Summary
هنا ، نقدم تطبيق مجهر القوة الذرية (AFM) كطريقة بسيطة وسريعة لتوصيف البكتيريا وتحليل التفاصيل مثل حجم البكتيريا وشكلها ، والأغشية الحيوية للزراعة البكتيرية ، ونشاط الجسيمات النانوية كمبيدات للجراثيم.
Abstract
المجهر الإلكتروني هو أحد الأدوات المطلوبة لتوصيف الهياكل الخلوية. ومع ذلك ، فإن الإجراء معقد ومكلف بسبب إعداد العينة للمراقبة. يعد الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) تقنية توصيف مفيدة للغاية نظرا لدقتها العالية في ثلاثة أبعاد وبسبب عدم وجود أي متطلبات للفراغ وموصلية العينة. يمكن ل AFM تصوير مجموعة متنوعة من العينات ذات التضاريس المختلفة وأنواع مختلفة من المواد.
يوفر AFM معلومات تضاريس 3D عالية الدقة من مستوى الأنجستروم إلى مقياس ميكرون. على عكس الفحص المجهري التقليدي ، يستخدم AFM مسبارا لتوليد صورة للتضاريس السطحية للعينة. في هذا البروتوكول ، يقترح استخدام هذا النوع من الفحص المجهري للتوصيف المورفولوجي وتلف الخلايا للبكتيريا المثبتة على الدعم. تم استخدام سلالات المكورات العنقودية الذهبية (ATCC 25923) والإشريكية القولونية (ATCC 25922) والزائفة هونانينسيس (المعزولة من عينات بصلة الثوم). في هذا العمل ، نمت الخلايا البكتيرية في وسائط ثقافة محددة. لمراقبة تلف الخلايا ، تم تحضين المكورات العنقودية الذهبية والإشريكية القولونية بتركيزات مختلفة من الجسيمات النانوية (NPs).
تم تثبيت قطرة من التعليق البكتيري على دعامة زجاجية ، وتم التقاط الصور باستخدام AFM بمقاييس مختلفة. أظهرت الصور التي تم الحصول عليها الخصائص المورفولوجية للبكتيريا. علاوة على ذلك ، باستخدام AFM ، كان من الممكن ملاحظة الأضرار التي لحقت بالبنية الخلوية الناجمة عن تأثير NPs. بناء على الصور التي تم الحصول عليها ، يمكن استخدام الاتصال AFM لتوصيف مورفولوجيا الخلايا البكتيرية المثبتة على الدعم. AFM هو أيضا أداة مناسبة للتحقيق في آثار NPs على البكتيريا. بالمقارنة مع المجهر الإلكتروني ، فإن AFM هي تقنية غير مكلفة وسهلة الاستخدام.
Introduction
وقد لوحظ لأول مرة أشكال بكتيرية مختلفة من قبل أنتوني فان ليفينهوك في القرن 171. توجد البكتيريا في مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأشكال منذ العصور القديمة ، بدءا من المجالات إلى الخلايا المتفرعة2. شكل الخلية هو شرط أساسي لعلماء التصنيف البكتيري لوصف وتصنيف كل نوع من الأنواع البكتيرية ، وذلك أساسا للفصل المورفولوجي للشعب إيجابية الجرام وسالبةالجرام 3. من المعروف أن العديد من العناصر تحدد أشكال الخلايا البكتيرية ، وكلها تشارك في أغطية الخلايا وتدعمها كمكونات لجدار الخلية والغشاء ، وكذلك في الهيكل الخلوي. بهذه الطريقة ، لا يزال العلماء يوضحون الآليات والعمليات الكيميائية والكيميائية الحيوية والفيزيائية المتورطة في تحديد أشكال الخلايا البكتيرية ، والتي يتم تعريفها جميعا بواسطة مجموعات من الجينات التي تحدد الأشكال البكتيرية 2,4.
بالإضافة إلى ذلك ، أظهر العلماء أن شكل القضيب هو على الأرجح شكل أسلاف الخلايا البكتيرية ، لأن شكل الخلية هذا يبدو مثاليا في المعلمات المهمة للخلية. وبالتالي ، تعتبر المكورات ، الحلزونية ، الضمة ، الخيطية ، وغيرها من الأشكال بمثابة تكيفات مع بيئات مختلفة. في الواقع ، تطورت أشكال معينة بشكل مستقل عدة مرات ، مما يشير إلى أن أشكال البكتيريا يمكن أن تكون تكيفات مع بيئات معينة 3,5. ومع ذلك ، طوال دورة حياة الخلية البكتيرية ، يتغير شكل الخلية ، وهذا يحدث أيضا كاستجابة وراثية للظروف البيئية الضارة3. يحدد شكل الخلية البكتيرية وحجمها بقوة صلابة البكتيريا ومتانتها ونسبة سطحها إلى حجمها ، ويمكن استغلال هذه الخاصية لعمليات التكنولوجيا الحيوية6.
