Summary
본 프로토콜은 우울증에 대한 몽골 전통 의학인 Zadi-5의 치료 효능에 대한 행동 테스트 검증 및 생물정보학적 예측을 위한 방법을 설명합니다.
Abstract
Zadi-5는 우울증과 자극 증상 치료에 널리 사용되는 몽골 전통 의학입니다. 우울증에 대한 Zadi-5의 치료 효과는 이전에 보고된 임상 연구에서 나타났지만, 약물에 존재하는 활성 제약 화합물의 정체와 영향은 완전히 설명되지 않았습니다. 이 연구는 네트워크 약리학을 사용하여 약물 구성을 예측하고 Zadi-5 알약의 치료 활성 화합물을 식별했습니다. 여기에서 만성 예측되지 않은 경미한 스트레스(CUMS)의 쥐 모델을 확립하고 우울증에 대한 Zadi-5의 잠재적 치료 효능을 조사하기 위해 OFT(Open Field Test), MWM(Morris water maze) 분석 및 SCT(sucrose consumption test)를 수행했습니다. 이 연구는 우울증에 대한 Zadi-5의 치료 효과를 입증하고 장애에 대한 Zadi-5 작용의 중요한 경로를 예측하는 것을 목표로 했습니다. 플루옥세틴(양성 대조군)과 Zadi-5 투여군의 수직 및 수평 점수(OFT), SCT 및 구역 교차 횟수는 치료를 받지 않은 CUMS 그룹 쥐보다 유의하게 높았다(P < 0.05). 네트워크 약리학 분석 결과에 따르면 PI3K-AKT 경로는 Zadi-5의 항우울 효과에 필수적인 것으로 밝혀졌습니다.
Introduction
주요우울장애(MDD)라고도 하는 우울증은 심각한 신경정신질환으로 사회에 대한 의료적, 경제적 부담을 증가시킵니다. 관련 복잡성, 이환율 및 사망률로 인해 장애에 대한 치료법을 찾기 위해 상당한 양의 연구가 수행되었습니다 1,2. 세계보건기구(WHO)의 정신 건강 조사에 따르면 현재 전 세계적으로 약 3억 5천만 명이 우울증 및 관련 증상으로 고통받고 있습니다. 2030년에는 우울증이 암과 심혈관 질환을 제치고 전 세계 질병 부담의 주요 원인이 될 것으로 예상됩니다. 따라서 우울증의 예방과 치료는 가까운 장래에 전 세계적인 우선순위가 될 것이다3. MDD의 발병 기전은 아직 밝혀지지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 일반적으로 유전적 소인, 시상하부-뇌하수체-부신 축의 기능 장애, 신경 전달 물질 분비 감소, 신경 면역 조절 장애로 인한 신경 염증, 세포 사멸 및 세포 증식 감소 4,5.
이러한 요인 중 신경면역 조절 장애로 인한 신경 염증과 신경 영양 인자의 분비 변화는 우울증 및 기타 많은 정신 질환의 발병에 중요한 역할을 하기 때문에 특히 주목을 받고 있다6. 지난 10년 동안 학자들은 해마가 재생 신경 기능의 지배적인 부위이며 감정과 인지 조절에 관여한다는 것을 입증했습니다. 이와 관련하여 해마 뉴런은 개발 중인 항우울제의 새로운 치료 표적으로 인식되고 있습니다 7,8. 또한 해마는 기억을 학습하고 통합하는 데 있어 단기 및 장기 기억에 관여하는 것으로 보고되었습니다. 특히, 해마의 CA1 영역에 피라미드 뉴런이 부족하면 역행성 및 전행성 기억상실증이 발생한다9. 일반적인 항우울제 치료 전략은 해마의 치상이랑에서 세포 증식과 신경 발생을 향상시키는 것을 목표로 합니다. 의약 화학 기술을 기반으로 합성된 천연물 유래 화합물 및 소분자는 다양한 신경 정신 질환에 대한 혁신적인 치료제의 주요 공급원으로 간주됩니다.
