Summary
Her præsenterer vi anvendelsen af atomkraftmikroskopi (AFM) som en enkel og hurtig metode til bakteriel karakterisering og analyserer detaljer såsom bakteriestørrelse og form, bakteriekulturbiofilm og aktiviteten af nanopartikler som baktericider.
Abstract
Elektronmikroskopi er et af de værktøjer, der kræves for at karakterisere cellulære strukturer. Proceduren er imidlertid kompliceret og dyr på grund af prøveforberedelsen til observation. Atomkraftmikroskopi (AFM) er en meget nyttig karakteriseringsteknik på grund af dens høje opløsning i tre dimensioner og på grund af fraværet af ethvert krav til vakuum og prøveledningsevne. AFM kan afbilde en lang række prøver med forskellige topografier og forskellige typer materialer.
AFM giver 3D-topografiinformation i høj opløsning fra angstrom-niveau til mikronskala. I modsætning til traditionel mikroskopi bruger AFM en sonde til at generere et billede af overfladetopografien af en prøve. I denne protokol foreslås brugen af denne type mikroskopi til morfologisk og celleskadekarakterisering af bakterier fastgjort på en støtte. Stammer af Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) og Pseudomonas hunanensis (isoleret fra hvidløgsløgprøver) blev anvendt. I dette arbejde blev bakterieceller dyrket i specifikke kulturmedier. For at observere celleskader blev Staphylococcus aureus og Escherichia coli inkuberet med forskellige koncentrationer af nanopartikler (NP'er).
En dråbe bakteriel suspension blev fastgjort på en glasstøtte, og billeder blev taget med AFM i forskellige skalaer. De opnåede billeder viste bakteriens morfologiske egenskaber. Ved anvendelse af AFM var det endvidere muligt at observere skaden på den cellulære struktur forårsaget af effekten af NP'er. Baseret på de opnåede billeder kan kontakt-AFM bruges til at karakterisere morfologien af bakterieceller fastgjort på en understøtning. AFM er også et velegnet værktøj til undersøgelse af NP'ers virkninger på bakterier. Sammenlignet med elektronmikroskopi er AFM en billig og brugervenlig teknik.
Introduction
Forskellige bakterieformer blev først bemærket af Antony van Leeuwenhoek i det 17. århundrede1. Bakterier har eksisteret i en stor mangfoldighed af former siden oldtiden, lige fra kugler til forgreningsceller2. Celleform er en grundlæggende betingelse for bakterielle taxonomer til at beskrive og klassificere hver bakterieart, hovedsageligt til morfologisk adskillelse af gram-positiv og gram-negativ phyla3. Flere elementer er kendt for at bestemme bakterielle celleformer, som alle er involveret i celledækslerne og støtten som komponenter i cellevæggen og membranen såvel som i cytoskelettet. På denne måde belyser forskere stadig de kemiske, biokemiske og fysiske mekanismer og processer, der er involveret i bestemmelse af bakteriecelleformer, som alle er defineret af klynger af gener, der definerer bakterieformer 2,4.
Derudover har forskere vist, at stavformen sandsynligvis er den forfædres form af bakterieceller, da denne celleform synes optimal i cellesignifikante parametre. Således betragtes kokker, spiral, vibrio, filamentøse og andre former som tilpasninger til forskellige miljøer; Faktisk har bestemte morfologier udviklet sig uafhængigt flere gange, hvilket tyder på, at bakteriernes former kunne være tilpasninger til bestemte miljøer 3,5. Men i løbet af bakteriecellens livscyklus ændres celleformen, og dette sker også som en genetisk reaktion på skadelige miljøforhold3. Bakteriens celleform og størrelse bestemmer stærkt bakteriernes stivhed, robusthed og overflade-til-volumen-forhold, og denne egenskab kan udnyttes til bioteknologiske processer6.
Elektronisk mikroskopi bruges til at studere biologiske prøver på grund af den høje forstørrelse, der kan nås ud over lysbaserede mikroskoper. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) og scanningelektronmikroskopi (SEM) er de mest almindeligt anvendte teknikker til dette formål; Prøver kræver dog nogle behandlinger, før de placeres i mikroskopets kammer for at opnå passende billeder. Et gulddæksel på prøverne er påkrævet, og den tid, der bruges til total billedoptagelse, bør ikke være for lang. I modsætning hertil er atomkraftmikroskopi (AFM) en teknik, der i vid udstrækning anvendes til analyse af overflader, men anvendes også til undersøgelse af biologiske prøver.