يستخدم الفحص المجهري الإلكتروني لدراسة العينات البيولوجية بسبب التكبير العالي الذي يمكن الوصول إليه خارج المجاهر القائمة على الضوء. يعد المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) والمجهر الإلكتروني الماسح (SEM) من أكثر التقنيات استخداما لهذا الغرض. ومع ذلك ، تتطلب العينات بعض العلاجات قبل وضعها في غرفة المجهر من أجل الحصول على الصور المناسبة. مطلوب غطاء ذهبي على العينات ، ويجب ألا يكون الوقت المستخدم للحصول على الصورة الإجمالية طويلا جدا. في المقابل ، فإن مجهر القوة الذرية (AFM) هو تقنية تستخدم على نطاق واسع في تحليل الأسطح ولكنها تستخدم أيضا في دراسة العينات البيولوجية.
هناك عدة أنواع من أوضاع AFM المستخدمة في تحليل السطح ، مثل وضع التلامس ، ووضع عدم الاتصال أو التنصت ، ومجهر القوة المغناطيسية (MFM) ، و AFM الموصل ، ومجهر القوة الكهرضغطية (PFM) ، والتنصت على قوة الذروة (PFT) ، ورنين التلامس ، وحجم القوة. يتم استخدام كل وضع في تحليل المواد ويوفر معلومات مختلفة حول سطح المواد وخصائصها الميكانيكية والفيزيائية. ومع ذلك ، يتم استخدام بعض أوضاع AFM لتحليل العينات البيولوجية في المختبر ، مثل PFT ، لأن PFT يسمح بالحصول على البيانات الطبوغرافية والميكانيكية على الخلايا في وسط سائل7.
في هذا العمل ، استخدمنا الوضع الأساسي المضمن في كل طراز AFM قديم وبسيط - وضع الاتصال. يستخدم AFM مسبارا حادا (قطره حوالي <50 نانومتر) لمسح المناطق التي يقل قطرها عن 100 ميكرومتر. يتم محاذاة المسبار إلى العينة من أجل التفاعل مع مجالات القوة المرتبطة بالعينة. يتم مسح السطح باستخدام المسبار للحفاظ على القوة ثابتة. بعد ذلك ، يتم إنشاء صورة للسطح من خلال مراقبة حركة الكابولي أثناء تحركه عبر السطح. توفر المعلومات التي تم جمعها الخصائص الميكانيكية النانوية للسطح ، مثل الالتصاق والمرونة واللزوجة والقص.
في وضع الاتصال AFM ، يتم مسح الكابولي عبر العينة عند انحراف ثابت. هذا يسمح للمرء بتحديد ارتفاع العينات (Z) ، وهذا يمثل ميزة على تقنيات المجهر الإلكتروني الأخرى. يسمح برنامج AFM بتوليد مسح ضوئي للصور 3D من خلال التفاعل بين الطرف وسطح العينة ، ويرتبط انحراف الطرف بارتفاع العينة من خلال الليزر والكاشف.
في الوضع الثابت (وضع الاتصال) بقوة ثابتة ، يقدم الإخراج صورتين مختلفتين: الارتفاع (تضاريس z) وإشارة الانحراف أو الخطأ. الوضع الثابت هو وضع تصوير قيم وبسيط ، خاصة بالنسبة للعينات القوية في الهواء التي يمكنها التعامل مع الأحمال العالية والقوى الالتوائية التي يمارسها الوضع الثابت. يتم تشغيل وضع الانحراف أو الخطأ في وضع القوة الثابتة. ومع ذلك ، يتم تحسين صورة التضاريس بشكل أكبر عن طريق إضافة إشارة الانحراف إلى هيكل السطح. في هذا الوضع ، يشار إلى إشارة الانحراف أيضا باسم إشارة الخطأ لأن الانحراف هو معلمة التغذية المرتدة ؛ أي ميزات أو مورفولوجيا تظهر في هذه القناة ترجع إلى "الخطأ" في حلقة التغذية الراجعة أو ، بالأحرى ، بسبب حلقة التغذية الراجعة المطلوبة للحفاظ على نقطة ضبط انحراف ثابتة.
تصميم AFM الفريد يجعلها مضغوطة - صغيرة بما يكفي لتناسب سطح الطاولة - مع وجود دقة عالية بما يكفي لحل الخطوات الذرية. معدات AFM لها تكلفة أقل من معدات المجاهر الإلكترونية الأخرى ، وتكاليف الصيانة ضئيلة. لا يتطلب المجهر مختبرا بشروط خاصة مثل غرفة نظيفة أو مساحة معزولة. يحتاج فقط إلى مكتب خال من الاهتزازات. بالنسبة ل AFM ، لا تحتاج العينات إلى الخضوع لإعداد متقن مثل التقنيات الأخرى (الغطاء الذهبي ، التخسيس) ؛ يجب إرفاق عينة جافة فقط بحامل العينة.
نستخدم وضع الاتصال AFM لمراقبة الأشكال البكتيرية وتأثيرات NPs. يمكن ملاحظة السكان والتشكل الخلوي للبكتيريا المثبتة على الدعم ، وكذلك الضرر الخلوي الناتج عن الجسيمات النانوية على الأنواع البكتيرية. تؤكد الصور التي تم الحصول عليها بواسطة وضع الاتصال AFM أنها أداة قوية ولا تقتصر على الكواشف والإجراءات المعقدة ، مما يجعلها طريقة بسيطة وسريعة واقتصادية لتوصيف البكتيريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عزل البكتيريا وتحديدها
- عزل سلالة داخلية من مرستيم لمبة الثوم:
- ضع شظايا 2 مم من meristems من بصيلات الثوم المقشرة والمطهرة والمقطعة مسبقا على أجار الصويا trypticase (TSA) كوسيط نمو غني ، واحتضانها عند 25 درجة مئوية لمدة 1 يوم.
