के साथ पिपेट को कस लें। फिर, पिपेट को माइक्रोमैनिपुलेटर के साथ स्नान में गिरा दें। 0 पीए परआईवी वर्तमान आधार रेखा बनाए रखने के लिए सिग्नल-एम्पलीफायर सॉफ्टवेयर के पिपेट ऑफसेट इंटरफ़ेस पर क्लिक करें (सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: इंट्रासेल्युलर समाधान (चरण 1.4) चांदी के तार के एजीसीएल / एजी भाग के संपर्क में होना चाहिए, और चांदी का तार पिपेट की आंतरिक दीवार के करीब नहीं होना चाहिए। पिपेट का प्रतिरोध 2-6 MH होना चाहिए। पिपेट टिप के रोड़ा से बचने के लिए, प्लास्टिक ट्यूबिंग24 के माध्यम से रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड होल्डर से जुड़े 1.0 एमएल सिरिंज का उपयोग करके पिपेट पर एक निरंतर सकारात्मक दबाव पहुंचाया जाना चाहिए।
  4. प्लास्टिक ट्यूब के माध्यम से रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड धारक से जुड़े 1.0 एमएल सिरिंज के साथ मैन्युअल रूप से एक उपयुक्त सकारात्मक दबाव वितरित करें। सेल से संपर्क करने के लिए माइक्रोमैनिपुलेटर को तीन आयामों में हेरफेर करके पिपेट को थोड़ा स्थानांतरित करें।
  5. एक बार जब झिल्ली परीक्षण वर्ग तरंग कोशिका झिल्ली को छूने के बाद 1/3 से 1/2 तक गिर जाती है, तो सकारात्मक दबाव को हटा दें, और मैन्युअल रूप से एक उपयुक्त नकारात्मक दबाव प्रदान करें। फिर, जीई सील बनाने के लिए डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के पैच इंटरफ़ेस पर क्लिक करें। तेज और धीमी धारिता की भरपाई के लिए सेल सीलिंग के दौरान "सी पीफास्ट" और "सीपी स्लो" सिग्नल-एम्पलीफायर सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    नोट: जब झिल्ली परीक्षण ≥1 जीओ होता है, तो पिपेट टिप और सेल के बीच एक सेल-संलग्न कॉन्फ़िगरेशन बनता है।
  6. कोशिका झिल्ली के एक पैच को तोड़ने के लिए नकारात्मक दबाव की संक्षिप्त दालें लागू करें।
    नोट: झिल्ली प्रतिरोध में एक प्रारंभिक कमी एक सफल पूरे सेल रिकॉर्डिंग पैटर्न की विशेषता है। यदि पहुँच प्रतिरोध (Ra) ≥30 MH है, तो कक्षों को चरण 6.3-6.6 के लिए पुन: चयनित किया जाना चाहिए. रिकॉर्ड किए गएआईवी डेटा की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, कोशिका झिल्ली टूटने के बाद नकारात्मक दबाव को हटा दिया जाना चाहिए।
  7. सिग्नल-एम्पलीफायर सॉफ्टवेयर के पूरे सेल बटन पर क्लिक करके पूरे सेल झिल्ली धारिता मुआवजे को निष्पादित करें। अंत में, डेटा रिकॉर्डिंग बटन पर क्लिक करके डेटा को सहेजें और रिकॉर्ड करें।
  8. डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयरके साथ सहेजे गए I KV डेटा खोलें। वर्तमान-वोल्टेज (I-V) संबंधों को सहेजें: निम्नलिखित करने के लिए सांख्यिकी का चयन करने के लिए विश्लेषण पर क्लिक करें: डेटा विश्लेषण के लिए Cousors 1,2 के रूप में श्रेणी का चयन करें; पीक आयाम और माध्य बटन पर क्लिक करें, और फिर परिणाम पृष्ठ में डेटा देखने के लिए ठीक पर क्लिक करें। अंत में, आगे के विश्लेषण के लिए फ़ंक्शन ड्राइंग सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें) मेंआईवी माध्य डेटा के कॉलम को कॉपी करें।
  9. प्रतिनिधि IKV वर्तमान निशान सहेजें: स्थानांतरण निशान का चयन करने के लिए संपादित करें पर क्लिक करें; फिर, स्थानांतरित करने के लिए क्षेत्र में पूर्ण ट्रेस का चयन करें; इसके बाद, ट्रेस चयन में चयन पर क्लिक करें, और सिग्नल में IN 0 (pA) का चयन करें; अंत में, "परिणाम" पृष्ठ में डेटा देखने के लिए ओके पर क्लिक करें, और वर्तमान निशान खींचने के लिए फ़ंक्शन ड्राइंग सॉफ्टवेयर में कुल डेटा कॉपी करें।
  10. IKV प्रोटोकॉल सहेजें: स्टिमुलस वेवफॉर्म सिग्नल बनाने का चयन करने के लिए संपादित करें पर क्लिक करें, और ठीक का चयन करें। फिर, "सिग्नल" में A0 # 0 (mA) का चयन करने के अलावा चरण 6.9 को फिर से करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल ने पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक में निर्धारित मापदंडों के अनुसारआईवी की रिकॉर्डिंग की अनुमति दी। आईकेवी को -60 एमवी (चित्रा 3 ए) की होल्डिंग क्षमता पर -40 से +60 एमवी तक पल्स उत्तेजना के 150 एमएस द्वारा ट्रिगर किया गया था। H9c2 चूहे कार्डियोमायोसाइट्स का IKV पहले -20 mV के आसपास दिखाई दिया, और फिर आयाम आगे विध्रुवण के साथ बढ़ गया। आईकेवी और झिल्ली क्षमता के बीच औसत संबंध की गणना मापा वर्तमान आयामों से की गई थी। परिणामों से पता चला है कि नियंत्रण समूह की तुलना में, 1.5 एमएम 4-एपी (चित्रा 3 बी) के साथ 5 मिनट के उपचार के बादआईवी आयाम को अपरिवर्तनीय रूप से कम कर दिया गया था। इसके अतिरिक्त, 24 एच एसी उपचार (चित्रा 3 सी-एफ) के बाद खुराक-निर्भर तरीके से 10 एमवी से 60 एमवी तक झिल्ली क्षमता परआईवी में काफी कमी आई है।

