Summary
Ce protocole présente l’utilisation de CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) dans les adipocytes (AdipoSPH) comme stratégie alternative au virus adéno-associé (AAV) pour étudier la biologie de la graisse beige. L’injection in vivo d’ARNg porteur d’AAV ciblant le gène endogène Prdm16 est suffisante pour induire le développement de graisse beige et améliorer le programme de gènes thermogéniques.
Abstract
La technologie CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) a provoqué une révolution en biologie, et des outils récents ont été appliqués bien au-delà de l’édition de gènes décrite à l’origine. Le système d’activation CRISPR (CRISPRa) combine la protéine catalytiquement inactive Cas9 (dCas9) avec des modules de transcription distincts pour induire l’expression endogène des gènes. SunTag-p65-HSF1 (SPH) est une technologie CRISPRa récemment développée qui combine des composants de médiateurs d’activation synergiques (SAM) avec les activateurs SunTag. Ce système permet la surexpression d’un ou de plusieurs gènes en concevant un ARN monoguide personnalisé (sgRNA). Dans cette étude, une souris SPH précédemment développée a été utilisée pour générer une souris conditionnelle exprimant la SPH dans les adipocytes (lignée de l’adiponectine Cre), appelée AdipoSPH. Pour induire un phénotype de graisse blanche à beige (brunissant), un virus adéno-associé (AAV) porteur d’ARNg ciblant le gène endogène Prdm16 (un facteur de transcription bien établi lié au développement de la graisse brune et beige) a été injecté dans le tissu adipeux blanc inguinal (iWAT). Ce modèle murin a induit l’expression de Prdm16 endogène et activé le programme de gènes thermogéniques. De plus, la surexpression in vitro de Prdm16 induite par SPH a augmenté la consommation d’oxygène des adipocytes beiges, phénocopiant les résultats d’un précédent modèle murin transgénique Prdm16. Ainsi, ce protocole décrit un modèle murin polyvalent, rentable et rapide pour étudier la biologie du tissu adipeux.
Introduction
Les adipocytes beiges (ou brite) sont des adipocytes exprimant la protéine 1 (UCP1) et des adipocytes riches en mitochondries qui résident dans des dépôts de tissu adipeux blanc (WAT). La graisse beige émerge d’un sous-ensemble de progéniteurs adipocytaires ou d’adipocytes blancs matures en réponse à l’exposition au froid et à d’autres stimuli 1,2. Les adipocytes beiges peuvent convertir l’énergie en chaleur d’une manière dépendante ou indépendante de UCP13. Indépendamment de sa fonction thermogénique, la graisse beige peut également améliorer la santé métabolique par d’autres moyens, tels que la sécrétion d’adipokines et les activités anti-inflammatoires et anti-fibrotiques. Des études chez la souris et l’homme ont montré que l’induction de graisse beige améliore le glucose dans tout le corps et l’homéostasie lipidique3. Cependant, bien que nos connaissances sur la biologie de la graisse beige aient évolué rapidement ces dernières années, la plupart de ses avantages métaboliques et des mécanismes connexes ne sont pas encore entièrement compris.
Les courtes répétitions palindromiques groupées régulièrement espacées (CRISPR) ont d’abord été décrites dans des cellules eucaryotes comme un outil capable de générer une rupture double brin (DSB) à un site spécifique du génome par l’activité nucléase de la protéine Cas9 4,5. Cas9 est guidé par un ARN monoguide synthétique (sgRNA) pour cibler une région génomique spécifique, conduisant à un ADN DSB. En plus d’utiliser la nucléase Cas9 à des fins d’édition, la technologie CRISPR-Cas9 a évolué pour être utilisée comme outil de régulation génique spécifiqueà la séquence 6. Le développement d’une protéine Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) et l’association de modules transcriptionnels capables d’améliorer l’expression génique ont donné naissance à des outils d’activation CRISPR (CRISPRa). Plusieurs systèmes CRISPRa ont vu le jour, tels que VP647,8, médiateur d’activation synergique (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 et SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, qui combine les composants des activateurs SAM et SunTag. Il a récemment été démontré que l’expression induite des gènes neurogènes dans les neuroblastes N2a et les astrocytes primaires est plus élevée en utilisant SPH par rapport aux autres systèmes CRISPRa14, démontrant SPH comme un outil CRISPRa prometteur.
Ici, nous avons profité d’une souris SPH14 précédemment développée pour générer un modèle murin conditionnel exprimant la SPH spécifiquement dans les adipocytes en utilisant la lignée Cre adiponectine (AdipoSPH). En utilisant un virus adéno-associé (AAV) portant l’ARNg ciblant le gène endogène Prdm16, le brunissement (conversion blanc en beige) de WAT inguinal (iWAT) a été induit pour augmenter l’expression du programme de gène thermogénique. De plus, la surexpression in vitro de Prdm16 a augmenté la consommation d’oxygène. Par conséquent, ce protocole fournit un modèle murin SPH polyvalent pour explorer les mécanismes de développement de la graisse beige dans le tissu adipeux.
