Summary
该协议提出了在脂肪细胞（AdipoSPH）中使用CRISPR SunTag-p65-HSF1（SPH）作为腺相关病毒（AAV）的替代策略来研究米色脂肪生物学。 体内 注射靶向内源性Prdm16基因的携带AAV的sgRNA足以诱导米色脂肪发育并增强产热基因程序。
Abstract
成簇规则间隔短回文重复（CRISPR）技术引发了生物学的革命，最近的工具已经远远超出了最初描述的基因编辑。CRISPR活化（CRISPRa）系统将催化无活性的Cas9（dCas9）蛋白与不同的转录模块相结合，以诱导内源性基因表达。SunTag-p65-HSF1（SPH）是最近开发的一种CRISPRa技术，它将协同激活介质（SAM）的成分与SunTag激活剂相结合。该系统通过设计定制的单向导RNA（sgRNA）允许单个或多个基因的过表达。在这项研究中，先前开发的SPH小鼠用于在脂肪细胞（脂联素Cre谱系）中产生表达SPH的条件小鼠，称为AdipoSPH。为了诱导白色至米色脂肪（褐变）表型，将携带靶向内源性Prdm16基因（一种与棕色和米色脂肪发育相关的成熟转录因子）的sgRNA的腺相关病毒（AAV）注射到腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中。该小鼠模型诱导内源性Prdm16的表达并激活产热基因程序。此外， 体外 SPH诱导的Prdm16过表达增强了米色脂肪细胞的耗氧量，表型复制了先前Prdm16转基因小鼠模型的结果。因此，该协议描述了一种用于研究脂肪组织生物学的多功能，经济高效且具有时间效率的小鼠模型。
Introduction
米色（或卤状）脂肪细胞是解偶联表达蛋白 1 （UCP1） 和富含线粒体的脂肪细胞，位于白色脂肪组织 （WAT） 库中。米色脂肪来自脂肪细胞祖细胞或成熟白色脂肪细胞的亚群，以响应寒冷暴露和其他刺激1，2。米色脂肪细胞可以以UCP1依赖性或独立的方式将能量转化为热量3。除了产热功能如何，米色脂肪还可以通过其他方式改善代谢健康，例如脂肪因子的分泌和抗炎和抗纤维化活性。对小鼠和人类的研究表明，米色脂肪的诱导改善全身葡萄糖和脂质稳态3。然而，尽管近年来我们对米色脂肪生物学的了解发展迅速，但其大部分代谢益处和相关机制仍未完全了解。
簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）首先在真核细胞中被描述为能够通过Cas9蛋白4，5的核酸酶活性在基因组的特定位点产生双链断裂（DSB）的工具。Cas9由合成的单向导RNA（sgRNA）引导，靶向特定的基因组区域，从而产生DNA DSB。除了使用核酸酶Cas9进行编辑外，CRISPR-Cas9技术还发展成为序列特异性基因调控工具6。催化无活性Cas9蛋白（dCas9）的发展和能够增强基因表达的转录模块的结合产生了CRISPR激活（CRISPRa）工具。已经出现了几种CRISPRa系统，例如VP647，8，协同激活介质（SAM）9，SunTag10，11，VPR 12，13和SunTag-p65-HSF1（SPH）14，它们结合了SAM和SunTag激活剂的组件。最近已经证明，与其他CRISPRa系统相比，使用SPH诱导的N2a神经母细胞和原代星形胶质细胞中神经源性基因的表达更高14，这表明SPH是一种有前途的CRISPRa工具。
在这里，我们利用先前开发的SPH小鼠14 ，使用脂联素Cre谱系（AdipoSPH）生成在脂肪细胞中特异性表达SPH的条件小鼠模型。使用携带靶向内源性Prdm16基因的gRNA的腺相关病毒（AAV），诱导腹股沟WAT（iWAT）的褐变（白色到米色转换）以增加产热基因程序的表达。此外， 体外 Prdm16过表达增加了耗氧量。因此，该协议提供了一种多功能的SPH小鼠模型，用于探索脂肪组织内米色脂肪发育的机制。
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Protocol