Der er flere typer AFM-tilstande, der anvendes i overfladeanalyse, såsom kontakttilstand, berøringsfri tilstand eller tapping, magnetisk kraftmikroskopi (MFM), ledende AFM, piezoelektrisk kraftmikroskopi (PFM), peak force tapping (PFT), kontaktresonans og kraftvolumen. Hver tilstand bruges til analyse af materialer og giver forskellige oplysninger om materialernes overflade og deres mekaniske og fysiske egenskaber. Imidlertid anvendes nogle AFM-tilstande til analyse af biologiske prøver in vitro, såsom PFT, fordi PFT giver mulighed for at opnå topografiske og mekaniske data om celler i et flydende medium7.
I dette arbejde brugte vi den mest basale tilstand, der er inkluderet i enhver gammel og enkel AFM-model - kontakttilstanden. AFM bruger en skarp sonde (ca. <50 nm i diameter) til at scanne områder mindre end 100 μm. Sonden er justeret til prøven for at interagere med de kraftfelter, der er knyttet til prøven. Overfladen scannes med sonden for at holde kraften konstant. Derefter genereres et billede af overfladen ved at overvåge udkragningens bevægelse, når den bevæger sig over overfladen. De indsamlede oplysninger giver overfladens nanomekaniske egenskaber, såsom vedhæftning, elasticitet, viskositet og forskydning.
I AFM-kontakttilstand scannes udkragningen hen over prøven ved en fast afbøjning. Dette gør det muligt at bestemme højden af prøverne (Z), og dette repræsenterer en fordel i forhold til de andre elektroniske mikroskopteknikker. AFM-softwaren tillader generering af en 3D-billedscanning ved interaktionen mellem spidsen og prøveoverfladen, og spidsafbøjningen er korreleret med prøvens højde gennem en laser og en detektor.
I statisk tilstand (kontakttilstand) med konstant kraft præsenterer udgangen to forskellige billeder: højden (z-topografi) og afbøjnings- eller fejlsignalet. Statisk tilstand er en værdifuld, enkel billeddannelsestilstand, især for robuste prøver i luft, der kan håndtere de høje belastninger og vridningskræfter, der udøves af statisk tilstand. Afbøjnings- eller fejltilstanden betjenes i konstant krafttilstand. Topografibilledet forbedres dog yderligere ved at tilføje afbøjningssignalet til overfladestrukturen. I denne tilstand kaldes afbøjningssignalet også fejlsignalet, da afbøjningen er feedbackparameteren; Alle funktioner eller morfologi, der vises i denne kanal, skyldes "fejlen" i feedback-sløjfen eller rettere på grund af den feedback-sløjfe, der kræves for at opretholde et konstant afbøjningssætpunkt.
AFM's unikke design gør den kompakt - lille nok til at passe på en bordplade - samtidig med at den har høj nok opløsning til at løse atomtrin. AFM-udstyret har lavere omkostninger end udstyret til andre elektroniske mikroskoper, og vedligeholdelsesomkostningerne er minimale. Mikroskopet kræver ikke et laboratorium med særlige forhold såsom et rent rum eller et isoleret rum; Det behøver kun et vibrationsfrit skrivebord. For AFM behøver prøverne ikke at gennemgå omfattende forberedelse som for andre teknikker (gulddæksel, slankning); Der må kun fastgøres en tør prøve til prøveholderen.
Vi bruger AFM-kontakttilstand til at observere bakterielle morfologier og virkningerne af NP'er. Populationen og cellulær morfologi af bakterier fastgjort på en støtte kan observeres, såvel som den cellulære skade produceret af nanopartikler på bakteriearterne. Billederne opnået ved AFM-kontakttilstand bekræfter, at det er et kraftfuldt værktøj og ikke er begrænset af reagenser og komplicerede procedurer, hvilket gør det til en enkel, hurtig og økonomisk metode til bakteriel karakterisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteriel isolering og identifikation
- Isolering af en endofytisk stamme fra hvidløgspæremeristemer:
- 2 mm fragmenter af meristemer fra tidligere skrællede, desinficerede og skårne hvidløgsløg anbringes på trypticase sojaagar (TSA) som et rigt vækstmedium, og de inkuberes ved 25 °C i 1 dag.
