CRISPR SunTag-p65-HSF1 활성화 시스템을 이용한 베이지색 지방 생물학 및 대사 조사
Summary
이 프로토콜은 베이지색 지방 생물학을 조사하기 위한 아데노 관련 바이러스(AAV)에 대한 대체 전략으로 지방 세포(AdipoSPH)에서 CRISPR SunTag-p65-HSF1(SPH)의 사용을 제시합니다. 내인성 Prdm16 유전자를 표적으로 하는 AAV 운반 sgRNA의 생체 내 주입은 베이지색 지방 발달을 유도하고 열 발생 유전자 프로그램을 향상시키기에 충분합니다.
Abstract
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기술은 생물학에 혁명을 일으켰으며, 최근의 도구는 원래 기술된 유전자 편집을 훨씬 뛰어넘어 적용되었습니다. CRISPR 활성화(CRISPRa) 시스템은 촉매 비활성 Cas9(dCas9) 단백질과 별개의 전사 모듈을 결합하여 내인성 유전자 발현을 유도합니다. SunTag-p65-HSF1(SPH)은 최근에 개발된 CRISPRa 기술로, 시너지 활성화 매개체(SAM)의 구성 요소와 SunTag 활성제를 결합합니다. 이 시스템은 맞춤형 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 설계하여 단일 또는 다중 유전자의 과발현을 허용합니다. 본 연구에서는 이전에 개발된 SPH 마우스를 사용하여 AdipoSPH라는 이름의 지방세포(adiponectin Cre lineage)에서 SPH를 발현하는 조건부 마우스를 생성하였다. 흰색에서 베이지색의 지방(갈변) 표현형을 유도하기 위해 내인성 Prdm16 유전자(갈색 및 베이지색 지방 발달과 관련된 잘 확립된 전사 인자)를 표적으로 하는 sgRNA를 운반하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 사타구니 백색 지방 조직(iWAT)에 주입했습니다. 이 마우스 모델은 내인성 Prdm16의 발현을 유도하고 열 발생 유전자 프로그램을 활성화시켰다. 또한, 시험관 내 SPH 유도 Prdm16 과발현은 베이지색 지방세포의 산소 소비를 향상시켜 이전 Prdm16 형질전환 마우스 모델의 결과를 표현화했습니다. 따라서 이 프로토콜은 지방 조직 생물학을 조사하기 위한 다재다능하고 비용 효율적이며 시간 효율적인 마우스 모델을 설명합니다.
Introduction
베이지색(또는 브라이트) 지방세포는 백색 지방 조직(WAT) 저장소 내에 존재하는 단백질 1(UCP1) 발현 및 미토콘드리아가 풍부한 지방세포의 결합을 해제합니다. 베이지색 지방은 저온 노출 및 기타 자극에 대한 반응으로 지방 세포 전구체 또는 성숙한 백색 지방 세포의 하위 집합에서 나옵니다 1,2. 베이지색 지방세포는 UCP1 의존적 또는 독립적인 방식으로 에너지를 열로 변환할 수 있다3. 열 발생 기능에 관계없이 베이지색 지방은 아디포카인 분비, 항염증 및 항섬유화 활동과 같은 다른 수단을 통해 대사 건강을 개선할 수도 있습니다. 생쥐와 인간을 대상으로 한 연구에 따르면 베이지색 지방을 유도하면 전신 포도당과 지질 항상성이 향상되는 것으로 나타났다3. 그러나 베이지색 지방 생물학에 대한 우리의 지식은 최근 몇 년 동안 빠르게 발전했지만 대부분의 대사 이점과 관련 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았습니다.
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic repeats(CRISPR)는 Cas9 단백질 4,5의 뉴클레아제 활성을 통해 게놈의 특정 부위에서 이중 가닥 절단(DSB)을 생성할 수 있는 도구로서 진핵 세포에서 처음 설명되었습니다. Cas9은 합성 단일 가이드 RNA(sgRNA)에 의해 유도되어 특정 게놈 영역을 표적으로 하여 DNA DSB를 유도합니다. CRISPR-Cas9 기술은 편집 목적으로 뉴클레아제 Cas9을 사용하는 것 외에도 서열 특이적 유전자 조절 도구로 사용되도록 발전했습니다6. 촉매 비활성 Cas9 단백질(dCas9)의 개발과 유전자 발현을 향상시킬 수 있는 전사 모듈의 결합으로 인해 CRISPR 활성화(CRISPRa) 도구가 탄생했습니다. SAM과 SunTag 활성제의 구성 요소를 결합한 VP647,8, 시너지 활성화 매개체(SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 및 SunTag-p65-HSF1(SPH)14와 같은 여러 CRISPRa 시스템이 등장했습니다. 최근 N2a 신경아세포와 일차 성상교세포에서 신경성 유전자의 유도 발현이 다른 CRISPRa 시스템에 비해 SPH를 사용하는 것이 더 높다는 것이 입증되었으며14, 이는 SPH가 유망한 CRISPRa 도구임을 입증한다.
여기서, 우리는 이전에 개발된 SPH 마우스(14 )를 활용하여 아디포넥틴 Cre 계통(AdipoSPH)을 사용하여 지방세포에서 SPH를 특이적으로 발현하는 조건부 마우스 모델을 생성하였다. 내인성 Prdm16 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 운반하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 사용하여 사타구니 WATT(iWAT)의 갈변(흰색에서 베이지색으로의 전환)을 유도하여 열 발생 유전자 프로그램의 발현을 증가시켰습니다. 또한, 시험관내 Prdm16 과발현은 산소 소비를 향상시켰다. 따라서 이 프로토콜은 지방 조직 내에서 베이지색 지방 발달 메커니즘을 탐색하기 위한 다목적 SPH 마우스 모델을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR 기술의 가장 유용한 비편집 응용 분야 중 하나는 CRISPRa 시스템을 사용하여 내인성 유전자의 활성화를 통한 유전자 기능의 조사입니다6. SPH는 강력한 CRISPRa로, 원래 여러 신경성 유전자를 표적으로 삼아 성상교세포를 활성 뉴런으로 전환시키는 것으로 기술되었다14. 이 연구에서 AdipoSPH는 지방 세포에서 내인성 Prdm16의 발현을 활성화하여 베이지색 지방 생물…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, AdipoSPH 마우스 생성, Inmmunometabolism and Cell Signaling Laboratory, INFABIC(National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology)의 모든 실험 지원에 감사드립니다. 상파울루 연구 재단 (FAPESP)의 재정 지원에 감사드립니다 : 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
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