오랜 역사와 이론적 의학 체계가 잘 뒷받침된 몽골 전통 의학은 몽골 고원의 유목민으로부터 내려온 것으로, 다양한 의약 성분이 함께 작용하여 시너지 효과를 창출하기 때문에 다중 표적 및 다중 경로 효과를 나타냅니다. Zadi-5는 이러한 약물 중 잘 확립된 제형이며 Dr. Gao Shi(1804-1876)라는 뛰어난 몽골 임상의가 쓴 "Clinical Experience of Dr. Gao Shi"에 처음 기록되었습니다. 몽골에서는 고통, 심계항진, 자극 및 심장 찌르는 듯한 통증의 증상을 치료하기 위해 이 알약을 사용하는 것이 오랫동안 임상적으로 시행되어 왔다10,11. 또한, Zadi-5는 뇌졸중 후 우울증을 완화하는 효과가 입증되었다12. CUMS에 대한 최근의 실험적 연구는 Zadi-5 제형이 중추 신경 전달 물질13을 조절함으로써 우울증을 완화한다는 것을 밝혔다. 실제로, Zadi-5를 사용하면 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF)와 티로신 키나아제 수용체 B(TrkB)의 수치가 증가하여 우울증 쥐 모델에서 학습 및 기억력 향상과 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다14. 그러나 이러한 우울증 완화를 위한 Zadi-5의 정확한 작용 메커니즘은 밝혀지지 않았습니다.
이 연구는 행동 검사를 통해 쥐의 우울증에 대한 Zadi-5의 치료 효과를 입증하고 TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology) 및 Swiss Target Prediction을 사용하여 Zadi-5의 구성 요소를 식별하여 몽골 전통 의학인 Zadi-5의 우울증 치료 효능의 기저에 있는 잠재적 메커니즘을 예측하는 것을 목표로 했습니다.
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Protocol
모든 실험 프로토콜은 내몽골 의과대학 동물실험윤리위원회의 승인을 받았으며 국립보건원의 동물관리 및 윤리 지침을 따랐다. 생후 8주령(200g ± 20g)의 수컷 Sprague Dawley(SD) 쥐를 1주일 동안 12시간/12시간 조절된 빛/어둠 주기에서 온도(22°C ± 2°C) 및 습도(55% ± 15%)로 조절된 방에 수용했습니다. 네트워크 약리학 분석의 워크플로우에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오.
1. 쥐의 행동 테스트
- CUMS 쥐 모델 설정
- 대조군을 제외한 모든 쥐에게 28일 동안 격리와 결합된 다음 자극을 적용합니다: 24시간 동안 빛/어둠 주기의 반전, 24시간 동안 음식 부족, 24시간 동안 물 부족, 15분 동안 고속 레벨 흔들기(1회/초), 꼬리 clamp 2분 동안, 5분 동안 냉수(4°C)에서 수영, 45°C 열 자극 및 24시간 동안 습식 패딩(표 1). 개별 우리에서 쥐를 키우십시오.
알림: 연속으로 같은 유형의 자극을 반복하지 마십시오. CUMS 쥐 모델을 확립하기 위한 위의 절차는 동물 윤리 위원회의 승인을 받았으며 앞서설명한 15.
- 대조군을 제외한 모든 쥐에게 28일 동안 격리와 결합된 다음 자극을 적용합니다: 24시간 동안 빛/어둠 주기의 반전, 24시간 동안 음식 부족, 24시간 동안 물 부족, 15분 동안 고속 레벨 흔들기(1회/초), 꼬리 clamp 2분 동안, 5분 동안 냉수(4°C)에서 수영, 45°C 열 자극 및 24시간 동안 습식 패딩(표 1). 개별 우리에서 쥐를 키우십시오.
- 약물 준비
- 그라인더에서 Zadi-5 알약을 분쇄하고 증류수에 1.16g/mL 용액을 준비합니다. 증류수에 0.36mg/mL의 플루옥세틴 용액을 별도로 준비합니다.
- 약국
- 쥐를 무작위로 6개 그룹(n = 10)으로 나눕니다: 대조군(CON), 모델(MOD), Zadi-5 그룹(Zadi-5, Zadi-5 1.6g/kg16), 플루옥세틴 그룹(플루옥세틴, 플루옥세틴 3.6mg/kg). 28일 동안 하루에 한 번, 적절한 약물 용액의 쥐당 1mL/g을 gavage로 투여하고 CON 및 MOD 그룹을 동일한 양의 증류수로 처리합니다.