- Baseret på de morfologiske forskelle i bakteriekolonierne - form, størrelse, farve, kant, transmitteret lys, reflekteret lys, tekstur, konsistens og pigmentproduktion - beskrives de forskellige observerede morfotyper og renses ved at krydsstribe en repræsentativ koloni af hver morfotype.
- Opbevar alle de rensede bakteriestammer i 30% glycerol ved -80 °C.
- Identificer en tilfældigt udvalgt stamme (9AP) ved at sekventere 16S rDNA. Uddrag DNA'et efter metoden fra Hoffman og Winston8.
- Forstærk 16S rRNA ved polymerasekædereaktion (PCR) med 100 ng DNA, 1x polymerasebuffer, 4 mMMgCl2, 0,4 mM dNTP'er, 10 pmol hver af 27F/1492r universelle oligonukleotider og 1 U DNA-polymerase9. Brug følgende termiske cykliske betingelser: 95 ° C i 5 minutter til den indledende denaturalisering; efterfulgt af 35 cyklusser på 1 minut ved 94 °C som denaturalisationstemperatur, 1 min ved 56 °C som hybridiseringstemperatur og 1 minut ved 72 °C som forlængelsestemperatur og derefter 10 min ved 72 °C som en sidste forlængelse.
- Kapillær sekvens PCR-produktet under anvendelse af de samme oligonukleotider Brug dideoxyterminalmetoden med matrixinstallationssættet til kapillærsekventering10, og udfør elektroforese i et automatiseret multikapillærsystem11.
- Rediger sekvenserne manuelt, sammenlign sekvensen med GenBank-biblioteket ved hjælp af en BLAST-søgning, og identificer forsøgsvis stammen med guldstandarden på mindst 98,7% identitet med den nærmeste art12,13.
BEMÆRK: Stammen 9AP blev identificeret som tilhørende arten Pseudomonas hunanensis med en identitet på 99,86% med sekvensen for stammen P. hunanensis LV (JX545210).
2. Forberedelse af bakterieprøver til morfologisk observation ved hjælp af AFM
- Under sterile forhold anbringes en dråbe bakteriesuspension (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) på et glasglas.
- Fastgør prøverne på diaset ved tør opvarmning. Glideren føres forsigtigt over en flamme flere gange, indtil prøven er tør.
BEMÆRK: Fiksering af prøver er en rutinemæssig teknik inden for mikrobiologi til at observere faste prokaryote organismer og simulere deres struktur som levende celler så tæt som muligt. - Placer de faste prøver i en petriskål, og tag dem til AFM-udstyret til observation.
BEMÆRK: Da prøverne kan ændres af vejrforholdene over tid, skal du afsætte en maksimal tid på 24 timer til analyse i AFM-udstyret. Hold prøverne fri for støv.
3. Antibakteriel virkning af MgO nanopartikler mod bakterier
BEMÆRK: Syntesen og karakteriseringen af MgO NP'er er tidligere offentliggjort14. I dette arbejde blev nanomaterialernes antibakterielle aktivitet estimeret baseret på manualen fra Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) ved hjælp af makrofortyndings- og mikrofortyndingsmetoder til hæmning15,16.
- Estimering af mindste hæmmende aktivitet (MIC) og baktericider (CMB)
- Forvækst af stammerne
- Der podes en passende mængde Escherichia coli eller Staphylococcus aureus i nærende bouillon for at opnå en slutkoncentration på 1 ×10 8 CFU/ml.
- Suspensionen inkuberes ved 37 °C (± 2 °C) i 18-24 timer.
- Eftervækst af akklimatiserede stammer
- Dyp en steril bakteriologisk sløjfe i suspensionen, der berører bunden af røret.
- Udfør striber med løkken på eosin og methylenblå agar og næringsagar.
- Agarpladerne inkuberes ved 37 °C (± 2 °C) i 24 timer.
- Udvælgelse af kolonier til fremstilling af det standardiserede inokulum
- Tag tre til fem kolonier med samme morfologiske type ved at røre toppen af kolonien i petriskålen med en bakteriologisk sløjfe.