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Protocol
Les études animales ont été réalisées conformément au Guide de l’Université de Campinas pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (protocole CEUA #5810-1/2021).
1. Clonage moléculaire
- Conception d’ARN guides uniques (ARNsg)
- Concevoir des sgRNA pour l’activation de CRISPR à l’aide de CHOPCHOP, disponible au https://chopchop.cbu.uib.no/, ou de tout autre outil approprié. Utilisez les paramètres suivants pour concevoir l’ARNg ciblant le gène Prdm16 : Cible : Prdm16 ; Dans: Mus musculus; Utilisation de: Crispr / Cas9; Pour : Activation.
REMARQUE : Concevoir des ARNg pour chaque région d’intérêt répartis sur une région de 200 pb en amont du site de début de la transcription (TSS). Par exemple, l’ARNg ciblant Prdm16 utilisé dans cette étude se lie à 154 pb en amont du SCT. - Ajouter des surplombs à l’ARNg pour correspondre au site de restriction SacI dans le squelette vectoriel pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (voir le tableau des matériaux). Inclure : 5'- (N20)AGCT-3' (N = nucléotides). Par exemple, la séquence ciblant le gène Prdm16 est 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3', et avec des surplombs est 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.
- Obtenir la séquence du complément inverse de l’ARNg 3' à l’aide de l’outil disponible à https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. Par exemple, la séquence d’ARNg 3' ciblant le gène Prdm16 est 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'.
- Concevoir des sgRNA pour l’activation de CRISPR à l’aide de CHOPCHOP, disponible au https://chopchop.cbu.uib.no/, ou de tout autre outil approprié. Utilisez les paramètres suivants pour concevoir l’ARNg ciblant le gène Prdm16 : Cible : Prdm16 ; Dans: Mus musculus; Utilisation de: Crispr / Cas9; Pour : Activation.
- Recuit d’oligonucléotides complémentaires simple brin
- Ajouter 1 μL de chaque oligonucléotide simple brin de 5' et 3' (concentration mère : 100 μM), 1 μL de tampon T4 ligase, 0,5 μL de polynucléotide kinase T4 (PNK) (1 × 104 unités/mL) et 6,5 μL deH2Oà un volume de réaction final de 10 μL. Recuit les oligonucléotides monocaténaires complémentaires à l’aide d’un thermocycleur dans les conditions suivantes : 37 °C pendant 30 min et 95 °C pendant 5 min, suivi d’une vitesse de descente de 5 °C/min.
REMARQUE : L’enzyme PNK est fournie avec un tampon PNK et ne contient pas suffisamment d’ATP requis pour la réaction de phosphorylation (voir le tableau des matériaux). Pour simplifier la réaction, utilisez le tampon de la ligase T4 (au lieu du tampon PNK). Le tampon de la ligase T4 fournit la quantité appropriée (1 mM ATP) de phosphate pour la réaction de phosphorylation. L’enzyme PNK fournit une phosphorylation terminale 5' des oligonucléotides pour la réaction de ligature ultérieure.
- Ajouter 1 μL de chaque oligonucléotide simple brin de 5' et 3' (concentration mère : 100 μM), 1 μL de tampon T4 ligase, 0,5 μL de polynucléotide kinase T4 (PNK) (1 × 104 unités/mL) et 6,5 μL deH2Oà un volume de réaction final de 10 μL. Recuit les oligonucléotides monocaténaires complémentaires à l’aide d’un thermocycleur dans les conditions suivantes : 37 °C pendant 30 min et 95 °C pendant 5 min, suivi d’une vitesse de descente de 5 °C/min.
- Ligature d’oligonucléotides sgRNA recuits
- Ajouter 25 ng de plasmide pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry à 2 μL d’oligonucléotides d’ARNg recuits, 1 μL d’enzyme SacI, 2 μL de tampon ADN ligase T4 10x, 1 μL d’ADN ligase T4 (1-3 u/μL) (voir le tableau des matériaux) et H2O à un volume de réaction final de 10 μL.
- Effectuer la ligature en incubant le mélange réactionnel à l’aide d’un thermocycleur dans les conditions suivantes : 15 cycles de 37 °C pendant 5 min et 25 °C pendant 5 min, suivis d’un maintien à 4 °C.
- Transformation suivie d’une réaction en chaîne de la polymérase (PCR)
- Transformer les cellules compétentes d’E. coli DH10B (voir le tableau des matières) avec 4 μL de produit de ligature en utilisant un choc thermique (42 °C pendant 45 s) et étaler sur une plaque de gélose contenant 100 μg/mL d’ampicilline.