주: 가변 이동은 모든 그룹에 대한 모델 설정 시작 부분에서 시작됩니다.
- 쥐를 무작위로 6개 그룹(n = 10)으로 나눕니다: 대조군(CON), 모델(MOD), Zadi-5 그룹(Zadi-5, Zadi-5 1.6g/kg16), 플루옥세틴 그룹(플루옥세틴, 플루옥세틴 3.6mg/kg). 28일 동안 하루에 한 번, 적절한 약물 용액의 쥐당 1mL/g을 gavage로 투여하고 CON 및 MOD 그룹을 동일한 양의 증류수로 처리합니다.
- 오픈 필드 테스트(OFT)
- 검은색 상자(50cm x 50cm x 30cm)를 동일한 면적의 9개의 정사각형 영역으로 나눕니다. 상자에 비디오 추적 분석 시스템을 장착하십시오. 마지막 개비지 후 하루 동안 쥐를 중앙 사각형에 놓고 3분 동안 수평 및 수직 활동을 기록합니다.
- 수평 활동으로 모든 발로 교차하는 사각형의 수를 점수로 매기고 수직 활동으로 서 있고 몸단장을 채점합니다. 각 테스트 후 75% 알코올로 상자를 청소하여 후속 테스트를 위해 쥐의 냄새를 제거합니다17.
- 자당 소비 테스트(SCT)
- 섭취 전후의 각 병의 무게를 측정하고 방정식 (60)을 사용하여 0일, 7일, 14일, 14일 및 21일에 28분 자당 선호도를 계산합니다.
자당 소비량 =
× 100% (1)
- 섭취 전후의 각 병의 무게를 측정하고 방정식 (60)을 사용하여 0일, 7일, 14일, 14일 및 21일에 28분 자당 선호도를 계산합니다.
- 모리스 워터 메이즈(MWM)
- 풀을 4개의 사분면으로 나눕니다. 사분면을 1에서 4까지 정렬하고 숨겨진 플랫폼을 수면 아래 1cm의 세 번째 사분면에 배치합니다.
- 쥐 피험자를 다른 사분면의 미로에 배치하여 120초 동안 플랫폼을 찾고 MWM 비디오 트레일 분석 시스템을 사용하여 대기 시간을 기록합니다.
- 쥐 피험자를 수영장의 고정된 위치에 놓습니다. 피험자가 120초 안에 숨겨진 플랫폼을 찾을 수 없다면, 지연 시간을 120초로 기록한다.
- 그런 다음 플랫폼을 제거하고 쥐를 물에 넣고 120초 동안 구역 횡단 횟수를 기록합니다.
- 어느 정도의 불투명도를 위해 수영장에 우유를 추가하십시오. 실험 중 수온을 23°C ± 1°C로 유지하십시오.
× 100% (1)2. 네트워크 약리학적 예측
- Zadi-5에서 활성 구성 요소를 스크리닝합니다.
- Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)를 검색하고 "약초 이름" 섹션에 "Myristicae Semen Seeds", "Aucklandiae Radix roots" 및 "Piperis longi Fructus"를 입력하여 화학 물질의 이름을 얻습니다. 경구 생체이용률(OB)의 약동학 지수를 >30%로, 약물 유사(DL) 지수를 >0.18로 설정합니다(보충 파일 1).
- "Rou Dou Kou"(Myristica fragrans Houtt), "Tu Mu Xiang"(Inula helenium L.), "Mu Xiang"(Aucklandia lappa Decne.), "Guang Zao"(Choerospondias axillaris Roxb. Burtt Hill) 및 Chinese Medicine Pharmacopeia(http://www.zhongyaocai360.com/zhongguoyaodian/)의 "Bi Ba"(Piper longum L.)를 사용하여 각 성분의 화학명을 식별합니다.
- PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 식별된 화학명을 검색하여 이성질체 SMILES 또는 InChIkey를 찾습니다.
- Zadi-5의 활성 성분의 표적 단백질을 식별합니다.
- 이성질체 SMILES 또는 InChIkey와 함께 SEA(http://sea.bkslab.org/), BATMAN(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/) 및 Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)을 사용하여 활성 성분의 표적 단백질을 식별하고 겹치는 단백질을 찾습니다.
- 단백질 데이터베이스 UniProt(http://www.uniprot.org/uploadlists/)를 사용하여 식별된 표적을 통합 유전자 이름으로 변환합니다.
