Summary
Dieses Protokoll stellt die Verwendung von CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) in Adipozyten (AdipoSPH) als alternative Strategie zum Adeno-assoziierten Virus (AAV) zur Untersuchung der Biologie von beigem Fett dar. Die In-vivo-Injektion von AAV-tragender sgRNA, die auf das endogene Prdm16-Gen abzielt, reicht aus, um die Entwicklung von beigem Fett zu induzieren und das thermogene Genprogramm zu verbessern.
Abstract
Die CRISPR-Technologie (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) hat eine Revolution in der Biologie ausgelöst, und neuere Werkzeuge wurden weit über die ursprünglich beschriebene Genom-Editierung hinaus eingesetzt. Das CRISPR-Aktivierungssystem (CRISPRa) kombiniert das katalytisch inaktive Cas9 (dCas9)-Protein mit verschiedenen Transkriptionsmodulen, um eine endogene Genexpression zu induzieren. SunTag-p65-HSF1 (SPH) ist eine neu entwickelte CRISPRa-Technologie, die Komponenten von synergistischen Aktivierungsmediatoren (SAMs) mit den SunTag-Aktivatoren kombiniert. Dieses System ermöglicht die Überexpression einzelner oder mehrerer Gene durch das Design einer maßgeschneiderten Single-Guide-RNA (sgRNA). In dieser Studie wurde eine zuvor entwickelte SPH-Maus verwendet, um eine bedingte Maus zu erzeugen, die SPH in Adipozyten exprimiert (Adiponektin-Cre-Linie), genannt AdipoSPH. Um einen Phänotyp von weißem bis beigem Fett (Bräunung) zu induzieren, wurde ein Adeno-assoziiertes Virus (AAV), das sgRNA trägt, das auf das endogene Prdm16-Gen (ein gut etablierter Transkriptionsfaktor, der mit der Entwicklung von braunem und beigem Fett in Verbindung steht) abzielt, in das weiße Leistenfettgewebe (iWAT) injiziert. Dieses Mausmodell induzierte die Expression von endogenem Prdm16 und aktivierte das thermogene Genprogramm. Darüber hinaus erhöhte die in vitro SPH-induzierte Prdm16-Überexpression den Sauerstoffverbrauch von beigen Adipozyten und phänokopierte damit die Ergebnisse eines früheren transgenen Prdm16-Mausmodells. Somit beschreibt dieses Protokoll ein vielseitiges, kostengünstiges und zeiteffektives Mausmodell zur Untersuchung der Fettgewebebiologie.
Introduction
Beige (oder Brite) Adipozyten sind entkoppelnde Protein 1 (UCP1)-exprimierende und mitochondriale Adipozyten, die sich in Depots für weißes Fettgewebe (WAT) befinden. Beigefett entsteht aus einer Untergruppe von Adipozyten-Vorläuferzellen oder reifen weißen Adipozyten als Reaktion auf Kälteeinwirkung und andere Reize 1,2. Beige Adipozyten können UCP1-abhängig oder unabhängig Energie in Wärme umwandeln3. Unabhängig von seiner thermogenen Funktion kann beigefarbenes Fett auch auf andere Weise die Stoffwechselgesundheit verbessern, z. B. durch die Sekretion von Adipokinen und entzündungshemmende und antifibrotische Aktivitäten. Studien an Mäusen und Menschen haben gezeigt, dass die Induktion von beigem Fett die Glukose- und Lipidhomöostase des ganzen Körpers verbessert3. Obwohl sich unser Wissen über die Biologie von beigem Fett in den letzten Jahren rasant weiterentwickelt hat, sind die meisten seiner metabolischen Vorteile und die damit verbundenen Mechanismen immer noch nicht vollständig verstanden.
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) wurden erstmals in eukaryotischen Zellen als ein Werkzeug beschrieben, das in der Lage ist, durch die Nukleaseaktivität des Cas9-Proteins einen Doppelstrangbruch (DSB) an einer bestimmten Stelle im Genom zu erzeugen 4,5. Cas9 wird von einer synthetischen Single-Guide-RNA (sgRNA) gesteuert, um auf eine bestimmte genomische Region abzuzielen, was zu einem DNA-DSB führt. Neben der Verwendung der Nuklease Cas9 für die Editierung hat sich die CRISPR-Cas9-Technologie weiterentwickelt, um als sequenzspezifisches Genregulationswerkzeug eingesetzt zu werden6. Die Entwicklung eines katalytisch inaktiven Cas9-Proteins (dCas9) und die Assoziation von Transkriptionsmodulen, die in der Lage sind, die Genexpression zu verbessern, haben zu CRISPR-Aktivierungswerkzeugen (CRISPRa) geführt. Es sind mehrere CRISPRa-Systeme entstanden, wie z. B. VP647,8, synergistischer Aktivierungsmediator (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 und SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, das die Komponenten von SAM- und SunTag-Aktivatoren kombiniert. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass die induzierte Expression neurogener Gene in N2a-Neuroblasten und primären Astrozyten mit SPH im Vergleich zu anderen CRISPRa-Systemen höher ist14, was SPH als vielversprechendes CRISPRa-Werkzeug demonstriert.