- Confirmer les colonies transformées par PCR de colonie à l’aide du mélange maître de PCR (voir le tableau des matériaux). Prélever la colonie et mélanger avec 5 μL de mélange maître, 0,1 μL d’amorce universelle (concentration mère : 100 μM), 0,1 μL d’amorce inverse sgRNA (concentration mère : 100 μM) (tableau 1) et 5 μL deH2O. Exécuter la PCR à l’aide d’un thermocycleur dans les conditions suivantes : dénaturation initiale (94 °C pendant 2 min), suivi de 35 cycles de dénaturation (94 °C pendant 20 s), de recuit (60 °C pendant 30 s), d’extension (72 °C pendant 30 s) et d’une étape finale d’allongement (72 °C pendant 5 min). Résoudre l’ADN en utilisant l’électrophorèse sur gel d’agarose (1,5%) dans un tampon TAE 0,5x à 90 V pendant 30 min.
REMARQUE: Les clones positifs donnent une bande de ~280 pb. - Soumettre des échantillons positifs pour le séquençage de Sanger à l’aide d’une amorce universelle (tableau 1, dossier supplémentaire 1).
- Purification plasmidique
- Purifier le plasmide d’un clone positif à l’aide d’une trousse de purification plasmidique (voir le tableau des matériaux), en suivant les instructions du fabricant.
REMARQUE: Purifier le plasmide à l’aide d’une résine échangeuse d’anions ou d’un autre kit adapté à la transfection cellulaire. - Incuber le clone positif (12 h à 37 °C avec agitation à 200 tr/min) en utilisant un milieu de croissance bactérien standard contenant 100 μg/mL d’ampicilline.
- Centrifuger les cellules bactériennes à 6 000 × g pendant 10 min à 4 °C. Suivez les étapes suivantes selon les instructions du kit du fabricant.
- Purifier le plasmide d’un clone positif à l’aide d’une trousse de purification plasmidique (voir le tableau des matériaux), en suivant les instructions du fabricant.
2. Emballage AAV
NOTE: L’emballage AAV a été effectué conformément aux publications précédentes15,16 avec des modifications mineures.
- Plaquer 293 lymphocytes T (voir le tableau des matières) dans une fiole de175 cm 2 (ensemencement de 5 × 106 cellules par fiole) en utilisant 25 mL de milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S). Incuber à 37 °C, 5% de CO2 et 95% d’humidité jusqu’à ce que les cellules atteignent 50%-70% de confluence.
- Mélanger 14 μL de polyéthylènemine (1 μg/μL) avec 1 mL de NaCl 150 mM. Mélanger les trois plasmides nécessaires à la production d’AAV dans un rapport molaire de 1:1:1 (c.-à-d. 17,7 μg de pAdDeltaF6, 7,9 μg d’AAV2/8 (voir le tableau des matériaux) et 5,9 μg d’ARNg cloné de l’étape 1 dans 1 mL de NaCl 150 mM. Transférer goutte à goutte le mélange polyéthylène:NaCl dans le tube contenant l’ADN (mélange de plasmides) et incuber pendant 20 min à 25 °C.
REMARQUE: pAdDeltaF6 est un plasmide auxiliaire et pCapside pAAV2/8 est un plasmide d’emballage exprimant des gènes de réplication (Rep) et de capside (cap). Les deux plasmides sont nécessaires pour produire l’AAV. - Avant la transfection, remplacer le milieu de croissance cellulaire par 18 mL de DMEM contenant 1 % de FBS et de L-alanyl-L-glutamine (0,5 g/L). Ajouter 2 mL du mélange polyéthylènemine:ADN à chaque fiole de culture et incuber les cellules dans un incubateur de CO 2 (37 °C, 5 % CO2, 95 % d’humidité).
- Après 5 h, ajouter 5 mL de DMEM complété par 10% FBS et L-alanyl-L-glutamine (0,5 g / L).
- Après 3 jours d’incubation, détacher les cellules du ballon de culture à l’aide d’un grattoir cellulaire. Prélever les cellules 293T de 10 (175 cm2) flacons de culture cellulaire dans des tubes coniques de 50 ml et ajouter du DMEM (voir le tableau des matières) jusqu’à 30 mL.
- Ajouter 3 mL de chloroforme à chaque tube conique de 50 mL contenant les cellules 293T et mélanger à l’aide d’un mélangeur vortex à grande vitesse pendant 5 minutes. Remettez les cellules en suspension en ajoutant brièvement 7,6 mL de NaCl 5 M et de vortex. Centrifuger à 3 000 × g et 4 °C pendant 5 min.
- Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube conique et ajouter 9,4 mL de polyéthylèneglycol (PEG) 8000 à 50 % (v/v). Mélanger avec un mélangeur vortex à grande vitesse pendant 10 s et mettre les échantillons sur glace pendant 1 h.
- Centrifuger à 3 000 × g à 4 °C pendant 30 min. Retirer le surnageant et laisser sécher la pastille pendant 10 min.