动物研究是根据坎皮纳斯大学实验动物护理和使用指南（协议CEUA #5810-1/2021）进行的。
1. 分子克隆
- 单向导RNA（sgRNA）的设计
- 使用CHOPCHOP（https://chopchop.cbu.uib.no/ 提供）或任何其他合适的工具设计用于CRISPR激活的sgRNA。使用以下参数设计靶向Prdm16基因的sgRNA：靶标：Prdm16;在：肌肉肌肉;使用：Crispr/Cas9;对于：激活。
注意：为每个感兴趣的区域设计sgRNA，分布在200 bp上游转录起始位点（TSS）区域。例如，本研究中使用的靶向Prdm16的sgRNA结合TSS上游的154 bp。 - 向sgRNA添加突出部分以匹配载体骨架pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry中的SacI限制性位点（参见 材料表）。包括：5'-（N20）AGCT-3'（N =核苷酸）。例如，靶向Prdm16基因的序列是5'-CGAGCTGCGCTGAAAAAGGGG-3'，悬垂是5'-CGAGCTGCGCTGAAAAAGGGAGCT-3'。
- 使用 https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html 提供的工具获取 3' sgRNA 逆转补体序列。例如，靶向Prdm16基因的3'sgRNA序列是3'-TCGAGCTCGACGCGACTTTTTCCCC-5'。
- 使用CHOPCHOP（https://chopchop.cbu.uib.no/ 提供）或任何其他合适的工具设计用于CRISPR激活的sgRNA。使用以下参数设计靶向Prdm16基因的sgRNA：靶标：Prdm16;在：肌肉肌肉;使用：Crispr/Cas9;对于：激活。
- 单链互补寡核苷酸的退火
- 加入 1 μL 各 5' 和 3' 单链寡核苷酸（储备浓度：100 μM）、1 μL T4 连接酶缓冲液、0.5 μL T4 多核苷酸激酶 （PNK）（1 × 104 单位/mL）和 6.5 μL H2O 至最终反应体积为 10 μL。 在以下条件下使用热循环仪对互补的单链寡核苷酸进行退火： 37°C30分钟和95°C5分钟，然后以5°C / min的斜坡速率下降。
注意：PNK酶与PNK缓冲液一起提供，并且不含磷酸化反应所需的足够ATP（参见 材料表）。为了简化反应，请使用T4连接酶缓冲液（而不是PNK缓冲液）。T4连接酶缓冲液为磷酸化反应提供适量的磷酸盐（1mM ATP）。PNK酶为随后的连接反应提供寡核苷酸的5'末端磷酸化。
- 加入 1 μL 各 5' 和 3' 单链寡核苷酸（储备浓度：100 μM）、1 μL T4 连接酶缓冲液、0.5 μL T4 多核苷酸激酶 （PNK）（1 × 104 单位/mL）和 6.5 μL H2O 至最终反应体积为 10 μL。 在以下条件下使用热循环仪对互补的单链寡核苷酸进行退火： 37°C30分钟和95°C5分钟，然后以5°C / min的斜坡速率下降。
- 退火的sgRNA寡核苷酸的连接
- 将 25 ng 质粒 pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry 加入 2 μL 退火的 sgRNA 寡核苷酸、1 μL SacI 酶、2 μL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液、1 μL T4 DNA 连接酶 （1-3 u/μL）（参见 材料表）和 H2O 至最终反应体积 10 μL。
- 通过在以下条件下使用热循环仪孵育反应混合物来进行连接：37°C的15个循环5分钟和25°C的5分钟，然后在4°C下保持。
- 转化后进行集落聚合酶链反应（PCR）