- Overfør og nedsænk udvælgelsen i 3-5 ml Müller-Hinton bouillon.
- Der inkuberes ved 37 °C (± 2 °C) for at opnå en turbiditet på 1 × 10 8 CFU/ml eller 2 × 108 CFU/ml.
BEMÆRK: I dette arbejde blev McFarland turbiditetsstandarder brugt som reference for de bakteriologiske suspensioner; specifikt svarer 0,5-standarden omtrent til en homogen E. coli-suspension på 1,5 × 108 celler / ml. Et UV-Vis-spektrofotometer blev brugt til at måle turbiditeten. - Tag 1 ml, og tilsæt det til 9 ml steril bouillon. Tag 200 μL af denne fortynding, og tilsæt den til 19,8 ml steril bouillon for at opnå en slutkoncentration på 5 × 105 CFU / ml.
- Påkrævede koncentrationer af MgO nanopartikler
- Brug en ultralydator til fremstilling af opløsningerne.
- Nanomaterialet suspenderes i sterilt vand i det dobbelte af den koncentration, der kræves for at opnå serielle opløsninger.
- Tilsæt disse suspensioner til sterile rør indeholdende Müller-Hinton bouillon for at opnå det nye koncentrationsområde, der kræves til eksperimentet.
BEMÆRK: Følgende MgO-NP-koncentrationer blev anvendt til mikrofortynding: 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1.000 ppm, 2.000 ppm, 3.000 ppm, 4.000 ppm og 8.000 ppm.
- Fremstilling af mikrofortyndingen15
- Forbered en ny og steril 96-brønds mikrotiterplade (mikroplade). Etiketkolonne nr. 12 på mikropladen som sterilitetskolonne; etiketkolonne nr. 11 som en vækstkontrolkolonne.
- Der tilsættes 120 μL nanopartikelsuspensioner med de forskellige koncentrationer i kolonne nr. 1-10.
- Der podes 120 μL bakterier (5 ×10 5 CFU/ml) i hullerne i kolonne nr. 1-10.
BEMÆRK: I dette studie var række G og række H kontroller med ceftriaxon i koncentrationer foreslået af CLSI-standarder: 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0,5 ppm, 0,25 ppm, 0,125 ppm, 0,06 ppm og 0,03 ppm. - Mikropladen med 96 huller inkuberes i 24 timer ved 37 °C (35 °C ± 2 °C). Til sidst skal du analysere brøndene.
- Forvækst af stammerne
- Observation af MgO nanopartikel-inducerede morfostrukturelle ændringer i bakteriestammerne af AFM
- Der udtages 250 μL fra hullerne i mikrofortyndingstestene, blandes med 750 μL sterilt vand, og centrifugeres ved 2 000 × g fra 2 min til 5 minutter ved 5 °C.
- Vask bundfaldet tre gange med 1 ml sterilt vand hver gang, og ved vaskens afslutning tilsættes 500 μL vand til dem.
- For at opnå AFM-billederne skal du tage 10-20 μL af den endelige suspension af hver startbrønd, udføre et udtværing på et dias, der tidligere er rengjort med ultralyd (30 min), og tørre ved stuetemperatur i 1 time.
4. AFM-målinger
BEMÆRK: Her blev atomkraftmikroskopet i kontakttilstand monteret på en antivibrationsarbejdsstation, der tillod isolering af mikroskopet fra enhver mekanisk vibrationskilde og holdt systemet nivelleret. Elektrisk interferens mindskes med linjefiltre og overspændingsbeskyttelse. AFM, der bruges her, justerer automatisk laserstrålen til fotodetektoren.
- Tænd computeren og AFM'en, og vælg derefter kontakttilstand, contAI-G-sonderne og indstillingerne Auto Slope i softwareværktøjerne. Standardværdierne for Z-controlleren er Setpoint = 20 nM, P-Gain = 10.000, I-Gain = 1.000, D-Gain = 0 og Tipspænding = 0 mV.
- Anbring prøverne i AFM-kontakttilstand ved hjælp af et 70 μm scanningsområdehoved. Vi brugte ContAI-G siliciumudkragninger med en fjederkonstant på 0,13 N/m.