- Ajouter 1,4 mL de HEPES (50 mM, pH 8) et mélanger pendant 5 min à l’aide d’un mélangeur vortex à grande vitesse. Ajouter 3,5 μL de 1 M MgCl2, 14 μL de DNase I (20 unités/μL) et 1,4 μL de RNase A (10 μg/μL). Incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 min, puis transférer les échantillons dans de nouveaux tubes de 1,5 mL (700 μL dans chaque tube).
- Ajouter 700 μL de chloroforme à chaque tube de 1,5 mL et mélanger à l’aide d’un mélangeur vortex à grande vitesse pendant 10 s. Centrifuger à 3 000 × g à 4 °C pendant 5 min et transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube. Répétez cette étape 3x.
- Évaporer le chloroforme pendant 30 min dans une enceinte de biosécurité. Ensuite, transférer 300 μL de la phase aqueuse dans un tube d’ultracentrifugation de 0,5 mL (voir Tableau des matériaux). Faire tourner le filtre à 14 000 × g à 25 °C pendant 5 min. Retirez le flux et faites tourner le filtre à nouveau jusqu’à ce que tout le volume ait traversé le filtre.
- Lavez le filtre en ajoutant 300 μL de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco et mélangez les solutions par pipetage. Centrifuger le filtre pendant 5 min à 14 000 × g à 25 °C. Répétez cette étape de lavage 4x.
- Centrifuger le filtre pendant 8 min à 14 000 × g à 25 °C. Placer le filtre à l’envers dans un tube neuf et faire tourner pendant 2 min à 1 000 × g à 25 °C.
3. Titrage de l’AAV par qPCR
- Préparer une courbe standard pour le titrage AAV et déterminer le titre AAV selon l’étude originale de Fripont et al.15.
4. Injection in vivo d’AAV dans le tissu adipeux blanc inguinal (iWAT)
- Séparez les outils chirurgicaux et les fournitures nécessaires à la chirurgie et stérilisez-les comme recommandé pour chaque matériau spécifique.
- Anesthésier la souris avec 100 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine par injection intrapéritonéale. Confirmez l’anesthésie en appliquant une pression vigoureuse sur la patte et la queue et en vérifiant un réflexe. Appliquez une pommade sur les yeux de la souris pour éviter la sécheresse oculaire pendant la chirurgie.
- Placez la souris anesthésiée en décubitus dorsal et rasez une petite zone sur les flancs, à proximité des articulations de la hanche pour les injections iWAT, avec un rasoir. Appliquer la crème dépilatoire pendant 5 min. Enlevez la crème résiduelle avec de l’eau pour éviter les brûlures de la peau.
- Désinfecter la peau en utilisant trois cycles alternés d’application d’une solution antiseptique (povidone-iode) sur la peau avec une gaze propre et de l’alcool à 70%. Jetez la gaze après chaque utilisation.
- Effectuer une application finale d’une solution antiseptique sur la peau. Ensuite, faites une incision de 1-2 cm avec des ciseaux stérilisés dans la zone proximale des articulations et maintenez la peau ouverte à l’aide de forceps pour exposer le dépôt de graisse. Le WAT peut être trouvé attaché à la peau des deux côtés, s’étendant du début sur le dos et vers le bas vers le testicule.
REMARQUE: Utilisez des champs pour éviter la contamination pendant la chirurgie ou les procédures de suture. - À l’aide de pinces, à travers l’incision, tirez doucement le dépôt de graisse vers le haut pour vous assurer que l’injection est au bon endroit et à la bonne profondeur.
REMARQUE: Veillez à ne pas retirer le tissu de son emplacement d’origine. - Remplir la seringue de microlitre (calibre : 33 ; style de point : 4 ; angle : 12 ; longueur : 10) (voir le tableau des matières) avec 2,5 μL (5,6 × 1010 génomes viraux [VG]/μL) de l’AAV (contenant l’ARNg ciblant le gène endogène Prdm16). Insérez délicatement l’aiguille à un angle de 30°-45° dans l’iWAT. Répétez l’injection 5x à différents endroits du tissu pour infecter de manière homogène l’ensemble du coussinet adipeux iWAT. Un volume total de 15 μL est recommandé pour infecter l’iWAT.
REMARQUE: La profondeur d’insertion de la seringue dépend de l’épaisseur du dépôt du coussinet adipeux. Utilisez la technique no-touch pour préparer l’injection. - Fermez l’incision de peau rasée à l’aide de sutures monofilament 4/0. Placez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à ce que la conscience soit retrouvée. Surveillez l’animal toutes les 10 à 15 minutes jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement. Une fois que l’animal a repris conscience, observez le profilage locomoteur, qui doit être linéaire et ne présenter aucun signe de détresse ou de douleur.