Figure 1
चित्रा 1: आई केवी रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक उपकरण और उपकरण कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग करके एच 9सी2 कोशिकाओं में आईवी की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग का प्रवाह चार्ट। (बी) इंट्रासेल्युलर और बाह्य समाधानों की तैयारी। (सी) पूरे सेल रिकॉर्डिंग का योजनाबद्ध चित्रण। सी 1: पिपेट को सेल के करीब ले जाएं; सी 2: पिपेट और सेल के बीच एक उच्च प्रतिरोध सील बनाएं; सी 3: कोशिका झिल्ली का टूटना। (डी) आईकेवी रिकॉर्ड करें। डी 1: के + वर्तमान गठन का योजनाबद्ध आरेख; डी 2: पूरे सेल वोल्टेज-क्लैंप मोड में दर्जआई केवी के लिए प्रतिनिधि वर्तमान निशान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एच9सी2 कोशिकाओं में प्रतिनिधि आईकेवी। (ए) बिना किसी उपचार (नियंत्रण समूह) के एच 9 सी 2 कोशिकाओं में मापा गयाआईकेवी के लिए प्रतिनिधि वर्तमान निशान, 24 घंटे के लिए एसी युक्त मीडिया के साथ (25 μM, 50 μM, 100 μM और 200 μM), और 5 मिनट के लिए 1.5 mM 4-AP के साथ। आईकेवी को -60 एमवी की होल्डिंग क्षमता पर -40 से +60 एमवी तक 150 एमएस डिपोलराइजिंग पल्स द्वारा ट्रिगर किया गया था। (बी) 1.5 एमएम 4-एपी उत्तेजना के लिए,आईकेवी 10 एमवी से 60 एमवी तक झिल्ली क्षमता पर उतरा। (C-F) एसी उपचार ने झिल्ली क्षमता पर एकाग्रता-निर्भर तरीके सेआईवी को 10 एमवी से 60 एमवी तक कम कर दिया। * पी < 0.05 बनाम नियंत्रण समूह (एन = 6)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बाह्य कोशिकीय समाधान
रसायन g/50 mL संरचना (mM)
NaCl 0.3945 135.0
KCl 0.1865 5.0
HEPES 0.5958 5.0
MgCl2.6H 2O 0.2033 2.0
डी-ग्लूकोज 0.9900 10.0
इंट्रासेल्युलर समाधान
रसायन g/50 mL संरचना (mM)
KCl 0.4100 110.0
MgCl2 0.0120 1.2
Na2-ATP 0.1270 5.0
HEPES 0.1190 10.0
ईजीटीए 0.1900 10.0

