Summary
Hier presenteren we de toepassing van atomic force microscopy (AFM) als een eenvoudige en snelle methode voor bacteriële karakterisering en analyseren we details zoals de bacteriële grootte en vorm, bacteriële cultuurbiofilms en de activiteit van nanodeeltjes als bactericiden.
Abstract
Elektronenmicroscopie is een van de hulpmiddelen die nodig zijn om cellulaire structuren te karakteriseren. De procedure is echter ingewikkeld en duur vanwege de monstervoorbereiding voor observatie. Atomic force microscopy (AFM) is een zeer nuttige karakteriseringstechniek vanwege de hoge resolutie in drie dimensies en vanwege de afwezigheid van enige vereiste voor vacuüm- en monstergeleidbaarheid. AFM kan een grote verscheidenheid aan monsters in beeld brengen met verschillende topografieën en verschillende soorten materialen.
AFM levert hoge resolutie 3D-topografie-informatie van het angstromniveau tot de micronschaal. In tegenstelling tot traditionele microscopie gebruikt AFM een sonde om een beeld te genereren van de oppervlaktetopografie van een monster. In dit protocol wordt het gebruik van dit type microscopie voorgesteld voor de morfologische en celschadekarakterisering van bacteriën die op een drager zijn gefixeerd. Er werden stammen van Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) en Pseudomonas hunanensis (geïsoleerd uit knoflookbolmonsters) gebruikt. In dit werk werden bacteriële cellen gekweekt in specifieke kweekmedia. Om celschade te observeren, werden Staphylococcus aureus en Escherichia coli geïncubeerd met verschillende concentraties nanodeeltjes (NP's).
Een druppel bacteriële suspensie werd op een glazen drager bevestigd en er zijn op verschillende schalen beelden gemaakt met AFM. De verkregen beelden toonden de morfologische kenmerken van de bacteriën. Verder was het met behulp van de AFM mogelijk om de schade aan de cellulaire structuur te observeren die werd veroorzaakt door het effect van NP's. Op basis van de verkregen beelden kan contact AFM worden gebruikt om de morfologie van bacteriële cellen die op een drager zijn gefixeerd te karakteriseren. De AFM is ook een geschikt instrument voor het onderzoek naar de effecten van NP's op bacteriën. In vergelijking met elektronenmicroscopie is AFM een goedkope en gebruiksvriendelijke techniek.
Introduction
Verschillende bacteriële vormen werden voor het eerst opgemerkt door Antony van Leeuwenhoek in de 17e eeuw1. Bacteriën bestaan al sinds de oudheid in een grote diversiteit aan vormen, variërend van bollen tot vertakkende cellen2. Celvorm is een fundamentele voorwaarde voor bacteriële taxonomen om elke bacteriesoort te beschrijven en te classificeren, voornamelijk voor de morfologische scheiding van grampositieve en gramnegatieve phyla3. Van verschillende elementen is bekend dat ze bacteriële celvormen bepalen, die allemaal betrokken zijn bij de celafdekkingen en ondersteuning als componenten van de celwand en het membraan, evenals in het cytoskelet. Op deze manier zijn wetenschappers nog steeds bezig met het ophelderen van de chemische, biochemische en fysische mechanismen en processen die betrokken zijn bij het bepalen van bacteriële celvormen, die allemaal worden gedefinieerd door clusters van genen die bacteriële vormen definiëren 2,4.
Bovendien hebben wetenschappers aangetoond dat de staafvorm waarschijnlijk de voorouderlijke vorm van bacteriële cellen is, omdat deze celvorm optimaal lijkt in cel-significante parameters. Zo worden cocci, spiraal, vibrio, filamenteuze en andere vormen beschouwd als aanpassingen aan verschillende omgevingen; Inderdaad, bepaalde morfologieën zijn meerdere keren onafhankelijk geëvolueerd, wat suggereert dat de vormen van bacteriën aanpassingen kunnen zijn aan bepaalde omgevingen 3,5. Gedurende de levenscyclus van de bacteriële cel verandert de celvorm echter, en dit gebeurt ook als een genetische reactie op schadelijke omgevingsomstandigheden3. De vorm en grootte van de bacteriële cellen bepalen sterk de stijfheid, robuustheid en oppervlakte-volumeverhouding van de bacteriën, en deze eigenschap kan worden gebruikt voor biotechnologische processen6.