- 우울증에 대한 표적 단백질을 찾습니다.
- Genecards(https://www.genecards.org/), Disgenet(https://www.disgenet.org/) 및 Drugbank(https://www.drugbank.com/)에서 "우울증" 및 "우울 장애"라는 키워드를 사용하여 우울증에 대한 잠재적인 단백질 표적을 검색하고 식별합니다.
- 표적 유전자를 찾습니다.
- 벤 다이어그램(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)을 탐색하고, List-1에 Zadi-5의 활성 구성 요소 타겟을 업로드하고, List-2에 우울증 타겟을 업로드한 후 제출합니다. 벤 다이어그램을 가져와서 겹치는 대상 후보를 필터링합니다.
- 신경망을 구축합니다.
- "Type and Network"(보충 파일 2)라는 스프레드시트를 구성합니다. "유형"은 네트워크의 서명이고 "네트워크"는 기호 간의 관계를 나타냅니다.
- "Type and Network"를 Cytoscape v3.9.0으로 내보내 "Zadi-5 herbs-ingredients-disease targets" 네트워크를 구축합니다.
- 표적 후보 물질의 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크를 분석합니다.
- STRING 데이터베이스(https://cn.string-db.org/)에서 공통 대상을 설정하여 상호 작용을 분석합니다. 단백질 유형을 "호모 사피엔스"로 설정합니다. 상호 작용 임계값 을 0.9로 설정하고 실험적으로 검증된 유형만 선택합니다. 외로운 고립영역 노드를 표시하지 않습니다.
- 표적 관련 경로에 대한 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 GO(Gene Ontology) 농축 분석을 수행합니다.
- 생물학적 과정, 세포 구성 요소 및 분자 기능을 포함한 유전자 온톨로지(GO) 기능과 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로 농축 분석을 수행하여 관련 신호 전달 경로를 연구하기 위해 DAVID(https:// david.ncifcrf.gov/)의 Zadi-5의 잠재적인 항우울제 표적 86개를 시작 분석 브래킷에 붙여넣습니다.
참고: KEGG는 온라인 IMageGP(http://www.ehbio.com /ImageGP/index.php/Home/Index/)를 사용하여 버블 차트에서 시각화됩니다. 거품 크기는 표시된 경로에서 보강된 대상의 수를 나타내고 거품 색은 보강의 P-값을 나타냅니다.
- 생물학적 과정, 세포 구성 요소 및 분자 기능을 포함한 유전자 온톨로지(GO) 기능과 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로 농축 분석을 수행하여 관련 신호 전달 경로를 연구하기 위해 DAVID(https:// david.ncifcrf.gov/)의 Zadi-5의 잠재적인 항우울제 표적 86개를 시작 분석 브래킷에 붙여넣습니다.
- PI3K-AKT 신호전달 경로와 상호작용하는 Zadi-5의 활성 화합물을 설명하기 위해 신경망을 구축합니다.
- KEGG 경로 문서를 다운로드하고, 농축 분석에서 PI3K-AKT 경로의 유전자를 선택하고, 스프레드시트에 붙여 넣어 "유형 및 네트워크" 문서를 구성합니다.
- "Type and Network" 문서를 Cytoscape로 내보내 "PI3K-AKT 시각화 화합물-표적-경로 네트워크"를 생성합니다(보충 파일 3).
참고: "유형"은 네트워크의 서명이고 "네트워크"는 기호 간의 관계를 나타냅니다.
3. 통계 분석
- 일원 분산 분석(ANOVA)과 Duncan의 사후 검정을 사용하여 생화학적 및 유전자 발현 매개변수의 유의한 차이를 확인할 수 있습니다. 평균± 표준편차(SD)를 계산하고 데이터를 시각화합니다. P < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.
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Representative Results
동물행동시험
CUMS 유도 쥐 우울증 모델의 행동 테스트 결과
CUMS 자극 전 OFT 점수, 자당 소비량 및 MWM 분석에서 테스트 그룹 간에 유의한 차이가 발견되지 않았습니다. CUMS 모형 구축 후 MOD 그룹의 수직 및 수평 점수는 CON 그룹보다 낮았습니다(P < 0.05). MOD 그룹과 비교했을 때, POS 및 Zadi-5 그룹의 수직 및 수평 점수는 유의하게 높았습니다(P < 0.05)(그림 2A,B).
