Summary
Her presenterer vi anvendelsen av atomkraftmikroskopi (AFM) som en enkel og rask metode for bakteriell karakterisering og analyserer detaljer som bakteriestørrelse og form, bakteriekulturbiofilm og aktiviteten til nanopartikler som bakteriedrepende midler.
Abstract
Elektronmikroskopi er et av verktøyene som kreves for å karakterisere cellulære strukturer. Prosedyren er imidlertid komplisert og kostbar på grunn av prøveforberedelsen for observasjon. Atomkraftmikroskopi (AFM) er en svært nyttig karakteriseringsteknikk på grunn av sin høye oppløsning i tre dimensjoner og på grunn av fraværet av krav til vakuum og prøveledningsevne. AFM kan avbilde et bredt utvalg av prøver med forskjellige topografier og forskjellige typer materialer.
AFM gir høyoppløselig 3D-topografiinformasjon fra angstromnivå til mikronskala. I motsetning til tradisjonell mikroskopi bruker AFM en sonde for å generere et bilde av overflatetopografien til en prøve. I denne protokollen foreslås bruk av denne typen mikroskopi for morfologisk og celleskadekarakterisering av bakterier festet på en støtte. Stammer av Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) og Pseudomonas hunanensis (isolert fra hvitløkspæreprøver) ble brukt. I dette arbeidet ble bakterieceller dyrket i bestemte kulturmedier. For å observere celleskader ble Staphylococcus aureus og Escherichia coli inkubert med forskjellige konsentrasjoner av nanopartikler (NP).
En dråpe bakteriell suspensjon ble festet på en glassstøtte, og bilder ble tatt med AFM i forskjellige skalaer. De oppnådde bildene viste bakteriens morfologiske egenskaper. Videre, ved bruk av AFM, var det mulig å observere skaden på den cellulære strukturen forårsaket av effekten av NP. Basert på bildene som er oppnådd, kan kontakt AFM brukes til å karakterisere morfologien til bakterielle celler festet på en støtte. AFM er også et egnet verktøy for undersøkelse av effekten av NP på bakterier. Sammenlignet med elektronmikroskopi er AFM en billig og brukervennlig teknikk.
Introduction
Ulike bakterieformer ble først notert av Antony van Leeuwenhoek i det 17. århundre1. Bakterier har eksistert i et stort mangfold av former siden antikken, alt fra kuler til forgreningsceller2. Celleform er en grunnleggende betingelse for bakterielle taksonomer for å beskrive og klassifisere hver bakterieart, hovedsakelig for morfologisk separasjon av gram-positiv og gram-negativ phyla3. Flere elementer er kjent for å bestemme bakterielle celleformer, som alle er involvert i celledekslene og støtten som komponenter i celleveggen og membranen, så vel som i cytoskelettet. På denne måten belyser forskere fortsatt de kjemiske, biokjemiske og fysiske mekanismene og prosessene som er involvert i å bestemme bakterielle celleformer, som alle er definert av klynger av gener som definerer bakterieformer 2,4.
I tillegg har forskere vist at stavformen sannsynligvis er den forfedre formen av bakterieceller, siden denne celleformen ser ut til å være optimal i cellesignifikante parametere. Dermed betraktes kokker, spiral, vibrio, trådformede og andre former som tilpasninger til ulike miljøer; Faktisk har spesielle morfologier utviklet seg uavhengig flere ganger, noe som tyder på at bakteriens former kan tilpasses bestemte miljøer 3,5. Men gjennom bakteriecellens livssyklus endres celleformen, og dette skjer også som en genetisk respons på skadelige miljøforhold3. Bakteriecellenes form og størrelse bestemmer sterkt bakterienes stivhet, robusthet og overflate-til-volum-forhold, og denne egenskapen kan utnyttes for bioteknologiske prosesser6.
Elektronisk mikroskopi brukes til å studere biologiske prøver på grunn av den høye forstørrelsen som kan nås utover lysbaserte mikroskoper. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og scanning elektronmikroskopi (SEM) er de mest brukte teknikkene for dette formålet; Imidlertid krever prøver noen behandlinger før de plasseres i mikroskopets kammer for å oppnå passende bilder. Et gulldeksel på prøvene er nødvendig, og tiden som brukes til total bildeinnsamling bør ikke være for lang. I motsetning til dette er atomkraftmikroskopi (AFM) en teknikk som er mye brukt i analysen av overflater, men er også ansatt i studiet av biologiske prøver.