Elektronische microscopie wordt gebruikt om biologische monsters te bestuderen vanwege de hoge vergroting die kan worden bereikt buiten op licht gebaseerde microscopen. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en scanningelektronenmicroscopie (SEM) zijn de meest gebruikte technieken voor dit doel; monsters vereisen echter enkele behandelingen voordat ze in de kamer van de microscoop worden geplaatst om geschikte beelden te verkrijgen. Een gouden omslag op de monsters is vereist en de tijd die wordt gebruikt voor de totale beeldacquisitie mag niet te lang zijn. Atomic force microscopy (AFM) is daarentegen een techniek die veel wordt gebruikt bij de analyse van oppervlakken, maar wordt ook gebruikt bij de studie van biologische monsters.
Er zijn verschillende soorten AFM-modi die worden gebruikt bij oppervlakteanalyse, zoals contactmodus, contactloze modus of tikken, magnetische krachtmicroscopie (MFM), geleidende AFM, piëzo-elektrische krachtmicroscopie (PFM), piekkrachttap (PFT), contactresonantie en krachtvolume. Elke modus wordt gebruikt bij de analyse van materialen en biedt verschillende informatie over het oppervlak van de materialen en hun mechanische en fysieke eigenschappen. Sommige AFM-modi worden echter gebruikt voor de analyse van biologische monsters in vitro, zoals PFT, omdat PFT het mogelijk maakt om topografische en mechanische gegevens over cellen in een vloeibaar mediumte verkrijgen 7.
In dit werk gebruikten we de meest elementaire modus die in elk oud en eenvoudig AFM-model is opgenomen- de contactmodus. AFM gebruikt een scherpe sonde (ongeveer <50 nm in diameter) om gebieden kleiner dan 100 μm te scannen. De sonde wordt uitgelijnd met het monster om te interageren met de krachtvelden die aan het monster zijn gekoppeld. Het oppervlak wordt gescand met de sonde om de kracht constant te houden. Vervolgens wordt een beeld van het oppervlak gegenereerd door de beweging van de cantilever te volgen terwijl deze over het oppervlak beweegt. De verzamelde informatie biedt de nanomechanische eigenschappen van het oppervlak, zoals de hechting, elasticiteit, viscositeit en afschuiving.
In de AFM-contactmodus wordt de cantilever met een vaste doorbuiging over het monster gescand. Hierdoor kan men de hoogte van de monsters (Z) bepalen, en dit is een voordeel ten opzichte van de andere elektronische microscooptechnieken. De AFM-software maakt het mogelijk om een 3D-beeldscan te genereren door de interactie tussen de tip en het monsteroppervlak, en de tipafbuiging wordt gecorreleerd aan de hoogte van het monster door middel van een laser en een detector.
In statische modus (contactmodus) met constante kracht presenteert de uitgang twee verschillende beelden: de hoogte (z-topografie) en het afbuigings- of foutsignaal. De statische modus is een waardevolle, eenvoudige beeldvormingsmodus, vooral voor robuuste monsters in lucht die de hoge belastingen en torsiekrachten van de statische modus aankunnen. De doorbuigings- of foutmodus wordt gebruikt in de constante krachtmodus. Het topografiebeeld wordt echter verder verbeterd door het afbuigsignaal aan de oppervlaktestructuur toe te voegen. In deze modus wordt het afbuigingssignaal ook wel het foutsignaal genoemd, omdat de afbuiging de feedbackparameter is; Alle kenmerken of morfologie die in dit kanaal verschijnen, zijn te wijten aan de "fout" in de feedbacklus of, beter gezegd, aan de feedbacklus die nodig is om een constant afbuigingsinstelpunt te behouden.
Het unieke ontwerp van AFM maakt het compact - klein genoeg om op een tafelblad te passen - terwijl het ook een resolutie heeft die hoog genoeg is om atomaire stappen op te lossen. De AFM-apparatuur heeft lagere kosten dan de apparatuur voor andere elektronische microscopen en de onderhoudskosten zijn minimaal. De microscoop vereist geen laboratorium met speciale omstandigheden zoals een cleanroom of een geïsoleerde ruimte; Het heeft alleen een trillingsvrij bureau nodig. Voor AFM hoeven de monsters geen uitgebreide voorbereiding te ondergaan zoals bij andere technieken (goudbedekking, afslanken); alleen een droog monster hoeft aan de monsterhouder te worden bevestigd.