- Effectuer un contrôle de la douleur postopératoire dans les 48 heures suivant la chirurgie en administrant du chlorhydrate de tramadol (5 mg / kg) par voie intrapéritonéale pendant 3 jours (2x / jour).
REMARQUE : Surveillez les signes de détresse et d’inconfort et surveillez la consommation d’eau et de nourriture. Administrer une dose efficace d’analgésique de manière préventive, de préférence avant ou au début de la chirurgie. - Gardez la souris dans une cage avec libre accès à la nourriture et à l’eau pendant la période de guérison. Après la période de guérison, procédez à l’euthanasie de la souris. Dans cette étude, l’euthanasie a été réalisée par une surdose d’anesthésiques injectables (intrapéritonéale) à partir de 3x la dose inductrice (300-360 mg/kg de chlorhydrate de kétamine + 30-40 mg/kg de chlorhydrate de xylazine) suivie d’une décapitation.
REMARQUE: Il est fortement recommandé de garder les animaux logés dans des cages individuelles jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis de l’anesthésie.
5. Différenciation in vitro des cellules vasculaires stromales (SVF) en adipocytes beiges
- Effectuer l’isolement et le placage des SVF primaires à partir de l’iWAT des souris AdipoSPH selon Aune et al.17. Graines de SVF dérivées de souris AdipoSPH iWAT dans une plaque à 6 puits contenant un milieu complet (DMEM contenant 3,1 g/L de glucose, 0,5 g/L de L-alanyl-L-glutamine, 10 % de FBS et 2,5 % de P/S) pendant 1 à 2 h.
REMARQUE: La fraction SVF contient un mélange de différents types de cellules. À ce stade, il n’est pas possible de définir le nombre de cellules progénitrices ensemencées qui donnent naissance aux adipocytes. - Aspirer le milieu, laver le puits 2x avec une solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) et remplacer par un milieu complet frais. Incuber les cellules à 37 °C, 5% CO2, 95% d’humidité jusqu’à ce que les cellules atteignent 70%-80% de confluence.
- Induire la différenciation (jour 0) en traitant les cellules avec le milieu d’induction (tableau 2).
NOTE: Le cocktail médicamenteux du milieu d’induction est nécessaire pour améliorer la différenciation des adipocytes beiges et pour l’expression du programme de gènes thermogéniques17. - Après 2 jours (jour 2), remplacez le milieu d’induction par le milieu d’entretien (tableau 2).
- Après 2 jours (jour 4), remplacez le milieu d’entretien par un milieu d’entretien frais (tableau 2) pendant 2 à 3 jours.
- Changez le milieu d’entretien toutes les 48 heures jusqu’à ce que les préadipocytes soient complètement différenciés en adipocytes (généralement 6 jours après l’ajout du milieu d’induction). Les adipocytes matures peuvent être observés en utilisant la microscopie optique, car les cellules différenciées semblent être chargées de gouttelettes lipidiques.
6. Infection in vitro par le VA des SVF
NOTE: Les SVF dérivés de souris AdipoSPH iWAT ont été infectés par le sgRNA-Prdm16 porteur d’AAV tel que décrit précédemment par Wang et al.18 avec quelques modifications.
- Cultiver les cellules sur une plaque de culture à 6 puits avec un milieu complet jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 70% à 80%, comme décrit précédemment aux étapes 5.1-5.3.
- Mélanger 5,6 × 1010 VG/μL de sgRNA-Prdm16 porteur d’AAV avec 2 mL de milieu complet et du bromure d’hexadiméthrine (8 μg/mL) (voir le tableau des matières). Transduisez les cellules en remplaçant le milieu complet et en ajoutant le milieu complet contenant AAV. Incuber les cellules transduites pendant 12 h à 37 °C, 95% d’humidité et 5% de CO2.
- Diviser et ensemencer les cellules comme décrit à l’étape 5 pour la prolifération cellulaire et la différenciation en adipocytes beiges.
NOTE: Pour le test de consommation d’oxygène, semer 4,0 × 104 cellules (à partir de l’étape 6.2) par puits avec un milieu d’induction dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits. Les étapes suivantes de prolifération et de différenciation cellulaire sont effectuées comme décrit à l’étape 5. Le test de consommation d’oxygène est effectué lorsque les cellules atteignent une confluence de 80% à 100% et sont complètement différenciées, comme indiqué précédemment19.
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Representative Results
Les souris AdipoSPH ont été développées en sélectionnant des souches de souris SPH et Adipoq-Cre. Les deux souches de souris étaient dans un fond hybride C57BL6J-DBA/2J (selon le fournisseur commercial; voir le tableau des matériaux). La lignée de souris SPH a été décrite à l’origine par Zhou et al.14.