तालिका 1: वोल्टेज-क्लैंप मोड मेंआईकेवी को रिकॉर्ड करने के लिए इंट्रासेल्युलर और बाह्य समाधान।

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Discussion

पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तकनीक का उपयोग मुख्य रूप से कोशिका झिल्ली25 पर आयन चैनलों की विद्युत गतिविधि और कार्यात्मक विशेषताओं को रिकॉर्ड करने और प्रतिबिंबित करने के लिए किया जाता है। वर्तमान में, पैच-क्लैंप तकनीक के मुख्य रिकॉर्डिंग विधियों में एकल-चैनल रिकॉर्डिंग और पूरे सेल रिकॉर्डिंग26 शामिल हैं। पूरे सेल मोड के लिए, ग्लास माइक्रोइलेक्ट्रोड और नकारात्मक दबाव का उपयोग कोशिका झिल्ली के एक छोटे से क्षेत्र और पिपेट टिप27 के बीच एक उच्च प्रतिरोध सील बनाने के लिए किया जाता है। एक बार जब निरंतर नकारात्मक दबाव के कारण पिपेट की नोक कोशिका झिल्ली को तोड़ देती है और झिल्ली पिपेट की आंतरिक दीवार से जुड़ जाती है, तो पिपेट और सेल के बीच गठित पूर्ण विद्युत सर्किट कोशिका झिल्ली की सतह पर व्यक्तिगत आयन चैनलों के वर्तमान घनत्व को रिकॉर्ड करने की अनुमति देताहै 26,27 . हाल के वर्षों में, आयन चैनल से संबंधित बीमारियों को लक्षित करने वाली दवा अनुसंधान के लिए पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। यद्यपि ऑपरेटरों के लिए इसकी उच्च आवश्यकताएं हैं, यह तकनीक अभी भी आयन चैनल अनुसंधान28 के लिए "स्वर्ण मानक" बनी हुई है। इसके अलावा, छिद्रित पैच-क्लैंप तकनीक कोशिका झिल्ली 29,30 में पारगम्यता छिद्र बनाने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करके लंबे समय तक अपेक्षाकृत स्थिर इंट्रासेल्युलर वातावरण में लक्ष्य आयन चैनलों में वर्तमानपरिवर्तनों को भी रिकॉर्ड कर सकती है। वर्तमान-क्लैंप या वोल्टेज-क्लैंप मोड में पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग करके आयन चैनलों के वोल्टेज या करंट में गतिशील परिवर्तनों को रिकॉर्ड और ट्रेस किया जा सकता है, जिससे यह निस्संदेह दवाओं31,32 की औषधीय गतिविधि या विषाक्तता तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए एक शक्तिशाली मंच बन जाता है।