We gebruiken de AFM-contactmodus om bacteriële morfologieën en de effecten van NP's te observeren. De populatie en cellulaire morfologie van bacteriën die op een drager zijn gefixeerd, kunnen worden waargenomen, evenals de cellulaire schade die door nanodeeltjes op de bacteriesoort wordt geproduceerd. De beelden verkregen door de AFM-contactmodus bevestigen dat het een krachtig hulpmiddel is en niet wordt beperkt door reagentia en gecompliceerde procedures, waardoor het een eenvoudige, snelle en economische methode is voor bacteriële karakterisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bacteriële isolatie en identificatie
- Isolatie van een endofytische stam uit knoflookbolmeristeem:
- Plaats 2 mm fragmenten van meristeem van eerder gepelde, gedesinfecteerde en gesneden knoflookbollen op trypticase soja-agar (TSA) als een rijk groeimedium en incubeer gedurende 1 dag bij 25 °C.
- Op basis van de morfologische verschillen van de bacteriële kolonies - vorm, grootte, kleur, rand, doorgelaten licht, gereflecteerd licht, textuur, consistentie en pigmentproductie - beschrijf de verschillende waargenomen morfotypen en zuiver door een representatieve kolonie van elk morfotype te kruisen.
- Bewaar alle gezuiverde bacteriestammen in 30% glycerol bij −80 °C.
- Identificeer een willekeurig geselecteerde stam (9AP) door het 16S rDNA te sequencen. Extraheer het DNA volgens de methode van Hoffman en Winston8.
- Amplify the 16S rRNA by polymerase chain reaction (PCR) with 100 ng of DNA, 1x polymerase buffer, 4 mM MgCl2, 0.4 mM dNTPs, 10 pmol each of 27F/1492r universal oligonucleotides, and 1 U of DNA polymerase9. Gebruik de volgende thermische cycler-omstandigheden: 95 °C gedurende 5 minuten voor de initiële denaturalisatie; gevolgd door 35 cycli van 1 min bij 94 °C als denaturalisatietemperatuur, 1 min bij 56 °C als hybridisatietemperatuur en 1 min bij 72 °C als extensietemperatuur; en vervolgens 10 min bij 72 °C als laatste verlenging.
- Capillaire sequentie van het PCR-product met dezelfde oligonucleotiden; Gebruik de dideoxy-terminale methode met de matrixinstallatiekit voor capillaire sequencing10 en voer elektroforese uit in een geautomatiseerd multicapillair systeem11.
- Bewerk de sequenties handmatig, vergelijk de reeks met de GenBank-bibliotheek met behulp van een BLAST-zoekopdracht en identificeer de stam voorlopig met de gouden standaard van ten minste 98,7% identiteit met de dichtstbijzijnde soort12,13.
OPMERKING: De stam 9AP werd geïdentificeerd als behorend tot de soort Pseudomonas hunanensis, met een identiteit van 99,86% met de sequentie voor de stam P. hunanensis LV (JX545210).
2. Bereiding van bacteriemonsters voor morfologische observatie door AFM
- Plaats onder steriele omstandigheden een druppel van de bacteriële suspensie (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) op een glasplaat.
- Bevestig de monsters op de glijbaan door ze droog te verwarmen. Laat de glijbaan een paar keer zachtjes over een vlam glijden totdat het monster droog is.
OPMERKING: De fixatie van monsters is een routinetechniek in de microbiologie om vaste prokaryote organismen te observeren en hun structuur als levende cellen zo dicht mogelijk te simuleren. - Plaats de vaste monsters in een petrischaaltje en breng ze ter observatie naar de AFM-apparatuur.
OPMERKING: Aangezien de monsters in de loop van de tijd kunnen worden gewijzigd door weersomstandigheden, moet u een maximale tijd van 24 uur reserveren voor analyse in de AFM-apparatuur. Houd de monsters stofvrij.
3. Antibacteriële werking van MgO nanodeeltjes tegen bacteriën
OPMERKING: De synthese en karakterisering van MgO NP's zijn eerder gepubliceerd14. In dit werk werd de antibacteriële activiteit van de nanomaterialen geschat op basis van de handleiding van het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) met behulp van macroverdunnings- en microverdunningsmethoden voor remming15,16.
- Schatting van de minimale remmende activiteit (MIC) en bactericiden (CMB)
- Voorgroei van de stammen
- Ent een geschikte hoeveelheid Escherichia coli of Staphylococcus aureus in voedzame bouillon om een eindconcentratie van 1 × 108 kve / ml te verkrijgen.
- Incubeer de suspensie bij 37 °C (± 2 °C) gedurende 18-24 uur.
- Nagroei van geacclimatiseerde stammen
- Dompel een steriele bacteriologische lus onder in de suspensie en raak de onderkant van de buis aan.
- Voer streaking uit met de lus op eosine en methyleenblauwe agar en voedingsagar.
- Incubeer de agarplaten bij 37 °C (± 2 °C) gedurende 24 uur.