- استنادا إلى الاختلافات المورفولوجية للمستعمرات البكتيرية - الشكل والحجم واللون والحافة والضوء المنقول والضوء المنعكس والملمس والاتساق وإنتاج الصباغ - وصف الأنماط المورفولوجية المختلفة المرصودة ، وتنقيتها عن طريق تقاطع مستعمرة تمثيلية لكل نمط مورفوتايب.
- الحفاظ على جميع السلالات البكتيرية النقية في 30٪ من الجلسرين عند -80 درجة مئوية.
- حدد سلالة مختارة عشوائيا (9AP) عن طريق تسلسل 16S rDNA. استخراج الحمض النووي باتباع طريقة هوفمان ونستون8.
- تضخيم 16S rRNA عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) مع 100 نانوغرام من الحمض النووي ، 1x بوليميراز المخزن المؤقت ، 4 mM MgCl2 ، 0.4 mM dNTPs ، 10 pmol لكل من 27F / 1492r oligonucleotides العالمي ، و 1 U من بوليميراز الحمض النووي9. استخدم شروط التدوير الحراري التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للتجريد الأولي من الجنسية ؛ تليها 35 دورة من 1 دقيقة عند 94 درجة مئوية كدرجة حرارة التجريد من الطبيعة ، و 1 دقيقة عند 56 درجة مئوية كدرجة حرارة التهجين ، و 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية كدرجة حرارة التمديد ؛ ثم 10 دقائق عند 72 درجة مئوية كتمديد نهائي.
- تسلسل الشعيرات الدموية منتج PCR باستخدام نفس قليل النوكليوتيدات ؛ استخدم طريقة Dideoxy-terminal مع مجموعة تركيب المصفوفة للتسلسل الشعري10 ، وقم بإجراء الرحلان الكهربائي في نظام آلي متعدد الشعيرات الدموية11.
- قم بتحرير التسلسلات يدويا ، وقارن التسلسل بمكتبة GenBank باستخدام بحث BLAST ، وحدد مبدئيا السلالة بالمعيار الذهبي لهوية 98.7٪ على الأقل مع أقرب الأنواع12,13.
ملاحظة: تم تحديد السلالة 9AP على أنها تنتمي إلى نوع Pseudomonas hunanensis ، بهوية 99.86٪ مع تسلسل السلالة P. hunanensis LV (JX545210).
2. تحضير العينة البكتيرية للمراقبة المورفولوجية بواسطة AFM
- في ظل ظروف معقمة ، ضع قطرة من المعلق البكتيري (Pseudomonas hunanensis ، المكورات العنقودية الذهبية) على شريحة زجاجية .
- إصلاح العينات على الشريحة عن طريق التسخين الجاف. مرر الشريحة برفق فوق اللهب عدة مرات حتى تجف العينة.
ملاحظة: تثبيت العينات هو تقنية روتينية في علم الأحياء الدقيقة لمراقبة الكائنات بدائية النواة الثابتة ومحاكاة هيكلها كخلايا حية قدر الإمكان. - ضع العينات الثابتة في طبق بتري ، واصطحبها إلى معدات AFM للمراقبة.
ملاحظة: نظرا لأنه يمكن تغيير العينات حسب الظروف الجوية بمرور الوقت ، خصص وقتا أقصى قدره 24 ساعة للتحليل في جهاز AFM. احتفظ بالعينات خالية من الغبار.
3. تأثير مضاد للجراثيم من الجسيمات النانوية MgO ضد البكتيريا
ملاحظة: تم نشر توليف وتوصيف MgO NPs سابقا14. في هذا العمل ، تم تقدير النشاط المضاد للبكتيريا للمواد النانوية بناء على دليل معهد المعايير السريرية والمخبرية (CLSI) باستخدام طرق التخفيف الكلي والتخفيف الدقيق للتثبيط15،16.
- تقدير الحد الأدنى من النشاط المثبط (MIC) ومبيدات الجراثيم (CMB)
- النمو المسبق للسلالات
- تلقيح كمية مناسبة من الإشريكية القولونية أو المكورات العنقودية الذهبية في مرق مغذي للحصول على تركيز نهائي قدره 1 × 108 CFU / mL.
- احتضان التعليق عند 37 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية) لمدة 18-24 ساعة.
- ما بعد نمو السلالات المتأقلمة
- اغمر حلقة بكتريولوجية معقمة في التعليق ، ولمس قاع الأنبوب.
- أداء الخطوط مع حلقة على يوزين والميثيلين الأزرق أجار وأجار المغذيات.
- احتضان ألواح الآجار عند 37 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية) لمدة 24 ساعة.