Développement in vivo d’adipocytes beiges par surexpression de Prdm16 médiée par AdipoSPH
Pour évaluer la capacité du modèle décrit dans cette étude à développer des adipocytes beiges in vivo, l’AAV portant l’ARNg ciblant le gène Prdm16 a été injecté dans l’iWAT de souris AdipoSPH. Prdm16 est un facteur de transcription bien établi qui détermine le développement et la fonction des adipocytes beiges20,21. Il est important de mentionner que nous avons choisi ici un sgRNA préalablement testé et validé ciblant le gène endogène Prdm1614. L’AAV portant un ARNg vide a été utilisé comme témoin. 10 jours après l’injection d’AAV, iWAT a été récolté pour des analyses histologiques et d’expression génique (Figure 1A). Comme prévu, les images d’immunofluorescence d’iWAT de souris AdipoSPH ont démontré l’expression de dCas9 dans les groupes témoin et Prdm16 (Figure 1B). De plus, l’expression de mCherry a confirmé le succès de l’infection par le virus AAV de l’iWAT dans le groupe témoin et le groupe Prdm16 (Figure 1B). L’expression de Prdm16 induite par SPH a clairement induit une accumulation généralisée d’adipocytes beiges multiloculaires dans iWAT (Figure 1B). De plus, la PCR quantitative (qPCR) a révélé une expression accrue de Prdm16 et du programme de gènes thermogéniques (Ucp1, Cox8b, Ppargc1a et Cidea) dans le groupe Prdm16 par rapport au groupe témoin (Figure 1C).
Promotion du développement des adipocytes beiges et amélioration de la consommation d’oxygène in vitro par surexpression de Prdm16 médiée par AdipoSPH
Ensuite, la pertinence de ce modèle pour étudier in vitro la biologie des adipocytes beiges a été étudiée. À cette fin, des préadipocytes dérivés de l’iWAT de souris AdipoSPH ont été transduits avec AAV portant la séquence sgRNA ciblant Prdm16. Sept jours après la différenciation, des adipocytes beiges ont été utilisés pour l’analyse de l’expression génique et de la consommation d’oxygène (Figure 2A). L’ARNg vide a été utilisé comme témoin. Il convient de noter que l’élimination du codon STOP par la recombinase CRE et l’activation de la machinerie SPH étaient sous le contrôle du promoteur/amplificateur de l’adiponectine, ce qui a entraîné l’activation du gène endogène Prdm16 dans les adipocytes matures. L’analyse de l’expression génique a confirmé l’augmentation de l’expression du gène Prdm16 endogène et des gènes thermogéniques dans le groupe de surexpression Prdm16 par rapport au groupe témoin (Figure 2B). Pour confirmer que les adipocytes beiges induits par SPH étaient fonctionnellement thermogéniques, un test de respirométrie à haute résolution a été effectué sur les adipocytes primaires. L’analyse et l’interprétation des données de pneumométrie ont été effectuées comme décrit récemment22. L’expression de Prdm16 induite par la SPH a entraîné une consommation d’oxygène basale et maximale plus élevée que celle des cellules témoins (Figure 2C). Il est important de noter que les données indiquaient une amélioration de la respiration non couplée (insensible à l’oligomycine) dans le groupe Prdm16 par rapport à celle du groupe témoin (Figure 2C, Tableau 3). Pris ensemble, ces résultats ont révélé que l’expression induite par SPH de Prdm16 endogène récapitule le phénotype de brunissement et améliore les taux de consommation d’oxygène observés chez les souris Prdm16 Tg conventionnelles.
Figure 1 : Développement de graisse beige par injection de virus adéno-associé (AAV) ciblant le gène Prdm16 endogène dans le tissu adipeux blanc inguinal (iWAT) de souris AdipoSPH. (A) Illustration schématique du plan expérimental in vivo d’adipocytes beiges (créé à l’aide de Biorender.com). (B) Images histologiques (coloration à l’hématoxyline et à l’éosine [H&E]) de l’iWAT. Barre d’échelle = 50 μm. (C) PCR quantitative (qPCR) de Prdm16 et des gènes thermogéniques (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α et Cidea; n = 3). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01 pour Prdm16 versus contrôle (CTR) par le test t de Student non apparié. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Différenciation des adipocytes beiges induite par SPH par surexpression de Prdm16. (A) Illustration schématique du plan expérimental in vitro d’adipocytes beiges (créé à l’aide de Biorender.com). (B) Expression relative des gènes Prdm16 et thermogéniques (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α et Cidea; n = 3). (C) Taux de consommation d’oxygène (TCO), n = 6. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001 pour Prdm16 versus contrôle (CTR) par (B) test t de Student non apparié et (C) ANOVA bidirectionnelle à mesures répétées, suivi du test de Tukey. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Séquençage de Sanger de l’ARNg Prdm16. (A) Illustration schématique démontrant l’alignement d’oligonucléotides complémentaires simple brin Prdm16. (B) Séquençage de Sanger de l’ARNg Prdm16 à l’aide d’une amorce universelle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
| Gène | Espèce | En avant | Inverse | |||||
| Expression des gènes | Prdm16 | souris | CAGCACGGTGAAGCCATTC | GCGTGCATCCGCTTGTG | ||||
| Ucp1 | souris | TCTCAGCCGGCTTAATGACTG | GGCTTGCATTCTGACCTTCAC | |||||
| Ppargc1a | souris | AGCCGTGACCACTGACAACGAG | GCTGCATGGTTCTGAGTGCTAAG | |||||
| Cox8b | souris | GAACCATGAAGCCAACGACT | GCGAAGTTCAGTGGTTCC | |||||
| Cidea | souris | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTGTCCATTTCT | |||||
| 36B4 | souris | TCCAGGCTTTGGGCATCA | CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA | |||||
| Clonage moléculaire | Séquence Prdm16 de sgRNA | souris | CGAGCTGCTGAAAAGGGG | CCCCTTTTCAGCAGCTCG | ||||
| Apprêt universel | souris | GAGGGCCTATTTCCC ATGATTCCTTCATAT |
||||||
Tableau 1 : Séquences d’amorces utilisées dans l’étude.
