Summary
本プロトコルは、うつ病におけるモンゴルの伝統的な薬であるZadi-5の治療効果の行動テスト検証とバイオインフォマティカル予測のための方法を説明しています。
Abstract
Zadi-5は、うつ病や刺激症状の治療に広く使用されているモンゴルの伝統医学です。うつ病に対するZadi-5の治療効果は以前に報告された臨床試験で示されていますが、薬物に存在する活性医薬品化合物の同一性と影響は完全には解明されていません。.この研究では、ネットワーク薬理学を使用して薬物組成を予測し、Zadi-5錠剤の治療活性化合物を特定しました。ここでは、慢性予測不能軽度ストレス(CUMS)のラットモデルを確立し、オープンフィールドテスト(OFT)、モリス水迷路(MWM)分析、およびショ糖消費テスト(SCT)を実施して、うつ病におけるZadi-5の潜在的な治療効果を調査しました。この研究は、うつ病に対する Zadi-5 の治療効果を実証し、障害に対する Zadi-5 の作用のクリティカル パスを予測することを目的としています。フルオキセチン(陽性対照)群とZadi-5群の垂直および水平スコア(OFT)、SCT、およびゾーン交差数は、CUMS群のラットよりも有意に高かった(P < 0.05)。ネットワーク薬理学分析の結果によると、PI3K-AKT経路はZadi-5の抗うつ効果に不可欠であることがわかりました。
Introduction
うつ病は、大うつ病性障害(MDD)とも呼ばれ、重度の神経精神疾患であり、社会の医学的および経済的負担を増大させる原因となっています。関連する複雑さ、罹患率、および死亡率のために、この障害の治療法を見つけるためにかなりの量の研究が行われてきました1,2。世界保健機関(WHO)のメンタルヘルス調査によると、現在、世界中で約3億5000万人がうつ病とそれに関連する症状に苦しんでいます。うつ病は、2030年までに世界の疾病負荷の主な原因として、がんと心血管疾患を追い越すと予測されています。したがって、うつ病の予防と治療は、近い将来、世界的な優先事項となるでしょう3。MDDの病因はまだ解明されていません。それでも、遺伝的素因、視床下部-下垂体-副腎軸の機能不全、神経伝達物質分泌の減少、神経免疫調節不全による神経炎症、細胞アポトーシス、および細胞増殖の減少4,5。
これらの因子の中でも、神経免疫調節不全による神経炎症や神経栄養因子の分泌変化は、うつ病をはじめとする多くの精神疾患の発症に関与していることが特に注目されています6。過去10年間、学者たちは、海馬が再生神経機能の主要な部位であり、感情と認知の調節に関与していることを実証してきました。この点で、海馬ニューロンは開発中の抗うつ薬の新規治療標的として認識されています7,8。また、海馬は記憶の学習や定着において、短期記憶や長期記憶にも関与していることが報告されています。具体的には、海馬のCA1領域における錐体ニューロンの不足は、逆行性および順行性健忘症を引き起こす9。典型的な抗うつ薬の治療戦略は、海馬の歯状回における細胞増殖と神経新生を促進することを目的としています。創薬化学技術に基づいて合成された天然物由来の化合物や低分子は、さまざまな神経精神疾患に対する革新的な治療薬の主要な供給源と考えられています。
モンゴル高原の遊牧民の子孫であるモンゴルの伝統薬は、長い歴史と理論的な医療体制が確立されており、様々な薬効成分が協調して作用し、相乗的な機能を生み出すため、マルチターゲット・マルチパスウェイ効果を発揮します。Zadi-5は、そのような薬の中でも確立された製剤であり、モンゴルの優れた臨床医である高石博士(1804-1876)によって書かれた「高石博士の臨床経験」に初めて記録されました。モンゴルでは、苦痛、動悸、刺激、心臓刺すような痛みの症状を治療するためにこれらの錠剤を使用することが長い間臨床的に行われてきました10,11。さらに、Zadi-5は、罹患した患者の脳卒中後うつ病の緩和に効果があることが証明されています12。CUMSに関する最近の実験的研究により、Zadi-5製剤は中枢神経伝達物質を調節することによりうつ病を緩和することが明らかになりました13。実際、Zadi-5では、うつ病のラットモデルにおいて、脳由来神経栄養因子(BDNF)とチロシンキナーゼ受容体B(TrkB)のレベルの上昇が検出され、学習と記憶の改善と相関しています14。しかし、そのようなうつ病の緩和のためのZadi-5の正確な作用機序は解明されていません。.