In dieser Arbeit nutzten wir eine zuvor entwickelte SPH-Maus14 , um ein bedingtes Mausmodell zu generieren, das SPH spezifisch in Adipozyten exprimiert, indem wir die Adiponektin-Cre-Linie (AdipoSPH) verwenden. Mit Hilfe eines Adeno-assoziierten Virus (AAV), das die gRNA trägt, die auf das endogene Prdm16-Gen abzielt, wurde die Bräunung (Umwandlung von weiß in beige) von inguinalem WAT (iWAT) induziert, um die Expression des thermogenen Genprogramms zu erhöhen. Darüber hinaus erhöhte die in vitro Überexpression von Prdm16 den Sauerstoffverbrauch. Daher stellt dieses Protokoll ein vielseitiges SPH-Mausmodell zur Verfügung, um die Mechanismen der beigen Fettentwicklung im Fettgewebe zu erforschen.
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Protocol
Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden der Universität Campinas für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (Protokoll CEUA #5810-1/2021) durchgeführt.
1. Molekulare Klonierung
- Design von Single-Guide-RNAs (sgRNAs)
- Entwerfen Sie sgRNAs für die CRISPR-Aktivierung mit CHOPCHOP, das bei https://chopchop.cbu.uib.no/ erhältlich ist, oder einem anderen geeigneten Werkzeug. Verwenden Sie die folgenden Parameter, um sgRNA zu entwerfen, die auf das Prdm16-Gen abzielt: Ziel: Prdm16; In: Mus musculus; Verwendung: Crispr/Cas9; Für: Aktivierung.
HINWEIS: Entwerfen Sie sgRNAs für jede Region von Interesse, die über eine 200 bp stromaufwärts gelegene TSS-Region (Transcription Start Site) verteilt ist. Zum Beispiel bindet die in dieser Studie verwendete sgRNA, die auf Prdm16 abzielt, 154 bp stromaufwärts von TSS. - Fügen Sie der sgRNA Überhänge hinzu, die mit der SacI-Restriktionsstelle im Vektor-Rückgrat pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry übereinstimmen (siehe Materialtabelle). Dazu gehören: 5'- (N20)AGCT-3' (N = Nukleotide). Zum Beispiel ist die Sequenz, die auf das Prdm16-Gen abzielt, 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3', und mit Überhängen ist 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.
- Erhalten Sie die 3'-sgRNA-Reverse-Komplement-Sequenz mit dem unter https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html verfügbaren Werkzeug. Zum Beispiel ist die 3'-sgRNA-Sequenz, die auf das Prdm16-Gen abzielt, 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'.
- Entwerfen Sie sgRNAs für die CRISPR-Aktivierung mit CHOPCHOP, das bei https://chopchop.cbu.uib.no/ erhältlich ist, oder einem anderen geeigneten Werkzeug. Verwenden Sie die folgenden Parameter, um sgRNA zu entwerfen, die auf das Prdm16-Gen abzielt: Ziel: Prdm16; In: Mus musculus; Verwendung: Crispr/Cas9; Für: Aktivierung.
- Annealing von einzelsträngigen komplementären Oligonukleotiden
- Fügen Sie je 1 μl 5' und 3' einzelsträngiges Oligonukleotid (Stammkonzentration: 100 μM), 1 μl T4-Ligasepuffer, 0,5 μl T4-Polynukleotidkinase (PNK) (1 × 104 Einheiten/ml) und 6,5 μlH2Ozu einem endgültigen Reaktionsvolumen von 10 μl hinzu. Die komplementären einzelsträngigen Oligonukleotide werden unter folgenden Bedingungen mit einem Thermocycler geglüht: 37 °C für 30 min und 95 °C für 5 min, gefolgt von einer Ramp-Down-Rate von 5 °C/min.
HINWEIS: Das PNK-Enzym wird mit PNK-Puffer versorgt und enthält nicht genügend ATP, das für die Phosphorylierungsreaktion benötigt wird (siehe Materialtabelle). Um die Reaktion zu vereinfachen, verwenden Sie den T4-Ligase-Puffer (anstelle des PNK-Puffers). T4-Ligasepuffer liefert die geeignete Menge (1 mM ATP) Phosphat für die Phosphorylierungsreaktion. Das PNK-Enzym sorgt für die 5'-Endphosphorylierung von Oligonukleotiden für die nachfolgende Ligationsreaktion.
- Fügen Sie je 1 μl 5' und 3' einzelsträngiges Oligonukleotid (Stammkonzentration: 100 μM), 1 μl T4-Ligasepuffer, 0,5 μl T4-Polynukleotidkinase (PNK) (1 × 104 Einheiten/ml) und 6,5 μlH2Ozu einem endgültigen Reaktionsvolumen von 10 μl hinzu. Die komplementären einzelsträngigen Oligonukleotide werden unter folgenden Bedingungen mit einem Thermocycler geglüht: 37 °C für 30 min und 95 °C für 5 min, gefolgt von einer Ramp-Down-Rate von 5 °C/min.
- Ligation von getemperten sgRNA-Oligonukleotiden
- Fügen Sie 25 ng Plasmid pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry zu 2 μl getemperten sgRNA-Oligonukleotiden, 1 μl SacI-Enzym, 2 μl 10x T4-DNA-Ligasepuffer, 1 μl T4-DNA-Ligase (1-3 u/μl) (siehe Materialtabelle) undH2Ohinzu, um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 10 μl zu erhalten.
- Führen Sie die Ligation durch, indem Sie das Reaktionsgemisch mit einem Thermocycler unter den folgenden Bedingungen inkubieren: 15 Zyklen bei 37 °C für 5 min und 25 °C für 5 min, gefolgt von Warmhalten bei 4 °C.