- 使用热休克（42°C45秒）用4μL连接产物转化感受态 大肠杆菌 DH10B细胞（参见 材料表），并铺展在含有100μg/ mL氨苄青霉素的琼脂平板上。
- 使用PCR预混液通过菌落PCR确认转化的菌落（参见 材料表）。挑选菌落并与 5 μL 预混液、0.1 μL 通用引物（储备浓度：100 μM）、0.1 μL sgRNA 反向引物（储备浓度：100 μM）（表 1）和 5 μL H2O 混合。 在以下条件下使用热循环仪运行PCR：初始变性（94°C2分钟）， 然后进行35个变性循环（94°C持续20秒），退火（60°C持续30秒），延伸（72°C持续30秒）和最终伸长步骤（72°C持续5分钟）。使用琼脂糖（1.5%）凝胶电泳在90 V的0.5x TAE缓冲液中分离DNA30分钟。
注意：阳性克隆给出~280 bp的条带。 - 使用通用引物提交阳性样品进行Sanger测序（表1，补充文件1）。
- 质粒纯化
- 按照制造商的说明，使用质粒纯化试剂盒（参见 材料表）从阳性克隆中纯化质粒。
注意：使用阴离子交换树脂或其他适合细胞转染的试剂盒纯化质粒。 - 使用含有100μg/ mL氨苄青霉素的标准细菌生长培养基孵育阳性克隆（在37°C下以200rpm振荡12小时）。
- 在4°C下以6，000× g 离心细菌细胞10分钟。 根据制造商的套件说明执行后续步骤。
- 按照制造商的说明，使用质粒纯化试剂盒（参见 材料表）从阳性克隆中纯化质粒。
2. AAV包装
注意：AAV包装是根据以前的出版物15，16 进行的，略有修改。
- 使用含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P / S）的25mL Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）在175cm2烧瓶中（每个烧瓶接种5×106个细胞）中板293T细胞（参见材料表）。在37°C，5%CO2和95%湿度下孵育，直到细胞达到50%-70%汇合。
- 将 14 μL 聚乙烯亚胺 （1 μg/μL） 与 1 mL 150 mM NaCl 混合。将AAV生产所需的三种质粒以1：1：1摩尔比混合（即17.7μgpAdDeltaF6，7.9μgAAV2 / 8（参见 材料表）和5.9μg来自步骤1的克隆sgRNA，1 mL 150 mM NaCl。将聚乙烯亚胺：NaCl混合物逐滴转移到含有DNA（质粒混合物）的管中，并在25°C下孵育20分钟。
注意：pAdDeltaF6是辅助质粒，p衣壳pAAV2 / 8是表达复制（Rep）和衣壳（帽）基因的包装质粒。两种质粒都是产生AAV所必需的。 - 转染前，用含有1%FBS和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（0.5 g/L）的18 mL DMEM替换细胞生长培养基。向每个培养瓶中加入 2 mL 聚乙烯亚胺：DNA 混合物，并将细胞在 CO 2 培养箱（37 °C、5% CO2、95% 湿度）中孵育。
- 5小时后，加入5mL补充有10%FBS和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（0.5g / L）的DMEM。
- 孵育3天后，使用细胞刮刀将细胞从培养瓶中分离。将 293T 细胞从 10 （175 cm2） 细胞培养瓶中收集到 50 mL 锥形管中，并加入高达 30 mL 的 DMEM（参见材料表）。
- 向含有293T细胞的每个50 mL锥形管中加入3 mL氯仿，并使用涡旋混合器高速混合5分钟。通过加入 7.6 mL 的 5 M NaCl 重悬细胞并短暂涡旋。在3，000× g 和4°C下离心5分钟。
- 将水相转移到新的锥形管中，加入 9.4 mL 的 50% （v/v） 聚乙二醇 （PEG） 8000。用涡旋混合器高速混合10秒，然后将样品放在冰上1小时。
- 在4°C下以3，000× g 离心30分钟。除去上清液，让沉淀干燥10分钟。