この研究は、行動テストを使用してラットのうつ病に対するZadi-5の治療効果を実証し、Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology(TCMSP)とSwiss Target Predictionを使用してZadi-5の成分を特定し、うつ病の治療におけるモンゴルの伝統医学であるZadi-5の有効性の根底にある潜在的なメカニズムを予測することを目的としています。
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Protocol
すべての実験プロトコルは、内モンゴル医科大学の動物実験ケア委員会の倫理によって承認され、動物のケアと倫理に関する国立衛生研究所のガイドラインに従っていました。8週齢(200g±20g)の雄のSprague Dawley(SD)ラットを、温度(22°C±2°C)と湿度(55%±15%)の部屋に、12時間/12時間の明暗サイクルで1週間飼育した。ネットワーク薬理解析のワークフローについては、 図 1 を参照してください。
1. ラットの行動試験
- CUMSラットモデルの確立
- 対照を除くすべてのラットに、28日間の隔離と組み合わせた次の刺激を適用します:24時間の明暗サイクルの反転、24時間の食物剥奪、24時間の水分剥奪、15分間の高速レベル振とう(1回/ s)、テールクランプ2分間、冷水(4°C)で5分間泳ぐ、 45°Cの熱刺激、および24時間の湿潤パディング(表1)。個々のケージでラットを飼育します。
注意: 同じ種類の刺激を連続して繰り返すことは避けてください。 CUMSラットモデルを確立するための上記の手順は、動物倫理委員会によって承認されており、以前に説明されています15。
- 対照を除くすべてのラットに、28日間の隔離と組み合わせた次の刺激を適用します:24時間の明暗サイクルの反転、24時間の食物剥奪、24時間の水分剥奪、15分間の高速レベル振とう(1回/ s)、テールクランプ2分間、冷水(4°C)で5分間泳ぐ、 45°Cの熱刺激、および24時間の湿潤パディング(表1)。個々のケージでラットを飼育します。
- 薬剤の調製
- Zadi-5錠剤を粉砕機で粉砕し、蒸留水で1.16 g / mL溶液を調製します。.蒸留水に0.36 mg/mLのフルオキセチン溶液を別途調製します。
- 薬物投与
- ラットを無作為に6つのグループ(n = 10)に分けます:コントロール(CON)、モデル(MOD)、Zadi-5グループ(Zadi-5、1.6 gのZadi-5 / kg16)、フルオキセチングループ(フルオキセチン、3.6 mgのフルオキセチン/ kg)。1日1回、28日間、ラット1匹あたり1mL/gの適切な薬液を強制経口投与し、CON群とMOD群を等量の蒸留水で処理する。
注:強制経口は、すべてのグループのモデル確立の開始時に開始されます。
- ラットを無作為に6つのグループ(n = 10)に分けます:コントロール(CON)、モデル(MOD)、Zadi-5グループ(Zadi-5、1.6 gのZadi-5 / kg16)、フルオキセチングループ(フルオキセチン、3.6 mgのフルオキセチン/ kg)。1日1回、28日間、ラット1匹あたり1mL/gの適切な薬液を強制経口投与し、CON群とMOD群を等量の蒸留水で処理する。
- オープンフィールドテスト(OFT)
- ブラックボックス(50 cm x 50 cm x 30 cm)を等面積の9つの正方形の領域に分割します。ボックスにビデオトラッキング分析システムを装備します。最後の強制経口投与の1日後、ネズミを中央の正方形に置き、その水平および垂直の活動を3分間記録します。
- すべての前足で交差した正方形の数を水平方向のアクティビティとして採点し、立って身だしなみを整える数を垂直方向のアクティビティとして採点します。各テストの後、75%アルコールで箱を洗浄して、その後のテスト17のためにラットの臭いを取り除きます。
- ショ糖消費試験(SCT)
- 消費の前後にそれぞれのボトルの重量を量り、式(1)を使用して、0日目、7日目、14日目、21日目、および28日目の60分間のスクロース選好率を計算します。
ショ糖消費量=
× 100% (1)
- 消費の前後にそれぞれのボトルの重量を量り、式(1)を使用して、0日目、7日目、14日目、21日目、および28日目の60分間のスクロース選好率を計算します。
- モリス水迷路(MWM)
- プールを 4 つの象限に分割します。象限を1から4まで順番に並べ、水面から1cm下の3番目の象限に隠しプラットフォームを配置します。
- ラットの被験者を異なる象限の迷路に配置してプラットフォームを120秒間探し、MWMビデオトレイル分析システムを使用して遅延時間を記録します。