0일째에, 피실험군은 자당 소비량(%)에서 유의한 차이가 없었다. 28일째에 Zadi-5 및 POS 그룹의 자당 소비량(%)이 MOD 그룹보다 높았습니다(그림 2C).
CON 그룹과 비교했을 때, MWM에서 플랫폼을 찾기 위한 MOD 그룹의 지연 시간은 상당히 높았다(P < 0.01). POS 그룹의 대기 시간은 MOD 그룹보다 현저히 낮았습니다. Zadi-5 그룹의 쥐의 대기 시간은 MOD 그룹보다 낮았지만 유의미한 정도는 아니었습니다. 구역 횡단 횟수와 관련하여 MOD 그룹은 CON 그룹보다 횡단 횟수가 적었습니다. POS와 Zadi-5 그룹은 MOD 그룹보다 더 많은 교차를 보였다(그림 2D,E).
네트워크 약리학 예측
Zadi-5에는 134개의 활성 성분이 있었고 이러한 성분에 대해 220개의 표적 단백질 후보가 검색되었습니다. 또한 1,000개의 우울증 관련 단백질 표적이 예측되었습니다. 벤 다이어그램 분석에 따르면, 86개의 중첩 표적이 Zadi-5의 중요한 우울증 관련 표적으로 확인되었습니다(그림 3). 이러한 결과를 바탕으로 "Zadi-5 허브-성분-질병 표적"과 표적 후보물질에 대한 PPI 네트워크 분석을 구성하였다(그림 4A, B, 그림 5 및 표 2). PI3K-AKT 경로는 상대적으로 불규칙한 가장자리를 보였는데, 이는 이 경로가 Zadi-5의 항우울 효과에 필수적임을 나타냅니다. KEGG 경로 분석에 따르면 PI3K-AKT 신호 경로는 7위(그림 6)였으며 많은 신호 전달 경로와 관련이 있었습니다. 따라서 다른 농축 경로보다 상대적으로 더 중요한 것으로 간주되었습니다(그림 7A-C 및 그림 8).
그림 1: in vivo 검증을 위한 네트워크 약리학 분석의 워크플로우. 약어: PPI = 단백질-단백질 상호 작용; KEGG = 교토 유전자 및 게놈 백과사전; GO = 유전자 온톨로지; OFT = 오픈 필드 테스트; MWM = 모리스 워터 메이즈; SCT = 자당 소비 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: CUMS로 인한 쥐 우울증 모델에 대한 Zadi-5의 효과. (A) OFT 수직 점수. (B) OFT 수평 점수. (C) 0일과 28일의 자당 소비 수준(%). (D) MWM 테스트의 대기 시간. (E) MWM 테스트를 위한 영역 교차 번호. ##P < 0.01은 CUMS MOD 그룹이 CON 그룹에 비해 유의한 차이를 보였음을 나타냅니다. *P < 0.05는 POS 그룹과 Zadi-5 그룹이 MOD 그룹에 비해 유의한 차이를 보였음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Zadi-5 및 우울증 관련 단백질의 단백질 표적에 대한 벤 다이어그램. 빨간색 원은 Zadi-5의 활성 성분의 표적을 나타내고 파란색 원은 우울증과 관련된 단백질을 나타냅니다. 두 색상의 교차점은 Zadi-5에 의한 우울증 완화를 위한 치료 표적으로 식별될 수 있는 겹치는 단백질을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: "Zadi-5 허브-성분-질병 표적 네트워크"의 구축. 빨간색 평행사변형은 Zadi-5와 그 허브를 나타내고 분홍색, 주황색, 노란색, 녹색 및 보라색 원은 각 허브의 구성 요소를 나타냅니다. 파란색 다이아몬드는 녹색 육각형인 우울증과 관련된 단백질을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 겹치는 단백질 표적의 PPI. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 86개의 겹치는 단백질 표적을 기반으로 한 상위 20개의 KEGG가 풍부한 용어에 대한 버블 차트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: Zadi-5 성분 및 우울증 관련 단백질 표적에 대한 주요 생물정보학 결과. (A) Zadi-5와 우울증의 상위 20개 중첩 분자 함수 GO 용어. (B) 상위 20개의 겹치는 세포 구성 요소는 Zadi-5와 우울증 용어입니다. (C) 상위 20개의 겹치는 생물학적 과정은 Zadi-5와 우울증을 나타냈다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 우울증 치료를 위한 Zadi-5 성분-PI3K-AKT 신호 전달 경로 농축 표적 네트워크. 