- Selectie van kolonies voor de bereiding van het gestandaardiseerde entmateriaal
- Neem drie tot vijf kolonies met hetzelfde morfologische type door de bovenkant van de kolonie in de petrischaal aan te raken met een bacteriologische lus.
- Breng over en dompel de selectie onder in 3-5 ml Müller-Hinton-bouillon.
- Incubeer bij 37 °C (± 2 °C) tot een troebelheid van 1 × 10 8 kve/ml of 2 × 108 kve/ml.
OPMERKING: In dit werk werden McFarland-troebelheidsnormen gebruikt als referentie voor de bacteriologische suspensies; in het bijzonder komt de 0,5-norm ongeveer overeen met een homogene E. coli-suspensie van 1,5 × 108 cellen/ml. Een UV-Vis spectrofotometer werd gebruikt om de troebelheid te meten. - Neem 1 ml en voeg het toe aan 9 ml steriele bouillon. Neem 200 μL van deze verdunning en voeg deze toe aan 19,8 ml steriele bouillon om een eindconcentratie van 5 × 105 kve/ml te verkrijgen.
- Vereiste concentraties MgO nanodeeltjes
- Gebruik een ultrasoonapparaat voor de bereiding van de oplossingen.
- Suspensie van het nanomateriaal in steriel water in tweemaal de concentratie die nodig is om seriële oplossingen te verkrijgen.
- Voeg deze suspensies toe aan steriele buizen die Müller-Hinton-bouillon bevatten om het nieuwe bereik van concentraties te bereiken dat nodig is voor het experiment.
OPMERKING: De volgende MgO NPs-concentraties werden toegepast voor microverdunning: 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1.000 ppm, 2.000 ppm, 3.000 ppm, 4.000 ppm en 8.000 ppm.
- Bereiding van de microverdunning15
- Bereid een nieuwe en steriele 96-well microtiterplaat (microplaat) voor. Label kolom nr. 12 van de microplaat als steriliteitskolom; label kolom nr. 11 als een kolom voor groeicontrole.
- Voeg 120 μL van de nanodeeltjessuspensies met de verschillende concentraties toe aan kolommen nr. 1-10.
- Ent 120 μL bacteriën (5 × 105 CFU/ml) in de putjes in kolommen nr. 1-10.
OPMERKING: Voor deze studie waren rij G en rij H controles met ceftriaxon in concentraties die worden gesuggereerd door CLSI-normen: 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0,5 ppm, 0,25 ppm, 0,125 ppm, 0,06 ppm en 0,03 ppm. - Incubeer de 96-well microplaat gedurende 24 uur bij 37 °C (35 °C ± 2 °C). Analyseer ten slotte de putten.
- Voorgroei van de stammen
- Observatie van de MgO nanodeeltjes-geïnduceerde morfo-structurele veranderingen in de bacteriestammen door AFM
- Neem 250 μL uit de putjes van de microverdunningstests, meng met 750 μL steriel water en centrifugeer bij 2.000 × g van 2 min tot 5 min bij 5 °C.
- Was de neerslag drie keer met 1 ml steriel water en voeg aan het einde van de wasbeurten 500 μL water toe.
- Om de AFM-beelden te verkrijgen, neemt u 10-20 μL van de laatste suspensie van elke startput, voert u een uitstrijkje uit op een dia die eerder is gereinigd door echografie (30 min) en droogt u gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
4. AFM-metingen
OPMERKING: Hier werd de atoomkrachtmicroscoop in contactmodus gemonteerd op een antitrillingswerkstation dat de microscoop kon isoleren van mechanische trillingsbronnen en het systeem waterpas hield. Elektrische interferentie wordt verminderd met lijnfilters en overspanningsbeveiliging. De AFM die hier wordt gebruikt, lijnt de laserstraal automatisch uit op de fotodetector.
- Schakel de computer en de AFM in en selecteer vervolgens de contactmodus, de contAI-G-sondes en de opties Auto Slope in de softwaretools. De standaardwaarden van de Z-controller zijn Setpoint = 20 nM, P-Gain = 10.000, I-Gain = 1.000, D-Gain = 0 en Tipspanning = 0 mV.
- Plaats de monsters in de AFM-contactmodus met behulp van een scanbereikkop van 70 μm. We gebruikten ContAI-G silicium cantilevers met een veerconstante van 0,13 N/m.
- Gebruik een cameraapparaat dat is gemonteerd op twee lenzen die in de scankop zijn geïntegreerd om een snel beeld te krijgen van het oppervlak van het gebied onder de sonde.