- ラットの被験者をプールの固定位置に置きます。被験者が 120 秒以内に隠れたプラットフォームを見つけられない場合は、レイテンシーを 120 秒として記録します。
- 次に、プラットフォームを取り外し、ネズミを水中に置き、120秒間のゾーン横断回数を記録します。
- ある程度の不透明度のためにプールにミルクを追加します。実験中は水温を23°C±1°Cに維持してください。
× 100% (1)2. ネットワーク薬理学的予測
- Zadi-5のアクティブなコンポーネントをスクリーニングします。
- Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology(TCMSP、https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)を参照し、「ハーブ名」セクションに「Myristicae Semen Seeds」、「Aucklandiae Radix roots」、「Piperis longi Fructus」を入力して、化学物質の名前を取得します。経口バイオアベイラビリティ (OB) の薬物動態指数を >30% とし、薬物様 (DL) 指数を >0.18 に設定します (補足ファイル 1)。
- 「Rou Dou Kou」(Myristica fragrans Houtt)、「Tu Mu Xiang」(Inula helenium L.)、「Mu Xiang」(Aucklandia lappa Decne.)、「Guang Zao」(Choerospondias axillaris Roxb.Burtt Hill)、および漢方薬局方(http://www.zhongyaocai360.com/zhongguoyaodian/)の「Bi Ba」(Piper longum L.)を使用して、各成分の化学名を特定します。
- 同定された化学名をPubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)で検索し、異性体SMILESまたはInChIkeyを見つけます
- Zadi-5の有効成分の標的タンパク質を同定します。
- SEA(http://sea.bkslab.org/)、BATMAN(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)、Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)を用いて有効成分の標的タンパク質を異性体SMILESまたはInChIkeyで同定し、重複するタンパク質を見つけます。
- タンパク質データベースUniProt(http://www.uniprot.org/uploadlists/)を使用して、同定されたターゲットを統一された遺伝子名に変換します。
- うつ病の標的タンパク質を探索します。
- Genecards(https://www.genecards.org/)、Disgenet(https://www.disgenet.org/)、Drugbank(https://www.drugbank.com/)のキーワード「depression」および「depressive disorder」を使用して、うつ病の潜在的なタンパク質標的を検索および特定します。
- 標的遺伝子を見つけます。
- ベン図(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)を閲覧し、リスト-1のZadi-5の有効成分のターゲットをアップロードし、リスト-2のうつ病のターゲットをアップロードして送信します。ベン図を取得し、重複するターゲット候補を除外します。
- ネットワークを構築します。
- "Type and Network" というスプレッドシートを作成します (補足ファイル 2)。「タイプ」はネットワークのシグネチャで、「ネットワーク」はサイン間の関係を示します。
- 「タイプとネットワーク」をCytoscape v3.9.0にエクスポートして、「Zadi-5 herbs-ingredients-disease targets」ネットワークを構築します。
- 標的候補のタンパク質間相互作用(PPI)ネットワークを解析します。
- STRINGデータベース(https://cn.string-db.org/)で共通のターゲットを設定し、それらの相互作用を分析します。タンパク質の種類 を「ホモ・サピエンス」に設定します。 交互作用のしきい値 を 0.9 に設定し、実験的に検証されたタイプのみを選択します。孤独な島のノードを表示しません。
- Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)およびGene Ontology(GO)による標的関連経路のエンリッチメント解析を実施する。