원은 Zadi-5의 성분을 나타내고, 육각형은 Zadi-5의 각 약물을 나타내며, 녹색 다이아몬드는 PI3K-AKT 신호 경로의 농축 표적을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 쥐 피험자에서 CUMS 유도를 위한 스트레스 자극의 적용 순서 및 방법. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 그림 2에 사용된 ID 코드. 약어: MF = Myristica Fragrans Inula IH = Innula helenium L.; FC = Fructus Choerospondiatis; AL = 오클랜드 lappa Decne.; PL = Piper Longum L. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 네트워크 약리학 프로토콜의 스크린샷 이미지. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: Zadi-5 성분-단백질-우울증 네트워크. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3: 네트워크 유형. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우울증은 우울한 기분, 무쾌감증, 에너지 부족을 특징으로 하는 정신 질환입니다. 이 장애는 산만함, 인지 기능 장애, 사회적 위축, 불면증, 성기능 장애 및 위장 질환을 동반합니다18,19. 우울증 연구에서 동물 모델을 확립하는 것은 신약의 병리학적 메커니즘과 효과를 이해하는 데 매우 중요합니다. 이 연구에서는 사회, 가족 및 일과 관련된 원인으로 인한 스트레스, 공격 및 좌절감을 시뮬레이션하기 위해 프로토콜 섹션 2 및 표 1에 설명된 자극을 통해 CUMS 유도 쥐 우울증 모델을 설정했습니다. 자극의 강도의 적절한 순서와 조정은 이 우울증 모델을 확립하는 데 매우 중요합니다. 또한 OFT의 각 쥐 테스트 후에는 다음 쥐의 발자국이 영향을 받지 않도록 상자를 즉시 청소해야 합니다. 분리와 결합된 CUMS는 인간 환자의 우울 증상 및 생화학적 징후의 발달을 시뮬레이션하는 신뢰할 수 있는 쥐 우울증 모델20을 효과적으로 생성합니다. 이 모델은 우울증의 병태생리학적 메커니즘을 탐구하고 개발 중인 항우울제를 평가하는 데 널리 사용되어 왔다21,22. OFT, SCT 및 MWM과 같은 테스트는 쥐 피험자의 식욕, 동기 부여 부재, 학습 능력 및 기억력을 평가하는 간단하고 객관적이며 합리적인 방법입니다. 이 검사는 신경 장애의 동물 모델을 테스트하기 위한 황금 표준으로 인정받고 있습니다.
본 연구에서 네트워크 약리학은 웹사이트, 서적, 학술지 등 다양한 출처에서 데이터를 수집, 저장 및 처리하는 온라인 사이트의 TCMSP 데이터베이스를 기반으로 하였다23. 이는 조사에 필요한 시간과 비용을 줄임으로써 복잡한 작용 기전을 가진 전통 의약품의 탐색을 효과적으로 지원합니다24,25. 네트워크 약리학에서는 데이터를 엑셀 파일로 복사하고 각 약물 및 데이터베이스를 기반으로 명확하게 분류합니다. 몽골 전통 의학은 각 약의 성분을 검색할 수 없다는 점에서 중국 전통 의학과 다르다. 이와 관련하여 프로토콜 단계 2.2.1은 이 연구에서 효과적인 화학 성분을 식별하기 위한 귀중한 데이터베이스를 나열합니다. 프로토콜 단계 2.4에서 설명한 바와 같이, 3개의 개별 데이터베이스를 기반으로 Zadi-5와 우울증의 중복되는 표적 단백질을 결정하면 조사의 정확성과 효율성을 보장할 수 있습니다. 이는 결과의 정확도를 개선하는 데 필수적인 실험의 주요 수정을 나타냅니다. PPI 상호작용, KEGG 및 GO 기능 강화 분석은 PI3K-AKT 신호 전달 경로가 우울증에 대한 Zadi-5의 치료 효과에 중요한 역할을 한다는 것을 나타냈습니다. pro-survival kinase-signaling cascade PI3K/AKT pathway는 항산화 스트레스 및 anti-apoptotic 효과를 통해 뉴런 손상에 중추적인 역할을 하는 세포 내 신호 전달 경로입니다26. PI3K-AKT 신호전달 경로는 증식, 생존, 분화 및 단백질 번역과 같은 기본적인 세포 기능과 밀접한 관련이 있습니다. 또한 심장과 뇌와 같은 특정 기관의 세포 대사에 지배적인 역할을 합니다27. PI3K-AKT 경로의 활성화는 항산화 Bcl-2 단백질을 조절하여 활성 산소 종(ROS)의 생성을 억제함으로써 뉴런 기능을 제어하고 산화 손상으로부터 뉴런을 보호할 수 있는 것으로 보고되었습니다.28,29.