- Transformation mit anschließender Koloniepolymerase-Kettenreaktion (PCR)
- Die kompetenten E. coli DH10B-Zellen (siehe Materialtabelle) werden mittels Hitzeschock (42 °C für 45 s) mit 4 μL des Ligationsprodukts transformiert und auf einer Agarplatte mit 100 μg/ml Ampicillin verteilt.
- Bestätigen Sie transformierte Kolonien durch Kolonie-PCR unter Verwendung des PCR-Mastermixes (siehe Materialtabelle). Wählen Sie die Kolonie und mischen Sie sie mit 5 μl Mastermix, 0,1 μl Universalprimer (Stammkonzentration: 100 μM), 0,1 μl sgRNA-Reverse-Primer (Stammkonzentration: 100 μM) (Tabelle 1) und 5 μlH2O. Führen Sie die PCR mit einem Thermocycler unter folgenden Bedingungen durch: anfängliche Denaturierung (94 °C für 2 min), gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung (94 °C für 20 s), des Glühens (60 °C für 30 s), des Ausdehnens (72 °C für 30 s) und eines abschließenden Dehnungsschritts (72 °C für 5 min). Lösen Sie die DNA mit Agarose (1,5%) Gelelektrophorese in 0,5x TAE-Puffer bei 90 V für 30 min.
HINWEIS: Positive Klone ergeben eine Bandbreite von ~280 bp. - Reichen Sie positive Proben für die Sanger-Sequenzierung mit dem Universalprimer ein (Tabelle 1, Supplemental File 1).
- Plasmid-Aufreinigung
- Reinigen Sie das Plasmid von einem positiven Klon mit einem Plasmid-Aufreinigungskit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Anmerkungen: Reinigen Sie das Plasmid mit Anionenaustauscherharz oder einem anderen Kit, das für die Verwendung in der Zelltransfektion geeignet ist. - Inkubieren Sie den positiven Klon (12 h bei 37 °C mit Schütteln bei 200 U/min) unter Verwendung eines standardmäßigen bakteriellen Nährmediums, das 100 μg/ml Ampicillin enthält.
- Zentrifugieren Sie die Bakterienzellen bei 6.000 × g für 10 min bei 4 °C. Befolgen Sie die nächsten Schritte gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Reinigen Sie das Plasmid von einem positiven Klon mit einem Plasmid-Aufreinigungskit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. AAV-Verpackungen
HINWEIS: Die AAV-Verpackung wurde gemäß früheren Veröffentlichungen15,16 mit geringfügigen Änderungen durchgeführt.
- Platte 293T-Zellen (siehe Materialtabelle) in einem 175-cm-2-Kolben (Aussaat 5 ×10 6 Zellen pro Kolben) unter Verwendung von 25 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S). Inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit, bis die Zellen eine Konfluenz von 50 % bis 70 % erreichen.
- Mischen Sie 14 μl Polyethylenimin (1 μg/μl) mit 1 ml 150 mM NaCl. Mischen Sie die drei für die AAV-Produktion erforderlichen Plasmide in einem molaren Verhältnis von 1:1:1 (d. h. 17,7 μg pAdDeltaF6, 7,9 μg AAV2/8 (siehe Materialtabelle) und 5,9 μg klonierte sgRNA aus Schritt 1 in 1 ml 150 mM NaCl. Das Polyethylenimin:NaCl-Gemisch tröpfchenweise in das Röhrchen mit der DNA (Plasmidgemisch) überführen und 20 min bei 25 °C inkubieren.
HINWEIS: pAdDeltaF6 ist ein Helferplasmid und pKapsid pAAV2/8 ist ein Verpackungsplasmid, das Replikations- (Rep) und Kapsidgene (cap) exprimiert. Beide Plasmide sind notwendig, um AAV zu produzieren. - Vor der Transfektion wird das Zellwachstumsmedium durch 18 ml DMEM ersetzt, das 1 % FBS und L-Alanyl-L-Glutamin (0,5 g/l) enthält. Geben Sie 2 ml des Polyethylenimin:DNA-Gemisches in jeden Kulturkolben und inkubieren Sie die Zellen in einem CO 2 -Inkubator (37 °C, 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit).
- Nach 5 h 5 ml DMEM mit 10 % FBS und L-Alanyl-L-Glutamin (0,5 g/l) hinzufügen.
- Nach 3 Tagen Inkubation lösen Sie die Zellen mit einem Zellschaber aus dem Kulturkolben. Sammeln Sie die 293T-Zellen aus 10 (175 cm2) Zellkulturflaschen in konische 50-ml-Röhrchen und fügen Sie DMEM (siehe Materialtabelle) bis zu 30 ml hinzu.
- Geben Sie 3 ml Chloroform in jedes konische 50-ml-Röhrchen, das die 293T-Zellen enthält, und mischen Sie es 5 Minuten lang mit einem Wirbelmischer bei hoher Geschwindigkeit. Resuspendieren Sie die Zellen durch Zugabe von 7,6 mL 5 M NaCl und wirbeln Sie kurz vortex. Bei 3.000 × g und 4 °C für 5 min zentrifugieren.
- Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues konisches Röhrchen und fügen Sie 9,4 ml 50% (v/v) Polyethylenglykol (PEG) 8000 hinzu. Mischen Sie mit einem Vortex-Mischer bei hoher Geschwindigkeit für 10 s und legen Sie die Proben für 1 h auf Eis.
- 30 min bei 3.000 × g bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie das Pellet 10 Minuten trocknen.