Det finnes flere typer AFM-moduser som brukes i overflateanalyse, for eksempel kontaktmodus, ikke-kontaktmodus eller tapping, magnetisk kraftmikroskopi (MFM), ledende AFM, piezoelektrisk kraftmikroskopi (PFM), peak force tapping (PFT), kontaktresonans og kraftvolum. Hver modus brukes i analysen av materialer og gir forskjellig informasjon om overflaten av materialene og deres mekaniske og fysiske egenskaper. Imidlertid brukes noen AFM-moduser til analyse av biologiske prøver in vitro, for eksempel PFT, fordi PFT tillater å oppnå topografiske og mekaniske data på celler i et flytende medium7.
I dette arbeidet brukte vi den mest grunnleggende modusen som er inkludert i hver gammel og enkel AFM-modell - kontaktmodusen. AFM bruker en skarp sonde (rundt <50 nm i diameter) for å skanne områder mindre enn 100 μm. Sonden er justert til prøven for å samhandle med kraftfeltene som er knyttet til prøven. Overflaten skannes med sonden for å holde kraften konstant. Deretter genereres et bilde av overflaten ved å overvåke utkragingens bevegelse når den beveger seg over overflaten. Den innsamlede informasjonen gir overflatenes nanomekaniske egenskaper, for eksempel vedheft, elastisitet, viskositet og skjær.
I AFM-kontaktmodus skannes utkrageren over prøven ved en fast avbøyning. Dette gjør at man kan bestemme høyden på prøvene (Z), og dette representerer en fordel i forhold til de andre elektroniske mikroskopteknikkene. AFM-programvaren tillater generering av en 3D-bildeskanning ved samspillet mellom spissen og prøveoverflaten, og spissavbøyningen er korrelert med prøvens høyde gjennom en laser og en detektor.
I statisk modus (kontaktmodus) med konstant kraft presenterer utgangen to forskjellige bilder: høyden (z-topografien) og avbøyningen eller feilsignalet. Statisk modus er en verdifull, enkel avbildningsmodus, spesielt for robuste prøver i luft som kan håndtere de høye belastningene og vridningskreftene som utøves av statisk modus. Avbøynings- eller feilmodus drives i konstant kraftmodus. Imidlertid forbedres topografibildet ytterligere ved å legge til avbøyningssignalet til overflatestrukturen. I denne modusen blir avbøyningssignalet også referert til som feilsignalet ettersom avbøyningen er tilbakemeldingsparameteren; Eventuelle funksjoner eller morfologi som vises i denne kanalen, skyldes "feilen" i tilbakemeldingssløyfen, eller rettere sagt på grunn av tilbakemeldingssløyfen som kreves for å opprettholde et konstant avbøyningssettpunkt.
AFMs unike design gjør den kompakt - liten nok til å passe på en bordplate - samtidig som den har høy nok oppløsning til å løse atomtrinn. AFM-utstyret har en lavere kostnad enn utstyret til andre elektroniske mikroskoper, og vedlikeholdskostnadene er minimale. Mikroskopet krever ikke et laboratorium med spesielle forhold som et rent rom eller et isolert rom; Den trenger bare et vibrasjonsfritt skrivebord. For AFM trenger prøvene ikke å gjennomgå forseggjort forberedelse som for andre teknikker (gulldeksel, slanking); Bare en tørr prøve må festes til prøveholderen.
Vi bruker AFM-kontaktmodus for å observere bakterielle morfologier og effekten av NP. Populasjonen og cellulær morfologi av bakterier festet på en støtte kan observeres, samt den cellulære skaden som produseres av nanopartikler på bakterieartene. Bildene oppnådd av AFM-kontaktmodus bekrefter at det er et kraftig verktøy og ikke er begrenset av reagenser og kompliserte prosedyrer, noe som gjør det til en enkel, rask og økonomisk metode for bakteriell karakterisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteriell isolasjon og identifikasjon
- Isolering av en endofytisk stamme fra hvitløkspære meristems:
- Legg 2 mm fragmenter av meristemer fra tidligere skrellet, desinfisert og kuttet hvitløksløk på trypticase soyaagar (TSA) som et rikt vekstmedium, og rug ved 25 °C i 1 dag.