एसी एकोनिटम प्रजातियों के मुख्य विषाक्त घटकों में से एक है, जो डायस्टर-डिटरपेनॉइड एल्कलॉइड के समूह से संबंधित है, और अत्यधिक विषाक्त20,33 है। साक्ष्य ने संकेत दिया है कि एसी कार्डियोवैस्कुलर विषाक्तता34,35 का कारण बन सकता है। एक गैर-चयनात्मक के + चैनल अवरोधक के रूप में, यह बताया गया है कि एसी क्षणिक बाहरी के + करंट, अल्ट्रा-रैपिड विलंबित रेक्टिफायर के + करंट, और तेजी से विलंबित रेक्टिफायर आउटवर्ड के + करंट को अवरुद्ध कर सकता है, जिससे अतालता 21,36,37 हो जाती है। आज तक, इस बात का कोई मजबूत सबूत नहीं है कि वोल्टेज-निर्भर पोटेशियम धाराएं एसी की कार्डियोटॉक्सिसिटी में शामिल हैं। इसलिए, इस अध्ययन में, चूहे एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स मेंआईवी पर एसी के निरोधात्मक प्रभाव की जांच पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग करके की गई थी। एनए + चैनलों की सक्रियता एक व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त तंत्र है जिसके द्वारा एसी औषधीय या विषाक्त प्रभावडालता है। दिलचस्प बात यह है कि इस बात के सबूत हैं कि एसी सीधेआईवी 21,36,37 पर कार्य कर सकता है। हालांकि, इस पेपर में प्रस्तुत डेटा पर्याप्त सबूत प्रदान नहीं करता है कि एसी सीधेआईवी को रोक सकता है। एसी काआईवी निरोधात्मक प्रभाव एनए + चैनलों के प्रत्यक्ष सक्रियण के कारण हो सकता है, जिसके लिए आगे की जांच की आवश्यकता होती है।

इसकी स्थापना और विकास के बाद से, इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक आयन चैनलों के संदर्भ में दवाओं की कार्डियोटॉक्सिसिटी का पता लगाने के लिए एक पारंपरिक तरीका बन गई है। इस प्रयोग ने पुष्टि की कि एसी ने वोल्टेज-क्लैंप मोड में एकाग्रता-निर्भर तरीके से एच 9 सी 2 कोशिकाओं केआईवी को प्रभावी ढंग से रोक दिया। हालांकि, के + चैनलों सहित प्रत्येक प्रकार के आयन चैनल में कई उपप्रकार होते हैं, और इस अध्ययन में केवल कुल वोल्टेज-निर्भर के + चैनल करंट दर्ज किया गया था। बाद के अध्ययन विशिष्ट आयन चैनल उपप्रकारों37 की उच्च अभिव्यक्ति के साथ मॉडल सेल लाइनों के माध्यम से एसी के औषधीय और विष विज्ञान तंत्र का पता लगा सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, एसी नेत्रहीन39 की मायोकार्डियल विषाक्तता की जांच के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किए गए विशिष्ट आयन चैनलों को शामिल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम चरण 6.4-6.6 हैं; इन तीन चरणों को पूरा करना सीधे निर्धारित करता है कि आईकेवी की बाद की रिकॉर्डिंग सफल है या नहीं। अन्य प्रौद्योगिकियों की तुलना में, पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक उच्च तकनीकी आवश्यकताओं और कम-थ्रूपुट रिकॉर्डिंग40 की विशेषताओं के साथ कोशिका झिल्ली या ऑर्गेनेल झिल्ली में एकल आयन चैनलों में वर्तमान को रिकॉर्ड करने के लिए स्वर्ण मानक और स्वीकृत विधि है। सारांश में, यह तकनीक न केवल सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अनुसंधान के लिए एक बुनियादी विधि है, बल्कि तंत्रिका विज्ञान, हृदय विज्ञान और अन्य क्षेत्रों में भी व्यापक रूप से उपयोग की जाती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82130113) और किंघाई प्रांत (2020-एसएफ-सी 33) के विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग के प्रमुख अनुसंधान एवं विकास और परिवर्तन कार्यक्रम से वित्तीय सहायता की सराहना करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045

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चिकित्सा अंक 189
पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक के <em>माध्यम से</em> एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स पर वोल्टेज-निर्भर पोटेशियम वर्तमान रिकॉर्डिंग
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Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).

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