- Brug en kameraenhed monteret på to objektiver, der er integreret i scanningshovedet, for at få et hurtigt overblik over overfladen af området under sonden.
- Udfør manuelt en forskydning i XY-planet for at vælge det ønskede område. Sonden er lavet til elektronisk at nærme sig overfladeprøven, indtil kontaktbetingelserne er nået. Juster XY-måleplanet på scanneren og prøveoverfladen elektronisk ved at reducere hældningerne i XY-retningerne.
- Brug softwarens standardparametre: 1 linje pr. Sekund ved 256 point pr. Linje.
- Udfør først et fuldt scanningsområde på et område på 70 μm x 70 μm; Vælg derefter et mindre område ved hjælp af zoomværktøjet. AFM optimerer automatisk kortområdet i Z.
BEMÆRK: Ved at reducere linjerne pr. sekund øges den samlede scanningstid, kvaliteten af scanningen er mere defineret, og noget støj fra målingen ryddes også. - For at vælge et nyt område fra prøven skal du trække udkragningen elektronisk tilbage og flytte prøven langs XY-planet. Realiser en ny scanning ved hjælp af proceduren beskrevet i trin 4.5 og trin 4.6.
BEMÆRK: De opnåede scanninger vises i en enkeltfarvet bjælkeskala, hvor de lyse farver er forbundet med højere højder, og de mørke farver er forbundet med dybere højder. AFM-softwaren genererer en 3D-visning af scanningen, der gør det muligt at vurdere detaljerne i den målte overflade. - Udfør databehandlingen ved hjælp af linje for linje nivellering i menuen Funktioner i billedet i filtervalget, som er den mest anvendte og enkleste nivelleringsmetode.
BEMÆRK: Denne nivelleringsmetode tager hver vandret eller lodret linje, der produceres i AFM-billedet, og tilpasser den til en polynomialligning. - Optimer den maksimale og minimale højde i farvebjælken til højre for at opnå den bedste billedopløsning.
- Udfør billedanalysen ved hjælp af menuen Analyse på værktøjslinjen. Bestem højder og afstande ved at vælge start- og slutpunkterne, når det ønskede værktøj er valgt.
BEMÆRK: Brugere skal prøve de forskellige filtre i menuen Funktioner for at undgå tipbilledartefakter på grund af den samkopiering, der bruges i udjævningsprocessen. Billedartefakter vises som streglinjer og vises på nogle af AFM-billederne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Billeder af morfologien og størrelsen af S. aureus og P. hunanensis stammer samt befolkningsorganisationen af begge stammer blev taget ved atomkraftmikroskopi i kontakttilstand. S. aureus-billederne viste, at dens befolkning var fordelt på zoner med aggregater af kokker (figur 1A). Med en stigning i skala var der en større forståelse af populationsfordelingen og morfologien af kokkerne (figur 1B). Mikroskopirapporterne viste, at en pseudo-halvkugleformet struktur var til stede i tilstødende celler af S. aureus, men at bakterierne generelt præsenterede en sfærisk morfologi i form af en coccus efter celledeling, som tidligere vist i AFM-billederne. Derudover tillod AFM-kontakttilstandsbillederne bestemmelse af cocciens størrelse, som viste en gennemsnitlig bredde på 1, 25 μm. De værdier, der opnås ved måling af 20 celler, er vist i figur 2.
I tilfælde af P. hunanensis blev der observeret en homogen fordeling på hele overfladen af glasstøtten, der dannede et bakterielt monolag, der klæbede til understøtningen (figur 3A), som rapporteret af Zuttion et al., hvor forfatterne immobiliserede P. aureginosa på en solid støtte og viste den samme adfærd. Pseudomonas hunanensis-bakterier blev observeret at være stavformede med en længde på 1,9 μm (L) og en bredde på 0,9 μm (W) (figur 3B,C); disse data ligger inden for de rapporterede værdier for P. fluorescens på 1,5-2,0 μm (L) og 0,6-0,9 μm (W)17,18,19.
For at visualisere de morfostrukturelle ændringer på grund af interaktionen mellem MgO-NP'erne blev bakteriestammerne udsat for AFM-analyse efter behandling (mikrofortynding). Tre grupper er vist i figur 4 og figur 5: figur 4A-C og figur 5A-C er kontrollerne; billederne i figur 4D-F og figur 5D-F er fremstillet på grundlag af resultaterne af mikrofortyndingen ved MIC. billederne af figur 4G-I og figur 5G-I blev opnået i en højere koncentration end MIC.