- Voer handmatig een verplaatsing uit in het XY-vlak om het gewenste gebied te kiezen. De sonde is gemaakt om het oppervlaktemonster elektronisch te benaderen totdat de contactomstandigheden zijn bereikt. Pas het XY-meetvlak van de scanner en het monsteroppervlak elektronisch aan door de hellingen in de XY-richtingen te verkleinen.
- Gebruik de standaardparameters van de software: 1 lijn per seconde bij 256 punten per lijn.
- Voer eerst een volledig scanbereik uit van een gebied van 70 μm x 70 μm; Selecteer vervolgens een kleiner gebied met het gereedschap Zoomen. De AFM optimaliseert het grafiekbereik in Z automatisch.
OPMERKING: Door de lijnen per seconde te verlagen, neemt de totale scantijd toe, is de kwaliteit van de scan beter gedefinieerd en wordt ook wat ruis van de meting gewist. - Om een nieuw gebied uit het monster te selecteren, trekt u de cantilever elektronisch in en beweegt u het monster langs het XY-vlak. Realiseer een nieuwe scan met behulp van de procedure beschreven in stap 4.5 en stap 4.6.
OPMERKING: De verkregen scans worden weergegeven in een staafschaal met één kleur, waarbij de lichte kleuren worden geassocieerd met grotere hoogten en de donkere kleuren worden geassocieerd met diepere hoogten. De AFM-software genereert een 3D-weergave van de scan waarmee de details van het gemeten oppervlak kunnen worden beoordeeld. - Voer de gegevensverwerking uit met behulp van de regel voor regelnivellering in het menu Extra van de afbeelding in de filterselectie, wat de meest gebruikte en eenvoudigste nivelleringsmethode is.
OPMERKING: Deze nivelleringsmethode neemt elke horizontale of verticale lijn die in de AFM-afbeelding wordt geproduceerd en past deze aan op een polynomiale vergelijking. - Optimaliseer de maximale en minimale hoogte in de kleurenbalk aan de rechterkant om de beste beeldresolutie te verkrijgen.
- Voer de afbeeldingsanalyse uit met behulp van het menu Analyse op de werkbalk. Bepaal de hoogten en afstanden door het begin- en eindpunt te selecteren zodra het gewenste gereedschap is geselecteerd.
OPMERKING: Gebruikers moeten de verschillende filters van het menu Extra proberen om artefacten van tipafbeeldingen te voorkomen vanwege de afvlakking die wordt gebruikt in het nivelleringsproces. Afbeeldingsartefacten worden weergegeven als streeplijnen en worden weergegeven in sommige AFM-afbeeldingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beelden van de morfologie en grootte van S. aureus en P. hunanensis stammen, evenals de populatieorganisatie van beide stammen, werden genomen door atoomkrachtmicroscopie in contactmodus. De S. aureus-beelden toonden aan dat de populatie was verdeeld over zones met aggregaten van cocci (figuur 1A). Met een schaalvergroting was er een grotere waardering voor de populatieverdeling en morfologie van de cocci (figuur 1B). Uit de microscopierapporten bleek dat er een pseudo-hemisferische structuur aanwezig was in aangrenzende cellen van S. aureus, maar dat de bacteriën in het algemeen een bolvormige morfologie vertoonden in de vorm van een coccus na celdeling, zoals eerder te zien was op de AFM-beelden. Bovendien konden de AFM-contactmodusbeelden de grootte van de cocci bepalen, die een gemiddelde breedte van 1,25 μm liet zien. De waarden verkregen uit de meting van 20 cellen zijn weergegeven in figuur 2.
In het geval van P. hunanensis werd een homogene verdeling waargenomen op het gehele oppervlak van de glasdrager, waarbij een bacteriële monolaag werd gevormd die zich aan de drager hechtte (figuur 3A), zoals gerapporteerd door Zuttion et al., waarin de auteurs P. aureginosa immobiliseerden op een solide drager en hetzelfde gedrag vertoonden. Pseudomonas hunanensis-bacteriën bleken staafvormig te zijn, met een lengte van 1,9 μm (L) en een breedte van 0,9 μm (W) (figuur 3B,C); deze gegevens liggen binnen de gerapporteerde waarden voor P. fluorescenen van 1,5-2,0 μm (L) en 0,6-0,9 μm (W)17,18,19.
Om de morfostructurele veranderingen als gevolg van de interactie van de MgO NP's in beeld te brengen, werden de bacteriestammen na behandeling onderworpen aan AFM-analyse (microdilutie). In figuur 4 en figuur 5 zijn drie groepen weergegeven: figuur 4A-C en figuur 5A-C zijn de bedieningsorganen; de beelden in figuur 4D-F en figuur 5D-F zijn verkregen uit de resultaten van de microverdunning bij het MIC; de beelden van figuur 4G-I en figuur 5G-I werden verkregen in een hogere concentratie dan de MIC.