이 연구는 Zadi-5의 효과를 추정하기 위해 행동 테스트 및 네트워크 약리학적 예측을 활용했습니다. 미래에는 네트워크 약리학을 사용하여 생약의 생리 활성 성분과 표적 단백질을 예측할 수 있습니다. Zadi-5의 생체 활성 성분을 특성화하기 위해 병리학적 평가 및 주요 분자 테스트가 수행됩니다. 동물의 동기 부여, 식욕 및 기억력을 검증하기 위해 행동 테스트가 적용됩니다. 검증 품질을 보장하기 위해 온라인 데이터베이스를 기반으로 한 Zadi-5의 구성 요소 예측은 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 및 핵 자기 공명(NMR) 분광법으로 분석됩니다. 표적 단백질은 웨스턴 블롯 및 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 분석(30)에 의해 분석될 것이다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 중국 내몽골 의과 대학의 몽골 의학 교수진이 제공한 장비와 실험실에 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(81760762)과 중국 내몽골 건강위원회 과학기술계획계획(202201300)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytoscape software | version 3.7.0 | ||
| Fluoxetine | Lilly Suzhou Pharmaceutical Co., Ltd | J20160029 | |
| Morris water maze video trail analysing system | Tai Meng Tech Co., Ltd | WMT-200 | |
| Sprague Dawley rats | Beijing Biotechnology Co., Ltd, China | SCXK (JING) 2016-0002 | |
| video tracking system | Tai Meng Tech Co., Ltd | ZH-ZFT | |
| Zadi-5 pill | Pharmaceutical Preparation Center of International Mongolian Hospital, Inner Mongolia, China | M1301006 |
References
- Jiang, N., et al. The antidepressant-like effects of Shen Yuan in a chronic unpredictable mild stress rat model. Frontiers in Psychiatry. 12, 622204 (2021).
- Yang, L. F., et al. The effects of psychological stress on depression. Current Neuropharmacology. 13 (4), 494-504 (2015).
- Liu, Q. Q., et al. Changes in the global burden of depression from 1990 to 2017: Findings from the Global Burden of Disease study. Journal of Psychiatric Research. 126, 134-140 (2020).
- Pinto, B., Conde, T., Domingues, I., Domingues, M. R. Adaptation of lipid profiling in depression disease and treatment: A critical review. International Journal of Molecular Sciences. 23 (4), 2032 (2022).
- Rahman, S., et al. Increased serum resistin but not G-CSF levels are associated in the pathophysiology of major depressive disorder: Findings from a case-control study. PLoS One. 17 (2), 0264404 (2022).
- Liu, C., et al. Danzhi Xiaoyao powder promotes neuronal regeneration by downregulating Notch signaling pathway in the treatment of generalized anxiety disorder. Frontiers in Pharmacology. 12, 772576 (2021).
- Tanti, A., Belzung, C. Hippocampal neurogenesis: a biomarker for depression or antidepressant effects? Methodological considerations and perspectives for future research. Cell and Tissue Research. 354 (1), 203-219 (2013).
- Zhu, C., et al. Silencing of RGS2 enhances hippocampal neuron regeneration and rescues depression-like behavioral impairments through activation of cAMP pathway. Brain Research. 1746, 147018 (2020).
- Toda, T., Parylak, S. L., Linker, S. B., Gage, F. H. The role of adult hippocampal neurogenesis in brain health and disease. Molecular Psychiatry. 24 (1), 67-87 (2019).