- اختيار المستعمرات لإعداد اللقاح الموحد
- خذ ثلاث إلى خمس مستعمرات بنفس النوع المورفولوجي عن طريق لمس الجزء العلوي من المستعمرة في طبق بتري بحلقة بكتريولوجية.
- نقل واغمر التحديد في 3-5 مل من مرق مولر هينتون.
- احتضان عند 37 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية) لتحقيق تعكر 1 × 10 8 CFU / مل أو 2 × 108 CFU / مل.
ملاحظة: في هذا العمل ، تم استخدام معايير التعكر McFarland كمرجع للمعلقات البكتريولوجية. على وجه التحديد ، يتوافق المعيار 0.5 تقريبا مع تعليق E. coli متجانس يبلغ 1.5 × 108 خلايا / مل. تم استخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة المرئية وفوق البنفسجية لقياس التعكر. - خذ 1 مل ، وأضفه إلى 9 مل من المرق المعقم. خذ 200 ميكرولتر من هذا التخفيف ، وأضفه إلى 19.8 مل من المرق المعقم للحصول على تركيز نهائي قدره 5 × 105 CFU / mL.
- التركيزات المطلوبة من الجسيمات النانوية MgO
- استخدام الموجات فوق الصوتية لإعداد الحلول.
- تعليق المادة النانوية في الماء المعقم عند ضعف التركيز المطلوب للحصول على المحاليل التسلسلية.
- أضف هذه المعلقات إلى الأنابيب المعقمة التي تحتوي على مرق مولر-هينتون لتحقيق النطاق الجديد من التركيزات المطلوبة للتجربة.
ملاحظة: تم تطبيق تركيزات MgO NPs التالية للتخفيف الدقيق: 30 جزء في المليون ، 60 جزء في المليون ، 120 جزء في المليون ، 250 جزء في المليون ، 500 جزء في المليون ، 1000 جزء في المليون ، 2000 جزء في المليون ، 3000 جزء في المليون ، 4000 جزء في المليون ، و 8000 جزء في المليون.
- إعداد التخفيف الدقيق15
- قم بإعداد صفيحة عيار 96 بئر جديدة ومعقمة (صفيحة دقيقة). عمود التسمية رقم 12 من الصفيحة الدقيقة كعمود عقم ؛ عمود التسمية رقم 11 كعمود للتحكم في النمو.
- أضف 120 ميكرولتر من معلقات الجسيمات النانوية بتركيزات مختلفة إلى الأعمدة رقم 1-10.
- تلقيح 120 ميكرولتر من البكتيريا (5 × 105 CFU / mL) في الآبار في الأعمدة رقم 1-10.
ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة ، كان الصف G والصف H عبارة عن ضوابط مع سيفترياكسون بتركيزات مقترحة وفقا لمعايير CLSI: 8 جزء في المليون ، 4 جزء في المليون ، 2 جزء في المليون ، 1 جزء في المليون ، 0.5 جزء في المليون ، 0.25 جزء في المليون ، 0.125 جزء في المليون ، 0.06 جزء في المليون ، و 0.03 جزء في المليون. - احتضان الصفيحة الدقيقة المكونة من 96 بئرا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية (35 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية). أخيرا ، قم بتحليل الآبار.
- النمو المسبق للسلالات
- مراقبة التغيرات المورفولوجية الهيكلية التي تسببها الجسيمات النانوية MgO في السلالات البكتيرية بواسطة AFM
- خذ 250 ميكرولتر من آبار اختبارات التخفيف الدقيق ، واخلطها مع 750 ميكرولتر من الماء المعقم ، وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم من 2 دقيقة إلى 5 دقائق عند 5 درجات مئوية.
- اغسل الرواسب ثلاث مرات ب 1 مل من الماء المعقم في كل مرة ، وفي نهاية الغسيل ، أضف 500 ميكرولتر من الماء إليها.
- للحصول على صور AFM ، خذ 10-20 ميكرولتر من التعليق النهائي لكل بئر بدء ، وقم بإجراء مسحة على شريحة تم تنظيفها مسبقا بواسطة الموجات فوق الصوتية (30 دقيقة) ، وجفف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
4. قياسات AFM
ملاحظة: هنا ، تم تركيب مجهر القوة الذرية في وضع التلامس على محطة عمل مضادة للاهتزاز سمحت بعزل المجهر عن أي مصادر اهتزازية ميكانيكية وأبقت النظام مستويا. يتم تقليل التداخل الكهربائي مع مرشحات الخط والحماية من زيادة التيار. يقوم AFM المستخدم هنا بمحاذاة شعاع الليزر تلقائيا مع الكاشف الضوئي.
- قم بتشغيل الكمبيوتر وAFM ، ثم حدد وضع الاتصال ومجسات contAI-G وخيارات Auto Slope في أدوات البرنامج. القيم الافتراضية لوحدة التحكم Z هي Setpoint = 20 nM ، P-Gain = 10000 ، I-Gain = 1000 ، D-Gain = 0 ، وجهد الطرف = 0 mV.
- ضع العينات في وضع تلامس AFM باستخدام رأس نطاق مسح 70 ميكرومتر. استخدمنا ناتئ السيليكون ContAI-G مع ثابت زنبركي 0.13 نيوتن / م.
