वर्तमान प्रोटोकॉल पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग करके एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स में वोल्टेज-गेटेड पोटेशियम (केवी) चैनल धाराओं के वास्तविक समय और गतिशील अधिग्रहण के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है।
मायोकार्डियल सेल झिल्ली पर पोटेशियम चैनल सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गतिविधियों के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। मुख्य आयन चैनलों में से एक होने के नाते, वोल्टेज-गेटेड पोटेशियम (केवी) चैनल कुछ गंभीर हृदय रोगों के साथ निकटता से जुड़े हुए हैं, जैसे कि दवा-प्रेरित मायोकार्डियल क्षति और मायोकार्डियल रोधगलन। वर्तमान अध्ययन में, पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक को एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स में केवी चैनल करंट (आईकेवी) पर 1.5 एमएम 4-एमिनोपाइरिडाइन (4-एपी, एक व्यापक स्पेक्ट्रम पोटेशियम चैनल अवरोधक) और एकोनिटाइन (एसी, 25 एसएम, 50 एसएम, 100 यूएम, और 200 एम) के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए नियोजित किया गया था। यह पाया गया कि 4-एपी नेआईकेवी को लगभग 54% तक रोक दिया, जबकिआईवी पर एसी के निरोधात्मक प्रभाव ने खुराक-निर्भर प्रवृत्ति दिखाई (25 μM के लिए कोई प्रभाव नहीं, 50 μM के लिए 30% निरोधात्मक दर, 100 μM के लिए 46% निरोधात्मक दर और 200 μM के लिए 54% निरोधात्मक दर)। उच्च संवेदनशीलता और परिशुद्धता की विशेषताओं के कारण, यह तकनीक कार्डियोटॉक्सिसिटी की खोज और आयन चैनलों को लक्षित करने वाले नृवंशविज्ञान के औषधीय प्रभावों को बढ़ावा देगी।
आयन चैनल कोशिका झिल्ली के लिपिड बाइलेयर में एम्बेडेड विशेष एकीकृत प्रोटीन हैं। सक्रियकर्ताओं की उपस्थिति में, ऐसे विशेष एकीकृत प्रोटीन के केंद्र अत्यधिक चयनात्मक हाइड्रोफिलिक छिद्र बनाते हैं, जिससे उचित आकार और चार्ज के आयनों को निष्क्रियपरिवहन तरीके से गुजरने की अनुमति मिलती है। आयन चैनल सेल उत्तेजना और जैव-विद्युत का आधार हैं और विभिन्न सेलुलर गतिविधियों में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाते हैं। हृदय नियमित संकुचन के माध्यम से अन्य अंगों को रक्त की आपूर्ति करता है जो कार्रवाई क्षमता3 द्वारा शुरू की गई उत्तेजना-संकुचन-युग्मित प्रक्रिया से उत्पन्न होता है। पिछले अध्ययनों ने पुष्टि की है कि कार्डियोमायोसाइट्स में कार्रवाई क्षमता की पीढ़ी इंट्रासेल्युलर आयन एकाग्रता में परिवर्तन के कारण होती है, और मानव कार्डियोमायोसाइट्स में एनए +, सीए2 +, और के + आयन चैनलों की सक्रियता और निष्क्रियता एक निश्चित अनुक्रम 4,5,6 में कार्रवाई क्षमता के गठन का कारण बनती है। परेशान वोल्टेज-गेटेड पोटेशियम (केवी) चैनल धाराएं (आई केवी) सामान्य हृदय ताल को बदल सकती हैं, जिससे अतालता हो सकती है, जो मृत्यु के प्रमुख कारणों में से एक है। इसलिए, जीवन-धमकाने वाले अतालता 7 के इलाज के लिए दवाओं के तंत्र को समझने के लिएआईवी को रिकॉर्ड करना महत्वपूर्णहै।
केवी चैनल पोटेशियम चैनल का एक महत्वपूर्ण घटक है। केवी चैनल का समन्वय कार्य स्तनधारी हृदय 8,9,10 की विद्युत गतिविधि और मायोकार्डियल सिकुड़न में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। कार्डियोमायोसाइट्स में, क्रिया क्षमता का आयाम और अवधि कई केवी चैनलउपप्रकारों 11 द्वारा बाहरी के + धाराओं के सह-चालन पर निर्भर करती है। कार्डियक एक्शन क्षमता के सामान्य पुनर्ध्रुवण के लिए केवी चैनल फ़ंक्शन का विनियमन बहुत महत्वपूर्ण है। यहां तक कि केवी चालकता में थोड़ा सा भी परिवर्तन कार्डियक रिपोलराइजेशन को बहुत प्रभावित करता है और अतालता12,13 की संभावना को बढ़ाता है।
सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अनुसंधान में एक मौलिक विधि का प्रतिनिधित्व करते हुए, कोशिका झिल्ली के एक छोटे से क्षेत्र के बीच एक उच्च प्रतिरोध सील और पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए एक पिपेट टिप को नकारात्मक दबाव लागू करके स्थापित किया जा सकता है। निरंतर नकारात्मक दबाव कोशिका झिल्ली को पिपेट टिप के संपर्क में लाता है और पिपेट की आंतरिक दीवार पर चिपक जाता है। परिणामस्वरूप पूर्ण विद्युत सर्किट कोशिका झिल्ली 14 की सतह पर किसी भी एकल आयन चैनल प्रवाह को रिकॉर्ड करने की अनुमतिदेता है। इस तकनीक में कोशिका झिल्ली आयन चैनल धारा के लिए बहुत अधिक संवेदनशीलता है और इसका उपयोग सभी आयन चैनलों में धाराओं का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, और अनुप्रयोगबेहद व्यापक हैं। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट लेबलिंग और रेडियोधर्मी लेबलिंग की तुलना में, पैच-क्लैंप में उच्च अधिकार और सटीकता16 है। वर्तमान में, केवी चैनलधाराओं 17,18,19 पर काम करने वाले पारंपरिक चीनी चिकित्सा घटकों का पता लगाने के लिए पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग किया गया है। उदाहरण के लिए, वांग एट अल ने पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग किया और पुष्टि की कि कमल के बीज का प्रभावी घटक सक्रिय राज्य चैनल19 को अवरुद्ध करके केवी 4.3 चैनल के निषेध को प्राप्त कर सकता है। एकोनिटाइन (एसी) एकोनिटम प्रजातियों के प्रभावी और सक्रिय अवयवों में से एक है, जैसे कि एकोनिटम कारमाइकली डेबक्स और एकोनिटम पेंडुलम बुश। कई अध्ययनों से पता चला है कि एसी के ओवरडोज से अतालता और यहां तक कि कार्डियक अरेस्ट भी हो सकताहै। एसी और वोल्टेज-गेटेड आयन चैनलों के बीच बातचीत इंट्रासेल्युलर आयन होमियोस्टैसिस के विघटन की ओर ले जाती है, जो कार्डियोटॉक्सिसिटी21 का प्रमुख तंत्र है। इसलिए, इस अध्ययन में, कार्डियोमायोसाइट्स केआईवी पर एसी के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग किया जाता है।
पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तकनीक का उपयोग मुख्य रूप से कोशिका झिल्ली25 पर आयन चैनलों की विद्युत गतिविधि और कार्यात्मक विशेषताओं को रिकॉर्ड करने और प्रतिबिंबित करने के लिए किया जाता ह?…
The authors have nothing to disclose.
हम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82130113) और किंघाई प्रांत (2020-एसएफ-सी 33) के विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग के प्रमुख अनुसंधान एवं विकास और परिवर्तन कार्यक्रम से वित्तीय सहायता की सराहना करते हैं।
4-Aminopyridine | Sigma | MKCJ2184 | |
Aconitine | Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd | DSTDW000602 | |
Amplifier | Axon Instrument | MultiClamp 700B | |
Analytical Balance | Sartorius | 124S-CW | |
ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length) | Sutter Instrument | 163225-5 | |
Cell culture dish (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
Cell culture dish (35 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 3012022 | |
Clampex software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 5 | |
Clampfit software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 6. 0. 13 | data acqusition software |
D-(+)-glucose | Rhawn | RH289133 | |
Digital camera | Hamamatsu | C11440 | |
Digitizer | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco | 8121587 | |
EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 2166090RP | |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 | |
H9c2 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0111 | |
HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
HCl | Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd | 2106081 | |
HEPES | Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd | 20210221 | |
KCl | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020082501 | |
KOH | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020112601 | |
MgCl2 | Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute | 20160408 | |
MgCl2·6H2O | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2021020101 | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285A | |
Microscope | Olympus | IX73 | |
Microscope cover glass (20 × 20 mm) | Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd | 80340-0630 | |
Milli-Q | Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd | Milli-Q IQ 7005 | |
MultiClamp 700B commander | Axon Instrument | MultiClamp commander 2.0 | signal-amplifier software |
OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
PH meter | Mettler Toledo | S201K | |
Phosphate buffered saline (1x) | Gibco | 8120485 | |
Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |