Summary
本方案描述了一种对蒙古传统药物Zadi-5在抑郁症中的治疗效果的行为测试验证和生物信息学预测的方法。
Abstract
Zadi-5是一种传统的蒙古药物，广泛用于治疗抑郁症和刺激症状。尽管Zadi-5对抑郁症的治疗作用已在先前报道的临床研究中得到证实，但药物中存在的活性药物化合物的身份和影响尚未完全阐明。本研究使用网络药理学来预测药物成分并鉴定Zadi-5药丸中的治疗活性化合物。在这里，我们建立了慢性不可预测的轻度应激（CUMS）大鼠模型，并进行了开放场试验（OFT）、莫里斯水迷宫（MWM）分析和蔗糖消耗试验（SCT），以研究Zadi-5在抑郁症中的潜在治疗效果。本研究旨在证明 Zadi-5 对抑郁症的治疗效果，并预测 Zadi-5 对抗该疾病的关键途径。氟西汀组（阳性对照）和Zadi-5组的纵横评分（OFT ）、SCT和跨区数显著高于未处理的CUMS组大鼠（P < 0.05）。根据网络药理学分析结果，发现PI3K-AKT通路对Zadi-5的抗抑郁作用至关重要。
Introduction
抑郁症，也称为重度抑郁症 （MDD），是一种严重的神经精神疾病，导致社会医疗和经济负担日益加重。由于相关的复杂性、发病率和死亡率，已经进行了大量研究以寻找该疾病的补救措施 1,2。根据世界卫生组织的一项心理健康调查，目前全球约有 3.5 亿人患有抑郁症及其相关症状。据预测，到 2030 年，抑郁症将超过癌症和心血管疾病，成为全球疾病负担的主要原因。因此，在不久的将来，抑郁症的预防和治疗将成为全球优先事项3.MDD的发病机制尚未阐明。尽管如此，它通常归因于以下因素：遗传易感性、下丘脑-垂体-肾上腺轴功能障碍、神经递质分泌减少、神经免疫失调诱导的神经炎症、细胞凋亡和细胞增殖减少 4,5。
在这些因素中，神经免疫失调诱导的神经炎症和神经营养因子分泌改变因其在抑郁症和许多其他精神疾病发展中的作用而受到特别关注6。在过去的十年中，学者们已经证明海马体是再生神经功能的主要场所，并参与调节情绪和认知。在这方面，海马神经元被认为是正在开发的抗抑郁药物的新治疗靶点 7,8。此外，据报道，海马体还参与学习和巩固记忆的短期和长期记忆。具体来说，海马CA1区域锥体神经元的缺乏会导致逆行和顺行性遗忘症9。典型的抗抑郁治疗策略旨在增强海马齿状回的细胞增殖和神经发生。基于药物化学技术合成的天然产物衍生化合物和小分子被认为是治疗各种神经精神疾病的创新治疗剂的主要来源。
蒙古族传统药物历史悠久，理论医学体系得到充分支持，是蒙古高原游牧民族的后裔，由于各种药用成分协同作用，产生协同作用，这些药物表现出多靶点和多通路效应。Zadi-5 是此类药物中公认的配方，最早记录在“高石博士的临床经验”中，由一位杰出的蒙古临床医生高石博士（1804-1876 年）撰写。在蒙古，使用这些药丸治疗痛苦、心悸、刺激和心脏刺痛的症状已经是很长一段时间的临床实践10,11。此外，Zadi-5 已被证明可缓解受影响患者的中风后抑郁症12。最近对 CUMS 的实验研究表明，Zadi-5 制剂通过调节中枢神经递质13 来缓解抑郁症;事实上，在 Zadi-5 中，已经检测到脑源性神经营养因子 （BDNF） 和酪氨酸激酶受体 B （TrkB） 水平升高，并与抑郁症大鼠模型中的学习和记忆改善相关14。然而，Zadi-5缓解抑郁症的确切作用机制尚未阐明。
本研究旨在通过行为测试证明Zadi-5对大鼠抑郁症的治疗效果，并使用中医药系统药理学（TCMSP）和瑞士靶点预测法鉴定Zadi-5的成分，以预测蒙古传统药物Zadi-5治疗抑郁症的潜在机制。
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Protocol
所有实验方案均经内蒙古医科大学动物实验伦理护理委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院动物护理伦理指南。将8周龄（200g±20g）的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠饲养在受控温度（22°C±2°C）和湿度（55%±15%）的房间中，在12小时/12小时调节的光/暗循环下，持续1周。网络药理学分析的工作流程见 图1 。
1.大鼠行为测试
- 建立CUMS大鼠模型
- 除对照组外，对所有大鼠施加以下刺激并隔离28天：光/暗循环反转24小时，食物剥夺24小时，水剥夺24小时，高速水平摇晃15分钟（一次/秒），尾巴夹2分钟，在冷水（4°C）中游泳5分钟， 45°C热刺激，湿垫24小时（表1）。将老鼠饲养在单独的笼子里。
注意：避免连续几天重复相同类型的刺激。 上述建立CUMS大鼠模型的程序已获得动物伦理委员会的批准，并在前面描述过15。
- 除对照组外，对所有大鼠施加以下刺激并隔离28天：光/暗循环反转24小时，食物剥夺24小时，水剥夺24小时，高速水平摇晃15分钟（一次/秒），尾巴夹2分钟，在冷水（4°C）中游泳5分钟， 45°C热刺激，湿垫24小时（表1）。将老鼠饲养在单独的笼子里。
- 药物制备
- 在研磨机中粉碎Zadi-5药丸，并在蒸馏水中制备1.16g/mL溶液。在蒸馏水中单独制备0.36mg / mL的氟西汀溶液。
- 药物管理
- 将大鼠随机分为六组（n = 10）：对照组（CON），模型组（MOD），Zadi-5组（Zadi-5,1.6g Zadi-5 / kg16），氟西汀组（氟西汀，3.6mg氟西汀/ kg）。每天一次，持续28天，通过管饲法给每只大鼠1mL / g适当的药物溶液，并用等体积的蒸馏水处理CON和MOD组。
注意：灌胃从所有组的模型建立开始时开始。
- 将大鼠随机分为六组（n = 10）：对照组（CON），模型组（MOD），Zadi-5组（Zadi-5,1.6g Zadi-5 / kg16），氟西汀组（氟西汀，3.6mg氟西汀/ kg）。每天一次，持续28天，通过管饲法给每只大鼠1mL / g适当的药物溶液，并用等体积的蒸馏水处理CON和MOD组。
- 露天试验 （OFT）
- 将一个黑盒子（50 cm x 50 cm x 30 cm）分成九个面积相等的正方形区域。为盒子配备视频跟踪分析系统。最后一次管饲后一天，将大鼠置于中心广场，并记录其水平和垂直活动3分钟。
- 将所有爪子交叉的方块数量作为水平活动进行评分，并将站立和梳理作为垂直活动进行评分。每次测试后，用 75% 酒精清洁盒子以去除大鼠的气味，以便进行后续测试17.
- 蔗糖消耗试验（SCT）
- 在食用前后称量各自的瓶子，并使用公式 （1） 计算第 0 天、第 7 天、第 14 天、第 21 天和第 28 天的 60 分钟蔗糖偏好率：
蔗糖消耗量 =
× 100% （1）
- 在食用前后称量各自的瓶子，并使用公式 （1） 计算第 0 天、第 7 天、第 14 天、第 21 天和第 28 天的 60 分钟蔗糖偏好率：
- 莫里斯水迷宫 （MWM）
- 将池分为四个象限。将象限从一到四排序，并将隐藏平台放置在水面以下 1 厘米的第三象限。
- 将大鼠受试者放入不同象限的迷宫中寻找平台120秒，并使用MWM视频轨迹分析系统记录潜伏时间。
- 将大鼠受试者置于池中的固定位置。如果受试者在 120 秒内找不到隐藏平台，则将延迟记录为 120 秒。
- 接下来，移开平台，将老鼠放入水中，并记录 120 秒的区域穿越次数。
- 将牛奶添加到池中以获得一定程度的不透明度。在实验过程中将水温保持在23°C±1°C。
× 100% （1）2. 网络药理学预测
- 筛选 Zadi-5 中的活动组件。
- 浏览中医系统药理学（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），在“草药名称”部分输入“肉豆蔻科精液种子”、“奥克兰根”和“Piperis longi Fructus”，即可获得化学品名称。将口服生物利用度 （OB） 的药代动力学指数设置为 >30%，将类药 （DL） 指数设置为 >0.18（补充文件 1）。
- 搜索“Rou Dou Kou”（肉豆蔻）、“Tu Mu Xiang”（Inula helenium L.）、“Mu Xiang”（奥克兰草）、“Guang Zao”（Choerospondias axillaris Roxb.Burtt Hill）和《中药药典》（http://www.zhongyaocai360.com/zhongguoyaodian/）中的“Bi Ba”（Piper longum L.）来识别每种成分的化学名称。
- 在 PubChem （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 中搜索已识别的化学名称以查找异构体 SMILES 或 InChIkey
- 鉴定 Zadi-5 中活性成分的靶蛋白。
- 使用 SEA （http://sea.bkslab.org/）、BATMAN （http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/） 和 Swiss Target Prediction （http://www.swisstargetprediction.ch/） 与异构体 SMILES 或 InChIkey 鉴定活性成分的靶蛋白，并找到重叠的蛋白质。
- 使用蛋白质数据库 UniProt （http://www.uniprot.org/uploadlists/） 将已识别的靶标转换为统一的基因名称。
- 搜索抑郁症的靶蛋白。
- 通过使用 Genecards （https://www.genecards.org/）、Disgenet （https://www.disgenet.org/） 和 Drugbank （https://www.drugbank.com/） 中的关键字“抑郁症”和“抑郁症”来搜索和识别抑郁症的潜在蛋白质靶点。
- 找到目标基因。
- 浏览维恩图（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），上传 List-1 中 Zadi-5 活性成分的靶点，上传 List-2 中抑郁的目标，然后提交。获取维恩图，并过滤掉重叠的目标候选者。
- 构建网络。
- 构建一个名为“类型和网络”的电子表格（补充文件 2）。“类型”是网络的标志，“网络”说明了标志之间的关系。
- 将“类型和网络”导出到 Cytoscape v3.9.0 以构建网络“Zadi-5 草药-成分-疾病靶点”。
- 分析目标候选物的蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络。
- 在 STRING 数据库 （https://cn.string- db.org/） 中设置公共目标以分析它们的交互作用。将蛋白质类型 设置为“智人”。将 交互阈值 设置为 0.9，并仅选择经过实验验证的类型。不要显示孤岛节点。
- 对靶标相关通路进行京都基因和基因组百科全书 （KEGG） 和基因本体论 （GO） 富集分析。
- 将 Zadi-5 的 86 个潜在抗抑郁靶点粘贴到 DAVID （https:// david.ncifcrf.gov/） 的 起始分析 支架中，通过执行基因本体 （GO） 功能（包括生物过程、细胞成分和分子功能）和京都基因和基因组百科全书 （KEGG） 通路富集分析来研究相关的信号通路。
注意：KEGG使用在线IMageGP（http://www.ehbio.com /ImageGP/index.php/Home/Index/）在气泡图中可视化。气泡大小表示在指示通路中富集的靶标数量，气泡颜色表示富集的 P 值。
- 将 Zadi-5 的 86 个潜在抗抑郁靶点粘贴到 DAVID （https:// david.ncifcrf.gov/） 的 起始分析 支架中，通过执行基因本体 （GO） 功能（包括生物过程、细胞成分和分子功能）和京都基因和基因组百科全书 （KEGG） 通路富集分析来研究相关的信号通路。
- 构建网络以说明 Zadi-5 中与 PI3K-AKT 信号通路相互作用的活性化合物。
- 下载KEGG通路文档，从富集分析中选择PI3K-AKT通路的基因，并将它们粘贴到电子表格上以构建“类型和网络”文档。
- 将“类型和网络”文档导出到 Cytoscape 以生成“PI3K-AKT 可视化化合物-靶标-通路网络”（补充文件 3）。
注意：“类型”是网络的签名，“网络”说明了符号之间的关系。
3. 统计分析
- 使用单因素方差分析 （ANOVA），然后进行 Duncan 事后检验，以确定生化和基因表达参数的显着差异。计算平均值±标准差 （SD），并可视化数据。将 P < 0.05 视为具有统计学意义。
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Representative Results
动物行为测试
CUMS诱导的大鼠抑郁模型中的行为测试结果
在CUMS刺激前，测试组之间的OFT评分、蔗糖消耗量和MWM分析没有显著差异。建立CUMS模型后，MOD组的纵向和水平得分均低于CON组（P < 0.05）。与MOD组相比，POS组和Zadi-5组的纵向和水平得分显著更高（P < 0.05）（图2A，B）。
第0天，试验组的蔗糖消耗量（%）无显著差异。Zadi-5 和 POS 组的蔗糖消耗量 （%） 在第 28 天高于 MOD 组（图 2C）。
与CON组相比，MOD组在MWM中寻找平台的时延显著更高（P < 0.01）。POS 组的延迟明显低于 MOD 组。Zadi-5组大鼠的潜伏期低于MOD组，但程度不显著。关于区域交叉计数，MOD组的交叉次数少于CON组。POS 和 Zadi-5 组比 MOD 组显示出更多的交叉（图 2D，E）。
网络药理学预测
Zadi-5 中有 134 个活性成分，并为这些成分检索了 220 个靶蛋白候选物。此外，还预测了 1,000 个与抑郁症相关的蛋白质靶标。根据维恩图分析，86个重叠靶点被确定为Zadi-5的关键抑郁相关靶点（图3）。基于这些发现，构建了“Zadi-5草药-成分-疾病靶点”和靶点候选物的PPI网络分析（图4A，B，图5和表2）。PI3K-AKT通路的边缘相对不规则，表明该通路对Zadi-5的抗抑郁作用至关重要。根据KEGG通路分析，PI3K-AKT信号通路排名第七（图6），与许多信号通路相关。因此，它被认为比其他富集途径相对更重要（图7A-C和图8）。
图 1：用于 体内 验证的网络药理学分析工作流程。 缩写：PPI = 蛋白质-蛋白质相互作用;KEGG = 京都基因和基因组百科全书;GO = 基因本体论;OFT = 露天试验;MWM = 莫里斯水迷宫;SCT = 蔗糖消耗测试。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：Zadi-5对CUMS诱导的大鼠抑郁模型的影响。 （A） OFT垂直评分。（B） OFT横向评分。（C） 第 0 天和第 28 天的蔗糖消耗水平 （%）。 （D） MWM 测试的延迟时间。（E） MWM测试的跨区编号。 ##P < 0.01表示CUMS MOD组与CON组相比存在显著差异。*P < 0.05表示POS组和Zadi-5组与MOD组相比存在显著差异。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：Zadi-5 和抑郁相关蛋白的蛋白质靶点的维恩图。 红色圆圈代表Zadi-5中活性成分的靶标，而蓝色圆圈代表与抑郁症相关的蛋白质。两种颜色的交集代表重叠的蛋白质，可以被确定为Zadi-5缓解抑郁症的治疗靶点。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：“Zadi-5草药-成分-疾病靶点网络”的构建。 红色平行四边形代表 Zadi-5 及其草药，而粉红色、橙色、黄色、绿色和紫色圆圈代表每种草药的成分。蓝色菱形代表与抑郁症相关的蛋白质，即绿色六边形。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：重叠蛋白质靶标的 PPI。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：基于 86 个重叠蛋白质靶标的前 20 个富含 KEGG 的术语的气泡图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：Zadi-5 组分和抑郁相关蛋白靶标的关键生物信息学结果。 （A） Zadi-5 和 depression 的前 20 个重叠分子功能 GO 项。（B） Zadi-5 和抑郁症的前 20 个重叠细胞成分 GO 项。（C） Zadi-5 和抑郁症的前 20 个重叠生物过程 GO 项。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：Zadi-5 成分-PI3K-AKT 信号通路富集靶点网络用于治疗抑郁症。 圆圈代表Zadi-5的成分，六边形代表Zadi-5的每种药物，绿色菱形代表PI3K-AKT信号通路的富集靶点。 请点击这里查看此图的较大版本.
表1：在大鼠受试者中诱导CUMS的应激刺激的应用顺序和方法。请按此下载此表格。
表 2： 图 2 中使用的 ID 代码。 缩写： MF = 肉豆蔻 Fragrans Inula IH = Innula helenium L.;FC = 脊肠果桔梗;AL = 奥克兰 lappa Decne.;PL = Piper Longum L. 请点击此处下载此表。
补充文件1：网络药理学方案的屏幕截图图像。请点击此处下载此文件。
补充文件2：Zadi-5成分-蛋白质-抑郁网络。请点击此处下载此文件。
补充文件3：网络类型。请点击此处下载此文件。
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Discussion
抑郁症是一种以情绪低落、快感缺乏和精力不足为特征的精神疾病。这种疾病伴有分心、认知功能障碍、社交退缩、失眠、性功能障碍和胃肠道疾病18,19。在抑郁症的研究中，建立动物模型对于理解新药的病理机制和作用至关重要。在这项研究中，通过协议第 2 节和表 1 中描述的刺激建立了 CUMS 诱导的大鼠抑郁模型，以模拟来自社会、家庭和工作相关来源的压力、攻击和挫折感。刺激强度的适当顺序和调整对于建立这种抑郁模型至关重要。此外，每次对OFT进行大鼠测试后，必须立即清洁箱子，以免影响下一只大鼠的踪迹。CUMS与分离相结合有效地创建了一个可靠的大鼠抑郁症模型20，该模型模拟了人类患者抑郁症状和生化体征的发展。该模型已被广泛用于探索抑郁症的病理生理机制和评估正在开发的抗抑郁药物21,22。OFT、SCT 和 MWM 等测试是评估大鼠受试者食欲、缺乏动力、学习能力和记忆力的简单、客观和合理的方法。这些测试被公认为测试神经疾病动物模型的金标准。
在这项研究中，网络药理学基于在线站点的 TCMSP 数据库，该数据库收集、存储和处理来自许多可用来源的数据，例如网站、书籍和学术期刊23。它通过减少调查所需的时间和成本，有效地支持了对具有复杂作用机制的传统药物的探索24,25。在网络药理学中，数据被复制到excel文件中，并根据每种药物和数据库进行明确分类。蒙古传统医学与传统中医的不同之处在于，每种药物的成分都无法搜索。在这方面，协议步骤2.2.1列出了一个有价值的数据库，用于识别本研究中的有效化学成分。如协议步骤2.4所述，基于三个不同的数据库确定Zadi-5和抑郁症的重叠靶蛋白可以确保研究的准确性和效率。这代表了对实验的关键修改，这对于提高结果的准确性至关重要。PPI相互作用、KEGGs和GO功能富集分析表明，PI3K-AKT信号通路在Zadi-5抗抑郁的治疗效果中起着至关重要的作用。促生存激酶信号级联 PI3K/AKT 通路是一种细胞内信号转导通路，通过抗氧化应激和抗凋亡作用在神经元损伤中发挥关键作用26。PI3K-AKT信号通路与增殖、存活、分化和蛋白质翻译等基本细胞功能密切相关。此外，它在特定器官（如心脏和大脑）的细胞代谢中起主导作用27.据报道，PI3K-AKT通路的激活可以通过调节抗氧化Bcl-2蛋白来抑制活性氧（ROS）的产生，从而控制神经元功能并保护神经元免受氧化损伤28,29。
本研究利用行为测试和网络药理学预测来估计 Zadi-5 的效果。未来，网络药理学可用于预测草药的生物活性成分及其靶蛋白。将进行病理评估和关键分子测试，以表征 Zadi-5 的生物活性成分。将应用行为测试来验证动物的动机、食欲和记忆力。为确保验证质量，将通过液相色谱-质谱（LC-MS）和核磁共振（NMR）波谱分析基于在线数据库的Zadi-5组分预测。目标蛋白将通过蛋白质印迹和定量聚合酶链反应 （qPCR） 分析30.
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Disclosures
作者没有需要披露的利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢中国内蒙古医科大学蒙古医学院提供的仪器和实验室。本研究得到了国家自然科学基金（81760762）和内蒙古卫生健康委员会科技计划项目（202201300）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytoscape software | version 3.7.0 | ||
| Fluoxetine | Lilly Suzhou Pharmaceutical Co., Ltd | J20160029 | |
| Morris water maze video trail analysing system | Tai Meng Tech Co., Ltd | WMT-200 | |
| Sprague Dawley rats | Beijing Biotechnology Co., Ltd, China | SCXK (JING) 2016-0002 | |
| video tracking system | Tai Meng Tech Co., Ltd | ZH-ZFT | |
| Zadi-5 pill | Pharmaceutical Preparation Center of International Mongolian Hospital, Inner Mongolia, China | M1301006 |
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