- استخدم جهاز كاميرا مثبتا على عدستين مدمجتين في رأس المسح للحصول على رؤية سريعة لسطح المنطقة الواقعة أسفل المسبار.
- قم بإجراء إزاحة يدويا في المستوى XY لاختيار المنطقة المطلوبة. يتم إجراء المسبار للاقتراب إلكترونيا من عينة السطح حتى يتم الوصول إلى ظروف الاتصال. اضبط مستوى قياس XY للماسحة الضوئية وسطح العينة إلكترونيا عن طريق تقليل المنحدرات في اتجاهات XY.
- استخدم المعلمات القياسية للبرنامج: 1 سطر في الثانية بمعدل 256 نقطة لكل سطر.
- أولا ، قم بإجراء نطاق مسح كامل لمنطقة 70 ميكرومتر × 70 ميكرومتر ؛ ثم حدد مساحة أصغر باستخدام أداة التكبير/التصغير. يعمل AFM على تحسين نطاق الرسم البياني في Z تلقائيا.
ملاحظة: من خلال تقليل الخطوط في الثانية ، يزداد إجمالي وقت المسح ، وتكون جودة الفحص أكثر تحديدا ، كما يتم مسح بعض الضوضاء الناتجة عن القياس. - لتحديد منطقة جديدة من العينة ، اسحب الكابولي إلكترونيا ، وحرك العينة على طول المستوى XY. قم بإجراء فحص جديد باستخدام الإجراء الموضح في الخطوتين 4.5 والخطوة 4.6.
ملاحظة: يتم عرض عمليات المسح التي تم الحصول عليها بمقياس شريطي أحادي اللون ، حيث ترتبط الألوان الفاتحة بارتفاعات أعلى ، وترتبط الألوان الداكنة بارتفاعات أعمق. يقوم برنامج AFM بإنشاء عرض 3D للمسح الضوئي الذي يسمح بتقدير تفاصيل السطح المقاس. - قم بإجراء معالجة البيانات باستخدام تسوية السطر بخط في قائمة الأدوات للصورة في تحديد المرشح ، وهي طريقة التسوية الأكثر استخداما والأبسط.
ملاحظة: تأخذ طريقة التسوية هذه كل خط أفقي أو رأسي تم إنتاجه في صورة AFM وتناسبه مع معادلة كثيرة الحدود. - قم بتحسين الحد الأقصى والحد الأدنى للارتفاع في شريط الألوان على اليمين للحصول على أفضل دقة للصورة.
- قم بإجراء تحليل الصورة باستخدام القائمة تحليل في شريط الأدوات. حدد الارتفاعات والمسافات عن طريق تحديد النقاط الأولية والنهائية بمجرد تحديد الأداة المطلوبة.
ملاحظة: يجب على المستخدمين تجربة عوامل التصفية المختلفة لقائمة الأدوات لتجنب عيوب صورة تلميح بسبب التسطيح المستخدم في عملية التسوية. تظهر نتائج الصور كخطوط متتالية وتظهر في بعض صور AFM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم التقاط صور لمورفولوجيا وحجم سلالات S. aureus و P. hunanensis ، بالإضافة إلى التنظيم السكاني لكلتا السلالتين ، بواسطة مجهر القوة الذرية في وضع الاتصال. أظهرت صور S. aureus أن سكانها موزعون حسب المناطق التي تحتوي على مجاميع من المكورات (الشكل 1 أ). مع زيادة الحجم ، كان هناك تقدير أكبر للتوزيع السكاني ومورفولوجيا المكورات (الشكل 1 ب). أظهرت تقارير الفحص المجهري أن بنية نصف كروية زائفة كانت موجودة في الخلايا المجاورة للمكورات العنقودية الذهبية ، ولكن بشكل عام ، قدمت البكتيريا مورفولوجيا كروية في شكل كوكوس بعد انقسام الخلية ، كما هو موضح سابقا في صور AFM. بالإضافة إلى ذلك ، سمحت صور وضع الاتصال AFM بتحديد حجم الكوتشي ، والذي أظهر متوسط عرض 1.25 ميكرومتر. القيم التي تم الحصول عليها من قياس 20 خلية موضحة في الشكل 2.
في حالة P. hunanensis ، لوحظ توزيع متجانس على كامل سطح الدعامة الزجاجية ، مما شكل طبقة أحادية بكتيرية التزمت بالدعم (الشكل 3A) ، كما أفاد Zuttion et al. ، حيث قام المؤلفون بشل P. aureginosa على دعم صلب وأظهروا نفس السلوك. لوحظ أن بكتيريا Pseudomonas hunanensis على شكل قضيب ، بطول 1.9 ميكرومتر (L) وعرض 0.9 ميكرومتر (W) (الشكل 3B ، C) ؛ هذه البيانات ضمن القيم المبلغ عنها ل P. fluorescens من 1.5-2.0 ميكرومتر (L) و 0.6-0.9 ميكرومتر (W) 17،18،19.