- Zadi-5 の 86 の潜在的な抗うつ薬ターゲットを DAVID (https:// david.ncifcrf.gov/) の開始 分析 ブラケットに貼り付けて、生物学的プロセス、細胞成分、分子機能を含む遺伝子オントロジー (GO) 機能、および遺伝子およびゲノムの京都百科事典 (KEGG) パスウェイ濃縮分析を実行することにより、関連するシグナル伝達経路を研究します。
注: KEGG は、オンラインの IMageGP (http://www.ehbio.com /ImageGP/index.php/Home/Index/) を使用してバブル チャートで視覚化されます。バブルサイズは、指定された経路でエンリッチされたターゲットの数を表し、バブルの色はエンリッチメントのP値を表します。
- Zadi-5 の 86 の潜在的な抗うつ薬ターゲットを DAVID (https:// david.ncifcrf.gov/) の開始 分析 ブラケットに貼り付けて、生物学的プロセス、細胞成分、分子機能を含む遺伝子オントロジー (GO) 機能、および遺伝子およびゲノムの京都百科事典 (KEGG) パスウェイ濃縮分析を実行することにより、関連するシグナル伝達経路を研究します。
- PI3K-AKT シグナル伝達経路と相互作用する Zadi-5 の活性化合物を説明するためにネットワークを構築します。
- KEGG経路のドキュメントをダウンロードし、エンリッチメント解析からPI3K-AKT経路の遺伝子を選択し、スプレッドシートに貼り付けて「タイプとネットワーク」のドキュメントを作成します。
- 「Type and Network」ドキュメントをCytoscapeにエクスポートして、「PI3K-AKT可視化された化合物-標的-経路ネットワーク」(補足ファイル3)を生成します。
メモ: 「タイプ」はネットワークのシグニチャで、「ネットワーク」はサイン間の関係を示します。
3. 統計解析
- 一元配置分散分析(ANOVA)とそれに続くダンカンの事後検定を使用して、生化学的パラメータと遺伝子発現パラメータの有意差を判断します。標準偏差 (SD) ±平均を計算し、データを可視化します。 P < 0.05 を統計的に有意なものと考えます。
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Representative Results
動物行動試験
CUMS誘発ラットうつ病モデルにおける行動試験の結果
CUMS刺激前のOFTスコア、ショ糖消費量、MWM分析について、試験群間に有意差は認められなかった。CUMSモデルを確立した後、MOD群の垂直および水平スコアはCON群よりも低かった(P < 0.05)。MOD群と比較して、POS群およびZadi-5群の垂直および水平スコアは有意に高かった(P < 0.05)(図2A、B)。
0日目に、試験群はスクロース消費量(%)に有意差を示さなかった。28日目のZadi-5およびPOS群のショ糖消費量(%)は、MOD群のそれよりも高かった(図2C)。
CON群と比較して、MOD群がMWMでプラットフォームを見つけるまでの待ち時間は有意に高かった(P < 0.01)。POSグループのレイテンシーは、MODグループよりも著しく低かった。Zadi-5群のラットの潜伏時間はMOD群よりも低かったが、有意な程度ではなかった。ゾーン交差数に関しては、MOD群はCON群よりも交差回数が少なかった。POS群とZadi-5群はMOD群よりも多くの交差を示した(図2D、E)。
ネットワーク薬理学予測
Zadi-5には134の有効成分があり、これらの成分について220の標的タンパク質候補が検索されました。さらに、1,000のうつ病関連タンパク質標的が予測されました。ベン図解析によると、86の重複するターゲットがZadi-5の重要なうつ病関連ターゲットとして特定されました(図3)。これらの知見に基づいて、「Zadi-5ハーブ-成分-疾患標的」および標的候補のPPIネットワーク分析を構築しました(図4A、B、図5、および表2)。PI3K-AKT経路は比較的不規則な縁を示し、この経路がZadi-5の抗うつ効果に不可欠であることを示しています。KEGG経路解析によると、PI3K-AKTシグナル伝達経路は7位にランクされ(図6)、多くのシグナル伝達経路と関連していました。したがって、他の濃縮経路よりも相対的に重要であると考えられました(図7A-Cおよび図8)。