- Fügen Sie 1,4 ml HEPES (50 mM, pH 8) hinzu und mischen Sie 5 Minuten lang mit einem Wirbelmischer bei hoher Geschwindigkeit. Fügen Sie 3,5 μl 1 M MgCl2, 14 μl DNase I (20 Einheiten/μl) und 1,4 μl RNase A (10 μg/μl) hinzu. Inkubieren Sie 20 Minuten lang in einem 37 °C warmen Wasserbad und übertragen Sie die Proben dann in neue 1,5-ml-Röhrchen (700 μl in jedem Röhrchen).
- 700 μl Chloroform in jedes 1,5-ml-Röhrchen geben und mit einem Wirbelmischer bei hoher Geschwindigkeit 10 s lang mischen. Bei 3.000 × g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren und die wässrige Phase in ein neues Röhrchen überführen. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
- Verdampfen Sie das Chloroform für 30 Minuten in einer Biosicherheitswerkbank. Anschließend werden 300 μl der wässrigen Phase in ein 0,5-ml-Ultrazentrifugationsröhrchen überführt (siehe Materialtabelle). Drehen Sie den Filter bei 14.000 × g bei 25 °C für 5 min. Entfernen Sie den Durchfluss und drehen Sie den Filter erneut, bis das gesamte Volumen durch den Filter geflossen ist.
- Waschen Sie den Filter, indem Sie 300 μl der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco hinzufügen, und mischen Sie die Lösungen durch Pipettieren. Zentrifugieren Sie den Filter 5 min lang bei 14.000 × g bei 25 °C. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 4x.
- Zentrifugieren Sie den Filter 8 min lang bei 14.000 × g bei 25 °C. Setzen Sie den Filter verkehrt herum in ein neues Röhrchen ein und schleudern Sie ihn 2 Minuten lang bei 1.000 × g bei 25 °C.
3. Titration der AAV mittels qPCR
- Bereiten Sie eine Standardkurve für die AAV-Titration vor und bestimmen Sie den AAV-Titer gemäß der Originalstudie von Fripont et al.15.
4. In-vivo-Injektion von AAV in das inguinale weiße Fettgewebe (iWAT)
- Trennen Sie die chirurgischen Instrumente und Verbrauchsmaterialien, die für die Operation benötigt werden, und sterilisieren Sie sie wie für jedes spezifische Material empfohlen.
- Betäubung der Maus mit 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin durch intraperitoneale Injektion. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie kräftigen Druck auf Pfote und Schwanz ausüben und auf einen Reflex achten. Tragen Sie Salbe auf die Augen der Maus auf, um Augentrockenheit während der Operation zu vermeiden.
- Legen Sie die anästhesierte Maus in Rückenlage und rasieren Sie einen kleinen Bereich an den Flanken, proximal zu den Hüftgelenken für iWAT-Injektionen, mit einem Rasierer. Enthaarungscreme 5 Minuten lang auftragen. Entfernen Sie die restliche Creme mit Wasser, um Hautverbrennungen zu vermeiden.
- Desinfizieren Sie die Haut, indem Sie dreimal abwechselnd eine antiseptische Lösung (Povidon-Jod) mit einer sauberen Gaze und 70% Alkohol auf die Haut auftragen. Entsorgen Sie die Gaze nach jedem Gebrauch.
- Tragen Sie zum Schluss eine antiseptische Lösung auf die Haut auf. Machen Sie dann mit einer sterilisierten Schere einen 1-2 cm großen Schnitt im proximalen Bereich der Gelenke und halten Sie die Haut mit einer Pinzette offen, um das Fettdepot freizulegen. Das WAT ist beidseitig an der Haut befestigt und erstreckt sich von Anfang an über den Rücken bis hinunter zum Hoden.
Anmerkungen: Verwenden Sie Abdeckungen, um eine Kontamination während der Operation oder des Nahtverfahrens zu vermeiden. - Ziehen Sie das Fettdepot mit einer Pinzette sanft durch den Schnitt nach oben, um sicherzustellen, dass sich die Injektion an der richtigen Stelle und in der richtigen Tiefe befindet.
Anmerkungen: Achten Sie darauf, das Gewebe nicht von seiner ursprünglichen Position zu entfernen. - Füllen Sie die Mikroliterspritze (Stärke: 33; Spitzenform: 4; Winkel: 12; Länge: 10) (siehe Materialtabelle) mit 2,5 μL (5,6 × 1010 virale Genome [VG]/μl) des AAV (mit der sgRNA, die auf das endogene Prdm16-Gen abzielt). Führen Sie die Nadel vorsichtig in einem Winkel von 30°-45° in den iWAT ein. Wiederholen Sie die Injektion 5x an verschiedenen Stellen des Gewebes, um das gesamte iWAT-Fettpolster homogen zu infizieren. Für die Infektion des iWAT wird ein Gesamtvolumen von 15 μL empfohlen.
Anmerkungen: Die Einführtiefe der Spritze hängt von der Dicke des Fettpolsters ab. Verwenden Sie die berührungslose Technik, um die Injektion zu ziehen. - Verschließen Sie den rasierten Hautschnitt mit 4/0-Monofilament-Nähten. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, bis das Bewusstsein wiedererlangt ist. Überwachen Sie das Tier alle 10-15 Minuten, bis es sich vollständig erholt hat. Nachdem das Tier das Bewusstsein wiedererlangt hat, beobachten Sie das Bewegungsprofil, das linear sein sollte und keine Anzeichen von Stress oder Schmerzen aufweisen sollte.
- Führen Sie innerhalb von 48 Stunden nach der Operation eine postoperative Schmerzkontrolle durch, indem Sie Tramadolhydrochlorid (5 mg/kg) intraperitoneal über 3 Tage (2x/Tag) verabreichen.
Anmerkungen: Achten Sie auf Anzeichen von Stress und Unwohlsein und überwachen Sie die Wasser- und Nahrungsaufnahme. Verabreichen Sie präventiv eine wirksame Dosis des Analgetikums, vorzugsweise vor oder zu Beginn der Operation. - Halten Sie die Maus während der Heilungsphase in einem Käfig mit freiem Zugang zu Futter und Wasser. Fahren Sie nach der Heilungsphase mit der Euthanasie der Maus fort. In dieser Studie wurde die Euthanasie durch eine Überdosis injizierbarer Anästhetika (intraperitoneal) ab dem 3-fachen der induzierenden Dosis (300-360 mg/kg Ketaminhydrochlorid + 30-40 mg/kg Xylazinhydrochlorid) mit anschließender Enthauptung durchgeführt.
HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, die Tiere in Einzelkäfigen zu halten, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt haben.
5. In-vitro-Differenzierung von stromalen Gefäßzellen (SVFs) in beige Adipozyten
- Isolierung und Plattierung von primären SVFs aus dem iWAT von AdipoSPH-Mäusen gemäß Aune et al.17. Samen-SVFs von AdipoSPH-Mäusen iWAT in eine 6-Well-Platte mit komplettem Medium (DMEM mit 3,1 g/L Glukose, 0,5 g/L L-Alanyl-L-Glutamin, 10% FBS und 2,5% P/S) für 1-2 h.
HINWEIS: Die SVF-Fraktion enthält eine Mischung aus verschiedenen Zelltypen. In diesem Schritt ist es nicht möglich, die Anzahl der ausgesäten Vorläuferzellen zu definieren, aus denen Adipozyten entstehen. - Saugen Sie das Medium ab, waschen Sie die Vertiefung 2x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) und ersetzen Sie es durch frisches komplettes Medium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO2, 95 % Feuchtigkeit, bis die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen.
- Induzieren Sie die Differenzierung (Tag 0), indem Sie die Zellen mit dem Induktionsmedium behandeln (Tabelle 2).
ANMERKUNG: Der Wirkstoffcocktail des Induktionsmediums ist notwendig, um die Differenzierung der beigen Adipozyten zu verbessern und um das thermogene Genprogramm17 zu exprimieren. - Ersetzen Sie nach 2 Tagen (Tag 2) das Induktionsmedium durch das Wartungsmedium (Tabelle 2).
- Ersetzen Sie nach 2 Tagen (Tag 4) das Pflegemedium für 2 bis 3 Tage durch frisches Pflegemedium (Tabelle 2).
- Wechseln Sie das Erhaltungsmedium alle 48 h, bis die Präadipozyten vollständig in Adipozyten differenziert sind (typischerweise 6 Tage nach Zugabe von Induktionsmedium). Reife Adipozyten können lichtmikroskopisch beobachtet werden, da die differenzierten Zellen mit Lipidtröpfchen beladen zu sein scheinen.
6. In-vitro-AAV-Infektion von SVFs
HINWEIS: SVFs, die von AdipoSPH-Mäusen iWAT stammten, wurden mit AAV-tragender sgRNA-Prdm16 infiziert, wie bereits von Wang et al.18 beschrieben, mit einigen Modifikationen.
- Züchten Sie die Zellen auf einer 6-Well-Kulturplatte mit komplettem Medium, bis die Zellen eine Konfluenz von 70%-80% erreichen, wie zuvor in den Schritten 5.1-5.3 beschrieben.
- Mischen Sie 5,6 × 1010 VG/μl AAV-tragende sgRNA-Prdm16 mit 2 ml Komplettmedium und Hexadimethrinbromid (8 μg/ml) (siehe Materialtabelle). Transduzieren Sie die Zellen, indem Sie das komplette Medium ersetzen und das komplette Medium hinzufügen, das AAV enthält. Inkubieren Sie die transduzierten Zellen 12 h lang bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.
- Teilen und säen Sie die Zellen wie in Schritt 5 beschrieben für die Zellproliferation und -differenzierung in beige Adipozyten.
HINWEIS: Für den Sauerstoffverbrauchs-Assay werden 4,0 × 104 Zellen (aus Schritt 6.2) pro Well mit Induktionsmedium in einer 24-Well-Zellkulturplatte gesät. Die nachfolgenden Schritte der Zellproliferation und -differenzierung werden wie in Schritt 5 beschrieben durchgeführt. Der Sauerstoffverbrauchstest wird durchgeführt, wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 100 % erreichen und vollständig differenziert sind, wie bereits berichtet19.
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Representative Results
AdipoSPH-Mäuse wurden durch die Züchtung von SPH- und Adipoq-Cre-Mausstämmen entwickelt. Beide Mausstämme befanden sich in einem hybriden C57BL6J-DBA/2J-Hintergrund (nach Angaben des kommerziellen Anbieters; siehe Materialtabelle). Die SPH-Mauslinie wurde ursprünglich von Zhou et al.14 beschrieben.