- 加入 1.4 mL HEPES（50 mM，pH 8），并使用涡旋混合器高速混合 5 分钟。加入 3.5 μL 的 1 M MgCl2、14 μL 的 DNase I（20 单位/μL）和 1.4 μL 的 RNase A（10 μg/μL）。在37°C水浴中孵育20分钟，然后将样品转移到新的1.5 mL管中（每个管中700μL）。
- 向每个 1.5 mL 管中加入 700 μL 氯仿，并使用涡旋混合器高速混合 10 秒。在4°C下以3，000× g 离心5分钟，并将水相转移到新管中。重复此步骤 3 次。
- 在生物安全柜中蒸发氯仿30分钟。然后，将 300 μL 水相转移到 0.5 mL 超速离心管中（参见 材料表）。在25°C下以14，000 ×g 旋转过滤器5分钟。取出流通物并再次旋转过滤器，直到整个体积通过过滤器。
- 通过加入 300 μL Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 清洗过滤器，并通过移液混合溶液。在25°C下以14，000× g 离心过滤器5分钟。 重复此洗涤步骤4x。
- 在25°C下以14，000× g 离心过滤器8分钟。 将过滤器倒置到新管中，并在25°C下以1，000× g 旋转2分钟。
3. 通过 qPCR 滴定 AAV
- 准备AAV滴定的标准曲线，并根据Fripont等人的原始研究确定AAV滴度15。
4. 体内 将AAV注射到腹股沟白色脂肪组织（iWAT）
- 分离手术所需的手术工具和用品，并按照每种特定材料的建议对其进行消毒。
- 通过腹膜内注射用100mg / kg氯胺酮和10mg / kg甲苯噻嗪麻醉小鼠。通过对爪子和尾巴施加剧烈的压力并检查反射来确认麻醉。在小鼠的眼睛上涂抹软膏，以避免在手术过程中眼睛干燥。
- 将麻醉的小鼠置于仰卧位，并用剃须刀在侧面剃除一小块区域，靠近髋关节进行iWAT注射。涂抹脱毛膏5分钟。用水去除残留的乳霜，以免皮肤灼伤。
- 用干净的纱布和70%的酒精在皮肤上交替涂抹三轮消毒液（聚维酮碘）对皮肤进行消毒。每次使用后丢弃纱布。
- 在皮肤上最后一次涂抹防腐溶液。然后，用消毒剪刀在关节的近端区域做一个1-2厘米的切口，并用镊子保持皮肤打开，露出脂肪库。WAT可以附着在两侧的皮肤上，从背部开始向下延伸到睾丸。
注意：在手术或缝合过程中使用窗帘以避免污染。 - 使用镊子，通过切口，轻轻向上拉脂肪库，以确保注射处于正确的位置和深度。
注意：注意不要将组织从其原始位置取出。 - 用 2.5 μL（5.6 ×10 10 病毒基因组 [VG]/μL）的 AAV（包含靶向内源性 Prdm16 基因的 sgRNA）填充微升注射器（规格：33;点样式：4;角度：12;长度：10）（参见材料表）。小心地将针头以 30°-45° 角插入 iWAT。将注射5次重复注射到组织的不同位置，以均匀地感染整个iWAT脂肪垫。建议总体积为 15 μL 以感染 iWAT。
注意：注射器的插入深度取决于脂肪垫沉积物的厚度。使用非接触技术进行注射。 - 使用4/0单丝缝合线关闭剃光的皮肤切口。将鼠标放在加热垫上，直到恢复意识。每10-15分钟监测一次动物，直到它完全恢复。动物恢复意识后，观察运动轮廓，该轮廓应该是线性的，没有痛苦或疼痛的迹象。
- 通过腹膜内给予盐酸曲马多（5mg / kg）3天（2x /天），在手术后48小时内进行术后疼痛控制。
注意：注意痛苦和不适的迹象，并监测水和食物的摄入量。以先发制人的方式给予有效剂量的镇痛药，优选在手术前或手术开始时。 - 在愈合期间将鼠标放在笼子里，可以自由获取食物和水。愈合期后，继续对小鼠实施安乐死。在这项研究中，安乐死是通过过量注射麻醉剂（腹膜内）从诱导剂量（300-360mg / kg盐酸氯胺酮+ 30-40mg / kg盐酸甲苯噻嗪）的3倍进行，然后斩首。
注意：强烈建议将动物饲养在单独的笼子中，直到从麻醉中完全恢复。