図1: in vivo バリデーションのためのネットワーク薬理解析のワークフロー。 略語:PPI =タンパク質間相互作用;KEGG = 京都遺伝子ゲノム事典;GO = 遺伝子オントロジー;OFT = オープンフィールドテスト;MWM = モリス ウォーター メイズ;SCT = スクロース消費テスト。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:CUMS誘発ラットうつ病モデルに対するZadi-5の効果。 (A)OFTの垂直スコア。(B)OFT水平スコア。(C)0日目と28日目のショ糖消費レベル(%)。 (D)MWMテストのレイテンシ時間。(E)MWMテストのゾーンクロッシング数。 ##P < 0.01は、CUMS MOD群がCON群と比較して有意差を示したことを示しています。*P < 0.05は、POS群とZadi-5群がMOD群と比較して有意差を示したことを示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:Zadi-5のタンパク質標的とうつ病関連タンパク質のベン図。 赤丸はZadi-5の有効成分の標的、青丸はうつ病に関連するタンパク質です。2つの色の交点は、Zadi-5によるうつ病緩和の治療標的として識別できる重なり合うタンパク質を表しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:「Zadi-5ハーブ-成分-疾患標的ネットワーク」の構築。 赤い平行四辺形はZadi-5とその薬草を表し、ピンク、オレンジ、黄、緑、紫の円は各薬草の成分を表しています。青いひし形は、うつ病に関連するタンパク質を表しており、緑色の六角形です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:重複するタンパク質ターゲットのPPI。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:重複する86のタンパク質ターゲットに基づく上位20のKEGGs濃縮項のバブルチャート。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:Zadi-5成分とうつ病関連タンパク質ターゲットの主要なバイオインフォマティクス結果。 (A)上位20の重複する分子機能は、Zadi-5とうつ病の用語を囲みます。(B)重複する上位20の細胞成分は、Zadi-5とうつ病の用語になります。(C)上位20の重複する生物学的プロセスGO用語は、Zadi-5とうつ病です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図8:Zadi-5成分-PI3K-AKTシグナル伝達経路の濃縮は、うつ病治療のためのネットワークを標的としています。 円はZadi-5の成分、六角形はZadi-5の各薬物、緑色のひし形はPI3K-AKTシグナル伝達経路の濃縮標的を表しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1:ラット被験者におけるCUMSの誘導のためのストレス刺激の適用順序と方法。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2: 図2で使用したIDコード 略語: MF = Myristica Fragrans Inula IH = Innula helenium L.;FC = Fructus Choerospondiatis;AL = Aucklandia lappa Decne.;PL = Piper Longum L. この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:ネットワーク薬理学プロトコルのスクリーンショット画像。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:Zadi-5成分-タンパク質-うつ病ネットワーク。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル3:ネットワークの種類。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
うつ病は、気分の落ち込み、無快感症、エネルギー不足を特徴とする精神疾患です。この障害は、注意散漫、認知機能障害、社会的引きこもり、不眠症、性機能障害、および胃腸疾患を伴います18,19。うつ病の研究では、新薬の病態メカニズムと効果を理解するために、動物モデルを確立することが重要です。この研究では、CUMS誘発ラットうつ病モデルが確立されました プロトコルセクション2および表1に記載されている刺激を通じて、社会、家族、および仕事に関連する原因からのストレス、攻撃、および欲求不満をシミュレートします。刺激の強度の適切な順序と調整は、このうつ病モデルを確立するために重要です。さらに、OFTのラットテストのたびに、次のラットの痕跡が影響を受けないように、箱をすぐに洗浄する必要があります。単離と組み合わされたCUMSは、ヒト患者における抑うつ症状および生化学的徴候の発症をシミュレートする信頼性の高いラットうつ病モデル20を効果的に作成する。このモデルは、うつ病の病態生理学的メカニズムを探り、開発中の抗うつ薬を評価するために広く使用されています21,22。OFT、SCT、MWMなどの検査は、ラット被験者の食欲、意欲の欠如、学習能力、記憶力を評価するための簡単で客観的かつ合理的な方法です。これらの検査は、神経疾患の動物モデルを試験するためのゴールドスタンダードとして認められています。