Billederne af den øverste gruppe af figur 4A-C viser en coccus-type celle af Staphylococcus aureus med en glat overflade og homogene konturer, der voksede i et passende miljø i Müeller-Hinton bouillon i 24 timer i henhold til mikrofortyndingsteknikken. Den gennemsnitlige diameter var 1 μm ± 0,15 μm. Denne diameter forsvandt praktisk talt efter NP-behandling, som vist i figur 4D-F, da forringelsen af cellestrukturen var meget alvorlig. Ifølge tværsnittet var den gennemsnitlige højde for kontrollen 200 nm ± 50 nm; Højden af de behandlede celler blev reduceret med 40% (120 nm ± 5 nm) i forhold til kontrollerne. Billederne viser tydeligt ændringer i overfladen, såsom dannelsen af vesikler, efter eksponering for MgO NP'er i partiklernes CMI; Derudover blev den interne status af de cellulære strukturer påvirket ved at fordoble koncentrationerne, og cytosolisk materiale blev frigivet, som vist på billederne i figur4G-I 20,21.
Disse ændringer blev også identificeret i E. coli-celler, som vist i figur 5, med tilstande svarende til S. aureus. Kontrollerne af denne bakterie viste glatte overflader og fremhævede dens meget homogene stavlignende form (bacillus) uden nogen tilsyneladende ændring. De tredimensionelle billeder viser de højeste topografiske områder forbundet med mikroorganismen i hvidt. Den gennemsnitlige højde af kontrollen E. coli var 160 nm ± 50 nm, og ifølge tværsnitsbillederne faldt gennemsnitshøjden til 76 nm ± 10 nm for celler udsat i 24 timer for en koncentration af MgO-nanopartikler på 500 ppm (MIC). Strukturen forsvandt fuldstændigt i en koncentration på 1.000 ppm, og kun silhuetterne af bakterierne kunne skelnes. Ved analyse af billederne for begge koncentrationer blev det observeret, at med hensyn til kontrollerne blev cellemorfologien af de behandlede celler signifikant ændret med en forlængelse på 2,0 μm ± 0,5 μm (figur 5A-C) til 3,0 μm ± 0,3 μm, som vist på billederne i figur 5D-I. Denne stigning var tydelig, da den cellulære struktur mistede intern homeostase, hvilket forårsagede strukturelt sammenbrud20,22. Billederne af bakterier udsat for MgO NP'er viste tydeligt overfladeændringer såsom rygdannelse eller korrugeringer, der dannede vesikulære forstyrrelser ved begge MIC'er og ved fordobling af koncentrationerne20,22.
Figur 1: Atomic force mikroskopi kontakttilstand for Staphylococcus aureus. Denne figur viser topografierne taget fra S. aureus på forskellige skalaer: (A) 70 μm og (B) 5,0 μm. Kortlægningsområderne blev valgt for at opnå S. aureus-topografien ; billede B viser tydeligt S. aureus cocci. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Atomic force mikroskopi kontaktmode topografier og histogrammer af Staphylococcus aureus. Billedet viser (A) topografi og (B) histogram af diametre af S. aureus-bakterier fastgjort på en glasstøtte ved hjælp af varmefikseringsproceduren. Cellediameteren blev målt med AFM-software; n = 20. Billedet er en repræsentation af målingen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Atomic force mikroskopi kontakttilstand for Pseudomonas hunanensis 1AP-CY. Denne figur viser topografierne taget fra P. hunanensis 1AP-CY på forskellige skalaer: (A) 70 μm, (B) 20 μm og (C) 5,0 μm. Billederne i forskellige skalaer viser fordelingen af cellepopulationen på diaset. For at analysere cellemorfologien fokuseres et område med en lavere befolkningstæthed, som vist på billede B, som viser stangformen af P. hunanensis (afbøjningssignalet vises for at forbedre topografibilledet). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Billeder af AFM-kontakttilstand taget for ubehandlede S. aureus (øverst) og S. aureus eksponeret for 250 ppm og 500 ppm MgO nanopartikler (mellem og nederst) i 24 timer. (A, D, G) Topografiske billeder; (B, E, H) tredimensionale billeder; (C, F, I) tværsnitsbilleder. Strukturelle ændringer i bakterierne blev observeret ved anvendelse af den mindste hæmmende koncentration af MgO (250 ppm) og en højere koncentration (500 ppm). Afbøjningssignalet er vist for at forbedre topografibilledet. Figur 4A, D, G er fra Muñiz Diaz et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: AFM-kontakttilstandsbilleder taget for ubehandlede E. coli (øverst) og E. coli eksponeret for 500 ppm og 1 000 ppm MgO-nanopartikler (mellem og bund) i 24 timer. (A, D, G) topografiske billeder; (B, E, H) tredimensionale billeder; (C, F, I) tværsnitsbilleder. Strukturelle ændringer i bakterierne blev observeret ved anvendelse af den mindste hæmmende koncentration af MgO (500 ppm) og en højere koncentration (1.000 ppm). Figur 5A, D, G er fra Muñiz Diaz et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroskopi er en teknik, der almindeligvis anvendes i biologiske laboratorier, der muliggør undersøgelse af strukturen, størrelsen, morfologien og det cellulære arrangement af biologiske prøver. For at forbedre denne teknik kan der anvendes flere typer mikroskoper, der adskiller sig fra hinanden med hensyn til deres optiske eller elektroniske egenskaber, som bestemmer instrumentets opløsningseffekt.
I videnskabelig forskning kræves brugen af mikroskopi til karakterisering af bakterieceller; for eksempel har mikroskopi vist, at NaCl påvirker den termiske modstand og cellemorfologi af E. coli-stammer, Schisandra chinensis-ekstrakt viser antibakterielle virkninger mod S. aureus, S. aureus udvikler termotolerance efter subletalt varmechok, og E. coli biomineraliserer platin 23,24,25,26,27 . Således har fordelene ved AFM gjort det muligt at udvide det til forskningsområderne miljø og biologi.
Atomkraftmikroskopet er et instrument, der anvendes i kontakttilstand til at analysere bakterier in situ og i ikke-kontakttilstand for at bestemme topografien af makro- og nanoskopiske materialer. Fordelen ved AFM i forhold til andre teknikker er, at det kræver færre prøver at opnå topografiske billeder; Det betragtes også som en ikke-destruktiv teknik, og det beskadiger eller kompromitterer ikke strukturen i det analyserede billede. Selvom vi brugte varmefiksering i denne protokol, blev bakteriecellemorfologien ikke ændret. Det er vigtigt at nævne, at denne teknik almindeligvis anvendes i mikrobiologilaboratoriet til at studere bakterielle morfologier. I modsætning til i plante- og dyrevævsprøver producerer varmefikseringsteknikken ændringer i proteiner og lipider, der manifesteres i vævsforringelse; I bakterier forårsager teknikken en lille krympning af cellen, der ikke forstyrrer observationen af celleform og identifikation.
Med AFM er prøveforberedelse let og kræver ingen kemiske produkter, som i tilfælde af elektronmikroskopi, hvor det er vigtigt, at prøven, der skal analyseres, er ledende, da billedet produceres ved interaktionen mellem elektronerne, der udsendes af udstyret og prøven. Hvis prøven ikke er ledende, skal den metaliseres med et ledende element som guld ved hjælp af den fysiske dampaflejringsteknik. Desuden når opløsningen af elektronmikroskopi op til 0,4 nm afhængigt af linsen og modellen, mens AFM i kontakttilstand kan nå mikrometer-, nanometer- eller endda picometeropløsning, hvilket gør den konkurrencedygtig med elektronmikroskopi22. En anden fordel ved AFM i forhold til elektronmikroskopi er, at det ikke kræver høje vakuumbetingelser for prøvebehandling20,21. Andre fordele ved AFM i forhold til almindeligt anvendte teknikker er de lave omkostninger og den korte billedoptagelsestid.
Med hensyn til teknikken til fastgørelse af bakterieprøven til en glasplade er det vigtigt at nævne, at varmefiksering er en teknik, der almindeligvis anvendes i mikrobiologiske laboratorier. Denne teknik anvendes, så bakterieprøver kan identificeres ved simpel eller differentiel farvning. Samtidig kan bakteriernes form, almindeligvis kokker eller stænger, ses. En ulempe ved varmefikseringsteknikken er faldet i bakteriens størrelse, men denne teknik kompromitterer ikke bakteriens form.