- Basert på de morfologiske forskjellene i bakteriekoloniene - form, størrelse, farge, kant, overført lys, reflektert lys, tekstur, konsistens og pigmentproduksjon - beskriver de forskjellige observerte morfotypene, og renser ved å krysse en representativ koloni av hver morfotype.
- Bevar alle rensede bakteriestammer i 30% glyserol ved -80 ° C.
- Identifiser en tilfeldig valgt stamme (9AP) ved å sekvensere 16S rDNA. Trekk ut DNA etter metoden til Hoffman og Winston8.
- Forsterk 16S rRNA ved polymerasekjedereaksjon (PCR) med 100 ng DNA, 1x polymerasebuffer, 4 mM MgCl2, 0,4 mM dNTP, 10 pmol hver av 27F / 1492r universelle oligonukleotider og 1 U DNA-polymerase9. Bruk følgende termiske syklistforhold: 95 °C i 5 minutter for den første denaturaliseringen; etterfulgt av 35 sykluser på 1 min ved 94 °C som denaturaliseringstemperatur, 1 min ved 56 °C som hybridiseringstemperatur og 1 min ved 72 °C som forlengelsestemperatur; og deretter 10 min ved 72 °C som en siste forlengelse.
- Kapillærsekvens PCR-produktet ved bruk av de samme oligonukleotider; bruke den dideoksyterminale metoden med matriseinstallasjonssettet for kapillærsekvensering10, og utføre elektroforese i et automatisert multikapillærsystem11.
- Rediger sekvensene manuelt, sammenlign sekvensen med GenBank-biblioteket ved hjelp av et BLAST-søk, og identifiser forsøksvis stammen med gullstandarden på minst 98,7% identitet med den nærmeste arten12,13.
MERK: Stammen 9AP ble identifisert som tilhørende arten Pseudomonas hunanensis, med en identitet på 99,86% med sekvensen for stammen P. hunanensis LV (JX545210).
2. Bakteriell prøveklargjøring for morfologisk observasjon ved AFM
- Under sterile forhold, legg en dråpe bakteriell suspensjon (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) på et glassglass.
- Fest prøvene på lysbildet ved tørrvarme. Før lysbildet forsiktig over en flamme flere ganger til prøven er tørr.
MERK: Fiksering av prøver er en rutinemessig teknikk i mikrobiologi for å observere faste prokaryote organismer og å simulere deres struktur som levende celler så nært som mulig. - Legg de faste prøvene i en petriskål, og ta dem med til AFM-utstyret for observasjon.
MERK: Siden prøvene kan endres av værforhold over tid, sett av en maksimal tid på 24 timer for analyse i AFM-utstyret. Hold prøvene fri for støv.
3. Antibakteriell effekt av MgO nanopartikler mot bakterier
MERK: Syntesen og karakteriseringen av MgO NP har blitt publisert tidligere14. I dette arbeidet ble den antibakterielle aktiviteten til nanomaterialene estimert basert på Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) -håndboken ved bruk av makrodilusjons- og mikrodilusjonsmetoder for inhibering15,16.
- Estimering av minste hemmende aktivitet (MIC) og bakteriedrepende midler (CMB)
- Forvekst av stammene
- Inokuler en passende mengde Escherichia coli eller Staphylococcus aureus i næringsrik buljong for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 × 108 CFU / ml.
- Inkuber suspensjonen ved 37 °C (± 2 °C) i 18-24 timer.
- Postvekst av akklimatiserte stammer
- Dyp en steril bakteriologisk sløyfe i suspensjonen, berør bunnen av røret.
- Utfør streker med sløyfen på eosin og metylenblå agar og næringsagar.
- Inkuber agarplatene ved 37 °C (± 2 °C) i 24 timer.
- Utvalg av kolonier for fremstilling av standardisert inokulum
- Ta tre til fem kolonier med samme morfologiske type ved å berøre toppen av kolonien i petriskålen med en bakteriologisk sløyfe.