In vivo beige Adipozytenentwicklung durch AdipoSPH-vermittelte Prdm16-Überexpression
Um die Fähigkeit des in dieser Studie beschriebenen Modells zur Entwicklung beiger Adipozyten in vivo zu evaluieren, wurde das AAV, das das sgRNA-gerichtete Prdm16-Gen trägt, in das iWAT von AdipoSPH-Mäusen injiziert. Prdm16 ist ein etablierter Transkriptionsfaktor, der die Entwicklung und Funktion der beigefarbenen Adipozyten bestimmt20,21. Es ist wichtig zu erwähnen, dass wir hier eine zuvor getestete und validierte sgRNA ausgewählt haben, die auf das endogene Prdm16-Gen14 abzielt. Als Kontrolle diente AAV, die eine leere sgRNA trug. 10 Tage nach der AAV-Injektion wurde iWAT für histologische und Genexpressionsanalysen entnommen (Abbildung 1A). Wie erwartet, zeigten Immunfluoreszenzbilder von iWAT von AdipoSPH-Mäusen die Expression von dCas9 sowohl in der Kontroll- als auch in der Prdm16-Gruppe (Abbildung 1B). Darüber hinaus bestätigte die mCherry-Expression den Erfolg der AAV-Infektion von iWAT sowohl in der Kontroll- als auch in der Prdm16-Gruppe (Abbildung 1B). Die SPH-induzierte Prdm16-Expression induzierte eindeutig eine weit verbreitete Akkumulation von multilokulären beigen Adipozyten in iWAT (Abbildung 1B). Darüber hinaus zeigte die quantitative PCR (qPCR) eine erhöhte Expression von Prdm16 und des thermogenen Genprogramms (Ucp1, Cox8b, Ppargc1a und Cidea) in der Prdm16-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 1C).
Förderung der Entwicklung beigefarbener Adipozyten und Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs in vitro durch AdipoSPH-vermittelte Prdm16-Überexpression
Als nächstes wurde die Eignung dieses Modells für die Untersuchung der beigen Adipozytenbiologie in vitro untersucht. Zu diesem Zweck wurden Präadipozyten, die aus dem iWAT von AdipoSPH-Mäusen gewonnen wurden, mit AAV transduziert, die die sgRNA-Sequenz trug, die auf Prdm16 abzielt. Sieben Tage nach der Differenzierung wurden beige Adipozyten zur Analyse der Genexpression und des Sauerstoffverbrauchs verwendet (Abbildung 2A). Als Kontrolle wurde leere sgRNA verwendet. Es ist erwähnenswert, dass die Entfernung des STOP-Codons durch CRE-Rekombinase und die Aktivierung der SPH-Maschinerie unter der Kontrolle des Adiponektin-Promotors/Enhancers stand, was zur Aktivierung des endogenen Prdm16-Gens in reifen Adipozyten führte. Die Genexpressionsanalyse bestätigte die erhöhte Expression des endogenen Prdm16-Gens und der thermogenen Gene in der Prdm16-Überexpressionsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 2B). Um zu bestätigen, dass die SPH-induzierten beigen Adipozyten funktionell thermogen sind, wurde ein hochauflösender Respirometrie-Assay an den primären Adipozyten durchgeführt. Die Analyse und Interpretation der Respirometriedaten wurde wie kürzlich beschriebendurchgeführt 22. Die SPH-induzierte Prdm16-Expression führte zu einem höheren basalen und maximalen Sauerstoffverbrauch als in Kontrollzellen (Abbildung 2C). Wichtig ist, dass die Daten in der Prdm16-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe auf eine verbesserte ungekoppelte Atmung (Oligomycin-unsensitiv) hinwiesen (Abbildung 2C, Tabelle 3). Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass die SPH-induzierte Expression von endogenem Prdm16 den Bräunungsphänotyp rekapituliert und die Sauerstoffverbrauchsraten erhöht, die in konventionellen Prdm16 Tg-Mäusen beobachtet wurden.
Abbildung 1: Beige Fettentwicklung durch Injektion des Adeno-assoziierten Virus (AAV), das auf das endogene Prdm16-Gen abzielt, in das inguinale weiße Fettgewebe (iWAT) von AdipoSPH-Mäusen. (A) Schematische Darstellung des in vivo beigen Adipozyten-Versuchsdesigns (erstellt mit Biorender.com). (B) Histologische Bilder (Hämatoxylin- und Eosin-[H&E]-Färbung) von iWAT. Maßstabsbalken = 50 μm. (C) Quantitative PCR (qPCR) von Prdm16 und thermogenen Genen (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α und Cidea; n = 3). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. *p < 0,05; **p < 0,01 für Prdm16 im Vergleich zur Kontrolle (CTR) durch ungepaarten Student-t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: SPH-induzierte Differenzierung der beigen Adipozyten durch Prdm16-Überexpression. (A) Schematische Darstellung des experimentellen Versuchsdesigns für beige Adipozyten in vitro (erstellt mit Biorender.com). (B) Relative Genexpression von Prdm16 und thermogenen Genen (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α und Cidea; n = 3). (C) Sauerstoffverbrauchsrate (OCR), n = 6. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001 für Prdm16 im Vergleich zur Kontrolle (CTR) durch (B) ungepaarten Student-t-Test und (C) zweifache ANOVA mit wiederholten Messungen, gefolgt von Tukey-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Sanger-Sequenzierung von Prdm16 sgRNA. (A) Schematische Darstellung der Ausrichtung einzelsträngiger komplementärer Prdm16-Oligonukleotide. (B) Sanger-Sequenzierung von Prdm16 sgRNA unter Verwendung eines Universalprimers. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
| Gen | Spezies | Vorwärts | Rückwärts | |||||
| Genexpression | Prdm16 | Maus | CAGCACGGTGAAGCCATTC | GCGTGCATCCGCTTGTG | ||||
| UCP1 | Maus | TCTCAGCCGGCTTAATGACTG | GGCTTGCATTCTGACCTTCAC | |||||
| Ppargc1a | Maus | AGCCGTGACCACTGACAACGAG | GCTGCATGGTTCTGAGTGCTAAG | |||||
| Cox8b | Maus | GAACCATGAAGCCAACGACT | GCGAAGTTCAGTGGTTCC | |||||
| Cidea | Maus | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTGTCCATTTCT | |||||
| 36B4 | Maus | TCCAGGCTTTGGGCATCA | CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA | |||||
| Molekulare Klonierung | sgRNA Prdm16 Sequenz | Maus | CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG | CCCCTTTTCAGCGCAGCTCG | ||||
| Universelle Grundierung | Maus | GAGGGCCTATTTCCC ATGATTCCTTCATAT |
||||||
Tabelle 1: In der Studie verwendete Primer-Sequenzen.