5. 基质血管细胞（SVF）体 外 分化为米色脂肪细胞
- 根据Aune等人17，从AdipoSPH小鼠的iWAT中分离和接种初级SVF。将源自AdipoSPH小鼠iWAT的种子SVF放入含有完全培养基（含有3.1g / L葡萄糖，0.5g / L L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，10%FBS和2.5%P / S）的6孔板中1-2小时。
注意：SVF 级分包含不同细胞类型的混合物。在此步骤中，无法定义产生脂肪细胞的种子祖细胞的数量。 - 吸出培养基，使用磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）洗涤孔2次，并用新鲜的完全培养基替换。将细胞在37°C，5%CO2，95%湿度下孵育，直到细胞达到70%-80%汇合。
- 通过用诱导培养基处理细胞来诱导分化（第0天）（表2）。
注意：诱导培养基的药物混合物对于增强米色脂肪细胞分化和表达产热基因程序17是必要的。 - 2天后（第2天），用维持培养基更换诱导培养基（表2）。
- 2天后（第4天），用新鲜的维持培养基（表2）更换维持培养基2至3天。
- 每48小时更换一次维持培养基，直到前脂肪细胞完全分化为脂肪细胞（通常在加入诱导培养基后6天）。可以使用光学显微镜观察成熟的脂肪细胞，因为分化的细胞似乎装有脂滴。
6. SVF的 体外 AAV感染
注意：来自AdipoSPH小鼠iWAT的SVF感染了携带AAV的sgRNA-Prdm16，如Wang等人之前描述的那样18 进行了一些修改。
- 如步骤5.1-5.3中所述，在具有完整培养基的6孔培养板上培养细胞，直到细胞达到70%-80%汇合。
- 将 5.6 ×10 10 VG/μL 携带 AAV 的 sgRNA-Prdm16 与 2 mL 完全培养基和六二甲基溴化物 （8 μg/mL） 混合（参见 材料表）。通过更换完整培养基并加入含有AAV的完整培养基来转导细胞。将转导的细胞在37°C，95%湿度和5%CO 2下孵育12小时。
- 按照步骤5中所述分裂并接种细胞，以细胞增殖并分化为米色脂肪细胞。
注意：对于耗氧测定，在24孔细胞培养板中用诱导培养基每孔接种4.0×104 个细胞（来自步骤6.2）。如步骤5所述执行细胞增殖和分化的后续步骤。当细胞达到80%-100%汇合并完全分化时进行耗氧测定，如先前报道的19。
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Representative Results
AdipoSPH小鼠是通过培育SPH和Adipoq-Cre小鼠品系开发的。两种小鼠品系均处于杂交C57BL6J-DBA / 2J背景中（根据商业供应商;见 材料表）。SPH小鼠谱系最初由Zhou等人描述14。
通过 AdipoSPH介导的Prdm16过表达实现体内米色脂肪细胞发育
为了评估本研究中描述的模型在 体内发育米色脂肪细胞的能力，将携带靶向Prdm16基因的sgRNA的AAV注射到AdipoSPH小鼠的iWAT中。Prdm16是一种成熟的转录因子，可决定米色脂肪细胞的发育和功能20，21。值得一提的是，我们在这里选择了先前测试和验证的针对内源性Prdm16基因14的sgRNA。携带空sgRNA的AAV用作对照。在AAV注射后10天，收获iWAT进行组织学和基因表达分析（图1A）。正如预期的那样，来自AdipoSPH小鼠的iWAT的免疫荧光图像在对照组和Prdm16组中都显示了dCas9的表达（图1B）。此外，mCherry表达证实了对照组和Prdm16组iWAT的AAV感染成功（图1B）。SPH诱导的Prdm16表达明显诱导多房米色脂肪细胞广泛积累到iWAT中（图1B）。此外，定量PCR（qPCR）显示，与对照组相比，Prdm16组和产热基因程序（Ucp1，Cox8b，Ppargc1a和Cidea）的表达增加（图1C）。