| Douleur moyenne | Composition | |||
| Support complet | Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) avec L-glutamine | |||
| 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) | ||||
| 2,5 % de pénicilline/streptomycine | ||||
| Milieu d’induction | Support complet | |||
| Indométacine, concentration finale 125 μM (0,125 M stock dans l’éthanol). NOTE: L’indométacine doit être chauffée à 90 °C pendant 10 secondes pour être dissoute. | ||||
| Insuline, concentration finale 20 nM (1 mM stock, ajouter 1 μL de HCl à solubiliser (5,73 mg/mL). Conserver le stock à -20 °C. | ||||
| Dexaméthasone, concentration finale 2 μg/mL (2 mg/mL de stock dans l’éthanol) | ||||
| 3-Isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), concentration finale 500 μM (0,25 M stock dans 0,5 M KOH) | ||||
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3), concentration finale 1 nM (10 μM stock, dissoudre T3 dans 1 M HCl et EtOH 1:4 dans le stock). | ||||
| Rosiglitazone, concentration finale 1 μg/mL (1 mg/mL de stock dans l’éthanol) | ||||
| Moyen d’entretien | Support complet | |||
| Insuline, concentration finale 20 nM (1 mM stock). Ajouter 1 μL de HCl pour solubiliser (5,73 mg/mL). | ||||
| Rosiglitazone, concentration finale 1 μg/mL (1 mg/mL de stock dans l’éthanol) | ||||
Tableau 2 : Composition des milieux utilisés dans l’étude.
| Paramètres | CTR | PRDM16 | Valeur de p | ||
| Pas de consommation d’oxygène mitochondrial (pMoles/min/μg de protéines) | 8,19 ± 1,40 | 10,80 ± 1,83 | 0.01 | ||
| Respiration basale (pMoles/min/μg de protéines) | 28,82 ± 5,20 | 52,58 ± 13,73 | 0.001 | ||
| Respiration maximale (pMoles/min/μg de protéines) | 63,81 ± 9,80 | 122,94 ± 22,31 | < 0,001 | ||
| Capacité respiratoire de réserve (pMoles/min/μg de protéines) | 34,98 ± 11,09 | 70,36 ± 26,06 | 0.006 | ||
| Insensible aux oligo (pMoles/min/μg de protéines) | 8,27 ± 2,29 | 15,85 ± 5,48 | 0.005 | ||
| Oligo sensible (pMoles/min/μg de protéines) | 20,54 ± 5,68 | 36,72 ± 14,79 | 0.016 | ||
| Efficacité du couplage | 71,28 ± 1,51 | 69,84 ± 3,05 | 0.163 | ||
| RCR cellulaire | 7,70 ± 1,46 | 7,75 ± 2,43 | 0.485 | ||
Tableau 3 : Paramètres respiratoires des adipocytes beiges induits par SPH.
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Discussion
L’une des applications non éditrices les plus utiles de la technologie CRISPR est l’interrogation de la fonction des gènes par l’activation de gènes endogènes à l’aide de systèmes CRISPRa6. SPH est un puissant CRISPRa qui a été décrit à l’origine pour induire la conversion des astrocytes en neurones actifs en ciblant plusieurs gènes neurogènes14. Dans cette étude, AdipoSPH s’est avéré être un outil approprié pour étudier la biologie des graisses beiges en activant l’expression de Prdm16 endogène dans les adipocytes. La surexpression de Prdm16 induite par SPH dans les adipocytes conduit à l’activation du programme de gènes thermogéniques et induit le phénotype brunissant, phénocopiant une précédente souris transgénique (Tg) Prdm16 modèle23. Prdm16 a été choisi dans cette étude comme cible pour induire des adipocytes beiges en raison du rôle central de ce facteur de transcription dans la régulation de la différenciation des graisses brunes et beiges, ainsi que de la régulation du programme de gènes thermogéniques (par exemple, l’amélioration de l’expression d’Ucp1) dans les adipocytes différenciés. Néanmoins, le modèle actuel permet la surexpression de tout gène endogène à la discrétion des chercheurs et du but de l’étude.