- Overfør og fordyp utvalget i 3-5 ml Müller-Hinton buljong.
- Inkuber ved 37 °C (± 2 °C) for å oppnå en turbiditet på 1 × 10, 8 CFU/ml eller 2 × 10,8 CFU/ml.
MERK: I dette arbeidet ble McFarland turbiditetsstandarder brukt som referanse for bakteriologiske suspensjoner; 0,5-standarden tilsvarer omtrent en homogen E. coli-suspensjon på 1,5 × 108 celler/ml. Et UV-Vis-spektrofotometer ble brukt til å måle turbiditeten. - Ta 1 ml, og legg den til 9 ml steril kjøttkraft. Ta 200 μL av denne fortynningen, og tilsett den til 19,8 ml steril buljong for å oppnå en endelig konsentrasjon på 5 × 105 CFU / ml.
- Nødvendige konsentrasjoner av MgO nanopartikler
- Bruk en ultralyd for fremstilling av løsningene.
- Suspender nanomaterialet i sterilt vann ved to ganger konsentrasjonen som kreves for å oppnå serielle løsninger.
- Legg disse suspensjonene til sterile rør som inneholder Müller-Hinton buljong for å oppnå det nye konsentrasjonsområdet som kreves for forsøket.
MERK: Følgende konsentrasjoner av MgO NP ble anvendt for mikrofortynning: 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, 2000 ppm, 3000 ppm, 4000 ppm og 8000 ppm.
- Fremstilling av mikrofortynning15
- Forbered en ny og steril 96-brønns mikrotiterplate (mikroplate). Etikettkolonne nr. 12 av mikroplaten som en sterilitetskolonne; 11 som kolonne for vekstkontroll.
- Tilsett 120 μL av nanopartikkelsuspensjonene med de forskjellige konsentrasjonene til kolonne nr. 1-10.
- Inokuler 120 μL bakterier (5 × 105 CFU / ml) i brønnene i kolonne nr. 1-10.
MERK: For denne studien var rad G og rad H kontroller med ceftriakson i konsentrasjoner foreslått av CLSI-standarder: 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0,5 ppm, 0,25 ppm, 0,125 ppm, 0,06 ppm og 0,03 ppm. - Inkuber 96-brønns mikroplaten i 24 timer ved 37 °C (35 °C ± 2 °C). Til slutt analyserer du brønnene.
- Forvekst av stammene
- Observasjon av MgO nanopartikkel-induserte morfo-strukturelle endringer i bakteriestammer av AFM
- Ta 250 μL fra brønnene i mikrofortynningstestene, bland med 750 μL sterilt vann og sentrifuge ved 2000 × g fra 2 minutter til 5 minutter ved 5 °C.
- Vask utfellingene tre ganger med 1 ml sterilt vann hver gang, og på slutten av vaskene, tilsett 500 μL vann til dem.
- For å oppnå AFM-bildene, ta 10-20 μL av den endelige suspensjonen av hver startbrønn, utfør et smør på et lysbilde som tidligere er rengjort med ultralyd (30 min) og tørk ved romtemperatur i 1 time.
4. AFM-målinger
MERK: Her ble atomkraftmikroskopet i kontaktmodus montert på en anti-vibrasjonsarbeidsstasjon som tillot isolering av mikroskopet fra alle mekaniske vibrasjonskilder og holdt systemet i vater. Elektriske forstyrrelser reduseres med linjefiltre og overspenningsvern. AFM som brukes her, justerer laserstrålen automatisk til fotodetektoren.
- Slå på datamaskinen og AFM, og velg deretter kontaktmodus, contAI-G-sonder og Auto Slope-alternativene i programvareverktøyene. Standardverdiene til Z-kontrolleren er Setpoint = 20 nM, P-Gain = 10 000, I-Gain = 1 000, D-Gain = 0 og Tip voltage = 0 mV.
- Plasser prøvene i AFM-kontaktmodus ved hjelp av et hode på 70 μm skanneområde. Vi brukte ContAI-G silisiumutkrager med en fjærkonstant på 0,13 N/m.