لتصور التغيرات المورفولوجية الهيكلية بسبب تفاعل MgO NPs ، خضعت السلالات البكتيرية لتحليل AFM بعد العلاج (التخفيف الدقيق). يتم عرض ثلاث مجموعات في الشكل 4 والشكل 5: الشكل 4A-C والشكل 5A-C هي عناصر التحكم ؛ تم الحصول على الصور في الشكل 4D-F والشكل 5D-F من نتائج التخفيف الدقيق في MIC ؛ تم الحصول على صور الشكل 4G-I والشكل 5G-I بتركيز أعلى من MIC.
تظهر صور المجموعة العليا من الشكل 4A-C خلية من نوع المكورات العنقودية الذهبية ذات سطح أملس وملامح متجانسة ، والتي نمت في بيئة مناسبة في مرق مولر-هينتون لمدة 24 ساعة وفقا لتقنية التخفيف الدقيق. كان متوسط القطر 1 ميكرومتر ± 0.15 ميكرومتر. اختفى هذا القطر عمليا بعد معالجة NP ، كما هو موضح في الشكل 4D-F ، لأن تدهور البنية الخلوية كان شديدا جدا. وفقا للمقطع العرضي ، كان متوسط ارتفاع التحكم 200 نانومتر ± 50 نانومتر ؛ تم تقليل ارتفاع الخلايا المعالجة بنسبة 40٪ (120 نانومتر ± 5 نانومتر) بالنسبة إلى الضوابط. تظهر الصور بوضوح التغيرات في السطح ، مثل تكوين الحويصلات ، بعد التعرض ل MgO NPs في CMI للجسيمات. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال مضاعفة التركيزات ، تأثرت الحالة الداخلية للهياكل الخلوية ، وتم إطلاق مادة خلوية ، كما هو موضح في صور الشكل4G-I 20,21.
تم تحديد هذه التغييرات أيضا في خلايا الإشريكية القولونية، كما هو موضح في الشكل 5، مع حالات مشابهة لبكتيريا العنقودية الذهبية. أظهرت ضوابط هذه البكتيريا أسطحا ناعمة ، مما يبرز شكلها المتجانس للغاية الذي يشبه القضيب (العصوية) دون أي تغيير واضح. تظهر الصور ثلاثية الأبعاد أعلى المناطق الطبوغرافية المرتبطة بالكائنات الحية الدقيقة باللون الأبيض. كان متوسط ارتفاع السيطرة E. coli 160 نانومتر ± 50 نانومتر ، ووفقا للصور المقطعية ، انخفض متوسط الارتفاع إلى 76 نانومتر ± 10 نانومتر للخلايا المعرضة لمدة 24 ساعة لتركيز جسيمات MgO النانوية 500 جزء في المليون (MIC). اختفى الهيكل تماما بتركيز 1000 جزء في المليون ، ويمكن تمييز الصور الظلية للبكتيريا فقط. عند تحليل الصور لكلا التركيزين ، لوحظ أنه فيما يتعلق بالضوابط ، تم تغيير مورفولوجيا الخلية للخلايا المعالجة بشكل كبير ، مع استطالة 2.0 ميكرومتر ± 0.5 ميكرومتر (الشكل 5A-C) إلى 3.0 ميكرومتر ± 0.3 ميكرومتر ، كما هو موضح في صور الشكل 5D-I. كانت هذه الزيادة واضحة عندما كان الهيكل الخلوي يفقد التوازن الداخلي ، مما تسبب في انهيار هيكلي20,22. أظهرت صور البكتيريا المعرضة ل MgO NPs بوضوح تغيرات سطحية مثل تكوين التلال أو التمويج الذي يشكل اضطرابات حويصلية في كل من البلدان المتوسطة الدخل وعند مضاعفة التركيزات20,22.
الشكل 1: وضع التلامس المجهري للقوة الذرية للمكورات العنقودية الذهبية. يوضح هذا الشكل التضاريس المأخوذة من S. aureus بمقاييس مختلفة: (A) 70 μm و (B) 5.0 μm. تم اختيار مناطق رسم الخرائط للحصول على تضاريس S. aureus. تظهر الصورة B بوضوح المكورات العنقودية الذهبية . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: طبوغرافيات نمط ملامسة القوة الذرية المجهرية والرسوم البيانية للمكورات العنقودية الذهبية. تظهر الصورة التضاريس (A) و (B) الرسم البياني لأقطار بكتيريا S. aureus المثبتة على دعامة زجاجية باستخدام إجراء التثبيت الحراري. تم قياس قطر الخلية باستخدام برنامج AFM. ن = 20. الصورة هي تمثيل للقياس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: وضع الاتصال بمجهر القوة الذرية ل Pseudomonas hunanensis 1AP-CY. يوضح هذا الشكل التضاريس المأخوذة من P. hunanensis 1AP-CY بمقاييس مختلفة: (A) 70 μm و (B) 20 μm و (C) 5.0 μm. تظهر الصور بمقاييس مختلفة توزيع عدد الخلايا على الشريحة. لتحليل مورفولوجيا الخلية ، يتم التركيز على منطقة ذات كثافة سكانية أقل ، كما هو موضح في الصورة B ، والتي توضح شكل قضيب P. hunanensis (تظهر إشارة الانحراف من أجل تحسين صورة التضاريس). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. صور وضع التلامس AFM التي تم الحصول عليها ل S. aureus غير المعالجة (أعلى) و S. aureus معرضة ل 250 جزء في المليون و 500 جزء في المليون من جسيمات MgO النانوية (الوسطى والسفلية) لمدة 24 ساعة. (أ ، د ، ز) الصور الطبوغرافية; (B,E,H) صور ثلاثية الأبعاد؛ (C، F، I) صور مقطعية. لوحظت تغيرات هيكلية في البكتيريا عند استخدام الحد الأدنى من التركيز المثبط ل MgO (250 جزء في المليون) وتركيز أعلى (500 جزء في المليون). يتم عرض إشارة الانحراف لتحسين صورة التضاريس. الشكل 4A ، D ، G مأخوذ من مونييز دياز وآخرون 14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور وضع التلامس AFM التي تم الحصول عليها ل E. coli (أعلى) و E. coli غير المعالجة المعرضة ل 500 جزء في المليون و 1000 جزء في المليون من جسيمات MgO النانوية (الوسطى والسفلية) لمدة 24 ساعة (A ، D ، G) الصور الطبوغرافية ؛ (B,E,H) صور ثلاثية الأبعاد؛ (C، F، I) صور مقطعية. لوحظت تغيرات هيكلية في البكتيريا عند استخدام الحد الأدنى من التركيز المثبط ل MgO (500 جزء في المليون) وتركيز أعلى (1000 جزء في المليون). الشكل 5A و D و G مأخوذ من مونييز دياز وآخرون 14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الفحص المجهري هو تقنية شائعة الاستخدام في المختبرات البيولوجية تسمح بالتحقيق في بنية العينات البيولوجية وحجمها ومورفولوجيا وترتيبها الخلوي. لتحسين هذه التقنية ، يمكن استخدام عدة أنواع من المجاهر التي تختلف عن بعضها البعض من حيث خصائصها البصرية أو الإلكترونية ، والتي تحدد قوة دقة الأداة.
في البحث العلمي ، يلزم استخدام الفحص المجهري لتوصيف الخلايا البكتيرية. على سبيل المثال ، أظهر الفحص المجهري أن كلوريد الصوديوم يؤثر على المقاومة الحرارية ومورفولوجيا الخلايا لسلالات الإشريكية القولونية ، ويظهر مستخلص Schisandra chinensis تأثيرات مضادة للبكتيريا تجاه S. aureus ، وتطور S. aureus التحمل الحراري بعد صدمة حرارية شبه مميتة ، و E. coli biomineralizes البلاتين 23،24،25، 26،27. وبالتالي ، فإن المزايا التي تقدمها AFM سمحت بتوسعها في مجالات البحث في البيئة والبيولوجيا.
مجهر القوة الذرية هو أداة تستخدم في وضع الاتصال لتحليل البكتيريا في الموقع وفي وضع عدم الاتصال لتحديد تضاريس المواد الكلية والنانوية. ميزة AFM على التقنيات الأخرى هي أنها تتطلب عينات أقل للحصول على صور طبوغرافية. تعتبر أيضا تقنية غير مدمرة ، ولا تلحق الضرر أو تضر ببنية الصورة التي تم تحليلها. على الرغم من أننا استخدمنا تثبيت الحرارة في هذا البروتوكول ، إلا أن مورفولوجيا الخلايا البكتيرية لم تتغير. من المهم الإشارة إلى أن هذه التقنية شائعة الاستخدام في مختبر الأحياء الدقيقة لدراسة الأشكال البكتيرية. على عكس عينات الأنسجة النباتية والحيوانية ، تنتج تقنية التثبيت الحراري تغيرات في البروتينات والدهون التي تتجلى في تدهور الأنسجة. في البكتيريا ، تسبب هذه التقنية انكماشا طفيفا للخلية لا يتداخل مع مراقبة شكل الخلية وتحديدها.
مع AFM ، يكون تحضير العينة سهلا ولا يتطلب أي منتجات كيميائية ، كما في حالة المجهر الإلكتروني ، حيث من الضروري أن تكون العينة المراد تحليلها موصلة ، حيث يتم إنتاج الصورة من خلال تفاعل الإلكترونات المنبعثة من الجهاز والعينة. إذا لم تكن العينة موصلة ، فيجب أن تكون معدنية بعنصر موصل مثل الذهب عن طريق تقنية ترسيب البخار الفيزيائي. علاوة على ذلك ، تصل دقة المجهر الإلكتروني إلى 0.4 نانومتر ، اعتمادا على العدسة والطراز ، في حين أن AFM في وضع التلامس يمكن أن تصل إلى دقة ميكرومتر أو نانومتر أو حتى بيكومتر ، مما يجعلها قادرة على المنافسة مع المجهر الإلكتروني22. ميزة أخرى ل AFM على المجهر الإلكتروني هي أنه لا يتطلب ظروف فراغ عالية لمعالجة العينات20,21. المزايا الأخرى ل AFM على التقنيات شائعة الاستخدام هي التكلفة المنخفضة ووقت الحصول على الصور القصير.