通过AdipoSPH介导的Prdm16过表达促进米色脂肪细胞发育和增强体外耗氧量
其次，研究了该模型在 体外 研究米色脂肪细胞生物学的适用性。为此，用携带靶向Prdm16的sgRNA序列的AAV转导来自AdipoSPH小鼠iWAT的前脂肪细胞。在分化后7天，使用米色脂肪细胞分析基因表达和耗氧量（图2A）。使用空的sgRNA作为对照。值得注意的是，CRE重组酶对STOP密码子的去除和SPH机制的活化是在脂联素启动子/增强子的控制下进行的，导致成熟脂肪细胞中内源性Prdm16基因的激活。基因表达分析证实，与对照组相比，Prdm16过表达组中内源性Prdm16基因和产热基因的表达增加（图2B）。为了确认SPH诱导的米色脂肪细胞具有功能性产热性，对原代脂肪细胞进行了高分辨率呼吸测定。如最近描述的22所示进行了呼吸测定数据分析和解释。SPH诱导的Prdm16表达导致的基础和最大耗氧量高于对照细胞（图2C）。重要的是，数据显示，与对照组相比，Prdm16组的无偶联呼吸（寡霉素不敏感）增强（图2C， 表3）。综上所述，这些结果表明，SPH诱导的内源性Prdm16表达概括了褐变表型，并提高了在常规Prdm16 Tg小鼠中观察到的耗氧率。
图 1：通过将靶向内源性 Prdm16 基因的腺相关病毒 （AAV） 注射到 AdipoSPH 小鼠的腹股沟白脂肪组织 （iWAT） 中，形成米色脂肪。 （A） 体内 米色脂肪细胞实验设计的示意图（使用 Biorender.com 创建）。（B）iWAT的组织学（苏木精和伊红[H&E]染色）图像。比例尺= 50μm.（C）Prdm16和产热基因（Ucp1，Cox8b，Ppargc1α和Cidea;n = 3）的定量PCR（qPCR）。数据以平均±SEM表示。 *p < 0.05;**p < Prdm16 与对照组 （CTR） 的 0.01 通过未配对的学生 t 检验。 请点击此处查看此图的大图。
图2：SPH通过Prdm16过表达诱导的米色脂肪细胞分化。 （A） 体外 米色脂肪细胞实验设计的示意图（使用 Biorender.com 创建）。（B）Prdm16和产热基因（Ucp1，Cox8b，Ppargc1α和Cidea;n = 3）的相对基因表达。（C）耗氧率（OCR），n = 6。数据以平均±SEM表示。 *p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.001 对于 Prdm16 与对照 （CTR） 通过 （B） 未配对的学生 t 检验和 （C） 双向重复测量方差分析，然后是 Tukey 检验。 请点击此处查看此图的大图。
补充图1：Prdm16 sgRNA的Sanger测序。 （A）显示单链互补Prdm16寡核苷酸排列的示意图。（B）使用通用引物对Prdm16 sgRNA进行Sanger测序。 请点击此处下载此文件。
| 基因 | 物种 | 向前 | 反向 | |||||
| 基因表达 | Prdm16 | 鼠 | CAGCACGGTGAAGCCATTC | GCGTGCATCCGCTTGTG | ||||
| Ucp1 | 鼠 | TCTCAGCCGGCTTAATGACTG | GGCTTGCATTCTGACCTTCAC | |||||
| 帕格c1a | 鼠 | AGCCGTGACCACTGACAACGAG | GCTGCATGGTTGAGTGCTAAG | |||||
| 考克斯8b | 鼠 | GAACCATGAAGCCAACACACT | GCGAAGTTCACAGTGGTTCC | |||||
| 西迪 | 鼠 | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTGTCCATTTCT | |||||
| 36B4 | 鼠 | TCCAGGCTTTGGGCATCA | CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA | |||||