- Bruk en kameraenhet montert på to linser integrert i skannehodet for å få en rask oversikt over overflaten av området under sonden.
- Utfør en forskyvning manuelt i XY-planet for å velge ønsket område. Sonden er laget for å nærme seg overflateprøven elektronisk til kontaktforholdene er nådd. Juster XY-måleplanet til skanneren og prøveoverflaten elektronisk ved å redusere skråningene i XY-retningene.
- Bruk standardparametrene til programvaren: 1 linje per sekund ved 256 poeng per linje.
- Utfør først et fullstendig skanneområde på et område på 70 μm x 70 μm; Velg deretter et mindre område ved hjelp av zoomverktøyet. AFM optimaliserer diagramområdet i Z automatisk.
MERK: Ved å redusere linjene per sekund øker den totale skannetiden, kvaliteten på skanningen er mer definert, og noe støy fra målingen fjernes også. - For å velge et nytt område fra prøven, trekk utkragingen elektronisk og flytt prøven langs XY-planet. Realiser en ny skanning ved hjelp av prosedyren beskrevet i trinn 4.5 og trinn 4.6.
MERK: De oppnådde skanningene vises i en ensfarget stangskala, der lysfargene er forbundet med høyere høyder, og de mørke fargene er forbundet med dypere høyder. AFM-programvaren genererer en 3D-visning av skanningen som gjør det mulig å verdsette detaljene på den målte overflaten. - Utfør databehandlingen ved hjelp av linjeutjevning linje for linje i Verktøy-menyen i bildet i filtervalget, som er den mest brukte og enkleste utjevningsmetoden.
MERK: Denne nivelleringsmetoden tar hver horisontal eller vertikal linje produsert i AFM-bildet og passer den til en polynomligning. - Optimaliser maksimums- og minimumshøyden i fargelinjen til høyre for å oppnå den beste bildeoppløsningen.
- Utfør bildeanalysen ved hjelp av Analyse-menyen på verktøylinjen. Bestem høyder og avstander ved å velge start- og sluttpunktene når ønsket verktøy er valgt.
MERK: Brukerne må prøve de forskjellige filtrene på Verktøy-menyen for å unngå bildeartefakter på grunn av sammenslåingen som brukes i utjevningsprosessen. Bildeartefakter vises som streklinjer og vises i noen av AFM-bildene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bilder av morfologien og størrelsen på S. aureus og P. hunanensis-stammer , samt populasjonsorganisasjonen av begge stammer, ble tatt ved atomkraftmikroskopi i kontaktmodus. S. aureus-bildene viste at populasjonen var fordelt etter soner med aggregater av kokker (figur 1A). Med en økning i skala var det en større forståelse av populasjonsfordelingen og morfologien til kokkene (figur 1B). Mikroskopirapportene viste at en pseudo-hemisfærisk struktur var tilstede i tilstøtende celler av S. aureus, men at bakteriene generelt presenterte en sfærisk morfologi i form av en kokkus etter celledeling, som tidligere vist på AFM-bildene. I tillegg tillot AFM-kontaktmodusbildene bestemmelsen av størrelsen på kokkene, som viste en gjennomsnittlig bredde på 1, 25 μm. Verdiene oppnådd ved måling av 20 celler er vist i figur 2.
I tilfelle av P. hunanensis ble det observert en homogen fordeling på hele overflaten av glassstøtten, og dannet et bakterielt monolag som festet seg til støtten (figur 3A), som rapportert av Zuttion et al., hvor forfatterne immobiliserte P. aureginosa på en solid støtte og viste samme oppførsel. Pseudomonas hunanensis-bakterier ble observert å være stavformede, med en lengde på 1,9 μm (L) og en bredde på 0,9 μm (W) (figur 3B,C); disse dataene er innenfor de rapporterte verdiene for P. fluorescens på 1,5-2,0 μm (L) og 0,6-0,9 μm (W)17,18,19.
For å visualisere de morfostrukturelle endringene på grunn av samspillet mellom MgO NP, ble bakteriestammene utsatt for AFM-analyse etter behandling (mikrofortynning). Tre grupper er vist i figur 4 og figur 5: Figur 4A-C og figur 5A-C er kontrollene; bildene i figur 4D-F og figur 5D-F ble hentet fra resultatene av mikrofortynningen ved MIC; bildene av figur 4G-I og figur 5G-I ble tatt ved en høyere konsentrasjon enn MIC.
Bildene av den øvre gruppen av figur 4A-C viser en coccus-type celle av Staphylococcus aureus med en jevn overflate og homogene konturer, som vokste i et passende miljø i Müeller-Hinton buljong i 24 timer i henhold til mikrodilusjonsteknikken. Gjennomsnittlig diameter var 1 μm ± 0,15 μm. Denne diameteren forsvant praktisk talt etter NP-behandling, som vist i figur 4D-F, siden forverringen av cellestrukturen var svært alvorlig. I henhold til tverrsnittet var gjennomsnittshøyden for kontrollen 200 nm ± 50 nm; Høyden på de behandlede cellene ble redusert med 40 % (120 nm ± 5 nm) i forhold til kontrollene. Bildene viser tydelig endringer i overflaten, for eksempel dannelsen av vesikler, etter eksponering for MgO NP i partiklenes CMI; I tillegg, ved å doble konsentrasjonene, ble den indre statusen til cellestrukturene påvirket, og cytosolisk materiale ble frigjort, som vist på bildene i figur4G-I 20,21.
Disse forandringene ble også identifisert i E. coli-celler, som vist i figur 5, med tilstander som ligner på S. aureus. Kontrollene av denne bakterien viste glatte overflater, og fremhevet sin meget homogene stavlignende form (bacillus) uten noen tilsynelatende endring. De tredimensjonale bildene viser de høyeste topografiske områdene assosiert med mikroorganismen i hvitt. Den gjennomsnittlige høyden på kontrollen E. coli var 160 nm ± 50 nm, og ifølge tverrsnittsbildene reduserte gjennomsnittshøyden til 76 nm ± 10 nm for celler utsatt i 24 timer til en konsentrasjon av MgO nanopartikler på 500 ppm (MIC). Strukturen forsvant helt i en konsentrasjon på 1000 ppm, og bare bakteriens silhuetter kunne skilles. Ved analyse av bildene for begge konsentrasjoner ble det observert at med hensyn til kontrollene ble cellemorfologien til de behandlede cellene signifikant endret, med en forlengelse på 2, 0 μm ± 0, 5 μm (figur 5A-C) til 3, 0 μm ± 0, 3 μm, som vist på bildene i figur 5D-I. Denne økningen var tydelig da den cellulære strukturen mistet intern homeostase, noe som forårsaket strukturell kollaps20,22. Bildene av bakterier utsatt for MgO NP viste tydelig overflateendringer som ryggdannelse eller korrugeringer som danner vesikulære forstyrrelser ved begge MICs og ved dobling av konsentrasjonene20,22.
Figur 1 Atomkraftmikroskopi kontaktmodus for gule stafylokokker. Denne figuren viser topografiene hentet fra S. aureus i forskjellige skalaer: (A) 70 μm og (B) 5,0 μm. Kartleggingsområdene ble valgt for å få S. aureus-topografien; bilde B viser tydelig S. aureus cocci. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Atomkraftmikroskopi kontaktmodustopografier og histogrammer av gule stafylokokker. Bildet viser (A) topografi og (B) histogrammet av diametrene til S. aureus-bakterier festet på en glassstøtte ved hjelp av varmefikseringsprosedyren. Cellediameteren ble målt med AFM-programvare; n = 20. Bildet er en representasjon av målingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Atomkraftmikroskopi kontaktmodus for Pseudomonas hunanensis 1AP-CY. Denne figuren viser topografiene hentet fra P. hunanensis 1AP-CY i forskjellige skalaer: (A) 70 μm, (B) 20 μm og (C) 5,0 μm. Bildene i ulike skalaer viser fordelingen av cellepopulasjonen på lysbildet. For å analysere cellemorfologien fokuseres et område med lavere befolkningstetthet på, som vist på bilde B, som viser stavformen til P. hunanensis (avbøyningssignalet vises for å forbedre topografibildet). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. AFM-kontaktmodusbilder oppnådd for ubehandlet S. aureus (øverst) og S. aureus utsatt for 250 ppm og 500 ppm MgO nanopartikler (midt og bunn) i 24 timer. (A,D,G) Topografiske bilder; (B,E,H) tredimensjonale bilder; (C,F,I) tverrsnittsbilder. Strukturelle endringer i bakteriene ble observert ved bruk av minste hemmende konsentrasjon av MgO (250 ppm) og en høyere konsentrasjon (500 ppm). Avbøyningssignalet vises for å forbedre topografibildet. Figur 4A,D,G er fra Muñiz Diaz et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: AFM-kontaktmodusbilder oppnådd for ubehandlet E. coli (øverst) og E. coli utsatt for 500 ppm og 1,000 ppm MgO nanopartikler (midt og bunn) i 24 timer. (A, D, G) topografiske bilder; (B,E,H) tredimensjonale bilder; (C,F,I) tverrsnittsbilder. Strukturelle endringer i bakteriene ble observert ved bruk av minste hemmende konsentrasjon av MgO (500 ppm) og en høyere konsentrasjon (1000 ppm). Figur 5A,D,G er fra Muñiz Diaz et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroskopi er en teknikk som vanligvis brukes i biologiske laboratorier som muliggjør undersøkelse av struktur, størrelse, morfologi og cellulær arrangement av biologiske prøver. For å forbedre denne teknikken kan flere typer mikroskoper brukes som avviger fra hverandre når det gjelder deres optiske eller elektroniske egenskaper, som bestemmer instrumentets oppløsningskraft.
I vitenskapelig forskning er bruk av mikroskopi nødvendig for karakterisering av bakterieceller; for eksempel har mikroskopi vist at NaCl påvirker termisk motstand og cellemorfologi av E. coli-stammer, Schisandra chinensis-ekstrakt viser antibakterielle effekter mot S. aureus, S. aureus utvikler termotoleranse etter subletalt varmesjokk, og E. coli biomineraliserer platina 23,24,25,26,27 . Dermed har fordelene presentert av AFM tillatt utvidelsen til forskningsområdene miljø og biologi.
Atomkraftmikroskopet er et instrument som brukes i kontaktmodus for å analysere bakterier in situ og i ikke-kontaktmodus for å bestemme topografien til makro- og nanoskopiske materialer. Fordelen med AFM over andre teknikker er at det krever færre prøver for å oppnå topografiske bilder; Det betraktes også som en ikke-destruktiv teknikk, og det skader eller kompromitterer ikke strukturen til det analyserte bildet. Selv om vi brukte varmefiksering i denne protokollen, ble bakteriecellemorfologien ikke endret. Det er viktig å nevne at denne teknikken ofte brukes i mikrobiologisk laboratorium for å studere bakterielle morfologier. I motsetning til i plante- og dyrevevsprøver produserer varmefikseringsteknikken endringer i proteiner og lipider som manifesteres i vevsforringelse; I bakterier forårsaker teknikken en liten krymping av cellen som ikke forstyrrer observasjonen av celleform og identifikasjon.
Med AFM er prøvepreparering enkel og krever ingen kjemiske produkter, som i tilfelle elektronmikroskopi, hvor det er viktig at prøven som skal analyseres er ledende, siden bildet produseres ved samspillet mellom elektronene som sendes ut av utstyret og prøven. Hvis prøven ikke er ledende, må den metalliseres med et ledende element som gull ved hjelp av den fysiske dampavsetningsteknikken. Videre når oppløsningen av elektronmikroskopi opp til 0, 4 nm, avhengig av linsen og modellen, mens AFM i kontaktmodus kan nå mikrometer, nanometer eller til og med pikometeroppløsning, noe som gjør den konkurransedyktig med elektronmikroskopi22. En annen fordel med AFM over elektronmikroskopi er at den ikke krever høyvakuumforhold for prøvebehandling20,21. Andre fordeler med AFM over vanlige teknikker er lav kostnad og kort bildeinnsamlingstid.
Når det gjelder teknikken for å feste bakterieprøven til en glassplate, er det viktig å nevne at varmefiksering er en teknikk som ofte brukes i mikrobiologiske laboratorier. Denne teknikken brukes slik at bakterieprøver kan identifiseres ved enkel eller differensiell farging. Samtidig kan man se formen på bakteriene, vanligvis kokker eller stang. En ulempe med varmefikseringsteknikken er nedgangen i bakteriens størrelse, men denne teknikken kompromitterer ikke bakteriens form.