De afbeeldingen van de bovenste groep van figuur 4A-C tonen een coccus-type cel van Staphylococcus aureus met een glad oppervlak en homogene contouren, die volgens de microverdunningstechniek gedurende 24 uur in een geschikte omgeving in Müeller-Hinton-bouillon groeide. De gemiddelde diameter was 1 μm ± 0,15 μm. Deze diameter verdween praktisch na NP-behandeling, zoals weergegeven in figuur 4D-F, omdat de verslechtering van de cellulaire structuur zeer ernstig was. Volgens de doorsnede was de gemiddelde hoogte voor de besturing 200 nm ± 50 nm; De hoogte van de behandelde cellen was verminderd met 40% (120 nm ± 5 nm) ten opzichte van de controles. De beelden tonen duidelijk veranderingen in het oppervlak, zoals de vorming van blaasjes, na de blootstelling aan MgO NP's in de CMI van de deeltjes; bovendien werd door het verdubbelen van de concentraties de interne status van de cellulaire structuren beïnvloed en kwam cytosolisch materiaal vrij, zoals te zien is in de afbeeldingen van figuur4G-I 20,21.
Deze veranderingen werden ook geïdentificeerd in E. coli-cellen, zoals weergegeven in figuur 5, met aandoeningen vergelijkbaar met S. aureus. De controles van deze bacterie vertoonden gladde oppervlakken, waarbij de zeer homogene staafachtige vorm (bacil) zonder enige duidelijke verandering werd benadrukt. De driedimensionale afbeeldingen tonen de hoogste topografische gebieden geassocieerd met het micro-organisme in wit. De gemiddelde hoogte van de controle-E. coli was 160 nm ± 50 nm, en volgens de dwarsdoorsnedebeelden daalde de gemiddelde hoogte tot 76 nm ± 10 nm voor cellen die gedurende 24 uur werden blootgesteld aan een concentratie MgO-nanodeeltjes van 500 ppm (MIC). De structuur verdween volledig bij een concentratie van 1.000 ppm en alleen de silhouetten van de bacteriën konden worden onderscheiden. Bij het analyseren van de beelden voor beide concentraties werd waargenomen dat met betrekking tot de controles de celmorfologie van de behandelde cellen significant was veranderd, met een rek van 2,0 μm ± 0,5 μm (figuur 5A-C) tot 3,0 μm ± 0,3 μm, zoals weergegeven in de afbeeldingen van figuur 5D-I. Deze toename was duidelijk toen de cellulaire structuur interne homeostase verloor, waardoor structurele ineenstorting20,22 ontstond. De beelden van bacteriën blootgesteld aan MgO NP's toonden duidelijk oppervlakteveranderingen zoals nokvorming of golfplaten die vesiculaire verstoringen vormden bij beide MIC's en bij verdubbeling van de concentraties20,22.
Figuur 1: Atoomkrachtmicroscopie contactmodus voor Staphylococcus aureus. Deze figuur toont de topografieën van S. aureus op verschillende schalen: (A) 70 μm en (B) 5,0 μm. De karteringsgebieden werden gekozen om de S. aureus-topografie te verkrijgen; afbeelding B toont duidelijk S. aureus cocci. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Atoomkracht microscopie contactmodus topografieën en histogrammen van Staphylococcus aureus. De afbeelding toont de (A) topografie en (B) histogram van de diameters van S. aureus bacteriën gefixeerd op een glazen drager met behulp van de warmte-fixatie procedure. De celdiameter is gemeten met AFM-software; n = 20. Het beeld is een weergave van de meting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Atomic force microscopy contact mode voor Pseudomonas hunanensis 1AP-CY. Deze figuur toont de topografieën van P. hunanensis 1AP-CY op verschillende schalen: (A) 70 μm, (B) 20 μm en (C) 5,0 μm. De afbeeldingen op verschillende schalen tonen de verdeling van de celpopulatie op de dia. Om de celmorfologie te analyseren, wordt gefocust op een gebied met een lagere bevolkingsdichtheid, zoals te zien is in afbeelding B, die de staafvorm van P. hunanensis toont (het afbuigingssignaal wordt getoond om het topografiebeeld te verbeteren). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. AFM-contactmodusbeelden verkregen voor onbehandelde S. aureus (boven) en S. aureus blootgesteld aan 250 ppm en 500 ppm MgO-nanodeeltjes (midden en onder) gedurende 24 uur. (A,D,G) Topografische afbeeldingen; (B,E,H) driedimensionale beelden; (C,F,I) dwarsdoorsnedebeelden. Structurele veranderingen in de bacteriën werden waargenomen bij gebruik van de minimale remmende concentratie van MgO (250 ppm) en een hogere concentratie (500 ppm). Het afbuigingssignaal wordt getoond om het topografiebeeld te verbeteren. Figuur 4A,D,G zijn van Muñiz Diaz et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: AFM-contactmodusbeelden verkregen voor onbehandelde E. coli (boven) en E. coli blootgesteld aan 500 ppm en 1.000 ppm MgO-nanodeeltjes (midden en onder) gedurende 24 uur (A,D,G) Topografische beelden; (B,E,H) driedimensionale beelden; (C,F,I) dwarsdoorsnedebeelden. Structurele veranderingen in de bacteriën werden waargenomen bij gebruik van de minimale remmende concentratie van MgO (500 ppm) en een hogere concentratie (1.000 ppm). Figuur 5A,D,G zijn van Muñiz Diaz et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microscopie is een techniek die vaak wordt gebruikt in biologische laboratoria en die het mogelijk maakt om de structuur, grootte, morfologie en cellulaire rangschikking van biologische monsters te onderzoeken. Om deze techniek te verbeteren, kunnen verschillende soorten microscopen worden gebruikt die van elkaar verschillen in termen van hun optische of elektronische kenmerken, die het resolutievermogen van het instrument bepalen.
In wetenschappelijk onderzoek is het gebruik van microscopie vereist voor de karakterisering van bacteriële cellen; microscopie heeft bijvoorbeeld aangetoond dat NaCl de thermische weerstand en celmorfologie van E. coli-stammen beïnvloedt, Schisandra chinensis-extract antibacteriële effecten vertoont op S. aureus, S. aureus ontwikkelt thermotolerantie na subletale hitteschok en E. coli biomineraliseert platina 23,24,25,26,27 . De voordelen van de AFM hebben het dus mogelijk gemaakt om uit te breiden naar de onderzoeksgebieden milieu en biologie.
De atoomkrachtmicroscoop is een instrument dat in contactmodus wordt gebruikt om bacteriën in situ te analyseren en in contactloze modus om de topografie van macro- en nanoscopische materialen te bepalen. Het voordeel van AFM ten opzichte van andere technieken is dat er minder samples nodig zijn om topografische beelden te verkrijgen; Het wordt ook beschouwd als een niet-destructieve techniek en het beschadigt of compromitteert de structuur van het geanalyseerde beeld niet. Hoewel we in dit protocol warmtefixatie gebruikten, werd de bacteriële celmorfologie niet gewijzigd. Het is belangrijk om te vermelden dat deze techniek vaak wordt gebruikt in het microbiologisch laboratorium om bacteriële morfologieën te bestuderen. Anders dan in planten- en dierenweefselmonsters produceert de warmtefixatietechniek veranderingen in eiwitten en lipiden die zich manifesteren in weefselafbraak; Bij bacteriën veroorzaakt de techniek een lichte krimp van de cel die de observatie van celvorm en identificatie niet verstoort.
Met AFM is monstervoorbereiding eenvoudig en zijn er geen chemische producten nodig, zoals in het geval van elektronenmicroscopie, waarbij het essentieel is dat het te analyseren monster geleidend is, omdat het beeld wordt geproduceerd door de interactie van de elektronen die door de apparatuur en het monster worden uitgezonden. Als het monster niet geleidend is, moet het worden gemetalliseerd met een geleidend element zoals goud door middel van de fysische dampafzettingstechniek. Bovendien bereikt de resolutie van elektronenmicroscopie tot 0,4 nm, afhankelijk van de lens en het model, terwijl AFM in contactmodus de resolutie van micrometer, nanometer of zelfs picometer kan bereiken, waardoor het concurrerend is met elektronenmicroscopie22. Een ander voordeel van AFM ten opzichte van elektronenmicroscopie is dat het geen hoogvacuümcondities vereist voor monsterverwerking20,21. Andere voordelen van AFM ten opzichte van veelgebruikte technieken zijn de lage kosten en de korte beeldacquisitietijd.
Met betrekking tot de techniek om het bacteriële monster aan een glasplaat te bevestigen, is het belangrijk om te vermelden dat warmtefixatie een techniek is die vaak wordt gebruikt in microbiologische laboratoria. Deze techniek wordt gebruikt zodat bacteriële monsters kunnen worden geïdentificeerd door eenvoudige of differentiële kleuring. Tegelijkertijd is de vorm van de bacteriën, meestal cocci of staaf, te zien. Een nadeel van de warmtefixatietechniek is de afname van de grootte van de bacteriën, maar deze techniek doet geen afbreuk aan de vorm van de bacteriën.