| 克隆 | sgRNA Prdm16序列 | 鼠 | CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG | CCCCTTTTCAGCGCCGCAGCTCG | ||||
| 通用底漆 | 鼠 | 嘎格格塔特 ATGATTCCTTCATAT |
||||||
表1：研究中使用的引物序列。
| 中等 | 组成 | |||
| 完整培养基 | 杜尔贝克的改良鹰培养基（DMEM）与L-谷氨酰胺 | |||
| 10%的胎牛血清（FBS） | ||||
| 2.5%的青霉素/链霉素 | ||||
| 感应介质 | 完整培养基 | |||
| 吲哚美辛，终浓度125μM（0.125M乙醇储备液）。注意：吲哚美辛必须加热至90°C10秒才能溶解。 | ||||
| 胰岛素，终浓度 20 nM（1 mM 储备液，加入 1 μL HCl 以溶解 （5.73 mg/mL）。将库存储存在-20°C。 | ||||
| 地塞米松，终浓度 2 μg/mL（2 mg/mL 乙醇储备液） | ||||
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 （IBMX），终浓度 500 μM（0.5 M KOH 中的 0.25 M 原液） | ||||
| 3，3'，5-三碘-L-甲状腺原氨酸 （T3），终浓度 1 nM（10 μM 储备液，将 T3 溶解在 1 M HCl 和 EtOH 中 1：4 至库存）。 | ||||
| 罗格列酮，终浓度 1 μg/mL（1 mg/mL 乙醇储备液） | ||||
| 维护介质 | 完整培养基 | |||
| 胰岛素，终浓度20nM（1mM储备）。加入 1 μL HCl 溶解 （5.73 mg/mL）。 | ||||
| 罗格列酮，终浓度 1 μg/mL（1 mg/mL 乙醇储备液） | ||||
表2：研究中使用的培养基组成。
| 参数 | 点击率 | PRDM16 | p 值 | ||
| 无线粒体耗氧量（pMoles/min/μg 蛋白） | 8.19 ± 1.40 | 10.80 ± 1.83 | 0.01 | ||
| 基础呼吸（pmol/分钟/μg蛋白质） | 28.82 ± 5.20 | 52.58 ± 13.73 | 0.001 | ||
| 最大呼吸（pMoles/min/μg蛋白质） | 63.81 ± 9.80 | 122.94 ± 22.31 | < 0.001 | ||
| 备用呼吸能力（pmol/min/μg 蛋白质） | 34.98 ± 11.09 | 70.36 ± 26.06 | 0.006 | ||
| 寡核苷酸不敏感（p摩尔/分钟/微克蛋白） | 8.27 ± 2.29 | 15.85 ± 5.48 | 0.005 | ||
| 寡核苷酸敏感（p摩尔/分钟/微克蛋白） | 20.54 ± 5.68 | 36.72 ± 14.79 | 0.016 | ||
| 耦合效率 | 71.28 ± 1.51 | 69.84 ± 3.05 | 0.163 | ||
| 细胞遥控反应 | 7.70 ± 1.46 | 7.75 ± 2.43 | 0.485 | ||
表3：SPH诱导的米色脂肪细胞的呼吸参数。
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Discussion
CRISPR技术最有用的非编辑应用之一是通过使用CRISPRa系统激活内源性基因来询问基因功能6。SPH是一种强大的CRISPRa，最初被描述为通过靶向几个神经源性基因来诱导星形胶质细胞转化为活跃的神经元14。在这项研究中，AdipoSPH被证明是通过激活脂肪细胞中内源性Prdm16的表达来研究米色脂肪生物学的合适工具。SPH诱导的Prdm16在脂肪细胞中的过表达导致产热基因程序的激活并诱导褐变表型，表型复制先前的转基因（Tg）Prdm16小鼠模型23。本研究选择Prdm16作为诱导米色脂肪细胞的靶标，基于该转录因子在调节棕色和米色脂肪分化以及分化脂肪细胞中产热基因程序（例如，增强Ucp1表达）的核心作用。然而，目前的模型允许任何内源性基因的过表达由研究人员自行决定和研究的目的。