- Bold, S. History and Development of Traditional Mongolian Medicine, third edition. , Sodpress Kompanid Khevlv. Ulaanbaatar, Mongolia. (2013).
- Medical, E. committee of Mongolian Encyclopedia. Mongolian Studies' Encyclopedia: Mongolian Medicine, third edition. , Hohhot, Mongolia. (2012).
- Fan, L., Wang, W. Clinical observation of Mongolian medicine Zadi-5 combined with Western medicine to treat depression after stroke. China Practice Medicine. 14 (2), 115-116 (2019).
- Hu, R. L. B. G., et al. Experimental research on nutmeg wuwei pills against of depression model rats behavior and hippocampus monoamine neurotransmitters. Chinese Journal of ETMF. 21 (11), 146-149 (2015).
- Hu, R. L. B. G., et al. Effects of Rou kou Wuwei Pill on the learning and memory abilities and the expression of BDNF and TrkB in hippocampus of depression rats. CJTCMP. 32 (8), 3797-3800 (2017).
- Yang,, et al. Morinda officinalis oligosaccharides mitigate depression-like behaviors in hypertension rats by regulating Mfn2-mediated mitophagy. J Neuroinflammation. 20 (1), 31 (2023).
- Hu, R. L. B. G., et al. Effect of Zadi Wuwei pills on behaviors and learning memory in the depression model rats. World Journal of ITWM. 10 (10), 1367-1370 (2015).
- Ghasemi, M., Raza, M., Dehpour, A. R. NMDA receptor antagonists augment antidepressant-like effects of lithium in the mouse forced swimming test. Journal of Psychopharmacology. 24 (4), 585-594 (2010).
- Zhang, Y., et al. tea attenuates chronic unpredictable mild stress-induced depressive-like behavior in rats via the gut-brain axis. Nutrients. 14 (1), 99 (2021).
- Kandola, A., Ashdown-Franks, G., Hendrikse, J., Sabiston, C. M., Stubbs, B. Physical activity and depression: Towards understanding the antidepressant mechanisms of physical activity. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 107, 525-539 (2019).
- Sun, J., et al. Clostridium butyricum attenuates chronic unpredictable mild stress-induced depressive-like behavior in mice via the gut-brain axis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8415-8421 (2018).
- Willner, P. Chronic mild stress (CMS) revisited: Consistency and behavioural-neurobiological concordance in the effects of CMS. Neuropsychobiology. 52 (2), 90-110 (2005).
- Albrakati, A., et al. Neuroprotective efficiency of prodigiosins conjugated with selenium nanoparticles in rats exposed to chronic unpredictable mild stress is mediated through antioxidative, anti-inflammatory, anti-apoptotic, and neuromodulatory activities. International Journal of Nanomedicine. 16, 8447-8464 (2021).
- Chan, K., et al. Good practice in reviewing and publishing studies on herbal medicine, with special emphasis on traditional Chinese medicine and Chinese materia medica. Journal of Ethnopharmacology. 140 (3), 469-475 (2012).
- Su, H., et al. Exploration of the mechanism of Lianhua Qingwen in treating influenza virus pneumonia and new coronavirus pneumonia with the concept of "different diseases with the same treatment" based on network pharmacology. Evidence Based Complementary Alternative Medicine. 2022, 5536266 (2022).
- Zhou, P., et al. Network pharmacology and molecular docking analysis on pharmacological mechanisms of Astragalus membranaceus in the treatment of gastric ulcer. Evidence Based Complementary Alternative Medicine. 2022, 9007396 (2022).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Aoyagi, T., Matsui, T. Phosphoinositide-3 kinase signaling in cardiac hypertrophy and heart failure. Current Pharmaceutical Design. 17 (18), 1818-1824 (2011).
- Zhu, H., et al. The neuroprotection of liraglutide against ischaemia-induced apoptosis through the activation of the PI3K/AKT and MAPK pathways. Scientific Reports. 6, 26859 (2016).
- Radak, Z., Zhao, Z., Koltai, E., Ohno, H., Atalayet, M. Oxygen consumption and usage during physical exercise: The balance between oxidative stress and ROS-dependent adaptive signaling. Antioxidants & Redox Signaling. 18 (10), 1208-1246 (2013).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 2022, 115278 (2022).