Na fixatie moet ervoor worden gezorgd dat de veroudering van het monster wordt voorkomen, wat zich kan manifesteren als een significante afname van de celgrootte; Daarom is het raadzaam om het monster binnen 24 uur na fixatie te analyseren. Er moet ook voor worden gezorgd dat het monster niet aan stof wordt blootgesteld; monsters moeten daarom in een gesloten container (bijvoorbeeld een petrischaaltje) worden bewaard. Deze voorwaarden zijn van cruciaal belang omdat ze de verkregen AFM-beelden kunnen wijzigen.
Het is duidelijk dat het verkleinen van de grootte van de bacteriën van invloed kan zijn op sommige onderzoekswerkzaamheden, evenals dat andere manieren om de bacteriën aan een drager te bevestigen nodig kunnen zijn. Bijvoorbeeld, S. aureus biofilms gekweekt in BM bouillon op 34 mm platen zijn gefixeerd met glyceraldehyde. Bovendien is S. aureus geïmmobiliseerd met V-vormige cantilevers behandeld met poly-l-lysine, terwijl voor C. albicans hyfen zijn gefixeerd op glasplaten bedekt met positief geladen poly-l-lysine om de uitwisseling van geadsorbeerde serumeiwitten te analyseren tijdens de hechting van beide aan een abiotisch oppervlak28,29.
In dit werk veranderde het fixeren van de monsters door warmte de vorm of aggregaten gevormd door de bacteriën niet, en de warmtefixatie maakte het mogelijk om het effect van de nanodeeltjes te visualiseren. Daarom konden de topografieën van de AFM de vorm van de geïsoleerde cocci of aggregaten van S. aureus en de staven van P. hunanensis weergeven (figuur 1 en figuur 3). Daarnaast vonden we ook dat S. aureus en E. coli schade vertoonden in hun structuren als gevolg van het effect van de MgO-nanodeeltjes, terwijl de controlemonsters (zonder nanodeeltjes) geen verandering in hun morfologie vertoonden (figuur 4 en figuur 5).
Dit werk toont aan dat het gebruik van de AFM-contactmodus een levensvatbaar alternatief is voor het karakteriseren van de oppervlaktetopologie en defecten van biologische monsters, zoals is aangetoond met S. aureus, P. hunanensis en E. coli. Bovendien is de warmtefixatietechniek geen bepalende factor die het celoppervlak verandert en analyse verhindert. Bescheiden kunnen we suggereren dat warmtefixatie een voordeel kan zijn bij het gebruik van AFM. Monsters worden minder verwerkt en het gebruik van chemische reagentia wordt vermeden. Daarom is de methodologie een eenvoudige en economische techniek. Het is vermeldenswaard dat dit kan veranderen afhankelijk van de specifieke analyse die moet worden uitgevoerd, zoals aangetoond voor de studie van biofilms en bacteriële adhesie28,29. Als mogelijke uitbreiding van dit werk zou contactmodus AFM kunnen worden gebruikt om het effect van NP's op andere medisch belangrijke bacteriën te analyseren of in onderzoek waarbij celschade moet worden waargenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Ramiro Muniz-Diaz bedankt CONACyT voor de beurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
References
- Koch, A. L. Growth and form of the bacterial cell wall. American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).
- Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. Bacterial growth and form under mechanical compression. Scientific Report. 5, 11367 (2015).
- Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology. Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).
- Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C.
- Smith, W. P., et al. Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).
- Volke, D. C., Nikel, P. I. Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories. Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).
- Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology. Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).
- Hoffman, C. S., Winston, F. A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).
- Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
- Behr, S., Mätzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis. ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).
- Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure. Nucleosides & Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stackebrandt, E., Ebers, J. Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards. Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).
- Muñiz Diaz, R., et al. Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria. Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).
- Andrews, J. M.
- Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals. Methods. 42 (4), 321-324 (2007).
- Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).
- Yamada, S., et al. autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).
- Zuttion, F., et al. The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy. Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).
- Kahli, H., et al. Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).
- Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations. World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).
- Kochan, K., et al. et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria. Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).
- Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents. Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).
- Lee, H. -E., et al. NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains. Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).
- Song, L. Y., et al. Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food. Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).
- Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock. Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).
- Shar, S. S., et al. Biomineralization of platinum by Escherichia coli. Metals. 9 (4), 407 (2019).
- Baidamshina, D., et al. Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease. Scientific Reports. 7, 46068 (2017).
- Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).