Efter fiksering skal man sørge for at undgå ældning af prøven, hvilket kan manifestere sig som et signifikant fald i cellestørrelsen; Derfor anbefales det at analysere prøven inden for 24 timer efter fiksering. Der skal også sørges for, at prøven ikke udsættes for støv; Prøverne bør derfor opbevares i en lukket beholder (f.eks. en petriskål). Disse forhold er kritiske, da de kan ændre de opnåede AFM-billeder.
Det er klart, at faldende størrelse af bakterierne kan påvirke noget forskningsarbejde, samt at andre måder at fastgøre bakterierne til en støtte kan være påkrævet. For eksempel er S. aureus-biofilm dyrket i BM-bouillon på 34 mm plader blevet fastgjort med glyceraldehyd. Desuden er S. aureus blevet immobiliseret med V-formede udkragninger behandlet med poly-l-lysin, mens hyphae for C. albicans er blevet fastgjort på glasglas belagt med positivt ladet poly-l-lysin for at analysere udvekslingen af adsorberede serumproteiner under vedhæftningen af begge til en abiotisk overflade28,29.
I dette arbejde ændrede varmefiksering af prøverne ikke formen eller aggregaterne dannet af bakterierne, og varmefiksering gjorde det muligt at visualisere effekten af nanopartiklerne. Derfor kunne AFM-topografierne vise formen af de isolerede kokker eller aggregater af S. aureus og stængerne af P. hunanensis (figur 1 og figur 3). Derudover fandt vi også, at S. aureus og E. coli viste skader i deres strukturer på grund af virkningen af MgO-nanopartiklerne, mens kontrolprøverne (uden nanopartikler) ikke viste nogen ændring i deres morfologi (figur 4 og figur 5).
Dette arbejde viser, at brugen af AFM-kontaktmodus er et levedygtigt alternativ til karakterisering af overfladetopologi og defekter af biologiske prøver, som det er blevet vist med S. aureus, P. hunanensis og E. coli. Desuden er varmefikseringsteknikken ikke en afgørende faktor, der ændrer celleoverfladen og forhindrer analyse. Beskedent kan vi foreslå, at varmefiksering kan være en fordel ved brugen af AFM. Prøver behandles mindre, og brugen af kemiske reagenser undgås. Derfor er metoden en enkel og økonomisk teknik. Det er værd at nævne, at dette kan ændre sig afhængigt af den specifikke analyse, der skal udføres, som vist for undersøgelsen af biofilm og bakteriel vedhæftning28,29. Som en mulig udvidelse af dette arbejde kan kontaktmodus AFM bruges til at analysere effekten af NP'er på andre medicinsk vigtige bakterier eller i forskning, hvor celleskader skal observeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Ramiro Muniz-Diaz takker CONACyT for stipendiet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
References
- Koch, A. L. Growth and form of the bacterial cell wall. American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).
- Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. Bacterial growth and form under mechanical compression. Scientific Report. 5, 11367 (2015).
- Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology. Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).
- Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C.
- Smith, W. P., et al. Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).
- Volke, D. C., Nikel, P. I. Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories. Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).
- Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology. Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).
- Hoffman, C. S., Winston, F. A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).
- Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
- Behr, S., Mätzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis. ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).
- Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure. Nucleosides & Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stackebrandt, E., Ebers, J. Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards. Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).
- Muñiz Diaz, R., et al. Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria. Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).
- Andrews, J. M.
- Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals. Methods. 42 (4), 321-324 (2007).
- Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).
- Yamada, S., et al. autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).
- Zuttion, F., et al. The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy. Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).
- Kahli, H., et al. Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).
- Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations. World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).
- Kochan, K., et al. et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria. Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).
- Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents. Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).
- Lee, H. -E., et al. NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains. Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).
- Song, L. Y., et al. Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food. Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).
- Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock. Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).
- Shar, S. S., et al. Biomineralization of platinum by Escherichia coli. Metals. 9 (4), 407 (2019).
- Baidamshina, D., et al. Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease. Scientific Reports. 7, 46068 (2017).
- Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).