Les modèles transgéniques traditionnels qui étudient la biologie du tissu adipeux reposent sur le développement de rongeurs génétiquement modifiés surexprimant un transgène sous le contrôle d’un promoteur/amplificateur limité aux adipocytes (par exemple, Fabp4 ou adiponectine)24. Bien que la technologie actuelle ait accéléré le rythme de développement de ces modèles, les coûts et le temps nécessaires à leur développement sont encore un problème commun à la communauté scientifique. En revanche, AdipoSPH est un modèle moins cher et plus polyvalent pour les approches de gain de fonction que les souris Tg traditionnelles. De plus, AdipoSPH est bien adapté à l’étude des isoformes d’ARN non codants et de transcription longs, qui ne sont pas particulièrement adaptés aux modèles de souris Tg.
AdipoSPH présente également plusieurs avantages dans l’étude de la biologie du tissu adipeux par rapport à la simple administration d’AAV, une approche alternative actuelle pour les expériences de gain de fonction25. Tout d’abord, l’AAV délivré au tissu adipeux favorise la surexpression en introduisant plusieurs copies d’un transgène. En revanche, l’activation SPH des gènes endogènes représente un mécanisme d’action plus naturel. Deuxièmement, les transgènes délivrés par AAV (utilisant des promoteurs constitutifs) entraînent normalement leur surexpression dans « n’importe quel type de cellule » dans le microenvironnement du tissu adipeux. En revanche, l’expression induite par AdipoSPH des gènes endogènes est limitée aux adipocytes. Troisièmement, la taille de l’emballage (~4,5 kb) est une limitation typique de l’AAV pour certains transgènes26. Cependant, l’ARNg porteur d’AAV nécessite une stratégie de clonage simple et facile pour 20 nucléotides personnalisés. Enfin, l’administration d’AAV atteint généralement la circulation systémique et infecte d’autres tissus et organes. Bien que certains AAV contiennent des microARN pour atténuer l’expression de transgènes dans des tissus particuliers, tels que le foie et le cœur25, cette stratégie ne peut pas prévenir l’infection par AAV dans d’autres tissus et organes. En revanche, l’expression induite par AdipoSPH des gènes endogènes est limitée aux adipocytes, même en tenant compte d’une certaine fuite d’AAV dans la circulation systémique. Ainsi, AdipoSPH est également un modèle approprié pour l’administration systémique d’ARNg porteur d’AAV et l’étude de la régulation du tissu adipeux de l’homéostasie énergétique du corps entier.
Bien que le modèle AdipoSPH offre certains avantages, il présente des limites qu’il est important de prendre en compte. AAV est actuellement la plate-forme la plus courante pour l’administration in vivo de sgRNA. Cependant, certains défis liés à la fabrication d’AAV et aux problèmes immunologiques restent non résolus26,27. De plus, différentes quantités et distributions d’AAV injecté dans le tissu adipeux entraînent une variabilité intra- et intertissulaire de l’expression génique. Nous considérons que le clonage du vecteur sgRNA, la production d’AAV et l’administration homogène d’AAV dans l’iWAT sont des étapes critiques pour le succès de ce protocole. Enfin, différents sgRNA activent distinctement l’expression des gènes endogènes dans le système SPH14. La principale recommandation est de concevoir et de tester trois à cinq séquences d’ARNg à moins de 200 pb en amont du site de début de la transcription (TSS) du gène d’intérêt. Par conséquent, la définition de la meilleure séquence d’ARNg pour un gène cible nécessite généralement des tests in vitro laborieux avant les expériences in vivo.
AdipoSPH est également un modèle attrayant pour étudier d’autres aspects de la biologie des tissus adipeux. Par exemple, les adipocytes favorisent la sécrétion de nombreuses adipokines28,29; Cependant, les effets sur l’ensemble du corps de la plupart de ces molécules restent mal compris. AdipoSPH est un modèle approprié pour résoudre ce problème en surexprimant un ou plusieurs gènes endogènes dans les adipocytes matures et en étudiant leurs effets locaux ou systémiques. Ainsi, AdipoSPH est un outil unique pour étudier la biologie et la physiologie du tissu adipeux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le soutien reçu du Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, pour la génération de souris AdipoSPH, du Laboratoire d’inmmunométabolisme et de signalisation cellulaire et de l’Institut national des sciences et technologies en photonique appliquée à la biologie cellulaire (INFABIC) pour tout le soutien expérimental. Nous remercions le soutien financier de la Fondation de recherche de Sao Paulo (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
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