この研究では、ネットワーク薬理学は、Webサイト、書籍、学術雑誌など、利用可能な多くのソースからデータを収集、保存、および処理するオンラインサイトのTCMSPデータベースに基づいていました23。これは、調査に必要な時間とコストを削減することにより、複雑な作用機序を持つ伝統薬の探索を効果的にサポートします24,25。ネットワーク薬理学では、データをエクセルファイルにコピーし、各薬剤やデータベースに基づいて明確に分類します。モンゴルの伝統医学は、漢方薬とは異なり、それぞれの薬の成分を調べることができません。この点に関して、プロトコルステップ2.2.1には、この研究で有効な化学成分を特定するための貴重なデータベースがリストされています。プロトコルステップ2.4で説明したように、3つの異なるデータベースに基づいてZadi-5とうつ病の重複する標的タンパク質を決定することで、調査の正確性と効率性を確保できます。これは、結果の精度を向上させるために不可欠な実験の重要な変更を表します。PPI相互作用、KEGG、およびGO機能エンリッチメント分析は、PI3K-AKTシグナル伝達経路がうつ病に対するZadi-5の治療効果に重要な役割を果たしていることを示しました。生存促進キナーゼシグナル伝達カスケードPI3K/AKT経路は、抗酸化ストレスと抗アポトーシス効果を介してニューロン損傷に極めて重要な役割を果たす細胞内シグナル伝達経路である26。PI3K-AKTシグナル伝達経路は、増殖、生存、分化、タンパク質翻訳などの基本的な細胞機能と密接に関連しています。さらに、心臓や脳などの特定の臓器の細胞の代謝において支配的な役割を果たします27。PI3K-AKT経路の活性化は、抗酸化Bcl-2タンパク質を調節して活性酸素種(ROS)の生成を抑制することにより、ニューロンの機能を制御し、ニューロンを酸化的損傷から保護できることが報告されています28,29。
この研究では、行動テストとネットワーク薬理学的予測を利用して、Zadi-5の効果を推定しました。将来的には、ネットワーク薬理学を用いて、生薬の生理活性成分や標的タンパク質の予測が期待されます。病理学的評価と主要分子試験は、Zadi-5の生理活性成分を特徴付けるために実施されます。行動テストは、動物のモチベーション、食欲、記憶を検証するために適用されます。検証の品質を確保するために、オンラインデータベースに基づくZadi-5の成分の予測は、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)および核磁気共鳴(NMR)分光法によって分析されます。標的タンパク質は、ウェスタンブロットおよび定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)分析によって分析されます30。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
中国の内モンゴル医科大学のモンゴル医学部が提供する機器と実験室に感謝しています。本研究は、中国国家自然科学基金会(81760762)および中国内モンゴル自治区衛生健康委員会科学技術計画プロジェクト(202201300)の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytoscape software | version 3.7.0 | ||
| Fluoxetine | Lilly Suzhou Pharmaceutical Co., Ltd | J20160029 | |
| Morris water maze video trail analysing system | Tai Meng Tech Co., Ltd | WMT-200 | |
| Sprague Dawley rats | Beijing Biotechnology Co., Ltd, China | SCXK (JING) 2016-0002 | |
| video tracking system | Tai Meng Tech Co., Ltd | ZH-ZFT | |
| Zadi-5 pill | Pharmaceutical Preparation Center of International Mongolian Hospital, Inner Mongolia, China | M1301006 |
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