Etter fiksering må det tas hensyn til å unngå aldring av prøven, noe som kan manifestere seg som en signifikant reduksjon i cellestørrelsen; Derfor anbefales det å analysere prøven innen 24 timer etter fiksering. Det må også utvises forsiktighet for å sikre at prøven ikke utsettes for støv. Prøvene bør derfor oppbevares i en lukket beholder (f.eks. en petriskål). Disse forholdene er kritiske da de kan endre AFM-bildene som er oppnådd.
Det er klart at å redusere bakteriens størrelse kan påvirke noe forskningsarbeid, samt at det kan være nødvendig med andre måter å feste bakteriene til en støtte. For eksempel har S. aureus biofilmer dyrket i BM-buljong på 34 mm plater blitt festet med glyseraldehyd. Videre har S. aureus blitt immobilisert med V-formede utkrager behandlet med poly-l-lysin, mens for C. albicans har hyfer blitt festet på glassglass belagt med positivt ladet poly-l-lysin for å analysere utvekslingen av adsorberte serumproteiner under adhesjonen av begge til en abiotisk overflate28,29.
I dette arbeidet endret ikke varmefiksering av prøvene formen eller aggregatene dannet av bakteriene, og varmefikseringen tillot effekten av nanopartiklene å bli visualisert. Derfor kunne AFM-topografiene vise formen på de isolerte kokkene eller aggregatene av S. aureus og stavene til P. hunanensis (figur 1 og figur 3). I tillegg fant vi også at S. aureus og E. coli viste skade i deres strukturer på grunn av effekten av MgO nanopartikler, mens kontrollprøvene (uten nanopartikler) ikke viste noen endring i deres morfologi (figur 4 og figur 5).
Dette arbeidet demonstrerer at bruken av AFM-kontaktmodus er et levedyktig alternativ for å karakterisere overflatetopologien og defektene i biologiske prøver, som det har blitt vist med S. aureus, P. hunanensis og E. coli. Videre er varmefikseringsteknikken ikke en avgjørende faktor som endrer celleoverflaten og forhindrer analyse. Beskjedent kan vi foreslå at varmefiksering kan være en fordel ved bruk av AFM. Prøver behandles mindre, og bruk av kjemiske reagenser unngås. Derfor er metodikken en enkel og økonomisk teknikk. Det er verdt å nevne at dette kan endres avhengig av den spesifikke analysen som skal utføres, som vist for studiet av biofilm og bakteriell adhesjon28,29. Som en mulig forlengelse av dette arbeidet kan kontaktmodus AFM brukes til å analysere effekten av NP på andre medisinsk viktige bakterier eller i forskning der celleskader skal observeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Ramiro Muniz-Diaz takker CONACyT for stipendet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
References
- Koch, A. L. Growth and form of the bacterial cell wall. American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).
- Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. Bacterial growth and form under mechanical compression. Scientific Report. 5, 11367 (2015).
- Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology. Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).
- Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C.
- Smith, W. P., et al. Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).
- Volke, D. C., Nikel, P. I. Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories. Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).
- Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology. Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).
- Hoffman, C. S., Winston, F. A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).
- Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
- Behr, S., Mätzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis. ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).
- Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure. Nucleosides & Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stackebrandt, E., Ebers, J. Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards. Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).
- Muñiz Diaz, R., et al. Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria. Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).
- Andrews, J. M.
- Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals. Methods. 42 (4), 321-324 (2007).
- Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).
- Yamada, S., et al. autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).
- Zuttion, F., et al. The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy. Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).
- Kahli, H., et al. Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).
- Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations. World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).
- Kochan, K., et al. et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria. Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).
- Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents. Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).
- Lee, H. -E., et al. NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains. Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).
- Song, L. Y., et al. Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food. Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).
- Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock. Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).
- Shar, S. S., et al. Biomineralization of platinum by Escherichia coli. Metals. 9 (4), 407 (2019).
- Baidamshina, D., et al. Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease. Scientific Reports. 7, 46068 (2017).
- Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).