研究脂肪组织生物学的传统转基因模型依赖于在仅限于脂肪细胞的启动子/增强子（例如，Fabp4或脂联素）的控制下过度表达转基因的转基因啮齿动物的发展24。尽管目前的技术加快了这些模型的开发步伐，但开发它们的成本和时间仍然是科学界共同遇到的问题。相比之下，与传统的Tg小鼠相比，AdipoSPH是一种更便宜，更通用的功能获得方法模型。此外，AdipoSPH非常适合研究长非编码RNA和转录本亚型，这些亚型不是特别适合Tg小鼠模型。
与简单施用AAV相比，AdipoSPH在研究脂肪组织生物学方面也具有几个优势，AAV是目前功能获得实验的替代方法25。首先，递送到脂肪组织的AAV通过引入转基因的几个拷贝来促进过表达。相比之下，内源性基因的SPH激活代表了一种更自然的作用机制。其次，AAV递送的转基因（使用组成型启动子）通常会导致它们在脂肪组织微环境中的“任何细胞类型”中过表达。相比之下，AdipoSPH诱导的内源性基因表达仅限于脂肪细胞。第三，包装尺寸（~4.5kb）是某些转基因AAV的典型限制26。然而，携带AAV的sgRNA需要一种简单易行的克隆策略来定制20个核苷酸。最后，AAV给药通常达到体循环并感染其他组织和器官。尽管一些AAV含有microRNA以减轻特定组织（例如肝脏和心脏）中转基因的表达25，但这种策略不能预防其他组织和器官中的AAV感染。相比之下，AdipoSPH诱导的内源性基因表达仅限于脂肪细胞，即使考虑到AAV泄漏到体循环中。因此，AdipoSPH也是携带AAV的sgRNA的全身给药和全身能量稳态脂肪组织调控研究的合适模型。
尽管AdipoSPH模型具有一些优点，但它具有需要考虑的局限性。AAV是目前最常见的体内递送sgRNA平台。然而，AAV制造和免疫学问题中的一些挑战仍未解决26，27。此外，注射AAV在整个脂肪组织中的不同数量和分布导致基因表达的组织内和组织间变异性。我们认为sgRNA载体克隆，AAV生产以及AAV均匀施用到iWAT中是该协议成功的关键步骤。最后，不同的sgRNA显著激活SPH系统中内源性基因的表达14。主要建议是在目的基因的转录起始位点（TSS）上游200 bp内设计和测试三到五个sgRNA序列。因此，为靶基因确定最佳sgRNA序列通常需要在体内实验之前进行费力的体外测定。
AdipoSPH也是研究脂肪组织生物学其他方面的有吸引力的模型。例如，脂肪细胞促进多种脂肪因子的分泌28，29;然而，大多数这些分子的全身效应仍然知之甚少。AdipoSPH是通过在成熟脂肪细胞中过表达单个或多个内源性基因并研究其局部或全身效应来解决此问题的合适模型。因此，AdipoSPH是研究脂肪组织生物学和生理学的独特工具。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢Unicamp的Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Animais de Laboratório（Cemib）对AdipoSPH小鼠的产生，免疫代谢和细胞信号实验室以及国家应用于细胞生物学的光子学科学技术研究所（INFABIC）的所有实验支持。我们感谢圣保罗研究基金会（FAPESP）的财政支持：2019/15025-5;2020/09308-1;2020/14725-0;2021/11841-2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
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