| Mittel | Zusammensetzung | |||
| Komplettes Medium | Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit L-Glutamin | |||
| 10 % des fötalen Kälberserums (FBS) | ||||
| 2,5% Penicillin/Streptomycin | ||||
| Induktionsmedium | Komplettes Medium | |||
| Indomethacin, Endkonzentration 125 μM (0,125 M Stamm in Ethanol). Anmerkungen: Indomethacin muss 10 Sekunden lang auf 90 °C erhitzt werden, um sich aufzulösen. | ||||
| Insulin, Endkonzentration 20 nM (1 mM Stamm, 1 μl HCl zur Solubilisierung hinzufügen (5,73 mg/ml). Lagern Sie den Bestand bei -20 °C. | ||||
| Dexamethason, Endkonzentration 2 μg/ml (2 mg/ml Stamm in Ethanol) | ||||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), Endkonzentration 500 μM (0,25 M Stamm in 0,5 M KOH) | ||||
| 3,3',5-Trijod-L-thyronin (T3), Endkonzentration 1 nM (10 μM Stamm, T3 in 1 M HCl und EtOH 1:4 auf Vorrat lösen). | ||||
| Rosiglitazon, Endkonzentration 1 μg/ml (1 mg/ml Ethanol) | ||||
| Pflegemedium | Komplettes Medium | |||
| Insulin, Endkonzentration 20 nM (1 mM Vorrat). Fügen Sie 1 μl HCl hinzu, um zu solubilisieren (5,73 mg/ml). | ||||
| Rosiglitazon, Endkonzentration 1 μg/ml (1 mg/ml Ethanol) | ||||
Tabelle 2: Zusammensetzung der in der Studie verwendeten Medien.
| Parameter | CTR | PRDM16 | p-Wert | ||
| Kein mitochondrialer Sauerstoffverbrauch (pMoles/min/μg Protein) | 8.19 ± 1.40 | 10.80 ± 1.83 | 0.01 | ||
| Basalatmung (pMoles/min/μg Protein) | 28.82 ± 5.20 | 52.58 ± 13.73 | 0.001 | ||
| Maximale Atmung (pMoles/min/μg Protein) | 63,81 ± 9,80 | 122,94 ± 22,31 | < 0,001 | ||
| Reserve-Atmungskapazität (pMoles/min/μg Protein) | 34.98 ± 11.09 | 70.36 ± 26.06 | 0.006 | ||
| Oligo-unempfindlich (pMoles/min/μg Protein) | 8.27 ± 2.29 | 15.85 ± 5.48 | 0.005 | ||
| Oligo-sensitiv (pMoles/min/μg Protein) | 20.54 ± 5.68 | 36.72 ± 14.79 | 0.016 | ||
| Effizienz der Kopplung | 71.28 ± 1.51 | 69.84 ± 3.05 | 0.163 | ||
| Zellen-RCR | 7.70 ± 1.46 | 7.75 ± 2.43 | 0.485 | ||
Tabelle 3: Respiratorische Parameter von SPH-induzierten beigen Adipozyten.
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Discussion
Eine der nützlichsten Nicht-Editing-Anwendungen der CRISPR-Technologie ist die Abfrage der Genfunktion durch die Aktivierung endogener Gene mit Hilfe von CRISPRa-Systemen6. SPH ist ein starkes CRISPRa, von dem ursprünglich beschrieben wurde, dass es die Umwandlung von Astrozyten in aktive Neuronen induziert, indem es auf mehrere neurogene Gene abzielt14. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass AdipoSPH ein geeignetes Werkzeug zur Untersuchung der Biologie von beigem Fett ist, indem es die Expression von endogenem Prdm16 in Adipozyten aktiviert. Die SPH-induzierte Prdm16-Überexpression in Adipozyten führt zur Aktivierung des thermogenen Genprogramms und induziert den Browning-Phänotyp, der ein früheres transgenes (Tg) Prdm16-Mausmodell23 phänokopiert. Prdm16 wurde in dieser Arbeit als Ziel für die Induktion beiger Adipozyten ausgewählt, basierend auf der zentralen Rolle dieses Transkriptionsfaktors bei der Regulation der Differenzierung von braunem und beigem Fett sowie der Regulation des thermogenen Genprogramms (z.B. Erhöhung der Ucp1-Expression) in differenzierten Adipozyten. Nichtsdestotrotz erlaubt das aktuelle Modell die Überexpression jedes endogenen Gens nach Ermessen der Forscher und des Ziels der Studie.