فيما يتعلق بتقنية تثبيت العينة البكتيرية على صفيحة زجاجية ، من المهم الإشارة إلى أن التثبيت الحراري هو تقنية شائعة الاستخدام في مختبرات الأحياء الدقيقة. تستخدم هذه التقنية بحيث يمكن التعرف على العينات البكتيرية عن طريق تلطيخ بسيط أو تفاضلي. في الوقت نفسه ، يمكن رؤية شكل البكتيريا ، عادة المكورات أو القضيب. عيب تقنية التثبيت الحراري هو انخفاض حجم البكتيريا ، لكن هذه التقنية لا تضر بشكل البكتيريا.
بعد التثبيت ، يجب توخي الحذر لتجنب شيخوخة العينة ، والتي يمكن أن تظهر كانخفاض كبير في حجم الخلية ؛ وبالتالي ، فمن المستحسن تحليل العينة في غضون 24 ساعة من التثبيت. وينبغي أيضا توخي الحذر لضمان عدم تعرض العينة للغبار؛ لذلك ، يجب حفظ العينات في حاوية مغلقة (على سبيل المثال ، طبق بتري). هذه الشروط حرجة لأنها قد تغير صور AFM التي تم الحصول عليها.
من الواضح أن تقليل حجم البكتيريا قد يؤثر على بعض الأعمال البحثية ، بالإضافة إلى أنه قد تكون هناك حاجة إلى طرق أخرى لربط البكتيريا بالدعم. على سبيل المثال ، تم تثبيت الأغشية الحيوية S. aureus المزروعة في مرق BM على ألواح 34 مم باستخدام glyceraldehyde. علاوة على ذلك ، تم تجميد S. aureus باستخدام ناتئات على شكل حرف V معالجة ببولي l-lysine ، بينما بالنسبة ل C. albicans ، تم تثبيت الخيوط الفطرية على شرائح زجاجية مطلية ببولي L-lysine موجب الشحنة من أجل تحليل تبادل بروتينات المصل الممتصة أثناء التصاق كليهما بسطح لاأحيائي28,29.
في هذا العمل ، لم يغير التثبيت الحراري للعينات الشكل أو الركام الذي شكلته البكتيريا ، وسمح التثبيت الحراري بتصور تأثير الجسيمات النانوية. لذلك ، يمكن أن تظهر طوبوغرافيا AFM شكل المكورات المعزولة أو مجاميع S. aureus وقضبان P. hunanensis (الشكل 1 والشكل 3). بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا أيضا أن S. aureus و E. coli أظهرا تلفا في هياكلهما بسبب تأثير جسيمات MgO النانوية ، في حين أن عينات التحكم (بدون جسيمات نانوية) لم تظهر أي تغيير في مورفولوجيتها (الشكل 4 والشكل 5).
يوضح هذا العمل أن استخدام طريقة الاتصال AFM هو بديل قابل للتطبيق لتوصيف طوبولوجيا السطح وعيوب العينات البيولوجية ، كما هو موضح مع S. aureus و P. hunanensis و E. coli. علاوة على ذلك ، فإن تقنية التثبيت الحراري ليست عاملا محددا يغير سطح الخلية ويمنع التحليل. بشكل متواضع ، يمكننا أن نقترح أن تثبيت الحرارة قد يكون ميزة في استخدام AFM. تتم معالجة العينات بشكل أقل ، ويتم تجنب استخدام الكواشف الكيميائية. لذلك ، فإن المنهجية هي تقنية بسيطة واقتصادية. تجدر الإشارة إلى أن هذا قد يتغير اعتمادا على التحليل المحدد الذي يتعين إجراؤه ، كما هو موضح لدراسة الأغشية الحيوية والالتصاق البكتيري28,29. كامتداد محتمل لهذا العمل ، يمكن استخدام وضع الاتصال AFM لتحليل تأثير NPs على البكتيريا المهمة طبيا الأخرى أو في الأبحاث التي يجب فيها ملاحظة تلف الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
Acknowledgments
راميرو مونيز دياز يشكر CONACyT على المنحة الدراسية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
References
- Koch, A. L. Growth and form of the bacterial cell wall. American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).
- Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. Bacterial growth and form under mechanical compression. Scientific Report. 5, 11367 (2015).
- Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology. Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).
- Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C.
- Smith, W. P., et al. Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).
- Volke, D. C., Nikel, P. I. Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories. Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).
- Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology. Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).
- Hoffman, C. S., Winston, F. A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).
- Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
- Behr, S., Mätzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis. ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).
- Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure. Nucleosides & Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stackebrandt, E., Ebers, J. Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards. Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).
- Muñiz Diaz, R., et al. Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria. Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).
- Andrews, J. M.
- Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals. Methods. 42 (4), 321-324 (2007).
- Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).
- Yamada, S., et al. autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).
- Zuttion, F., et al. The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy. Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).
- Kahli, H., et al. Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).
- Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations. World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).
- Kochan, K., et al. et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria. Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).
- Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents. Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).
- Lee, H. -E., et al. NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains. Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).
- Song, L. Y., et al. Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food. Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).
- Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock. Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).
- Shar, S. S., et al. Biomineralization of platinum by Escherichia coli. Metals. 9 (4), 407 (2019).
- Baidamshina, D., et al. Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease. Scientific Reports. 7, 46068 (2017).
- Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).