Herkömmliche transgene Modelle, die die Biologie des Fettgewebes untersuchen, beruhen auf der Entwicklung genetisch veränderter Nagetiere, die ein Transgen unter der Kontrolle eines auf Adipozyten beschränkten Promotors/Enhancers (z. B. Fabp4 oder Adiponectin) überexprimieren24. Obwohl die aktuelle Technologie das Tempo der Entwicklung dieser Modelle beschleunigt hat, sind die Kosten und der Zeitaufwand für ihre Entwicklung immer noch ein häufiges Problem der wissenschaftlichen Gemeinschaft. Im Gegensatz dazu ist AdipoSPH ein billigeres und vielseitigeres Modell für Gain-of-Function-Ansätze als herkömmliche Tg-Mäuse. Darüber hinaus eignet sich AdipoSPH gut für die Untersuchung langer nicht-kodierender RNA- und Transkript-Isoformen, die für Tg-Mäusemodelle nicht besonders geeignet sind.
AdipoSPH bietet auch mehrere Vorteile bei der Untersuchung der Fettgewebebiologie im Vergleich zur einfachen Verabreichung von AAV, einem aktuellen alternativen Ansatz für Gain-of-Function-Experimente25. Erstens fördert AAV, das an das Fettgewebe abgegeben wird, die Überexpression, indem es mehrere Kopien eines Transgens einführt. Im Gegensatz dazu stellt die SPH-Aktivierung endogener Gene einen natürlicheren Wirkmechanismus dar. Zweitens führen Transgene, die von AAV (unter Verwendung konstitutiver Promotoren) abgegeben werden, normalerweise zu ihrer Überexpression in "jedem Zelltyp" innerhalb der Mikroumgebung des Fettgewebes. Im Gegensatz dazu ist die AdipoSPH-induzierte Expression endogener Gene auf Adipozyten beschränkt. Drittens ist die Verpackungsgröße (~4,5kb) eine typische Einschränkung von AAV für einige Transgene26. AAV-tragende sgRNA erfordert jedoch eine einfache und unkomplizierte Klonierungsstrategie für maßgeschneiderte 20-Nukleotide. Schließlich erreicht die AAV-Verabreichung typischerweise den systemischen Kreislauf und infiziert andere Gewebe und Organe. Obwohl einige AAVs microRNAs enthalten, um die Expression von Transgenen in bestimmten Geweben wie Leber und Herz zu verringern25, kann diese Strategie eine AAV-Infektion in anderen Geweben und Organen nicht verhindern. Im Gegensatz dazu ist die AdipoSPH-induzierte Expression endogener Gene auf Adipozyten beschränkt, selbst wenn ein gewisses Austreten von AAV in den systemischen Kreislauf berücksichtigt wird. Somit ist AdipoSPH auch ein geeignetes Modell für die systemische Verabreichung von AAV-tragender sgRNA und die Untersuchung der Fettgeweberegulation der Ganzkörperenergiehomöostase.
Obwohl das AdipoSPH-Modell einige Vorteile bietet, weist es Einschränkungen auf, die es zu berücksichtigen gilt. AAV ist derzeit die gebräuchlichste Plattform für die In-vivo-Verabreichung von sgRNA. Einige Herausforderungen bei der Herstellung von AAV und immunologische Fragen sind jedoch nach wie vor ungelöst26,27. Darüber hinaus führen unterschiedliche Mengen und Verteilungen von injiziertem AAV im gesamten Fettgewebe zu einer Variabilität der Genexpression innerhalb und zwischen den Geweben. Wir sind der Meinung, dass die Klonierung von sgRNA-Vektoren, die AAV-Produktion und die homogene Verabreichung von AAV in den iWAT entscheidende Schritte für den Erfolg dieses Protokolls sind. Schließlich aktivieren verschiedene sgRNAs die Expression endogener Gene im SPH-System14. Die Hauptempfehlung besteht darin, drei bis fünf sgRNA-Sequenzen innerhalb von 200 bp stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle (TSS) des interessierenden Gens zu entwerfen und zu testen. Daher erfordert die Definition der besten sgRNA-Sequenz für ein Zielgen in der Regel aufwändige In-vitro-Assays vor In-vivo-Experimenten.
AdipoSPH ist auch ein attraktives Modell, um andere Aspekte der Fettgewebebiologie zu untersuchen. Zum Beispiel fördern Adipozyten die Sekretion zahlreicher Adipokine28,29; Die Ganzkörperwirkungen der meisten dieser Moleküle sind jedoch nach wie vor nur unzureichend verstanden. AdipoSPH ist ein geeignetes Modell, um dieses Problem anzugehen, indem einzelne oder mehrere endogene Gene in reifen Adipozyten überexprimiert und ihre lokalen oder systemischen Wirkungen untersucht werden. Somit ist AdipoSPH ein einzigartiges Werkzeug zur Untersuchung der Biologie und Physiologie des Fettgewebes.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken dem Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp für die Erzeugung von AdipoSPH-Mäusen, dem Inmmunometabolism and Cell Signaling Laboratory und dem National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABIC) für die experimentelle Unterstützung. Wir danken für die finanzielle Unterstützung der São Paulo Research Foundation (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
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